Artykuł metodologiczny

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67902

⸱

4 kwietnia 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Baylor University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Streszczenie

Rak piersi jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem wśród kobiet w USA. Wykazano, że organoidalne modele guzów litych wiernie odwzorowują aspekty progresji raka, takie jak proliferacja i inwazja. Chociaż organoidy pochodzące od pacjentów i organoidy ksenoprzeszczepów pochodzące od pacjentów są patofizjologicznie istotne, ich rozmnażanie jest kosztowne, trudne do manipulowania i składają się głównie z najbardziej proliferacyjnych typów komórek w mikrośrodowisku guza (TME). Ograniczenia te uniemożliwiają ich wykorzystanie do wyjaśnienia komórkowych mechanizmów progresji choroby, które zależą od komórek zrębowych związanych z nowotworem, które znajdują się w TME i o których wiadomo, że przyczyniają się do przerzutów i oporności na terapię.

Tutaj opisujemy metody hodowli wielokomórkowych kultur 3D nabłonkowo-stromalnych. Do zalet tych metod należy ekonomiczny system do szybkiego generowania organoidowych kultur 3D w środowiskach wolnych od rusztowań, który można wykorzystać do śledzenia inwazji w rozdzielczości pojedynczej komórki w rusztowaniach hydrożelowych. W szczególności pokazujemy, jak generować te heterowielokomórkowe hodowle 3D przy użyciu komórek raka piersi BT-474 w połączeniu z fibroblastami (BJ-5ta), komórkami podobnymi do monocytów (THP-1) i / lub komórkami śródbłonka (EA.hy926). Dodatkowo, różnicowe znakowanie fluorescencyjne populacji komórek umożliwia mikroskopię poklatkową w celu zdefiniowania dynamiki składania kultur 3D i inwazji.

Warto zauważyć, że dodanie dowolnych dwóch kombinacji komórek zrębu do kultur 3D komórek BT-474 znacznie zmniejsza okrągłość kultur 3D, co jest zgodne z obecnością organoidopodobnych lub drugorzędowych struktur sferoidalnych. W eksperymentach z barwnikiem śledzącym fibroblasty i komórki śródbłonka kolokalizują się w obwodowych wypukłościach przypominających organoidy i są przestrzennie oddzielone od pierwotnej sferoidy BT-474. Wreszcie, heterowielokomórkowe hodowle 3D komórek BT-474 mają zwiększoną zdolność inwazji hydrożelu. Ponieważ zaobserwowaliśmy te wystające struktury w heterowielokomórkowych kulturach 3D zarówno nienowotworowych, jak i rakotwórczych komórek nabłonka piersi, praca ta zapewnia wydajną i powtarzalną metodę generowania organoidowych kultur 3D w środowisku wolnym od rusztowań do późniejszych analiz fenotypów związanych z progresją guza litego.

Wprowadzenie

Postęp raka jest teraz uznawany za zależny od dwóch głównych czynników: zmian genetycznych/epigenetycznych w komórkach nowotworowych oraz niezliczonych interakcji z komórkami nienowotworowymi w mikrośrodowisku guza (TME)1. Chociaż uznaje się, że zmiany genetyczne w komórkach są niezbędne do inicjacji nowotworu, same takie zmiany nie są wystarczające do progresji guza i przerzutów2. Komponenty TME, pierwotnie uważane za cichych obserwatorów, są obecnie znane z aktywnego promowania progresji raka poprzez wzajemne i dynamiczne przesłuchy z komórkami nowotworowymi3. Skład TME różni się w zależności od tkanki, z której pochodzi guz, stadium guza i charakterystyki pacjenta, ale cechy charakterystyczne obejmują fibroblasty związane z rakiem zrębu (CAF), macierz zewnątrzkomórkową (ECM), komórki śródbłonka naczyń krwionośnych, a także adaptacyjne i szpikowe komórki odpornościowe1,4.

Zrębowe CAFy w TME składają się z podtypów fibroblastów o różnym pochodzeniu i funkcji5. Takie CAF są kluczowymi składnikami TME, ponieważ oddziałują z komórkami nowotworowymi na kilku granicach faz. CAF wydzielają białka ECM, które zmieniają sztywność macierzy, co może albo ograniczać dostarczanie leków poprzez nadmierne odkładanie się kolagenu, proteoglikanów i fibronektyny, albo umożliwiać komórkom nowotworowym inwazję z pierwotnego miejsca guza poprzez wydzielanie metaloproteinaz macierzy rozkładających ECM (MMPs)6,7. Ponadto CAF promują wzrost, migrację i unaczynienie guza poprzez wydzielanie różnych czynników wzrostu, cytokin i czynników angiogennych, takich jak odpowiednio naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), transformujący czynnik wzrostu β (TGF-β) i czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF)1,6. Równolegle, komórki śródbłonka, pobudzane przez niedotlenione TME, również promują unaczynienie guza i hamują funkcje komórek odpornościowych poprzez zwiększone wydzielanie czynników angiogennych i zmniejszone wydzielanie cząsteczek adhezyjnych leukocytów1,8.

Z pozorną złożonością progresji raka, niezbędne stało się włączenie komponentów zrębu TME do podstawowych badań nad rakiem. Jednak ustanowienie modeli, które wiernie odwzorowują znaną patofizjologię nowotworu, jest nadal istotną niezaspokojoną potrzebą9,10. Podczas gdy tradycyjne dwuwymiarowe (2D) modele hodowli komórkowych są łatwe w obsłudze, szybko hodowane i wysoce powtarzalne, składają się tylko z szybko proliferujących klonów komórek rakowych i nie odzwierciedlają heterogeniczności komórkowej występującej w nowotworach10,11,12. W podobny sposób, transgeniczne modele myszy również nie uwzględniają biologii ludzkiego nowotworu ze względu na niską heterogeniczność genetyczną wynikającą z chowu wsobnego, znaczące różnice w układzie odpornościowym i złożoność histologiczną13,14. Ze względu na takie ograniczenia terapie opracowane na podstawie klasycznych modeli nowotworów często nie przekładają się na warunki kliniczne.

Modele nowotworów pochodzące od pacjentów, takie jak ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów i organoidy pochodzące od pacjentów, mogą rozwiązać problemy konwencjonalnych modeli raka, rejestrując cechy molekularne guza in-situ, tło genetyczne i organizację komórkową10,11,15. Jednak takie ksenoprzeszczepy i organoidy pochodzące od pacjentów wymagają skomplikowanych procedur wszczepienia i długiego czasu hodowli16,17. W połączeniu z różnicami w miejscach pozyskiwania i pobierania próbek guza oraz słabą wydajnością w krioprezerwacji, istnieje potrzeba opracowania modeli, które działają jako pomost między klasycznymi hodowlami komórek 2D a modelami nowotworów pochodzącymi od pacjentów11,18. W związku z tym modele 3D hodowli komórkowych mogą służyć jako modele, które można szybko hodować i uchwycić ważne cechy guza in vivo, takie jak interakcja komórka-komórka, interakcja komórka-ECM, niedotlenienie, angiogeneza i produkcja ECM19,20.

3D modele hodowli komórkowych są podzielone na systemy modeli bez rusztowań i oparte na rusztowaniach. W systemach bez rusztowań komórki są indukowane do samozagregowania w kulisty kształt za pomocą specjalnych płytek do hodowli komórkowych o niskim stopniu przylegania lub poprzez manipulowanie parametrami fizycznymi metod hodowli. Sprawdzone metody uzyskiwania sferoid 3D bez rusztowań obejmują zarówno proste hodowle granulek komórkowych przez wirowanie, jak i wiszące krople mikropłytek, lewitację magnetyczną oraz dynamiczne bioreaktory i systemy mikroprzepływowe20,21. Hodowle komórkowe 3D na bazie rusztowań są tworzone przez dodanie rusztowań na bazie polimerów lub hydrożeli w celu imitacji fizjologicznej macierzy zewnątrzkomórkowej19,22. Takie modele mają ogromny potencjał do modelowania in vivo organizacji komórek, topologii, przyłączania macierzy, migracji i reakcji na leki.

