Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar potencjału błony mitochondrialnej in vivo przy użyciu genetycznie kodowanego wskaźnika napięcia

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67911

⸱

21 lutego 2025

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Systems Biology Laboratories, The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, 2Department of Neurology, The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, 3The Academy of Medical Sciences, Zhengzhou University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje zastosowanie genetycznie kodowanych wskaźników napięcia (GEVI) ukierunkowanych na mitochondria. Te GEVI oferują znaczną przewagę nad tradycyjnymi barwnikami potencjału błony mitochondrialnej, umożliwiając specyficzne monitorowanie potencjału błony mitochondrialnej in vivo w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

Potencjał błony mitochondrialnej (MMP, ΔΨm) jest krytyczny dla funkcji mitochondriów, w tym syntezy ATP, transportu jonów, generowania reaktywnych form tlenu (ROS) i importu białek kodowanych przez jądro. Istniejące metody pomiaru ΔΨm zazwyczaj wykorzystują lipofilowe barwniki kationowe, takie jak Rhodamine 800 i ester metylowy tetrametylorodaminy (TMRM), ale są one ograniczone niską specyficznością i nie nadają się do zastosowań in vivo. Aby zaradzić tym ograniczeniom, opracowaliśmy nowatorski protokół wykorzystujący genetycznie kodowane wskaźniki napięcia (GEVI). Genetycznie kodowane wskaźniki napięcia (GEVI), które generują sygnały fluorescencyjne w odpowiedzi na zmiany potencjału błonowego, wykazały znaczny potencjał w monitorowaniu błony komórkowej i potencjałów neuronalnych. Jednak ich zastosowanie do błon mitochondrialnych pozostaje niezbadane. W tym celu opracowaliśmy oparte na mitochondriach GEVI na bazie białek, zdolne do wykrywania fluktuacji ΔΨm w komórkach i korze ruchowej żywych zwierząt. Wskaźnik potencjału mitochondrialnego (MPI) oferuje nieinwazyjne podejście do badania dynamiki ΔΨm w czasie rzeczywistym, zapewniając metodę badania funkcji mitochondriów zarówno w warunkach normalnych, jak i patologicznych.

Wprowadzenie

Mitochondria są niezbędnymi organellami w komórkach eukariotycznych, służąc jako główni dostawcy energii poprzez wytwarzanie adenozynotrójfosforanu (ATP), a jednocześnie pełniąc szereg innych kluczowych funkcji, takich jak synteza metabolitów, buforowanie jonów wapnia, produkcja ciepła i regulacja przeżywalności komórek1. Ich rola jest szczególnie istotna w tkankach o wysokim poziomie metabolizmu, takich jak mózg i serce, gdzie pomagają utrzymać homeostazę komórkową. Potencjał błony mitochondrialnej (MMP, Ψm) ma kluczowe znaczenie dla tych procesów, w tym napędza syntezę ATP poprzez fosforylację oksydacyjną, ułatwia transport metabolitów i jonów przez błony mitochondrialne oraz przyczynia się do wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS)2,3. MMP wpływa również na morfologię i dynamikę mitochondriów4, w tym mitofagia (selektywna degradacja mitochondriów)5i apoptoza (programowana śmierć komórki)6. Utrzymanie odpowiedniego Ψm jest niezbędne dla funkcjonowania komórek; Jego rozregulowanie wiąże się z licznymi patologiami, w tym chorobami neurodegeneracyjnymi, niewydolnością serca i rakiem. Obecne metody pomiaru Ψm opierały się przede wszystkim na zastosowaniu lipofilowych barwników kationowych, w tym TMRM (ester metylowy tetrametylorodaminy), TMRE (ester etylowy tetrametylorodaminy), rodamina 123, Safranina O, rodamina 800, DiOC6, JC-1 itp.7. Jednak te fluorescencyjne cząsteczki mają kilka ograniczeń. Barwniki te nie mają specyficzności komórkowej, są podatne na wygaszanie, a niektóre są toksyczne. Dodatkowo mogą dyfundować w czasie, a gdy mitochondrialny ΔΨ zostanie utracony, wyciekają, co uniemożliwia wskazanie potencjału błonowego zdepolaryzowanych mitochondriów. Co więcej, barwniki na bazie rodaminy, takie jak TMRM i TMRE, są wrażliwe na temperaturę8, co wymaga starannego rozważenia wpływu temperatury na fluorescencję barwnika, szczególnie podczas pomiaru napięcia błony mitochondrialnej podczas czynności fizjologicznych obejmujących termogenezę komórkową.

