Artykuł metodologiczny

Pomiar potencjału błony mitochondrialnej in vivo przy użyciu genetycznie kodowanego wskaźnika napięcia

DOI:

10.3791/67911

⸱

21 lutego 2025

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Systems Biology Laboratories, The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, 2Department of Neurology, The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, 3The Academy of Medical Sciences, Zhengzhou University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje zastosowanie genetycznie kodowanych wskaźników napięcia (GEVI) ukierunkowanych na mitochondria. Te GEVI oferują znaczną przewagę nad tradycyjnymi barwnikami potencjału błony mitochondrialnej, umożliwiając specyficzne monitorowanie potencjału błony mitochondrialnej in vivo w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potencjał błony mitochondrialnej (MMP, ΔΨm) jest krytyczny dla funkcji mitochondriów, w tym syntezy ATP, transportu jonów, generowania reaktywnych form tlenu (ROS) i importu białek kodowanych przez jądro. Istniejące metody pomiaru ΔΨm zazwyczaj wykorzystują lipofilowe barwniki kationowe, takie jak Rhodamine 800 i ester metylowy tetrametylorodaminy (TMRM), ale są one ograniczone niską specyficznością i nie nadają się do zastosowań in vivo. Aby zaradzić tym ograniczeniom, opracowaliśmy nowatorski protokół wykorzystujący genetycznie kodowane wskaźniki napięcia (GEVI). Genetycznie kodowane wskaźniki napięcia (GEVI), które generują sygnały fluorescencyjne w odpowiedzi na zmiany potencjału błonowego, wykazały znaczny potencjał w monitorowaniu błony komórkowej i potencjałów neuronalnych. Jednak ich zastosowanie do błon mitochondrialnych pozostaje niezbadane. W tym celu opracowaliśmy oparte na mitochondriach GEVI na bazie białek, zdolne do wykrywania fluktuacji ΔΨm w komórkach i korze ruchowej żywych zwierząt. Wskaźnik potencjału mitochondrialnego (MPI) oferuje nieinwazyjne podejście do badania dynamiki ΔΨm w czasie rzeczywistym, zapewniając metodę badania funkcji mitochondriów zarówno w warunkach normalnych, jak i patologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria są niezbędnymi organellami w komórkach eukariotycznych, służąc jako główni dostawcy energii poprzez wytwarzanie adenozynotrójfosforanu (ATP), a jednocześnie pełniąc szereg innych kluczowych funkcji, takich jak synteza metabolitów, buforowanie jonów wapnia, produkcja ciepła i regulacja przeżywalności komórek1. Ich rola jest szczególnie istotna w tkankach o wysokim poziomie metabolizmu, takich jak mózg i serce, gdzie pomagają utrzymać homeostazę komórkową. Potencjał błony mitochondrialnej (MMP, Ψm) ma kluczowe znaczenie dla tych procesów, w tym napędza syntezę ATP poprzez fosforylację oksydacyjną, ułatwia transport metabolitów i jonów przez błony mitochondrialne oraz przyczynia się do wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS)2,3. MMP wpływa również na morfologię i dynamikę mitochondriów4, w tym mitofagia (selektywna degradacja mitochondriów)5i apoptoza (programowana śmierć komórki)6. Utrzymanie odpowiedniego Ψm jest niezbędne dla funkcjonowania komórek; Jego rozregulowanie wiąże się z licznymi patologiami, w tym chorobami neurodegeneracyjnymi, niewydolnością serca i rakiem. Obecne metody pomiaru Ψm opierały się przede wszystkim na zastosowaniu lipofilowych barwników kationowych, w tym TMRM (ester metylowy tetrametylorodaminy), TMRE (ester etylowy tetrametylorodaminy), rodamina 123, Safranina O, rodamina 800, DiOC6, JC-1 itp.7. Jednak te fluorescencyjne cząsteczki mają kilka ograniczeń. Barwniki te nie mają specyficzności komórkowej, są podatne na wygaszanie, a niektóre są toksyczne. Dodatkowo mogą dyfundować w czasie, a gdy mitochondrialny ΔΨ zostanie utracony, wyciekają, co uniemożliwia wskazanie potencjału błonowego zdepolaryzowanych mitochondriów. Co więcej, barwniki na bazie rodaminy, takie jak TMRM i TMRE, są wrażliwe na temperaturę8, co wymaga starannego rozważenia wpływu temperatury na fluorescencję barwnika, szczególnie podczas pomiaru napięcia błony mitochondrialnej podczas czynności fizjologicznych obejmujących termogenezę komórkową.