Oprócz manipulacji rusztowaniami dla modeli kompozycji ECM w stanach chorobowych, hodowle komórek 3D mogą być również używane do modelowania heterogenicznych populacji komórkowych w TME. 3D hodowle komórkowe złożone z komórek nowotworowych i fibroblastów zrębu lub komórek śródbłonka zostały wykorzystane do badania interakcji raka i indywidualnych linii komórkowych niebędących nowotworami23,24, 25. Powtarzalne i opłacalne metody rozszerzania takich hodowli komórkowych 3D składających się z wielu heterogenicznych linii komórkowych pomogłyby naukowcom wyjaśnić progresję nowotworu. W tym miejscu przedstawiamy metody hodowli wielokomórkowych kultur 3D nabłonkowo-zrębowych w celu zbadania proliferacji, inwazji i plastyczności stanu komórki. Protokół opisuje wolne od rusztowań i oparte na rusztowaniach podstawnych hodowle 3D komórek raka piersi hodowane wspólnie z kombinacją komórek zrębu, począwszy od fibroblastów (BJ-5ta), komórek śródbłonka (Ea.hy926) i komórek podobnych do monocytów (THP-1). Rak piersi jest obecnie drugim najczęściej występującym nowotworem na świecie i najczęściej diagnozowanym nowotworem u kobiet w USA26. Zgon z powodu raka piersi jest w dużej mierze spowodowany przerzutowym i opornym na terapię charakterem choroby, ponieważ ogólne przeżycie bez przerzutów jest znacznie zmniejszone u pacjentek, u których zdiagnozowano agresywne podtypy raka piersi wzbogacone w HER2 i podstawnopodobne27. Opisane przez nas protokoły hodowli komórkowych 3D mogą pomóc w opracowaniu opłacalnych, szybkich i powtarzalnych metod hodowli, które można połączyć z metodami konserwacji tkanek zatopionych w parafinie utrwalonym w formalinie i późniejszymi zastosowaniami biologii przestrzennej.

Protokół

1. Pożywka do hodowli komórkowych

UWAGA: Przygotuj wszystkie media w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Aby przygotować pożywkę do hodowli komórkowych dla BJ-5ta, BT474, EA.hy926 i MDA-MB-468, uzupełnij 500 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy z 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną za pomocą pipety. Dodać 0,1% gentamycyny za pomocą mikropipety.
  2. Aby przygotować pożywkę do hodowli komórkowych dla MCF10A, należy uzupełnić 500 ml DMEM/F12 5% surowicy końskiej i 1% penicyliny-streptomycyny za pomocą pipety. Za pomocą mikropipety dodaj 0,1% gentamycyny, 1 ml 1 μg/ml hydrokortyzonu, 500 μl 10 μg/ml insuliny, 50 μl 100 ng/ml toksyny i 10 μl naskórkowego czynnika wzrostu 20 ng/ml za pomocą mikropipety.
  3. Aby przygotować pożywkę do hodowli komórkowych dla MCF10Ca1h, należy uzupełnić 500 ml DMEM/F12 5% surowicą końską i 1% penicyliną-streptomycyną za pomocą pipety. Dodać 0,1% gentamycyny za pomocą mikropipety.
  4. Aby przygotować pożywkę do hodowli komórkowych dla THP-1, uzupełnij pipetą 500 ml RPMI 1640 z 10% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną. Dodać 0,1% gentamycyny za pomocą mikropipety.
  5. Zmieniaj pożywkę do hodowli komórkowych co 2-3 dni dla BJ-5ta, BT474, EA.hy926, MDA-MB-468, MCF10A i MCF10Ca1h, aż komórki osiągną 70-80% konfluencji, oceniając ich wzrost codziennie za pomocą mikroskopu jasnego pola. Zmieniaj pożywkę do hodowli komórkowych raz w tygodniu dla komórek THP-1.
  6. Hoduj komórki BJ-5ta, BT474, EA.hy926, MDA-MB-468, MCF10A i MCF10Ca1h na 100-milimetrowych szalkach z powierzchniami poddanymi działaniu kultur komórkowych w standardowych inkubatorach do hodowli komórkowych z 5% CO2 .
  7. Hoduj komórki THP-1 w kolbach poddanych działaniu kultur komórkowych T75 w standardowych inkubatorach do hodowli komórkowych z 5% CO2 .

2. Kolekcja komórek

  1. Włącz światło UV, aby zdezynfekować wnętrze szafy bezpieczeństwa biologicznego przez 15 minut.
  2. Otwórz skrzydło okienne szafy bezpieczeństwa biologicznego, aby ustabilizować przepływ powietrza i włącz system aspiracji próżniowej.
  3. Oczyść wewnętrzną powierzchnię okapu i rurki systemu zasysania próżniowego 70% etanolem.
  4. Przygotuj świeżą, pozbawioną surowicy pożywkę do hodowli komórkowych w komorze bezpieczeństwa biologicznego: uzupełnij 500 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy 1% penicyliną/streptomycyną za pomocą pipety. Dodać 0,1% gentamycyny za pomocą mikropipety.
  5. Ogrzej pożywkę do hodowli komórkowej, sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i trypsynę-EDTA (0,25%) do 37 °C, umieszczając przedmioty w kąpieli perełkowej przed rozpoczęciem eksperymentu.
  6. Upewnij się, że komórki są zlewane w 70-80% poprzez oględziny pod mikroskopem.
  7. Odessać i wyrzucić pożywkę hodowlaną z posianych komórek za pomocą aspiratora próżniowego. Umyj pozostałą pożywkę raz 2 ml PBS za pomocą pipety, a następnie odessać i wyrzucić PBS za pomocą aspiratora próżniowego.
    UWAGA: Komórki THP-1 są hodowane w zawiesinie; Kroki 2.7-2.9 można pominąć.
  8. Dodać 1 ml trypsyny do naczynia do hodowli komórkowych za pomocą mikropipety i umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C na 5 minut.
  9. Dezaktywuj trypsynę, dodając 1 ml inhibitora trypsyny sojowej (w 1x PBS) do płytki za pomocą mikropipety. Zdyspergować klastry komórek, pipetując płynną mieszaninę za pomocą mikropipety P1000 i zebrać zawiesinę komórek z dna płytki. Przenieść zawiesinę komórek za pomocą mikropipety do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 100 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzucić supernatant za pomocą aspiratora próżniowego.
  10. Kontynuuj liczenie komórek.