Genetycznie kodowane wskaźniki napięcia (GEVI), białka zdolne do wykrywania zmian potencjału błonowego poprzez sygnały fluorescencyjne9,10, pojawiły się jako potężne narzędzia do monitorowania potencjałów błonowych w różnych kontekstach komórkowych11. Chociaż GEVI są szeroko stosowane do badania błon plazmatycznych, nastąpił niewielki postęp w ich adaptacji do pomiaru potencjałów błon wewnątrzkomórkowych, szczególnie w przypadku mitochondriów. Protokół ten ma na celu wypełnienie tej luki poprzez wykorzystanie ukierunkowanych na mitochondria GEVI, które mogą monitorować potencjał błony mitochondrialnej in vitro i in vivo. Dodając mitochondrialną sekwencję sygnałową do istniejących GEVI, odpowiednie GEVI mogą być kierowane do mitochondriów12. Te wskaźniki potencjału mitochondrialnego (MPI) dostarczyłyby nowych informacji na temat fizjologii mitochondriów i dałyby znaczący potencjał w badaniu funkcji mitochondriów w różnych stanach chorobowych in vivo, pogłębiając nasze zrozumienie, w jaki sposób dynamika mitochondriów przyczynia się zarówno do normalnych, jak i patologicznych procesów komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie zabiegi pielęgnacyjne i eksperymenty na zwierzętach były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu w Zhengzhou. Wszystkie instrumenty chirurgiczne należy wysterylizować przed użyciem. Należy stosować techniki aseptyczne, aby zapobiec infekcjom. Po zebraniu wszystkich danych zwierzęta zostały uśpione poprzez podanie przedawkowanej anastezji inhalacyjnej, a następnie poddane dekapitacji.