Genetycznie kodowane wskaźniki napięcia (GEVI), białka zdolne do wykrywania zmian potencjału błonowego poprzez sygnały fluorescencyjne9,10, pojawiły się jako potężne narzędzia do monitorowania potencjałów błonowych w różnych kontekstach komórkowych11. Chociaż GEVI są szeroko stosowane do badania błon plazmatycznych, nastąpił niewielki postęp w ich adaptacji do pomiaru potencjałów błon wewnątrzkomórkowych, szczególnie w przypadku mitochondriów. Protokół ten ma na celu wypełnienie tej luki poprzez wykorzystanie ukierunkowanych na mitochondria GEVI, które mogą monitorować potencjał błony mitochondrialnej in vitro i in vivo. Dodając mitochondrialną sekwencję sygnałową do istniejących GEVI, odpowiednie GEVI mogą być kierowane do mitochondriów12. Te wskaźniki potencjału mitochondrialnego (MPI) dostarczyłyby nowych informacji na temat fizjologii mitochondriów i dałyby znaczący potencjał w badaniu funkcji mitochondriów w różnych stanach chorobowych in vivo, pogłębiając nasze zrozumienie, w jaki sposób dynamika mitochondriów przyczynia się zarówno do normalnych, jak i patologicznych procesów komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty związane z opieką nad zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Zhengzhou. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne przed użyciem. Postępuj zgodnie z technikami aseptycznymi, aby zapobiec infekcji. Po zebraniu wszystkich danych zwierzęta zostały poddane eutanazji przy użyciu przedawkowania znieczulenia wziewnego, a następnie ściętej głowy.

1. Zastosowania in vitro

  1. Budowa plazmidu
    1. Uzyskaj przyspieszony czujnik potencjałów czynnościowych genów 1 (ASAP1) i ASAP3 z Addgene lub syntetyzujący z sekwencji. (ASAP1, identyfikator akcesyjny NCBI: AHV90412.1, identyfikator Addgene: 52519; ASAP3, identyfikator Addgene: 132331).
    2. Do budowy plazmidów należy stosować startery wymienione w Tabeli 1.
    3. Do wyrażania w komórkach użyj wektora EGFPN1 do konstrukcji.
      1. Początkowo należy zsyntetyzować sekwencję genu cox8 (NP_004065, aminokwasy 1-29) z czterema powtórzeniami tandemowymi (4cox8) otoczonymi miejscami restrykcyjnymi NheI i XhoI. Przetrawić zarówno zsyntetyzowany fragment 4cox8, jak i wektor EGFPN1 za pomocą NheI i XhoI, a następnie ligację w celu wygenerowania wektora 4cox8-EGFP.
      2. Następnie wykonaj amplifikację PCR sekwencji ASAP1 za pomocą startera 1 i startera 2. Trawić fragment ASAP1 i wektor 4cox8-EGFP za pomocą SalI i NotI, a następnie ligację w celu wygenerowania końcowego wektora MPI-1 (MPI oznacza wskaźnik potencjału mitochondrialnego).
        UWAGA: Mapa wektorowa CMV-MPI-1 jest przedstawiona na rysunku Rysunek 1. Szczegółowa sekwencja jest dostępna w NCBI (identyfikator akcesji: PQ678920).