3. Przygotowanie roztworu barwnika roboczego i komórek barwiących w zawiesinie

  1. Przed otwarciem fiolki z molekularnymi sondami fluorescencyjnymi do śledzenia komórek (patrz Tabela materiałów), należy pozostawić produkt do ogrzania do temperatury pokojowej przez 15 minut w kąpieli perełkowej ustawionej na 37 °C.
  2. Za pomocą mikropipety rozpuścić liofilizowany niebieski barwnik do śledzenia komórek (masa = 5 mg, masa cząsteczkowa = 209,6 g/mol) do końcowego stężenia 10 mM w 2,385 ml DMSO.
  3. Rozpuścić liofilizowany pomarańczowy barwnik do śledzenia komórek (masa = 50 μg, masa cząsteczkowa = 550,4 g/mol) do końcowego stężenia 10 mM w 9,084 μl DMSO za pomocą mikropipety.
  4. Rozpuścić liofilizowany barwnik głębokiej czerwieni cell tracker (masa = 15 μg, masa cząsteczkowa = 698,3 g/mol) do końcowego stężenia 1 mM za pomocą 20 μl DMSO za pomocą mikropipety.
  5. Przygotować roztwór niebieskiego barwnika do śledzenia komórek roboczych (5 μM), rozcieńczając 1 μl barwnika w 2 ml pożywki DMEM bez surowicy za pomocą mikropipety.
  6. Przygotować roztwór pomarańczowej pożywki barwiącej do śledzenia komórek roboczych (5 μM), rozcieńczając 1 μl barwnika w 2 ml pożywki DMEM bez surowicy za pomocą mikropipety.
  7. Przygotować roztwór pożywki z barwnikiem w kolorze głębokiej czerwieni (1 μM) do śledzenia komórek roboczych, rozcieńczając 2 μl barwnika w 2 ml pożywki DMEM bez surowicy za pomocą mikropipety.
  8. Ponownie zawiesić komórki nabłonkowe, fibroblasty BJ-5ta i komórki śródbłonka Ea.hy926 w przygotowanych roztworach pożywki barwiącej w kolorze niebieskim, pomarańczowym i ciemnoczerwonym (2 ml) odpowiednio w mikropipecie.
  9. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 30 minut.
  10. Po 30 minutach inkubacji odwirować probówki o sile 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Odessać i wyrzucić supernatant za pomocą aspiratora próżniowego, a następnie dokładnie zawiesić granulki w 1 ml 10% pożywki DMEM zawierającej surowicę FBS za pomocą mikropipety.
  12. Kontynuuj liczenie komórek.

4. Liczenie komórek

  1. Zebrać 10 μl zawiesiny komórek i przenieść ją do mikroprobówki za pomocą mikropipety.
  2. Wymieszać z 10 μl błękitu trypanowego i dokładnie odpipetować.
  3. Przenieść 20 μl roztworu trypanu komórkowego za pomocą mikropipety do szkiełka w komorze zliczania komórek. Wstaw i policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek.
  4. Oblicz średnią całkowitą liczbę komórek na żywo na podstawie dwóch odczytów.

5. Obliczenia

  1. Przygotuj robocze zapasy komórek dla każdego typu komórek w stężeniu 6,67 × 103 komórki/ml, co odpowiada 2,000 komórek/300 μL.
    UWAGA: Całkowita wielkość zapasów będzie zależeć od wielkości próby eksperymentalnej.
  2. W przypadku sferoid z monokulturą należy upewnić się, że każda niezależna próbka składa się z 300 μl materiału roboczego komórek nabłonka, co odpowiada 2 000 komórek nabłonka.
  3. W przypadku sferoid z jednoczesnej hodowli (dwa typy komórek) należy upewnić się, że każda niezależna próbka składa się ze 150 μl materiału roboczego komórek nabłonka i 150 μl materiału roboczego komórek zrębu. Próbka będzie zawierała 1000 komórek nabłonkowych i 1000 komórek zrębu.
  4. W przypadku sferoid z kohodowli (trzy typy komórek) upewnij się, że każda niezależna próbka składa się ze 150 μl materiału roboczego komórek nabłonkowych, 75 μl materiału roboczego komórek zrębu #1 i 75 μl materiału roboczego komórki zrębu #2. Próbka będzie zawierała 1,000 komórek nabłonkowych, 500 komórek zrębu materiału roboczego #1 i 500 komórek zrębu materiału roboczego #2.

6. Poszycie

  1. Przenieść wymaganą objętość za pomocą mikropipety dla trzech kontrprób technicznych oraz jednej dodatkowej do mikroprobówki. Dokładnie wymieszać pipetą, a następnie przenieść 300 μl próbki do dołka na 96-dołkowej mikropłytce z dnem w kształcie litery U, o bardzo niskim nasadce.
  2. Powtórz ten proces dla każdej dodatkowej repliki technicznej.
  3. Umieścić 96-dołkową płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C.

7. Obrazowanie w jasnym polu

  1. Obserwuj wzrost i morfologię sferoidów co 24 godziny do 96 godzin za pomocą mikroskopu.
  2. Obrazowanie sferoid za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym.

8. Konfiguracja protokołu obrazowania szerokokątnego dla sferoid barwionych barwnikami śledzącymi i sferoid pokrytych ekstraktem z błony podstawnej

  1. Włącz urządzenia do obrazowania i automatyczne inkubatory wymienione w Tabeli materiałów, a następnie utwórz nowy protokół obrazowania w menedżerze zadań oprogramowania do obrazowania. Na karcie Procedura ustaw nastawę temperatury automatycznego inkubatora na 37 °C i pozwól inkubatorowi zrównoważyć CO2% i temperaturę, zanim przejdziesz do następnego kroku.
    UWAGA: Można użyć alternatywnego imagera fluorescencyjnego, jeśli ma on odpowiednie filtry dla każdego z użytych barwników (niebieskiego, ciemnoczerwonego i pomarańczowego).
  2. Ustaw ustawienia obrazu zgodnie z następującymi specyfikacjami: Powiększenie: 4x faza PL FL, pole widzenia: 3185 x 3185 μm, pełne WFOV.
  3. Użyj następujących specyfikacji dla kanałów: DAPI: 377/447 nm, oświetlenie = 10, czas integracji = 107 ms, wzmocnienie = 10, zapytanie ofertowe: 531/593 nm, oświetlenie = 10, czas integracji = 137 ms, wzmocnienie = 10, CY5: 628/685 nm, oświetlenie = 10, czas całkowania = 137 ms, wzmocnienie = 10.
  4. Do obrazowania sferoid w nakładce roztworu ekstrakcyjnego błony podstawnej należy użyć następujących specyfikacji jasnego pola: oświetlenie = 10, czas integracji = 5 ms i wzmocnienie = 17,1.
  5. Wybierz żądane studnie do obrazowania i zatwierdź zmiany specyfikacji, klikając ikonę wyboru studni.
  6. Przejdź do zakładki Redukcja danych, aby dostosować ustawienia analizy komórkowej.
  7. Ustaw wartość progową na 19 500 z jasnym tłem i wybierz opcję Wypełnij w maskach.
  8. W przypadku wyboru obiektu ustaw minimalny rozmiar obiektu na 100 μm, a maksymalny rozmiar obiektu na 1 000 μm, a następnie wybierz opcję Analizuj cały obraz.
    UWAGA: Do tej analizy potrzebna jest tylko maska podstawowa i liczba obiektów.
  9. Zapisz wszystkie zmiany i otwórz aplikację imager.
  10. Umieść eksperymentalną mikropłytkę z dnem w kształcie litery U w inkubatorze, otwierając szufladę, a następnie zamknij ją za pomocą oprogramowania imagera.
  11. Aby uruchomić protokół, kliknij kartę Informacje o procedurze, dodaj użytkownika i wybierz protokół.
  12. Upewnij się, że wybrano właściwy typ płytki i ustaw czas obrazowania na 30 minut na płytkę.
  13. Wybierz żądany interwał obrazowania, wskaż, czy płytka ma pokrywę, a następnie dostosuj czas rozpoczęcia i czas trwania obrazowania.
  14. Kliknij przycisk Zaplanuj płytę/naczynie, aby rozpocząć proces obrazowania.

9. Nakładka z roztworem ekstrakcyjnym z membrany podstawnej (opcjonalnie)

UWAGA: Roztwór ekstraktu z błony podstawnej może być stosowany do sferoid 24 godziny po poszyciu.