1. Zastosowania in vitro

  1. Konstrukcja plazmidu
    1. Należy pozyskać geny accelerated sensor of action potentials 1 (ASAP1) oraz ASAP3 z repozytorium Addgene lub zsyntetyzować je na podstawie sekwencji. (ASAP1, NCBI Accession ID: AHV90412.1, Addgene ID: 52519; ASAP3, Addgene ID: 132331).
    2. Należy użyć starterów wymienionych w Tabela 1 do konstrukcji plazmidowych.
    3. Do ekspresji w komórkach należy użyć wektora EGFPN1 do konstrukcji.
      1. W pierwszej kolejności należy zsyntetyzować sekwencję genu cox8 (NP_004065, aminokwasy 1-29) z czterema tandemowymi powtórzeniami (4cox8), flankowaną miejscami restrykcyjnymi NheI i XhoI. Następnie należy przeprowadzić trawienie zarówno zsyntetyzowanego fragmentu 4cox8, jak i wektora EGFPN1 za pomocą enzymów NheI i XhoI, a następnie wykonać ligację w celu otrzymania wektora 4cox8-EGFP.
      2. Następnie należy przeprowadzić amplifikację PCR sekwencji ASAP1 z wykorzystaniem primera 1 i primera 2. Fragment ASAP1 oraz wektor 4cox8-EGFP należy poddać trawieniu enzymami SalI i NotI, a następnie przeprowadzić ligację w celu otrzymania końcowego wektora MPI-1 (MPI oznacza wskaźnik potencjału mitochondrialnego).
        UWAGA: Mapa wektora CMV-MPI-1 przedstawiona jest na Rycina 1Szczegółowa sekwencja jest dostępna w bazie NCBI (numer dostępu: PQ678920).
    4. W celu uzyskania specyficznej ekspresji w neuronach, należy przeprowadzić amplifikację PCR sekwencji promotora hSyn z plazmidu AAV-hSyn-EGFP (NCBI Accession ID: MH458079, Addgene ID: 50465) przy użyciu startera 3 i startera 4.
      1. Poddaj sekwencję hSyn oraz wektor 4cox8-EGFP trawieniu enzymami AseI i NheI, a następnie przeprowadź ligację w celu otrzymania wektora hSyn-4cox8-EGFP. Następnie przeprowadź amplifikację PCR sekwencji ASAP3 z użyciem primera 1 i primera 2.
      2. Przetraw wektor hSyn-4cox8-EGFP oraz sekwencję ASAP3 za pomocą enzymów SalI i NotI, a następnie przeprowadź ligację w celu otrzymania wektora hSyn-MPI-2.
        UWAGA: Warunki PCR będą się różnić w zależności od konkretnych enzymów i temperatur topnienia (Tm) starterów. Typowa reakcja PCR obejmuje wstępny etap denaturacji w 95 °C przez 30 s, a następnie 25–35 cykli denaturacji (95 °C, 10 s), przyłączanie (55 °C, 30 s) oraz elongacji (72°C, 30 s/kb). Końcowy etap przedłużania w 72 °C przez 5 min zapewnia pełną syntezę produktu, po czym następuje utrzymanie temperatury w 4 °CTemperatura przyłączania powinna wynosić w przybliżeniu 5 °C poniżej Tm starterów. W celu ustalenia optymalnych parametrów PCR należy zapoznać się z instrukcjami producenta. Startery dla ASAP1 i ASAP3 są identyczne.
  2. Obrazowanie w żywych komórkach
    1. Przygotować pożywkę DMEM, dodając do niej 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 100 mg/L penicyliny i streptomycyny.
    2. Przygotuj Ca2+ odczynniki do transfekcji: 2,5 mol/L CaCl22, 2x HEBS (274 mmol/L NaCl, 10 mmol/L KCl, 1,4 mmol/L Na)2HPO (histologia i patologia narządów)4, 15 mmol/L D-glukozy, 42 mmol/L HEPES, pH 7,07).
    3. Przygotować bufor Tyrode’a do utrzymania komórek podczas obrazowania (145 mmol/L NaCl, 3 mmol/L KCl, 10 mmol/L HEPES, 10 mmol/L glukozy, pH 7,4).
    4. Hodować komórki HeLa w 35 mm szalce hodowlanej z dodatkiem pożywki DMEM w inkubatorze o temperaturze 37 °C oraz atmosfera zawierająca 5% CO22/95% powietrza. Do każdej płytki dodaj 2–3 szkiełka coverglass, aby umożliwić wzrost komórek na ich powierzchni.
    5. Przeprowadź transfekcję komórek HeLa metodą wytrącania fosforanu wapnia.
      1. Aby przeprowadzić transfekcję komórek, należy rozpocząć od zastąpienia starej pożywki hodowlanej 2 ml DMEM bez surowicy. Po 35 minutach należy przygotować kompleks DNA/Ca2+ roztwór otrzymany przez mieszanie 10 µg DNA, 4 µL CaCl22or ddH2O2do końcowej objętości 40 µL w probówce do mikrocentryfugi.
      2. Dodaj 40 µL 2x HEBS do DNA/Ca2+ dodawać roztwór kroplami podczas intensywnego mieszania. Przedmuchać mieszaninę powietrzem za pomocą pipety, aby ułatwić wytrącanie fosforanu wapnia.
      3. Po 25 min dodać 80 µL przenieść ten osad wraz z roztworem do naczynia z komórkami i ponownie umieścić w inkubatorze na kolejne 1-2 h. Następnie usunąć medium DMEM bez surowicy i przepłukać komórki 15% glicerolem (rozpuszczonym w PBS) przez 2 min.
      4. Po odessaniu glicerolu należy dodać 2 mL pożywki DMEM zawierającej 10% FBS i kontynuować hodowlę komórek przez 16–24 h.
    6. Umieścić szkiełka podstawowe z komórkami w 35-milimetrowej płytce hodowlanej z 2 ml buforu Tyrode'a i zabarwić komórki barwnikiem rhodamine 800, dodając 20 µmol/L rodamina 800 (rozpuszczona w ddH2O)2do naczynia do końcowego stężenia 50 nmol/L.
    7. Przygotować mikroskop fluorescencyjny i skonfigurować go z odpowiednimi filtrami oraz źródłem światła tak, aby wzbudzać białko światłem o długości fali 488 nm i zbierać emisję w zakresie 490–540 nm. Wzbudzać barwnik rhodamine 800 światłem o długości fali 633 nm i zbierać emisję w zakresie 650–720 nm.
    8. Przygotować roztwór cyjanorku karbonylowego m-chlorofenylhydrazonu (CCCP) w stężeniu 500 µM (roztwór zapasowy) i dodać do komórek do stężenia końcowego wynoszącego 5 µM podczas obrazowania.
      UWAGA: pH roztworu 2x HEBS ma kluczowe znaczenie dla wydajności transfekcji. Należy starannie dostosować pH do wartości 7,07 przy użyciu stałego wodorotlenku sodu. pH nie może być niższe niż 7,01 ani wyższe niż 7,12.