    4. Aby uzyskać specyficzną ekspresję w neuronach, wykonaj amplifikację PCR sekwencji promotora hSyn z plazmidu AAV-hSyn-EGFP (NCBI Accession ID: MH458079, Addgene ID: 50465) przy użyciu startera 3 i startera 4.
      1. Przetraw zarówno sekwencję hSyn, jak i wektor 4cox8-EGFP za pomocą AseI i NheI, a następnie ligację, aby wygenerować wektor hSyn-4cox8-EGFP. Następnie wykonaj amplifikację PCR sekwencji ASAP3 za pomocą startera 1 i startera 2.
      2. Przetrawić wektor hSyn-4cox8-EGFP i sekwencję ASAP3 za pomocą SalI i NotI, a następnie ligację w celu wygenerowania wektora hSyn-MPI-2.
        UWAGA: Warunki PCR będą się różnić w zależności od konkretnych enzymów i temperatur topnienia startera (Tm). Typowa reakcja PCR obejmuje początkowy etap denaturacji w temperaturze 95 °C przez 30 s, po którym następuje 25-35 cykli denaturacji (95 °C, 10 s), wyżarzania (55 °C, 30 s) i przedłużania (72°C, 30 s/kb). Końcowy etap przedłużania w temperaturze 72 °C przez 5 minut zapewnia pełną syntezę produktu, po którym następuje zatrzymanie w temperaturze 4 °C. Temperatura wyżarzania powinna być o około 5 °C niższa od Tm podkładów. Zapoznaj się z instrukcjami producenta, aby uzyskać informacje o optymalnych parametrach PCR. Startery dla ASAP1 i ASAP3 są identyczne.
  2. Obrazowanie w żywych komórkach
    1. Przygotować pożywkę hodowlaną DMEM, dodając do pożywki 10% płodowej surowicy bydlęcej i 100 mg/l penicyliny/streptomycyny.
    2. Przygotować odczynniki do transfekcji Ca2+: 2,5 mol/L CaCl2, 2x HEBS (274 mmol/L NaCl, 10 mmol/L KCl, 1,4 mmol/L Na2HPO4, 15 mmol/L D-glukozy, 42 mmol/L HEPES, pH 7,07).
    3. Przygotuj bufor Tyrode'a do utrzymania komórek podczas obrazowania (145 mmol/L NaCl, 3 mmol/L KCl, 10 mmol/L HEPES, 10 mmol/L glukozy, pH 7,4).
    4. Hodowla komórek Hela w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm karmionej pożywką hodowlaną DMEM w inkubatorze o temperaturze 37 °C i atmosferze 5% CO2 / 95% powietrza. Dodaj 2-3 szkiełka nakrywkowe na naczynie, aby komórki mogły na nich wyrosnąć.
    5. Transfekcja komórek Hela metodą wytrącania fosforanu wapnia.
      1. Aby przetransfekować komórki, zacznij od zastąpienia starej pożywki hodowlanej 2 ml DMEM bez surowicy. Po 35 minutach przygotować roztwór DNA/Ca2+, mieszając 10 μg DNA, 4 μl CaCl2 i ddH2O do końcowej objętości 40 μl w probówce do mikrowirówki.
      2. Dodawać kroplami 40 μl 2x HEBS do roztworu DNA/Ca2+, energicznie mieszając. Wprowadzić powietrze bąbelkowe za pomocą pipety do mieszaniny, aby ułatwić wytrącanie fosforanu wapnia.
      3. Po 25 minutach dodać 80 μl tego roztworu osadu do naczynia z komórkami i wrzucić do inkubatora na kolejne 1-2 godziny. Następnie usuń DMEM bez surowicy i płucz komórki 15% glicerolem (rozpuszczonym w PBS) przez 2 minuty.
      4. Po odessaniu glicerolu dodaj 2 ml DMEM zawierającego 10% FBS i kontynuuj hodowlę komórek przez 16-24 godziny.
    6. Umieścić szkiełka nakrywkowe z komórkami w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm z 2 ml buforu Tyrode'a i wybarwić komórki barwnikiem rodaminy 800, dodając do szalki 20 μmol/l rodaminę 800 (rozpuszczoną w ddH2O) do końcowego stężenia 50 nmol/l.