  1. Napełnij wiadro na lód lodem, aby roztwór ekstraktu z błony podstawnej był zimny i przechowuj go w temperaturze 4 °C, gdy nie jest używany.
  2. Odessać około 170 μl pożywki za pomocą pipety wielokanałowej.
  3. Użyj szkła powiększającego i mini lightboxa, aby dokładnie obserwować małe sferoidy. Umieść 96-dołkową płytkę sferoidalną nad lightboxem i umieść lupę nad głową.
  4. Ustaw pipetę P200 na 30 μl i zbierz ekstrakt z błony podstawnej, aby utworzyć trzy mikrokropelki.
  5. Dodać jedną mikrokroplę do każdej sferoidy z trzech kontrprób technicznych za pomocą mikropipety.
  6. Upewnij się, że 96-dołkowa płytka jest płaska i ustaw pipetę pionowo nad sferoidą. Uwolnij kroplę bez dotykania dna studzienki.
  7. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 20 minut.
  8. Na sferoidy nałożyć dodatkowe 50 μl roztworu ekstrakcyjnego z błony podstawnej na studzienkę za pomocą mikropipety.
  9. Zmień położenie sferoid na środek studzienki za pomocą końcówki pipety.
  10. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  11. Do każdego dołka dodać 100 μl pożywki do hodowli komórkowych.

10. Kwantyfikacja

  1. Pobierz i otwórz oprogramowanie ImageJ. Prześlij obrazy sferoidów.
  2. Ustaw pomiary, klikając Analizuj | Ustaw Measurements (Wymiary) i wybierz opcję Area (Obszar) | Środek ciężkości. Zmierz sferoidy za pomocą narzędzia lasso, aby narysować sferoidę i zmierzyć obiekt.
  3. Zapisać wartości dla trzech kontrprób biologicznych i obliczyć średnią powierzchnię i kołowość.
  4. Przelicz obszar z pikseli na metry kwadratowe, korzystając z następującego wzoru:
    Powierzchnia (m2) = ((550/504) × √ (powierzchnia w pikselach)) 2
  5. Analizowanie danych.
    1. Wybierz pozycję Wprowadź wartości replikacji skumulowane w kolumnach.
    2. Wprowadź dane do kolumn i wybierz próbki sferoidów z monokulturą kontrolną i próbki sferoidów z kokulturą.
    3. Wykonaj jednoczynnikową analizę kolumn ANOVA.
  6. Użyj następujących parametrów ANOVA:
    1. Unikaj dopasowywania lub parowania.
    2. Załóżmy, że reszt ma rozkład Gaussa.
    3. Załóżmy, że odchylenia standardowe są równe.
    4. Użyj testu wielokrotnego porównania Tukeya, aby porównać średnią z każdej kolumny ze średnią każdej innej kolumny.

11. Przetwarzanie obrazu immunofluorescencyjnego w szerokim polu

  1. Zapisz obrazy bezpośrednio z oprogramowania imager w formacie PNG lub Tiff.
  2. Wybierz każdy kanał z osobna lub nakładające się kanały i zapisz jako plik PNG.
  3. Dostosuj jasność i kontrast w oprogramowaniu imagera lub w ImageJ, jeśli obrazy są eksportowane jako pliki TIFF.

Wyniki

W niniejszym badaniu opracowano system hodowli komórkowej do generowania heteromultikomórkowych sferoidów 3D składających się z komórek nabłonkowych i zrębu o morfologii przypominającej organoidy. Sferoidy tworzono poprzez wysiew 2 000 komórek nabłonkowych w warunkach monokultury. W warunkach kokultury dwóch typów komórek sferoidy tworzono poprzez wysiew 1 000 komórek nabłonkowych i 1 000 komórek zrębu. W warunkach kokultury trzech typów komórek sferoidy tworzono poprzez wysiew 1 000 komórek nabłonkowych oraz dwóch różnych typów komórek zrębu po 500 komórek każdego typu. Przed utworzeniem sferoidów komórki można barwić fluorescencyjnymi barwnikami do śledzenia komórek, co umożliwia monitorowanie przestrzennej organizacji komórkowej. Po 24 h od początkowego formowania sferoidów możliwe są dalsze zastosowania, obejmujące perturbacje farmakologiczne, obrazowanie oraz pobieranie próbek. Obrazowanie poklatkowe jest przydatne do oceny zmian w zachowaniu i morfologii sferoidów, w tym ich pola powierzchni i kolistości (Rycina 1A). W 24 h po wysiewie sferoidy można osadzić w rusztowaniu, a obrazowanie poklatkowe może służyć do oceny pojawienia się struktur inwazyjnych wychodzących ze sferoidu (Rycina 1B). Pobieranie próbek heteromultikomórkowych sferoidów znajduje wiele zastosowań, w tym profilowanie genomowe i proteomiczne na poziomie globalnym i pojedynczych komórek za pomocą technik eksperymentalnych, takich jak sekwencjonowanie RNA, sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek, sekwencjonowanie proteomiczne oraz cykliczna immunofluorescencja.

Proces tworzenia sferoidów: mieszanie komórek stropowych/nabłonkowych, mikroskopia, analiza, sekwencjonowanie RNA.
Rysunek 1: Schematyczny opis procesu hodowli komórkowej 3D i potencjalnych zastosowań. (A) Zawiesina komórkowa składająca się z komórek nabłonkowych i niestropowych komórek stropowych jest pipetowana do płytek 3D o ultraniskiej adhezji w celu utworzenia sferoidów. Sferoidy są obrazowane za pomocą mikroskopii w jasnym polu co 24 h przez okres 96 h. Linie komórkowe mogą zostać przebarwione fluorescencyjnymi barwnikami do śledzenia komórek przed indukcją tworzenia sferoidów w celu późniejszej mikroskopii szerokopolowej lub mogą zostać poddane perturbacjom farmakologicznym po utworzeniu sferoidów. Analizie mogą zostać poddane parametry sferoidów, takie jak morfologia, powierzchnia, kołowość i organizacja. (B) Sferoidy z samych komórek nabłonkowych oraz sferoidy z komórek nabłonkowych i stropowych są tworzone zgodnie z protokołem z punktu A. Sferoidy tworzono poprzez wysiew 2 000 komórek nabłonkowych w warunkach monokultury. W warunkach kokultury dwóch typów komórek sferoidy tworzono poprzez wysiew 1 000 komórek nabłonkowych i 1 000 komórek stropowych. W warunkach kokultury trzech typów komórek sferoidy tworzono poprzez wysiew 1 000 komórek nabłonkowych i dwóch różnych typów komórek stropowych po 500 komórek każdego typu. Po 24 h naniesiono roztwór ekstraktu z błony podstawnej pełniący rolę rusztowania, a obrazy rejestrowano w mikroskopii w jasnym polu co 24 h przez 120 h. (C) Ustanowione bezrusztowianowe i rusztowianowe heter wielokomórkowe hodowle 3D mogą być wykorzystywane w wielu zastosowaniach, takich jak cykliczna immunofluorescencja, sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek oraz proteomika pojedynczych komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Sferoidy monokulturowe MCF10A, MCF10Ca1h oraz BT-474 zachowują zwarty, sferyczny fenotyp do 96 h po wysianiu. W przypadku kokultury z mikro naczyniowymi komórkami śródbłonkowymi EA.hy926, fibroblastami BJ-5ta i/lub komórkami przypominającymi monocyty THP-1, sferoidy wytworzyły wypustki komórkowe na obwodzie, które stały się bardziej wyraźne po 96 h (Rysunek 2A-C). Co istotne, wypustki te, zjawiska pączkowania oraz zagęszczania sferoidów reprezentują warianty organizacji komórkowej sferoidu nowotworowego i kokultywowanych komórek zrębu, które korelowały z inwazywnością w 3D po dodaniu hydrożelu opartego na błonie podstawnej, takiego jak Matrigel. Morfologia pączkowania obejmowała zarówno lite, jak i luźne agregaty komórkowe, przypominające morfologię organoidów. W przeciwieństwie do nich, sferoidy monokulturowe MDA-MB-468 jawiły się jako duże, luźne agregaty komórkowe. Jednakże, gdy komórki MDA-MB-468 były hodowane w kokulturze z EA.hy926, BJ-5ta i/lub THP-1, tworzyły one zwarte sferoidy (Rysunek 2D).