Schemat mapy plazmidu; edycja genów, wzmacniacz CMV, regiony promotorowe, miejsca restrykcyjne.
Rycina 1: Mapa wektora CMV-MPI-1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Zastosowania in vivo

  1. Konstrukt plazmidowy
    1. Dla in vivo ekspresja, do transdukcji zastosowano wirusa AAV. Należy pozyskać szkielet ekspresyjny do pakowania AAV (Addgene ID: 46954 lub 26968), który zawiera sekwencje odwróconych powtórzeń końcowych (ITR) niezbędne do pakowania wirusa AAV.
    2. Przeprowadź amplifikację PCR wektora hSyn-MPI-2 (z kroku 1.1.4) przy użyciu starterów 5 i 7 w Tabela 1.
    3. Przeprowadź drugą amplifikację PCR, używając tej samej matrycy oraz starterów 6 i 8 w Tabela 1.
    4. Przeprowadź końcową reakcję PCR, wykorzystując produkt z pierwszej i drugiej reakcji PCR (kroki 2.1.2 i 2.1.3) jako matrycę oraz primery 5 i 8 w Tabela 1generując końcową sekwencję hSyn-MPI-2.
    5. Przetraw sekwencję hSyn-MPI-2 oraz szkielet pAAV za pomocą enzymów MluI i EcoRI, a następnie przeprowadź ligację w celu otrzymania końcowej konstrukcji pAAV-hSyn-MPI-2. Mapa wektora pAAV-hSyn-MPI-2 przedstawiona jest na Rysunek 2Szczegółowa sekwencja jest dostępna w bazie NCBI (numer akcesyjny: PQ678919).
      UWAGA: Wektor hSyn-MPI-2 zawiera wewnętrzną sekwencję rozpoznawczą EcoRI pochodzącą z pierwotnego szkieletu EGFPN1, która zostaje usunięta przy użyciu zmodyfikowanych starterów w strategii nakładającej się reakcji PCR (kroki 2.1.2–2.1.4).
  2. Przygotowanie i transdukcja wirusa
    1. Kulturyzuj komórki HEK293t w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm, dostarczając pożywkę DMEM z dodatkiem 10% FBS, w inkubatorze o temperaturze 37 °C or atmosferze zawierającej 5% CO2295% powietrza, aby osiągnąć 70% konfluencji.
    2. Wykonaj kotransfekcję komórek HEK293t plazmidem genowym AAV, plazmidem kapsydu (pAAV-DJ lub pAAV9) oraz plazmidami pomocniczymi (pHelper), stosując metodę wytrącania fosforanu wapnia. Ilość DNA dla każdego plazmidu wynosiła: gen: 10 µg, pHelper: 11 µg, kapsyd: 9 µgIlość odczynnika do transfekcji: 12 µL z CaCl22, 120 µL z 2x HEBS.
    3. Inkubować transfekowane komórki przez 72 h w celu umożliwienia produkcji wirusa.
    4. Po okresie inkubacji zebrać komórki poprzez wirowanie przy 400 g gPrzemyć komórki dwa razy buforem PBS i ponownie zawiesić komórki w 400 µL buforu PBS.
    5. Pozyskiwanie wirusów z zawiesiny komórkowej za pomocą czterech cykli zamrażania i rozmrażania (37 °C i -80 °C ). Wirować lizat z prędkością 13 500 × g w 4 °C i odrzucić pellet. W nadsączu znajduje się wirus AAV.
    6. Przeprowadź reakcję PCR w czasie rzeczywistym, aby określić miano przygotowanego wirusa. Szczegółowy protokół wyznaczania miana AAV znajduje się pod adresem https://www.addgene.org/protocols/aav-titration-qpcr-using-sybr-green-technology/.
    7. Rozdziel przygotowany wirus AAV na alikwoty i przechowuj w temperaturze -80 °C.
  3. Stereotaktyczne wstrzykiwanie wirusa
    1. Zanestezjować dorosłą samca myszy szczepu C57/BL o masie 24–26 g, podając 3% roztwór pentobarbalku sodu drogą dosytnijną w dawce 30 mg/kg. Po znieczuleniu unieruchomić myszy w aparacie stereotaksycznym, aby zapewnić stabilną pozycję podczas całej procedury.
    2. Nanieś weterynaryjną maść okulistyczną, aby chronić oczy przed uszkodzeniem światłem oraz zapewnić ich nawilżenie.