    7. Przygotuj mikroskop fluorescencyjny i wyposaż go w odpowiednie filtry i źródło światła, aby wzbudzić białko za pomocą źródła światła o długości fali 488 nm i zebrać emisję w zakresie 490-540 nm. Wzbudz barwnik rodaminy 800 źródłem światła o długości fali 633 nm i zbierz emisję o długości fali 650-720 nm.
    8. Przygotować roztwór cyjanku karbonylu m-chlorofenylohydrazonu (CCCP) o stężeniu 500 μM (podstawowy) i dodać do komórek do końcowego stężenia 5 μM podczas obrazowania.
      UWAGA: pH roztworu 2x HEBS ma kluczowe znaczenie dla wydajności transfekcji. pH należy ostrożnie dostosować do 7,07 za pomocą stałego wodorotlenku sodu. pH nie może być niższe niż 7,01 ani wyższe niż 7,12.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Mapa wektorowa CMV-MPI-1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Zastosowania in vivo

  1. Konstrukcja plazmidu
    1. Do ekspresji in vivo użyj wirusa AAV do transdukcji. Uzyskaj szkielet ekspresyjny dla pakowania AAV (identyfikator Addgene: 46954 lub 26968), który zawiera sekwencje odwróconych powtórzeń końcowych (ITR) dla pakowania wirusa AAV.
    2. Przeprowadzić amplifikację PCR wektora hSyn-MPI-2 (od kroku 1.1.4) przy użyciu starterów 5 i 7 w Tabeli 1.
    3. Wykonać drugą amplifikację PCR, używając tej samej matrycy i starterów 6 i 8 w Tabeli 1.
    4. Przeprowadzić końcową reakcję PCR, używając produktu z pierwszego i drugiego testu PCR (etapy 2.1.2 i 2.1.3) jako matrycy i starterów 5 i 8 w tabeli 1, generując końcową sekwencję hSyn-MPI-2.
    5. Przetrawić sekwencję hSyn-MPI-2 i szkielet pAAV za pomocą MluI i EcoRI, a następnie ligację, aby wygenerować końcowy konstrukt pAAV-hSyn-MPI-2. Mapa wektorowa pAAV-hSyn-MPI-2 jest zilustrowana na rysunku Rysunek 2. Dostęp do szczegółowej sekwencji można uzyskać pod adresem NCBI (identyfikator dostępu: PQ678919).
      UWAGA: Wektor hSyn-MPI-2 zawiera wewnętrzne miejsce EcoRI pochodzące z oryginalnego szkieletu EGFPN1, które jest usuwane za pomocą zmodyfikowanych starterów w nakładającej się strategii PCR (kroki 2.1.2-2.1.4).
  2. Przygotowanie i transdukcja wirusa
    1. Hodowla komórek HEK293t w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm zasilana 10% pożywką hodowlaną FBS DMEM w inkubatorze o temperaturze 37 °C i atmosferze 5% CO2 / 95% powietrza w celu osiągnięcia 70% konfluencji.
    2. Współtransfekować komórki HEK293t plazmidem genu AAV, kapsydem (pAAV-DJ lub pAAV9) i plazmidami pomocniczymi (pHelper) przy użyciu metody wytrącania fosforanu wapnia. Ilość DNA dla każdego plazmidu była następująca: gen: 10 μg, pHelper: 11 μg, kapsyd: 9 μg. Ilość odczynnika do transfekcji: 12 μL CaCl2, 120 μL 2x HEBS.
    3. Inkubować transfekowane komórki przez okres 72 godzin, aby umożliwić produkcję wirusa.
    4. Po okresie inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie o masie 400 g. Przepłukać komórki PBS 2 razy i ponownie zawiesić ogniwo w 400 μl PBS.