Wzrost hodowli komórkowych w czasie; obraz z mikroskopu; MCF7, MCF10A, BF24, MDA-MB-468; analiza badawcza.
Rysunek 2: Zakres architektur i morfologii przyjmowanych przez kombinacje nieepithelialnych komórek zialnych w połączeniu z epitelnymi komórkami nowotworowymi/nienowotworowymi w bezrusztowianowych kulturach 3D. Reprezentatywne obrazy w jasnym polu sferoidów (A) MCF10A, (B) MCF10Ca1h, (C) BT-474, (D) MDA-MB-468 w monokulturze lub w warunkach kokultury z fibroblastami BJ-5ta/mikronaczyniowymi komórkami śródbłonka Ea.hy926 lub komórkami Ea.hy926/THP-1 przypominającymi monocyty lub komórkami BJ-5ta/THP-1 w ciągu 96 h. Każdy sferoid został uformowany poprzez wysianie 2 000 komórek. Sferoidy w warunkach monokultury zostały uformowane przy użyciu 2 000 komórek nabłonkowych. Sferoidy w warunkach kokultury zostały uformowane przy użyciu 1 000 komórek nabłonkowych oraz dwóch różnych typów komórek zialnych po 500 komórek każdego rodzaju. Formowanie struktur przypominających organoidy z pączkowaniem lub agregacją rozpoczęło się w warunkach kokultury sferoidów 24 h po wysianiu w komórkach nabłonkowych MCF10A, MCF10Ca1h i BT-474. Zagęszczenie komórek MDA-MB-468 zaobserwowano w warunkach kokultury sferoidów 25 h po wysianiu. Paski skali = 100 µm. Skrót: hpp = godziny po wysianiu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

W 72 h po wysiewaniu komórki MCF10A, MCF10Ca1h i BT-474 w ko-kulturze z EA.hy926 i THP-1 lub z BJ-5ta i THP-1 wykazały znaczący wzrost powierzchni sferoidów w porównaniu do sferoidów nabłonkowych w monokulturze. MCF10Ca1h wykazały również znaczący wzrost powierzchni sferoidów w ko-kulturze z EA.hy926 i BJ-5ta. Pojawienie się struktur pączkujących w sferoidach w ko-kulturze doprowadziło do znaczącego spadku kolistości sferoidów dla MCF10A, MCF10Ca1h i BT-474 w ko-kulturze z EA.hy926 i THP-1 lub z BJ-5ta i THP-1. Podobne efekty zaobserwowano dla BT-474 w ko-kulturze z EA.hy926 i BJ-5ta (Rycyna 3A,B). W przeciwieństwie do nich, komórki MDA-MB-468 w ko-kulturze z EA.hy926 i BJ-5ta, EA.hy926 i THP-1 lub BJ-5ta i THP-1 wykazały znaczący spadek powierzchni sferoidów w porównaniu do sferoidów MDA-MB-468 w monokulturze; nie odnotowano jednak wpływu na kolistość (Rycyna 3A,B).

Analiza powierzchni i kolistości sferoidów; wykresy słupkowe dla różnych składów; porównanie statystyczne.
Rycina 3: Wykresy analizy powierzchni i kolistości monokultur oraz heteromultikomórkowych kultur zrębowych 3D bez rusztowania 72 h po wysiewaniu. (A) Średnia powierzchnia (cm2) i (B) średnia kolistość linii MCF10A, MCF10Ca1h, BT-474 oraz MDA-MB-468 w monokulturach i heteromultikomórkowych kulturach sferoidów zrębowych 72 h po wysiewaniu. Przedstawione dane są reprezentatywne dla co najmniej trzech niezależnych powtórzeń biologicznych i są podane jako średnie z powtórzeń technicznych ± SEM, o ile nie wskazano inaczej. *, **, *** lub **** oznaczają wartości p odpowiednio < 0,05, 0,01, 0,001 lub 0,0001, chyba że zaznaczono inaczej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Zastosowanie barwnika do śledzenia komórek w gujotwórczych komórkach nabłonkowych BT-474 oraz komórkach zrębowych przed utworzeniem sferoidów wykazało, że komórki zrębowe, w tym EA.hy926 i BJ-5ta, tworzyły struktury pączkujące na obwodzie centralnych sferoidów BT-474 (Rycina 4, Wideo dodatkowe S1, Wideo dodatkowe S2, Wideo dodatkowe S3 oraz Wideo dodatkowe S4). 48 h po wysiewaniu pojedyncze obrazy fluorescencyjne sferoidów w szerokim polu, współhodowanych z fibroblastami, ujawniły, że sferoidy fibroblastów współlokalizowały z komórkami śródbłonka, ale nie współlokalizowały z sferoidami BT-474. Stwierdzono również, że niewielka część komórek śródbłonka współlokalizuje z sferoidami BT-474 w warunkach współhodowli. Sugeruje to, że rozmieszczenie komórek zrębowych wewnątrz sferoidu jest skorelowane z morfologią przypominającą organoidy.

Mikroskopia fluorescencyjna komórek BT-474 z BJ-5ta i EA.hy926, pokazująca interakcje komórkowe.
Rysunek 4: Statyczne obrazy z szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej różnie barwionych komórek BT-474 i komórek zrębu w heteromultikomórkowych kulturach 3D w 48 h po wysiewaniu. Sferoidy BT-474 są barwione niebieskim fluorescencyjnym barwnikiem cell tracker. Fibroblasty BJ-5ta są barwione pomarańczowym barwnikiem cell tracker, przedstawionym w kolorze czerwonym. Komórki śródbłonka Ea.hy926 są barwione ciemnoczerwonym barwnikiem cell tracker, przedstawionym w kolorze zielonym. Każdy sferoid został utworzony poprzez wysianie 2 000 komórek. Sferoidy w warunkach monokultury utworzono przy użyciu 2 000 komórek nabłonkowych. Sferoidy w warunkach kokultury (BT-474/BJ-5ta, BT-474/Ea.hy926) utworzono przy użyciu 1 000 komórek nabłonkowych i 1 000 komórek zrębu. Sferoidy w warunkach podwójnej kokultury (BT-474/BJ-5ta/Ea.hy926) utworzono przy użyciu 1 000 komórek nabłonkowych i 500 komórek każdego typu komórek zrębu. Rysunki są reprezentatywne dla co najmniej trzech powtórzeń biologicznych. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Aby ocenić istotność biologiczną naszego modelu sferoid organoidowych, 24 h po wysianiu sferoidy przykryto roztworem ekstraktu z błony podstawnej. Sferoidy monokulturowe BT-474 nie wykazały właściwości inwazyjnych 120 h po wysianiu. Jednak sferoidy BT-474 w ko-kulturze z BJ-5ta lub EA.hy926 wytworzyły struktury na obwodzie sferoidy, które naciekały do środowiska z ekstraktu z błony podstawnej stanowiącego rusztowanie. Liczba i długość tych wypustek były znacznie zwiększone w sferoidach BT-474 w ko-kulturze z BJ-5ta i EA.hy926 w czasie od 48 h do 120 h po wysianiu (Rycina 5, Wideo uzupełniające S5, Wideo uzupełniające S6, Wideo uzupełniające S7 oraz Wideo uzupełniające S8).

Test żywotności komórek z obrazami sferoidów i wykresami słupkowymi dla porównania proliferacji, wyniki mikroskopowe.
Rycina 5: Zdjęcia w polu jasnym komórek BT-474 w heterowielokomórkowych kulturach 3D z nałożonym roztworem ekstraktu błony podstawnej 5 dni po nałożeniu. Każda sferoida została utworzona poprzez wysianie 2 000 komórek. Roztwór ekstraktu błony podstawnej nałożono na sferoidy 24 h po wysianiu. Sferoidy w warunkach monokultury utworzono z 2 000 komórek nabłonkowych. Sferoidy w warunkach kokultury (BT-474/BJ-5ta i BT-474/Ea.hy926) utworzono z 1 000 komórek nabłonkowych i 1 000 komórek zmarzlinowych. Sferoidy w warunkach podwójnej kokultury (BT-474/BJ-5ta/Ea.hy926) utworzono z 1 000 komórek nabłonkowych i 500 komórek każdego typu komórek zmarzlinowych. (A) W warunkach kokultury można zaobserwować struktury inwazyjne wystające ze sferoidy nowotworowej zanurzonej w roztworze ekstraktu błony podstawnej. (B) Ocena liczby wypustek inwazyjnych w czasie 48 hpp. (C) Ocena długości wypustek inwazyjnych w czasie 48 hpp. Ryciny są reprezentatywne dla co najmniej trzech powtórzeń biologicznych. Pasek skali = 200 µm. Skrót: hpp = godziny po wysianiu. Aby zobaczyć większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Film uzupełniający S1: Sferoid z monokultury BT-474 z barwnikiem cell tracker blue. Komórki BT-474 (2 000) zawieszono w mikropłytce 96-dołkowej o dnie w kształcie litery U i ultra-niskim przytwieraniu w celu utworzenia sferoidów. Przez okres 48 h rejestrowano nakładające się obrazy w jasnym polu oraz fluorescencyjne w szerokim polu. Skrót: ULA = ultra-niskie przytwieranie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo uzupełniające S2: Sferoidy BT-474 w koulturze z fibroblastami BJ-5ta. Komórki BT-474 (1 000) oraz 1 000 fibroblastów BJ-5ta zawieszono ponownie w płytkach ULA w celu utworzenia sferoidów. Komórki BT-474 inkubowano z barwnikiem Cell Tracker Blue, a fibroblasty BJ-5ta z barwnikiem Cell Tracker Orange. Przez 48 h rejestrowano nakładające się obrazy z mikroskopii w polu jasnym oraz fluorescencji w szerokim polu (niebieski = BT-474, czerwony = BJ-5ta). Skrót: ULA = ultralow attachment (bardzo niska adhezja). Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo uzupełniające S3: Sferoidy BT-474 w ko-kulturze z komórkami śródbłonka Ea.hy926. Komórki BT-474 (1 000) oraz 1 000 komórek śródbłonka Ea.hy926 zawieszono ponownie w płytkach ULA w celu utworzenia sferoidów. Komórki BT-474 inkubowano z barwnikiem CellTracker Blue, a komórki śródbłonka Ea.hy926 z barwnikiem CellTracker Deep Red. Przez 48 h rejestrowano nałożone na siebie obrazy w świetle jasnym oraz fluorescencyjne w szerokim polu (niebieski = BT-474, zielony = Ea.hy926). Skrót: ULA = ultralow attachment (bardzo niska adhezja). Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo uzupełniające S4: Sferoidy BT-474 w ko kulturze z fibroblastami BJ-5ta i komórkami śródbłonka Ea.hy926. Komórki BT-474 (1 000), 500 fibroblastów BJ-5ta oraz 500 komórek śródbłonka Ea.hy926 zawieszono ponownie w płytkach ULA w celu utworzenia sferoidów. Komórki BT-474 inkubowano z barwnikiem Cell Tracker Blue. Fibroblasty BJ-5ta oraz komórki śródbłonka Ea.hy926 inkubowano odpowiednio z barwnikami Cell Tracker Orange oraz Deep Red. Przez 48 h rejestrowano nałożone na siebie obrazy w świetle białym i fluorescencyjne w szerokim polu (niebieski = BT-474, czerwony = BJ-5ta, zielony = Ea.hy926). Skrót: ULA = ultraniska adhezja. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo dodatkowe S5: Sferoidy z monokultury BT-474 w roztworze ekstraktu z błony podstawnej. Komórki BT-474 (2 000) resuspendowano na płytkach ULA w celu utworzenia sferoidów, a sferoidy osadzono w roztworze błony podstawnej 24 h po wysiewaniu. Obrazy w jasnym polu rejestrowano przez 60 h. Skrót: ULA = ultraniska adhezja. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo uzupełniające S6: Sferoidy BT-474 w hodowli współdzielonej z fibroblastami BJ-5ta w roztworze ekstraktu z błony podstawnej. Komórki BT-474 (1 000) oraz 1 000 fibroblastów BJ-5ta resuspendowano w płytkach ULA w celu utworzenia sferoidów, a następnie sferoidy zatopiono w roztworze ekstraktu z błony podstawnej 24 h po wysiewaniu. Obrazy w jasnym polu rejestrowano w ciągu 60 h. Skrót: ULA = ultraniska adhezja. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo uzupełniające S7: Sferoidy BT-474 w koκulturze z komórkami endotelialnymi Ea.hy926 w roztworze ekstraktu z błony podstawnej. Komórki BT-474 (1 000) i 1 000 komórek endotelialnych Ea.hy926 resuspendowano w płytkach ULA w celu utworzenia sferoidów, a sferoidy osadzono w roztworze ekstraktu z błony podstawnej 24 h po wysianiu. Obrazy w świetle przechodzącym rejestrowano przez 60 h. Skrót: ULA = ultraniska adhezja. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo uzupełniające S8: Sferoidy BT-474 w hodowli współdzielonej z fibroblastami BJ-5ta i komórkami śródbłonka Ea.hy926 w roztworze ekstraktu błony podstawnej. BT-474 (1 000), 500 fibroblastów BJ-5ta oraz 500 komórek śródbłonka Ea.hy926 zawieszono ponownie w płytkach ULA w celu utworzenia sferoidów, a następnie sferoidy osadzono w roztworze ekstraktu błony podstawnej 24 h po wysianiu. Obrazy w jasnym polu rejestrowano przez 60 h. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

Nasz hetero-wielokomórkowy model sferoidalny pokazuje, że interakcje komórek nabłonkowo-zrębowych napędzają pączkowanie komórek zrębu w warunkach hodowli 3D bez rusztowań oraz tworzenie inwazyjnych struktur w warunkach hodowli 3D opartych na rusztowaniach. Zaobserwowaliśmy konsekwentne tworzenie się struktury pączkującej zarówno w rakotwórczych liniach komórkowych (MCF10Ca1h i BT-474), jak i w nierakotwórczej linii komórek nabłonkowych MCF10A (ryc. 2A-C). Co ciekawe, podczas gdy sferoidy z linii komórkowych MCF10A, MCF10Ca1h i BT-474, czy to w monokulturze, czy w kokulturze z fibroblastami i komórkami śródbłonka, tworzyły okrągłe i zwarte struktury pączkujące w środowiskach wolnych od rusztowań, sferoidy z linii komórkowej MDA-MB-468 wykazywały mniejsze zagęszczenie (Figura 2D). Było to nieoczekiwane, ponieważ przewidywano, że komórki MDA-MB-468 będą tworzyć okrągłe sferoidy, podobnie jak inne badane linie komórkowe nabłonka. Stwierdzono, że linia komórkowa SUM-149, hybrydowa nabłonkowo-mezenchymalna pierwotna linia komórkowa raka piersi, tworzy zwarte sferoidy, takie jak MCF10A, MCF10Ca1h i BT-474 (dane nie pokazane)28. Przyszłe badania powinny dotyczyć szlaków sygnałowych pośredniczących w tworzeniu mniej zwartych sferoid w linii komórkowej MDA-MB-468, ponieważ takie anomalie mogą wskazywać na podatność komórek, które można wykorzystać do opracowania nowych strategii terapeutycznych.

Jeśli chodzi o połączenie różnych linii komórkowych, komórki podobne do monocytów THP-1 indukują tworzenie luźnych struktur agregatowych we wszystkich warunkach kohodowli sferoidów. Mniejsze zagęszczenie obserwuje się w strukturach pączkujących w warunkach kohodowli z komórkami THP-1 / Ea.hy926 w porównaniu z tymi w warunkach kohodowli z komórkami THP-1 / BJ-5ta (Figura 2A-D). W związku z tym na zagęszczenie sferoid ma wpływ skład komórek zrębu w modelu29,30.

Niespójne posiewanie kombinacji heterokomórek może skutkować niepełnym rozwojem sferoidów lub zmiennością wielkości sferoidów w porównaniu z ich technicznymi kontrpróbami. Zapewnienie spójności posiewu komórek ma kluczowe znaczenie, ponieważ przestrzenne ułożenie komórek, które decyduje o fenotypie sferoidalnym i rozwoju, zachodzi przede wszystkim w ciągu pierwszych 48 godzin31 godzin. W tym krytycznym okresie proporcje komórek odgrywają kluczową rolę, a proporcja komórek zrębu wpływa zarówno na obszar sferoidalny, jak i na okrągłość.

Luźne agregaty sferoidalne, które są zależne od typu ogniwa, można łatwo rozmontować podczas ręcznej obsługi. Jednak ręczna manipulacja jest konieczna w przypadku nakładania sferoid na podobny do rusztowania roztworu ekstraktu z błony podstawnej lub podczas pobierania całych próbek sferoidów. Aby złagodzić ten problem, zaleca się pracę w wolniejszym tempie podczas pobierania sferoid za pomocą aspiracji pipet i zminimalizowanie obsługi ręcznej, gdy tylko jest to możliwe. Podczas nakładania roztworu ekstrakcyjnego błony podstawnej sferoidy są podatne na przesuwanie się w studni, często osiadając na krawędzi studni. Stosunek ekstraktu z błony podstawnej do roztworu do podłoża jest ważny dla utrzymania właściwości matrycy systemu 3D; Jednak sferoidy nie mogą być w pełni otoczone ze względu na lepkość roztworu ekstraktu z błony podstawnej, dlatego wymagana jest ręczna interwencja32. Niewyśrodkowane ustawienie sferoidów stanowi wyzwanie dla obrazowania, ponieważ załamanie światła w pobliżu plastikowej krawędzi studni może zakłócać klarowność obrazu.

Sferoidy użyte w tym badaniu składały się z ludzkich linii komórek rakowych; Opisane tutaj metody nie zostały jeszcze zastosowane do pierwszorzędowych linii komórkowych. Nasze wyniki sugerują, że określone interakcje komórka-komórka mogą napędzać tworzenie struktur podobnych do organoidów, co wskazuje na potencjalną przydatność tej metody do szerokiego zakresu rakotwórczych linii komórkowych. Jednakże, podczas gdy nasz model próbuje naśladować złożoność mikrośrodowiska guza, różne tempo proliferacji komórek stanowi wyzwanie dla długoterminowych badań33. Szybko proliferujące komórki mają tendencję do wyrastania z wolniej proliferujących, co sprawia, że model ten jest mniej odpowiedni do długotrwałych eksperymentów. Ponadto różne wymagania dotyczące typów pożywek wzrostowych dla linii komórkowych mogą wprowadzać dodatkowe czynniki, które mogą prowadzić do fenotypów sferoidalnych. Większość linii komórkowych w tym badaniu była hodowana w pożywkach DMEM. Badania z liniami komórkowymi hodowanymi na różnych podłożach mogą wymagać różnych warunków hodowli, testowania różnych proporcji pożywek; Efekt ten obserwuje się jednak w długoterminowych eksperymentach30.

Nasz model ma kilka zalet w porównaniu z innymi modelami 3D raka. Generowane przez nas sferoidy mają jednolitą i powtarzalną początkową morfologię i rozmiar, co ułatwia porównywanie wyników leczenia z kontrolnymi. Z kolei niektóre modele wykorzystujące pojedyncze komórki zawieszone w pożywkach lub rusztowaniach mogą powodować zmienne rozkłady przestrzenne komórek, co prowadzi do niespójności. Model ten pokazuje, że interakcje między różnymi populacjami komórek mogą być skutecznie badane.

Tradycyjnie, modele organoidowe i sferoidalne składały się z monokulturowych komórek rakowych lub kokultur komórek rakowych w celu zbadania gradientów składników odżywczych, niedotlenienia lub układu komórkowego34. Ponadto model ten może być badany w środowisku rusztowania w ciągu 24 godzin po poszyciu, co daje możliwość zbadania wczesnych zdarzeń inwazji napędzanych różnymi interakcjami komórka-komórka. Podczas gdy alternatywne podejścia do raka 3D wykorzystują różne komponenty macierzy rusztowania do badania zmian w morfologii sferoidalnej i inwazyjności, model ten uzupełnia je, umożliwiając badanie tych zmian w kontekście zarówno dynamiki populacji komórek, jak i składu rusztowania35.

Większość sferoid wytworzonych przy użyciu naszych metod zachowuje swoją integralność strukturalną po ręcznej obsłudze, co pozwala na pobieranie próbek w dalszych zastosowaniach. Konwencjonalne modyfikacje genetyczne, takie jak CRISPR-Cas9, lentiwirusowa transdukcja shRNA i interferencja siRNA, mogą być wprowadzane przed powstaniem sferoidów. Złożone zachowania obserwowane w tych sferoidach sugerują dynamiczne zmiany w ekspresji genów, które można dalej badać za pomocą sekwencji RNA. Zaawansowane techniki, takie jak CycIF, scRNA-seq, CosMx i Visium, mogą być również wykorzystywane do badania genomiki i proteomiki na poziomie przestrzennym lub pojedynczych komórek. Ten sferoidalny model ma potencjał do naśladowania badań in vivo nad celowanymi terapiami przeciwnowotworowymi poprzez wychwytywanie interakcji między zawiązkami komórek zrębu a środkami terapeutycznymi, zanim dotrą one do komórek rakowych. Jest to istotne, ponieważ może pomóc w ustaleniu, czy komórki zrębu wpływają na siłę działania leku, potencjalnie chroniąc komórki rakowe przed efektami terapeutycznymi.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy członkom Laboratorium Onkogenów Rozwojowych Uniwersytetu Baylor za ich pomocne uwagi i opinie podczas przygotowywania tego manuskryptu. Wsparcie finansowe zostało zapewnione przez Wydział Biologii Uniwersytetu Baylor oraz College of Arts and Sciences, NIH-NIGMS 2SC1GM121182 (dla J.A.K.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki wirówkowe z polipropylenu 15 ml   Sokół 14-959-53A 
96-dołkowa, poddana obróbce mikropłytka z dnem w kształcie litery U Thermo Scientific 12566432 
100 mm Powierzchnia poddana hodowli komórkowej naczynia Thermo Scientific 130182 
Inkubatory CO2 170 l VWRVWR51014991(10810902)
200 Samouszczelniające się barierowe końcówki do pipetFisher Scientific02-682-255
500 ml DMEM/Szynki F-12, [+] L-glutaminaCorning10-090-CV
1000 Samouszczelniające się barierowe końcówki do pipetMolecular Biology Products Inc.2179HR
Bezzwierzęcy rekombinowany ludzki EGFPeproTechAF-100-15
Automatyczny wzmacniacz pipet E3xEppendorf4987000410
Rozwiązanie membrany podstawnejHuntsman Cancer Institute https://healthcare.utah.edu/huntsmancancerinstitute/
do kąpieli z koralikami 
Biorender BiorenderBiorender.com 
Komory laminarne bezpieczeństwa biologicznego Thermo Scientific300590389
BioSpa 8 Agilent   
23082120 Licznik komórek InvitrogenAMQAF2000
Prowadnice do komory zliczania komórekThermo ScientificC10283
CellTracker Deep Red Thermo Fisher Naukowy C34565 
Wirówka Thermo Scientific 
Podjednostka B toksynySigma-AldrichC9903-1MG
Combitips zaawansowane, sterylne, 5,0 mlFisher Scientific13-683-714
Cytacja 10  Czytnik ImagerAgilent 
zdefiniowany inhibitor trypsyny Gibco R007100 inhibitor trypsyny sojowej w 1x PBS
Surowica dla konia dawcy, 500 ml, pochodzenie ze Stanów ZjednoczonychCorning35-030-CV
Zmodyfikowana pożywka orła firmy Dulbecco Corning 10-013-CV 
Oprogramowanie Excel Biuro Microsoft 365 
Płodowa surowica bydlęca Thermo Scientific 26140079 
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, pochodzenia amerykańskiegoThermo Scientific26140079
Siarczan gentamycyny, płynnyCorning30-005-CR
GraphPad Prism
Hydrokortyzon roztwór, 50 i mikro; M, sterylnie filtrowany, BioXtraSigma-AldrichH6909-10ML
Image J Oprogramowanie Fidżi https://imagej.net/ij/
Roztwór insuliny ludzkiSigma-AldrichI9278-5ML
Szkło powiększające Fisher Naukowy 01-182-392 
Probówka do mikrowirówek Costar 3621 
MikroskopOlympusCKX53SF
Mini Lightbox Fisher Naukowy 361044708 
Sondy molekularne CellTracker Niebieski barwnik CMAC Fisher Naukowy C2110 
Sondy molekularne CellTracker Pomarańczowy CMRA Barwnik Fisher Naukowy C34551 
Roztwór penicyliny-streptomycynyCytivaSV30010
roztwór penicyliny-streptomycyny Cytiva SV30010 
Mikroskop z kontrastem fazowym Echo 
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Fisher Naukowy SH3025601 
Kontroler pipetCorning4099
Pipeta 100 – 1,000 µ LEppendorf3123000063
Pipeta 20 – 200 µ LEppendorf3123000055
Pryzmat Oprogramowanie GraphPadhttps://www.graphpad.com/features
RPMI 1640 z L-glutaminą i 25 mM HEPESCorning10-041-CV
, 10 mlPipeta170356N
, 25 mlPipeta170357N
, 5 mlThermo Scientific170355N
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4% Corning 25900CI 
Trypsyna-EDTA, 0,25% Corning 25053CI 
Zbroja laboratoryjna 74300706Automatyczny inkubator 131006752105245https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excelRVSF1000 Pipeta serologiczna serologiczna Thermo Scientific serologiczna Thermo Scientific

Bibliografia

  1. de Visser, K. E., Joyce, J. A. The evolving tumor microenvironment: From cancer initiation to metastatic outgrowth. Cancer Cell. 41 (3), 374-403 (2023).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Anderson, N. M., Simon, M. C. The tumor microenvironment. Curr Biol. 30 (16), R921-R925 (2020).
  4. Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Commun Signal. 18 (1), 59(2020).
  5. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  6. Erdogan, B., Webb, D. J. Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis. Biochem Soc Trans. 45 (1), 229-236 (2017).
  7. Iozzo, R. V., Sanderson, R. D. Proteoglycans in cancer biology, tumour microenvironment and angiogenesis. J Cell Mol Med. 15 (5), 1013-1031 (2011).
  8. Amersfoort, J., Eelen, G. Immunomodulation by endothelial cells - partnering up with the immune system. Nat Rev Immunol. 22 (9), 576-588 (2022).
  9. Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. Modeling the process of human tumorigenesis. Nat Commun. 8 (1), 15422(2017).
  10. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  11. Wang, E., Xiang, K., Zhang, Y., Wang, X. -F. Patient-derived organoids (PDOs) and PDO-derived xenografts (PDOXs): New opportunities in establishing faithful pre-clinical cancer models. J Natl Cancer Cent. 2 (4), 263-276 (2022).
  12. Kamb, A. What's wrong with our cancer models. Nat Rev Drug Discov. 4 (2), 161-165 (2005).
  13. Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
  14. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J. Mouse models in oncoimmunology. Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).
  15. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 160(2023).
  16. Ben-David, U., et al. Patient-derived xenografts undergo mouse-specific tumor evolution. Nat Genet. 49 (11), 1567-1575 (2017).
  17. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nat Rev Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
  18. Ivanics, T., et al. Patient-derived xenograft cryopreservation and reanimation outcomes are dependent on cryoprotectant type. Lab Invest. 98 (7), 947-956 (2018).
  19. Biju, T. S., Priya, V. V., Francis, A. P. Role of three-dimensional cell culture in therapeutics and diagnostics: an updated review. Drug Deliv and Transl Res. 13 (9), 2239-2253 (2023).
  20. Urzì, O., et al. Three-dimensional cell cultures: The bridge between in vitro and in vivo models. Int J Mol Sci. 24 (15), 12046(2023).
  21. Cacciamali, A., Villa, R., Dotti, S. 3D cell cultures: Evolution of an ancient tool for new applications. Front Physiol. 13, 836480(2022).
  22. Abuwatfa, W. H., Pitt, W. G. Scaffold-based 3D cell culture models in cancer research. J Biomed Sci. 31 (1), 7(2024).
  23. Yakavets, I., et al. Advanced co-culture 3D breast cancer model for investigation of fibrosis induced by external stimuli: optimization study. Sci Rep. 10 (1), 21273(2020).
  24. Mohammadrezaei, D., et al. Predicting and elucidating the post-printing behavior of 3D printed cancer cells in hydrogel structures by integrating in-vitro and in-silico experiments. Sci Rep. 13 (1), 1211(2023).
  25. Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLOS ONE. 12 (7), e0182039(2017).
  26. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  27. Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).
  28. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
  29. Pingitore, P., et al. Human multilineage 3D spheroids as a model of liver steatosis and fibrosis. Int J Mol Sci. 20 (7), 1629(2019).
  30. Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K. Organoids in immunological research. Nat Rev Immunol. 20 (5), 279-293 (2020).
  31. Beerkens, A. P. M., et al. Characterizing OXPHOS inhibitor-mediated alleviation of hypoxia using high-throughput live cell-imaging. Cancer Metab. 12 (1), 13(2024).
  32. Feaster, T. K., et al. Matrigel mattress. Cir Res. 117 (12), 995-1000 (2015).
  33. Huang, Z., Yu, P., Tang, J. Characterization of triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cell spheroid model. Onco Targets Ther. 13, 5395-5405 (2020).
  34. Nam, S., Khawar, I. A., Park, J. K., Chang, S., Kuh, H. -J. Cellular context-dependent interaction between cancer and stellate cells in hetero-type multicellular spheroids of pancreatic tumor. Biochem Biophys Res Commun. 515 (1), 183-189 (2019).
  35. Monteiro, M. V., Gaspar, V. M., Ferreira, L. P. Hydrogel 3D in vitro tumor models for screening cell aggregation mediated drug response. Biomater Sci. 8 (7), 1855-1864 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

trójwymiarowa hodowla komórekorganoidy bez rusztowaniakokultura komórek zrębowychmodele raka piersimikrośrodowisko guzatworzenie sferoidówtest inwazji komórkowejfluorescencyjne znakowanie komórekekstrakt błony podstawnejinterakcje nabłonkowo-zrębowe
Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.