    3. Użyj kremu do depilacji, aby usunąć owłosienie z głowy myszy i odsłonić skórę czaszki.
    4. Naciąć skórę głowy za pomocą nożyczek chirurgicznych i odsłonić czaszkę. Przemyć czaszkę 3-procentowym nadtlenkiem wodoru w celu sterylizacji oraz uwidocznienia kluczowych punktów orientacyjnych, takich jak bregma i lambda.
    5. Dostosuj położenie głowy myszy, aby upewnić się, że czaszka znajduje się w pozycji poziomej.
    6. Użyj programowalnej wyciągarki do pipet, aby uformować szklane pipety o pożądanym kształcie i rozmiarze, umożliwiającym precyzyjne iniekcje. Napełnij szklaną mikropipetę olejem parafinowym.
    7. Umieść mikropipetę w miejscu docelowym. W niniejszym protokole celem jest obszar M2 po prawej stronie, przy użyciu następujących współrzędnych: AP (przednio-tylna), +1,94 mm; ML (środkowo-boczna), +0,75 mm; DV (grzbietowo-brzuszna), -1,5 mm.
    8. Użyj wiertarki elektrycznej, aby wywiercić niewielki otwór w czaszce w miejscu docelowym.
    9. Naciągnąć 500 nL wirusa o mianie 1,5 x 1011 Liczba kopii genomu na mililitr (GC/mL) za pomocą końcówki mikropipety. Wstrzyknąć 500 nL wirusa w miejsce docelowe za pomocą pompy wtryskowej przy szybkości przepływu 100 nL/min.
    10. Po wstrzyknięciu pozostawić pipetę w miejscu przez około 5 min, aby umożliwić dyfuzję, a następnie ostrożnie ją wycofać.
    11. Zaimplantować światłowód (200 µm średnica, aperturą numeryczną 0,37, długość 2 mm) w miejsce wstrzyknięcia.
    12. Unieruchom włókno optyczne za pomocą cementu dentystycznego.
    13. Zaszyć skórę głowy myszy nicią nylonową 5-0 (igła estetyczna Δ1/2 4x12) i umieścić zwierzę z powrotem w klatce domowej.
    14. Umieść klatkę macierzystą na macie grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała myszy do czasu jej pełnego wybudzenia z narkozy.
    15. Wyłączyć podkład grzewczy, gdy zwierzę zacznie się poruszać. Pozostawić mysz na kolejne 2 godziny w celu aklimatyzacji do temperatury pokojowej (RT) przed przeniesieniem jej do pomieszczenia z klatkami.
    16. Mysz domowa w cyklu 12 h światła/12 h ciemności przy 22 °C z dostępem ad libitum do pokarmu i wody przez 2–3 tygodnie w celu umożliwienia ekspresji wirusa.
  4. Fotometria światłowodowa
    1. Podłączyć światłowód zaimplantowany myszy do kabla optycznego.
    2. Podłącz drugi koniec światłowodu do detektora, który zostanie użyty do rejestracji danych obrazowych.
    3. Do obrazowania należy użyć źródła światła w celu wzbudzenia białek przy długości fali 488 nm. Detektor należy skonfigurować tak, aby zbierał emitowane światło w zakresie długości fal od 490 nm do 540 nm.
    4. Dostosuj natężenie światła wzbudzenia, aby zoptymalizować sygnał, nie powodując jednocześnie uszkodzenia tkanki mózgowej.
    5. Zmodyfikuj wzmocnienie sygnału fluorescencyjnego, aby zapewnić rejestrację wyraźnego i silnego sygnału przez detektor.
    6. Aby uniknąć szybkiego wybielania fluorescencji, co obniżyłoby jakość obrazowania, należy w razie potrzeby odpowiednio dostroić natężenie światła oraz wzmocnienie sygnału fluorescencyjnego.
    7. Przeprowadzenie testu behawioralnego u myszy.
    8. Kieruj ciągłym nadzorem nad procesem obrazowania podczas testu behawioralnego.
  5. Analiza danych
    1. Użyj języka Python oraz programu GNUplot do utworzenia mapy ciepła prób doświadczalnych w celu wizualnej reprezentacji danych. Kody źródłowe znajdują się w Plik uzupełniający 1.