    5. Zbieranie wirusów z zawiesiny komórkowej w czterech cyklach metody zamrażania i rozmrażania (37 °C i -80 °C). Odwirować lizat w temperaturze 13 500 × g w temperaturze 4 °C i wyrzucić osad. Supernatant zawiera wirusa AAV.
    6. Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym, aby określić miareczkowanie przygotowanego wirusa. Szczegółowy protokół oznaczania miareczkowania AAV można znaleźć na stronie https://www.addgene.org/protocols/aav-titration-qpcr-using-sybr-green-technology/.
    7. Przygotować i przechowywać przygotowany wirus AAV w temperaturze -80 °C.
  3. Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa
    1. Znieczulić dorosłego samca myszy C57/BL o masie ciała 24-26 g 3% pentobarbitalem sodu we wstrzyknięciu dootrzewnowym w dawce 30 mg/kg. Po znieczuleniu umieść myszy na aparacie stereotaktycznym, aby utrzymać stabilną pozycję przez cały zabieg.
    2. Zastosuj weterynaryjną maść okulistyczną, aby chronić oczy przed lekkim uszkodzeniem i utrzymać nawilżenie oczu.
    3. Użyj kremu do depilacji, aby usunąć włosy z głowy myszy i odsłonić skórę głowy.
    4. Otwórz skórę głowy za pomocą nożyczek chirurgicznych i odsłoń czaszkę. Potraktuj czaszkę 3% nadtlenkiem wodoru, aby wysterylizować i uwidocznić kluczowe punkty orientacyjne, takie jak miejsca bregma i lambda.
    5. Dostosuj pozycję głowy myszy, aby upewnić się, że czaszka jest pozioma.
    6. Użyj programowalnego ściągacza do mikropipet, aby narysować szklane pipety do żądanego kształtu i rozmiaru w celu precyzyjnego wstrzykiwania. Napełnij szklaną mikropipetę olejem parafinowym.
    7. Umieścić mikropipetę w miejscu docelowym. W tym protokole celem jest obszar M2 po prawej stronie, przy użyciu następujących współrzędnych: AP (przednio-tylny), +1,94 mm; ML (przyśrodkowo-boczny), +0,75 mm; DV (grzbietowo-brzuszne), -1,5 mm.
    8. Użyj wiertarki elektrycznej, aby zrobić mały otwór w czaszce w miejscu docelowym.
    9. Aspirować 500 nL wirusa przy mianie 1,5 x 1011 kopii genomu na mililitr (GC / ml) przez końcówkę mikropipety. Wstrzyknąć 500 nL wirusa do miejsca docelowego za pomocą pompy iniekcyjnej o natężeniu przepływu 100 nL/min.
    10. Po wstrzyknięciu należy pozostawić pipetę na miejscu na około 5 minut, aby umożliwić dyfuzję, a następnie ostrożnie ją schować.
    11. Implant światłowodowy (średnica 200 μm, apertura numeryczna 0,37, długość 2 mm) do miejsca wstrzyknięcia.
    12. Zabezpiecz światłowód na miejscu za pomocą cementu dentystycznego.
    13. Zszyj skórę głowy myszy nylonową nicią 5-0 (igła estetyczna Δ1/2 4x12) i umieść ją z powrotem w klatce domowej.
    14. Umieść klatkę domową na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała myszy, dopóki w pełni nie wyzdrowieje ze znieczulenia.
    15. Wyłącz poduszkę grzewczą, gdy zwierzę zacznie się poruszać. Odczekaj kolejne 2 godziny na aklimatyzację do temperatury pokojowej (RT) przed przeniesieniem myszy do pomieszczenia mieszkalnego.
    16. Mysz domowa w 12-godzinnym cyklu świetlnym/12-godzinnym cyklu ciemnym w temperaturze 22 °C z dostępem ad libitum do pożywienia i wody przez 2-3 tygodnie, aby umożliwić ekspresję wirusa.