Schemat mapy plazmidu PAAV-hsyn-MP12, zawierający miejsca restrykcyjne, promotory i sekwencje.
Rycina 2: Mapa wektora AAV-hSyn-MPI-2. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po skonstruowaniu plazmidu CMV-MPI-1, jego zdolność do targetowania mitochondriów została przetestowana w komórkach Hela z wykorzystaniem markeru mitochondrialnego Rhodamine 800 do barwienia. Eksperymenty z kolokalizacji wykazały wysoki stopień nakładania się sygnału fluorescencyjnego MPI-1 i sygnału Rhodamine 800, co wskazuje, że MPI-1 został skutecznie zlokalizowany w mitochondriach (Rysunek 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Napięcie błony mitochondrialnej jest utrzymywane na poziomie -120--180 mV w warunkach spoczynku i zmienia się wraz ze zmianami stanu metabolicznego. Obecnie pomiar potencjału błony mitochondrialnej może być wykonywany metodami elektrofizjologicznymi oraz metodami barwników fluorescencyjnych. Zaciskanie łat mitochondrialnych wymaga izolacji mitochondriów i zniszczenia struktur komórkowych13. Takie podejście może prowadzić do pomiarów, które odbiegają od warunków fizjologicznych. Metoda sondy fluore...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy za wsparcie Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych (NSF) Chin: JSK (32071137 i 92054103) oraz za finansowanie Zespołu Badań Naukowych i Innowacji Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Zhengzhou: JSK (ZYCXTD2023014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BamHIThermoFD0054
Chlorek wapniaSigmaC4901
CCCP SigmaC2759
Wirówkaeppendorf5430R
Wirówka (hodowla komórkowa)eppendorf5810R
Inkubator komórek CO2ESCO170L Szkiełka
nakrywkoweGlaswarenfabrik Karl Hecht GmbH &Co.KG 92100100030
Dentystyczny adhezyjny cement żywicznySłońce firma medyczna, LTD.Złącze Super-Bond C& Zestaw B D-glucose
SigmaG7021
Zestaw do ligacji DNA Ver. 2.1Takara6022
Zmodyfikowane medium Eagle firmy DulbeccoGibco
 RWD Instruments78001
Surowica bydlęcapłodu GibcoA5670701
Kaniula światłowodowaRWD InstrumentyR-FOC-L200C-39NA
Detektor fotometrii światłowodowejThinkerQAXK_FPS-TC-MC-LED
Mikroskop fluorescencyjny Olimpia IX83
Szklana pipeta (do wstrzykiwań)Drummond Scientific company3.5" Drummond # 3-000-203-G/X
HEK293tATCCCat# CRL-3216
Hela cellsATCCCat# CCL-2
HEPESSigmaH3375
Pompa wtryskowaDrummond Scientific company3-000-207
IsofluraneRWD InstrumentsR510-22
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyZeissLSM980
MluIThermoFD0564
NheIThermoFD0974
ŚwiatłowodyRWD InstrumentyR-FC-L-N3-200-L1
Olej parafinowySangonB500301
PCR termiczny Cycleranalytik jenaBiometra Tone 96G
Pentobarbital sodowySinopharm Odczynnik chemiczny Co.LTD57-33-0
Chlorek potasuSigmaP5405
PrimeSTAR HS DNA PolimerazaTakaraR010A
Programowalny ściągacz do mikropipetSutter InstrumentsP2000
Szybki Żywica akrylowa samoutwardzalna YamahachiV-PINK
PCR w czasie rzeczywistym   analiza termocyklerazqTOWER³ auto
Rodamina 800Sigma83701
SalIThermoFD0644
Chlorek soduSigmaS9888
Fosforan sodu dwuzasadowySigmaS9763
Aparat stereotaktycznyRWD InstrumentsE06354
Maść weterynaryjna okulistycznaPuralubeNA
XhoIThermoFD0694
Czujnik podczerwieni Wiertarka elektryczna 11965092

Bibliografia

  1. Vyas, S., Zaganjor, E., Haigis, M. C. Mitochondria and cancer. Cell. 166 (3), 555-566 (2016).
  2. Dzbek, J., Korzeniewski, B. Control over the contribution of the mitochondrial membrane potential (ΔΨ) and proton gradient (ΔpH) to the protonmotive force (Δp): IN SILICO STUDIES. J Biol Chem. 283 (48), 33232-33239 (2008).
  3. O'Rourke, B., Cortassa, S., Aon, M. A. Mitochondrial ion channels: Gatekeepers of life and death. Physiology. 20 (5), 303-315 (2005).
  4. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
  5. Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL. J Cell Biol. 191 (5), 933-942 (2010).
  6. Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8 (2), 115-128 (2003).
  7. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
  8. Meng, X. -Y., et al. A sensitive mitochondrial thermometry 2.0 and the availability of thermogenic capacity of brown adipocyte. Front Physiol. 13, 977431(2022).
  9. Kaestner, L., et al. Genetically encoded voltage indicators in circulation research. Int J Mol Sci. 16 (9), 21626-21642 (2015).
  10. Yang, H. H., St-Pierre, F. Genetically encoded voltage indicators: Opportunities and challenges. J Neurosci. 36 (39), 9977(2016).
  11. Sepehri Rad, M., Cohen, L. B., Braubach, O., Baker, B. J. Monitoring voltage fluctuations of intracellular membranes. Sci Rep. 8 (1), 6911(2018).
  12. Yang, R. -Z., Wang, D. -D., Li, S. -M., Liu, P. -P., Kang, J. -S. Development and application of a mitochondrial genetically encoded voltage indicator in narcosis. Neurosci Bull. 40 (10), 1529-1544 (2024).
  13. Kumari, A., Nguyen, D. M., Garg, V. Patch-clamp technique to study mitochondrial membrane biophysics. J Gen Physiol. 155 (8), e202313347(2023).
  14. Bayne, A. N., Dong, J., Amiri, S., Farhan, S. M. K., Trempe, J. -F. MTSviewer: A database to visualize mitochondrial targeting sequences, cleavage sites, and mutations on protein structures. PLoS One. 18 (4), e0284541(2023).
  15. Kim, B. B., et al. A red fluorescent protein with improved monomericity enables ratiometric voltage imaging with ASAP3. Sci Rep. 12 (1), 3678(2022).
  16. Evans, S. W., et al. A positively tuned voltage indicator for extended electrical recordings in the brain. Nat Methods. 20 (7), 1104-1113 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wskaźnik potencjału mitochondrialnegopomiar in vivofunkcja mitochondrialnadynamika potencjału błonowegofluorescencyjny czujnik napięciabiałkowy wskaźnik napięciatargetowanie mitochondrialnemonitorowanie w czasie rzeczywistym

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.