  4. Fotometria światłowodowa
    1. Podłącz światłowód wszczepiony w mysz do optycznego.
    2. Podłącz drugi koniec optycznego do detektora, który będzie używany do przechwytywania danych obrazowania.
    3. Do obrazowania użyj źródła światła do wzbudzenia białek o długości fali 488 nm. Ustaw detektor tak, aby zbierał emitowane światło o długości fal od 490 nm do 540 nm.
    4. Dostosuj intensywność światła wzbudzenia, aby zoptymalizować sygnał bez powodowania uszkodzenia tkanki mózgowej.
    5. Zmodyfikuj wzmocnienia sygnału fluorescencyjnego, aby zapewnić wyraźne i silne sygnał jest przechwytywany przez detektor.
    6. Aby uniknąć szybkiego blaknięcia fluorescencji, które obniżyłoby jakość obrazowania, w razie potrzeby należy dostroić natężenie światła i wzmocnienie sygnału fluorescencyjnego.
    7. Przeprowadź test zachowania myszy.
    8. Stale monitoruj proces obrazowania podczas testu zachowania.
  5. analiza danych
    1. Użyj Pythona i GNUplot, aby utworzyć mapę cieplną prób eksperymentalnych w celu wizualnej reprezentacji danych. Kody źródłowe znajdują się w pliku uzupełniającym 1.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Mapa wektorowa AAV-hSyn-MPI-2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po skonstruowaniu plazmidu CMV-MPI-1, jego zdolność do celowania w mitochondria została przetestowana na komórkach Hela przy użyciu markera mitochondrialnego Rhodamine 800 do barwienia. Eksperymenty kolokalizacyjne wykazały wysoki stopień nakładania się sygnału fluorescencyjnego MPI-1 i sygnału z Rhodamine 800, co wskazuje, że MPI-1 został pomyślnie zlokalizowany w mitochondriach (Figura 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Napięcie błony mitochondrialnej jest utrzymywane na poziomie -120--180 mV w warunkach spoczynku i zmienia się wraz ze zmianami stanu metabolicznego. Obecnie pomiar potencjału błony mitochondrialnej może być wykonywany metodami elektrofizjologicznymi oraz metodami barwników fluorescencyjnych. Zaciskanie łat mitochondrialnych wymaga izolacji mitochondriów i zniszczenia struktur komórkowych13. Takie podejście może prowadzić do pomiarów, które odbiegają od warunków fizjologicznych. Metoda sondy fluore...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy za wsparcie Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych (NSF) Chin: JSK (32071137 i 92054103) oraz za finansowanie Zespołu Badań Naukowych i Innowacji Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Zhengzhou: JSK (ZYCXTD2023014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BamHIThermoFD0054
Chlorek wapniaSigmaC4901
CCCP SigmaC2759
Wirówkaeppendorf5430R
Wirówka (hodowla komórkowa)eppendorf5810R
Inkubator komórek CO2ESCO170L Szkiełka
nakrywkoweGlaswarenfabrik Karl Hecht GmbH &Co.KG 92100100030
Dentystyczny adhezyjny cement żywicznySłońce firma medyczna, LTD.Złącze Super-Bond C& Zestaw B D-glucose
SigmaG7021
Zestaw do ligacji DNA Ver. 2.1Takara6022
Zmodyfikowane medium Eagle firmy DulbeccoGibco
 RWD Instruments78001
Surowica bydlęcapłodu GibcoA5670701
Kaniula światłowodowaRWD InstrumentyR-FOC-L200C-39NA
Detektor fotometrii światłowodowejThinkerQAXK_FPS-TC-MC-LED
Mikroskop fluorescencyjny Olimpia IX83
Szklana pipeta (do wstrzykiwań)Drummond Scientific company3.5" Drummond # 3-000-203-G/X
HEK293tATCCCat# CRL-3216
Hela cellsATCCCat# CCL-2
HEPESSigmaH3375
Pompa wtryskowaDrummond Scientific company3-000-207
IsofluraneRWD InstrumentsR510-22
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyZeissLSM980
MluIThermoFD0564
NheIThermoFD0974
ŚwiatłowodyRWD InstrumentyR-FC-L-N3-200-L1
Olej parafinowySangonB500301
PCR termiczny Cycleranalytik jenaBiometra Tone 96G
Pentobarbital sodowySinopharm Odczynnik chemiczny Co.LTD57-33-0
Chlorek potasuSigmaP5405
PrimeSTAR HS DNA PolimerazaTakaraR010A
Programowalny ściągacz do mikropipetSutter InstrumentsP2000
Szybki Żywica akrylowa samoutwardzalna YamahachiV-PINK
PCR w czasie rzeczywistym   analiza termocyklerazqTOWER³ auto
Rodamina 800Sigma83701
SalIThermoFD0644
Chlorek soduSigmaS9888
Fosforan sodu dwuzasadowySigmaS9763
Aparat stereotaktycznyRWD InstrumentsE06354
Maść weterynaryjna okulistycznaPuralubeNA
XhoIThermoFD0694
Czujnik podczerwieni Wiertarka elektryczna 11965092

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vyas, S., Zaganjor, E., Haigis, M. C. Mitochondria and cancer. Cell. 166 (3), 555-566 (2016).
  2. Dzbek, J., Korzeniewski, B. Control over the contribution of the mitochondrial membrane potential (ΔΨ) and proton gradient (ΔpH) to the protonmotive force (Δp): IN SILICO STUDIES. J Biol Chem. 283 (48), 33232-33239 (2008).
  3. O'Rourke, B., Cortassa, S., Aon, M. A. Mitochondrial ion channels: Gatekeepers of life and death. Physiology. 20 (5), 303-315 (2005).
  4. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
  5. Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL. J Cell Biol. 191 (5), 933-942 (2010).
  6. Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8 (2), 115-128 (2003).
  7. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
  8. Meng, X. -Y., et al. A sensitive mitochondrial thermometry 2.0 and the availability of thermogenic capacity of brown adipocyte. Front Physiol. 13, 977431(2022).
  9. Kaestner, L., et al. Genetically encoded voltage indicators in circulation research. Int J Mol Sci. 16 (9), 21626-21642 (2015).
  10. Yang, H. H., St-Pierre, F. Genetically encoded voltage indicators: Opportunities and challenges. J Neurosci. 36 (39), 9977(2016).
  11. Sepehri Rad, M., Cohen, L. B., Braubach, O., Baker, B. J. Monitoring voltage fluctuations of intracellular membranes. Sci Rep. 8 (1), 6911(2018).
  12. Yang, R. -Z., Wang, D. -D., Li, S. -M., Liu, P. -P., Kang, J. -S. Development and application of a mitochondrial genetically encoded voltage indicator in narcosis. Neurosci Bull. 40 (10), 1529-1544 (2024).
  13. Kumari, A., Nguyen, D. M., Garg, V. Patch-clamp technique to study mitochondrial membrane biophysics. J Gen Physiol. 155 (8), e202313347(2023).
  14. Bayne, A. N., Dong, J., Amiri, S., Farhan, S. M. K., Trempe, J. -F. MTSviewer: A database to visualize mitochondrial targeting sequences, cleavage sites, and mutations on protein structures. PLoS One. 18 (4), e0284541(2023).
  15. Kim, B. B., et al. A red fluorescent protein with improved monomericity enables ratiometric voltage imaging with ASAP3. Sci Rep. 12 (1), 3678(2022).
  16. Evans, S. W., et al. A positively tuned voltage indicator for extended electrical recordings in the brain. Nat Methods. 20 (7), 1104-1113 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wska nik potencja u mitochondrialnegopomiar in vivofunkcja mitochondrialnadynamika potencja u b onowegofluorescencyjny czujnik napi ciabia kowy wska nik napi ciatargetowanie mitochondrialnemonitorowanie w czasie rzeczywistym
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły