Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test biofilmu na obecność Clostridioides difficile z zastosowaniami do odkrywania leków

981 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67913

⸱

8 lipca 2025

 ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology and The South Texas Center for Emerging Infectious Diseases (STCEID), The University of Texas at San Antonio

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Biofilmy patogenu bakteryjnego Clostridioides difficile i ich znaczenie w chorobie nie są dobrze poznane. Ostatnie odkrycia sugerują rolę w nawrotach, podkreślając ich znaczenie. W tym miejscu opisujemy adaptację testu biofilmu w połączeniu z odczytem metabolicznym z zastosowaniami do odkrywania leków przeciwko biofilmom.

Streszczenie

Clostridioides difficile to patogen bakteryjny przewodu pokarmowego, który potrafi wykorzystać środowisko mikrobioty dysbiotycznej do namnażania się, wydzielania toksyn i uszkadzania nabłonka jelitowego. W podgrupie pacjentów z zakażeniem C. difficile (CDI) niepowodzenie leczenia antybiotykiem (15%-30%) lub przeszczepem mikrobioty kałowej (FMT) (<10%). W związku z tym opracowanie dodatkowych interwencji terapeutycznych ma kluczowe znaczenie. Rola biofilmów C. difficile w nawrotach jest niejasna. Jednak biofilmy w innych organizmach są odpowiedzialne za przewlekłą i nawrotową chorobę, co sugeruje, że może tak być również w przypadku nawracających CDI. Stawiamy hipotezę, że biofilmy C. difficile stanowią cenny cel terapeutyczny. Celem przedstawionego tutaj protokołu jest dostosowanie testu tworzenia biofilmu do identyfikacji związków repozycyjnych o aktywności wobec ustalonych biofilmów C. difficile. Protokół udoskonala solidny i powtarzalny test tworzenia biofilmów, łączy go z testem metabolicznym i stosuje do odkrywania leków. Protokół ten przedstawia test tworzenia biofilmu, odczyty biomasy i aktywności metabolicznej, testy wrażliwości leków, badania przesiewowe leków w bibliotece repozycjonowania oraz reprezentatywne wyniki.

Wprowadzenie

Clostridioides difficile to beztlenowy patogen bakteryjny tworzący przetrwalniki, zdolny do wyrządzenia poważnych szkód w ludzkim przewodzie pokarmowym (GI) poprzez wytwarzanie toksyn. C. difficile jest odpowiedzialny za prawie pół miliona przypadków rocznie, z ~ 30 000 ofiar śmiertelnych (CDC, 2015). Leczenie zakażenia C. difficile (CDI) wiąże się ze znacznymi kosztami dla i tak już napiętego systemu opieki zdrowotnej (~4,8 miliarda dolarów)1,2,3. Osoby najbardziej zagrożone to osoby z immunosupresją, narażeniem na antybiotyki i/lub osoby starsze, wszystkie populacje, które nadal znacznie się rozszerzają zarówno w USA, jak i na całym świecie 4,5,6,7.

C. difficile jest wysoce zależne od statusu mikrobioty przewodu pokarmowego gospodarza, dlatego antybiotykoterapia jest kluczowym czynnikiem predysponującym do CDI. Identyfikacja opornych na antybiotyki izolatów klinicznych C. difficile dodatkowo komplikuje leczenie8,9,10. Co więcej, od 15% do 30% pacjentów leczonych antybiotykami z powodu CDI nie przejdzie początkowego leczenia5,11,12,13,14,15,16. Gdy u pacjenta wystąpi epizod nawrotu, prawdopodobieństwo wystąpienia epizodów nawrotu wzrasta do 45%-64% (schody ruchome nawrotu) i towarzyszy mu zwiększone ryzyko dalszych niepowodzeń leczenia16,17. Co ważne, większość przypadków nawrotu CDI jest spowodowana przez oryginalny szczep, który zapoczątkował pierwszy epizod infekcji u hosta18,19, co sugeruje kontynuację kolonizacji przez C. difficile nawet po skutecznym leczeniu. Chociaż wykazano, że zarodniki utrzymują się w przewodzie pokarmowym i prowadzą do nawrotów choroby w modelach ex vivo i mysich20, biofilmy C. difficile i ich rola w chorobie i nawrotach są niedostatecznie zbadane. Biofilmy to zbiorowiska drobnoustrojów chronione przez samodzielnie wytwarzaną macierz zewnątrzkomórkową, co sprawia, że są one wysoce odporne na szkodliwe czynniki środowiskowe, takie jak antybiotykoterapia i reakcje immunologiczne21. Ponadto tworzenie się biofilmu jest istotnym czynnikiem wirulencji22,23,24,25 oraz w infekcjach bakteryjnych, takich jak te wywoływane przez Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa, biofilmy mają kluczowe znaczenie w nawrotach i przewlekłych objawach26,27. Ostatnio zasugerowano, że biofilmy C. difficile są rezerwuarem nawracających infekcji28,29,30 i dlatego stanowią cel o wysokiej wartości w leczeniu i/lub zapobieganiu nawrotom CDI.

Obecne modele do badania biofilmów C. difficile obejmują modele biofilmów kolonijnych31,32, microfermentors33, chemostat gut models34,35, oraz systemy hodowli płynnych wykorzystujące kolby lub płytki studzienkowe36,37. Wszystkie te modele dostarczyły kluczowych informacji na temat biofilmów C. difficile na różnych etapach rozwoju i w różnych środowiskach. Jednak niektóre z tych modeli (np. mikrofermentory, modele jelit chemostatów, biofilmy kolonii) nie nadają się do badań nad lekami. Do tej pory większość badań związanych z odkrywaniem leków koncentrowała się na planktonicznym stylu życia C. difficile38,39,40,41. W związku z tym opisany tutaj protokół ma na celu dostosowanie, standaryzację i walidację istniejącego modelu biofilmu z 96-dołkową płytką w celu opracowania platformy dla bibliotek przesiewowych w celu identyfikacji repozycjonowalnych cząsteczek ze zdolnością do zabijania ustalonych (24-godzinnych) biofilmów C. difficile. Walidację protokołu przeprowadzono poprzez porównanie możliwości tworzenia biofilmu między szczepem przystosowanym laboratoryjnie (630 Δerm) a epidemicznym izolatem klinicznym (szczep UK1 wyizolowany podczas wybuchu epidemii w 2006 r. w szpitalu Stoke-Mandeville w Wielkiej Brytanii42). Tworzenie biofilmu określono ilościowo za pomocą klasycznego testu fioletu krystalicznego do pomiaru biomasy i testu metabolicznego do pomiaru żywotności biofilmów. Zidentyfikowano znaczące różnice w zdolnościach do tworzenia biofilmu między szczepami, co sugeruje potencjalne implikacje kliniczne. Ponadto test wykorzystano do określenia profili wrażliwości na antybiotyki ustalonych biofilmów. Wreszcie, jako dowód słuszności koncepcji, przebadano zestaw priorytetów Global Health od Medicines for Malaria Venture (MMV), organizacji non-profit zajmującej się odkrywaniem nowych terapii przeciwko zaniedbanym chorobom, takim jak malaria, w celu zidentyfikowania związków o aktywności przeciwko ustalonym biofilmom C. difficile. Opisany tutaj protokół dostosowuje i weryfikuje klasyczny test biofilmu do stosowania jako platforma przesiewowa leków ukierunkowana na dojrzałe biofilmy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie komórek do badania biofilmu

UWAGA: Clostridioides difficile jest ludzkim patogenem i wymaga zabezpieczenia BSL-2.

UWAGA: Zarodniki użyte do tego badania zostały nabyte od dr Carol Kumamoto z Tufts University School of Medicine. Zapasy zarodników C. difficile zostały przygotowane zgodnie z wcześniejszym opisem43,44,45. Zarodniki są następnie rozdzielane jako objętości 10 μl do probówek PCR w celu rozdrobnienia płytek. Wszystkie pożywki i sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS) wymagane w doświadczeniu powinny być wstępnie zredukowane w komorze beztlenowej na 24 godziny przed użyciem. Osiąga się to poprzez poluzowanie nakrętki butelki zawierającej pożywkę lub PBS wewnątrz komory.

  1. Wstępnie zmniejsz płytkę agarową Brain Heart Infusion uzupełnioną 0,1% (w/v) taurocholanem i 0,1% (w/v) L-cysteiną (BHIS) w komorze beztlenowej, najlepiej przez noc lub przez co najmniej 3 godziny, aby umożliwić pełną redukcję. Ustawić temperaturę komory beztlenowej na 37 °C.
  2. Podgrzewać probówkę PCR zawierającą 10 μl zarodników przez 20 minut w temperaturze 70 °C. Można to zrobić w łaźni wodnej lub termocyklerze.
  3. Wprowadzić zarodniki do komory beztlenowej, wymieszać delikatnie pipetując 5x-6x i odpipetować 10 μl na wstępnie zredukowaną płytkę BHIS. Wykonaj serię czterech kwadrantów, jak opisano wcześniej46, i inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 °C (temperatura komory beztlenowej).
  4. Po 24 godzinach wzrostu powinny być widoczne izolowane kolonie. Wybierz pojedynczą kolonię i za pomocą jednorazowej pętli przenieś do probówki zawierającej 10 ml płynu BHIS. Inkubować przez noc (14-18 godzin).
  5. Określić gęstość komórek, seryjnie rozcieńczając nocną kulturę w komorze.
    1. Wykonaj 10-krotne rozcieńczenie nocnej kultury. Rozcieńczenie 10:3 daje policzalną próbkę dla każdego ze szczepów wykorzystanych w tym protokole. Jednak standaryzacja tego etapu może być wymagana w przypadku izolatów klinicznych z różnicami we wzroście.
    2. Wyjąć probówki z komory beztlenowej, umieścić 10 μl każdej próbki w hemocytometrze i policzyć za pomocą mikroskopu jasnego pola, zgodnie z opisem producenta hemocytometru.
    3. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby określić stężenie komórek po zliczeniu.

2. Tworzenie biofilmu

UWAGA: Chociaż ten protokół można dostosować do różnych rozmiarów odwiertów, został zoptymalizowany dla platformy 96-dołkowej. Jeśli rozmiar studzienki zostanie zmodyfikowany, stężenie komórek będzie musiało zostać dostosowane w oparciu o powierzchnię studzienki.

  1. Po określeniu stężenia komórek z hodowli nocnej, dostosuj stężenie komórek do 1 x 107 komórek/ml w BHIS (uzupełnione 10% (w/v) L-cysteiną i 0,1M glukozy).
    UWAGA: Wcześniej wykazano, że suplementacja glukozą o 0,1 mln zwiększa tworzenie biofilmu przez szczep C. difficile 630 Δerm47. Dla tego protokołu stężenie 1 x 107 komórek/ml zostało wybrane po przetestowaniu różnych stężeń początkowych (Rysunek 1). Silne tworzenie biofilmu można osiągnąć bez suplementacji glukozy.
  2. Dozować 100 μl komórek do studzienek 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania (płaskie dno i hodowla tkankowa poddana obróbce), pozostawiając kolumny kontrolne (tylko komórki) i ślepą (tylko pożywki). Inkubować przez 24 godziny w komorze beztlenowej (37 °C).
    1. Jeśli parowanie pożywki stanie się problemem, umieść płytki biofilmu z dala od jakiegokolwiek urządzenia grzewczego. Alternatywnie można umieścić biofilmy w dodatkowym pojemniku lub przykryć przepuszczalnymi 96-dołkowymi membranami płytkowymi.
  3. Delikatnie wyjmij pożywkę ze wszystkich studzienek, zaczynając od półfabrykatu. Spowoduje to usunięcie nieprzylegających komórek i pozostawienie biofilmu. Ten krok ma kluczowe znaczenie, ponieważ interesujące są tylko komórki w biofilmie.
  4. Delikatnie przemyj biofilmy 2x 200 μl wstępnie zredukowanego PBS. Aby delikatnie wykonać to płukanie, lekko przechyl 96-dołkową płytkę, włóż końcówki pipet do ścianki studzienki, przesuń końcówki blisko dna studzienki bez skrobania dna i powoli zaciśnij. Jeśli PBS pozostanie na dole, powtórz proces ponownie. Na tym etapie można usunąć nieprzylegające komórki i jest to normalne. Wyjąć PBS przed wyjęciem płytki z komory beztlenowej.
  5. W tym momencie należy użyć biofilmów do: pomiarów biomasy (patrz krok 3), pomiarów aktywności metabolicznej (patrz krok 4), wrażliwości na leki i badań przesiewowych leków (patrz krok 5).
    UWAGA: Protokół ten został zatwierdzony dla laboratoryjnie dostosowanego szczepu 630 Δerm i szczepu epidemic UK1. Odrębne izolaty i szczepy kliniczne mogą wykazywać słabą zdolność do tworzenia biofilmu. Aby zminimalizować przerwanie biofilmu, umyj PBS 1x zamiast 2x i zmniejsz objętość prania do 100 μL.

3. Pomiar biomasy biofilmu za pomocą testu fioletu krystalicznego

UWAGA: Barwienie na fiolet krystaliczny było oparte na wcześniej opisanym protokole48.

  1. Po umyciu biofilmów w komorze beztlenowej (patrz krok 2.4) należy zdjąć płytkę i przenieść ją do dygestorium chemicznego.
  2. Aby utrwalić biofilmy, delikatnie dodaj 150 μl metanolu do każdej studzienki. Przykryj talerz pokrywką na 10 min.
  3. Usuń metanol i pozostaw studzienki do całkowitego wyschnięcia ze zdjętą pokrywą. Powinno to zająć od 30 minut do 45 minut.
  4. Dodaj 100 μl 0,3% fioletu krystalicznego do wszystkich studzienek i bejcuj przez 10 minut. Ostrożnie usuń fiolet krystaliczny, aby zapobiec zabrudzeniu krawędzi i ścian studzienki, ponieważ może to wpłynąć na odczyt.
  5. Pozostaw płytkę do wyschnięcia ze zdjętą pokrywką. Powinno to zająć od 30 minut do 45 minut.
  6. Umyj studzienki 3x 200 μl wody destylowanej i pozostaw płytkę do całkowitego wyschnięcia. Powinno to zająć od 30 do 45 minut.
  7. Po wyschnięciu użyj mikroskopu jasnego pola, aby zobrazować biofilmy (Rysunek 2A). Chociaż ten krok jest opcjonalny, pozwala na dokładniejszą obserwację komórek w biofilmie.
    1. Umieść 96-dołkową płytkę na odwróconym mikroskopie jasnego pola za pomocą adaptera płytki. Zidentyfikuj reprezentatywne studzienki dla każdego badanego szczepu.
    2. Zrób zdjęcia dla każdej studzienki w żądanym powiększeniu. Obrazy przedstawione w tym protokole zostały wykonane w 40-krotnym powiększeniu.
  8. Po uzyskaniu pożądanych obrazów przenieś płytkę z powrotem do dygestorium chemicznego w celu usunięcia plam
    9. .
  9. Aby odbarwić biofilm, dodaj 150 μl 33% kwasu octowego i umieść na wytrząsarce na średnich obrotach na 10 minut.
  10. Usunąć 90 μl z każdej studzienki i przenieść do nowej 96-dołkowej płytki z płaskim dnem. Odczyt absorbancji przy długości fali 595 nm za pomocą czytnika płytek (Rysunek 2B).

4. Pomiar żywotności biofilmu za pomocą barwnika metabolicznego PrestoBlue

  1. Przeprowadzić pomiar aktywności metabolicznej zgodnie z protokołem producenta dla testu z kluczowymi modyfikacjami. Ogrzać czytnik płytek do temperatury 37 °C przed przygotowaniem biofilmów do oznaczenia. Zalecany jest czytnik płytek zdolny do pomiaru fluorescencji.
    UWAGA: Alternatywnie, aktywność metaboliczną można odczytać przy OD600; Nie stwierdziliśmy jednak, aby to podejście było wystarczająco czułe dla tych testów. Zaleca się, aby użytkownicy zapoznali się z protokołem producenta i w razie potrzeby dokonali standaryzacji.
  2. Po umyciu biofilmów PBS w komorze beztlenowej, jak opisano powyżej (patrz krok 2.4), wyjąć płytkę z komory.
  3. Wraz z płytką usuń 9 ml wstępnie zredukowanego BHIS (uzupełnionego 10% (w/v) L-cysteiną i 0,1 M glukozą).
  4. Szybko dodaj 1 ml odczynnika PrestoBlue do 9 ml wstępnie zredukowanego BHIS i wiruj. Nie należy wstępnie redukować odczynnika, ponieważ może to wpłynąć na zabarwienie odczynnika (patrz Dyskusja).
  5. Do każdej studzienki dodać 100 μl mieszaniny BHIS-PrestoBlue. Umieścić płytkę w czytniku płytek z następującymi ustawieniami: Temperatura 37 °C, typ testu jako Kinetyczny; czas czytania jako 30 min; częstotliwość odczytu co 2 minuty; Intensywność fluorescencji w zależności od rodzaju dostępnego czytnika płytek. Pomiary opisane w tym protokole zostały wykonane przy użyciu długości fal wzbudzenia/emisji odpowiednio 560 nm/ 590 nm.
  6. Po przeczytaniu wyrzuć talerze.
  7. Po uzyskaniu wartości fluorescencji z odczytów płytki należy użyć ślepych studzienek (tylko pożywki), aby odjąć szum od wszystkich dołków na próbki. Następnie należy podzielić studzienki biofilmu poddane działaniu każdego związku przez studzienkę kontrolną zawierającą niepoddany działaniu (100%) biofilm w celu uzyskania aktywności metabolicznej.

5. Dodawanie leków do biofilmów

UWAGA: Opisana poniżej konfiguracja może być zmodyfikowana do testów wrażliwości na leki i badań przesiewowych leków o stałym stężeniu. W przypadku obu metod opisanych poniżej zalecany jest test PrestoBlue.

  1. Oznaczanie minimalnych stężeń hamujących (MIC) różnych antybiotyków
    UWAGA: Biofilmy są przetwarzane przez okres 48 godzin, co zwiększa prawdopodobieństwo zanieczyszczenia. Bardzo ważne jest, aby najpierw przetworzyć ślepe studzienki i postępować zgodnie z procedurami aseptycznymi. Wartości MIC podane w literaturze dla innych szczepów C. difficile oraz testy odpowiedzi na dawkę testową wykorzystano do poinformowania o początkowych stężeniach antybiotyków dla testów MIC przedstawionych w niniejszym protokole. Takie podejście będzie przydatne do określania początkowych stężeń antybiotyków podczas pracy z izolatami klinicznymi.
    1. Przepłukać dojrzałe (24-godzinne) biofilmy PBS w komorze beztlenowej, jak opisano powyżej (patrz krok 2.4).
    2. Dodać 200 μl wstępnie zredukowanej pożywki BHIS (uzupełnionej 10% (w/v) L-cysteiną i 0,1M glukozą) zawierającej dwukrotne rozcieńczenia badanego antybiotyku do każdej studzienki z wyjątkiem kolumny kontrolnej (tylko komórki) i ślepej próby (tylko pożywka) na płytce.
    3. Inkubować przez dodatkowe 24 godziny. W tym badaniu do walidacji testu wykorzystano wankomycynę (stężenie początkowe 200 μg/ml), metronidazol (stężenie początkowe 16 μg/ml) i fidaksomycynę (stężenie początkowe 4 μg/ml). Wartości MIC podano w tabeli 1.
    4. Aby zapobiec wysychaniu płyt, należy trzymać się z dala od urządzenia grzewczego w komorze beztlenowej lub użyć membrany przepuszczającej gaz.
      UWAGA: Alternatywnie można użyć wstępnie zredukowanego PBS lub fosy pożywki (300 μl) na zewnętrznych dołkach płyty.
    5. Po 24 godzinach inkubacji z lekami usunąć pożywkę i delikatnie przemyć biofilmy 1x PBS. Przetwarzaj biofilmy za pomocą testu fioletu krystalicznego lub testu PrestoBlue.
  2. Biblioteki leków przesiewowych
    1. Przepłukać dojrzałe (24-godzinne) biofilmy PBS w komorze beztlenowej, jak opisano powyżej (patrz krok 2.4).
    2. Dodać 200 μl pożywki zawierającej stałe stężenie związków z biblioteki leków do każdego dołka, z wyjątkiem kolumn kontrolnych (komórki w pożywce bez antybiotyków) i ślepej próby (pożywki bez antybiotyków) na płytce. Inkubować przez dodatkowe 24 godziny. Aby zapobiec wysychaniu płyt, należy trzymać z dala od urządzenia grzewczego w komorze beztlenowej.
    3. Po 24 godzinach inkubacji z lekami usunąć pożywkę i delikatnie przemyć biofilmy 1x PBS. Przetwarzaj biofilmy za pomocą testu fioletu krystalicznego lub testu metabolicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Celem opisanego powyżej protokołu jest adaptacja i walidacja modelu tworzenia biofilmu na płytkach 96-dołkowych jako platformy do przesiewania leków w celu identyfikacji związków do repositioningu wykazujących aktywność przeciwko uformowanym biofilmom C. difficile. Określono wpływ różnych gęstości komórek (104, 105, 106 i 107 cells/mL) na tworzenie biofilmu, a samo tworzenie biofilmu ilościowo określono za pomocą barwienia fioletem krys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Powstawanie biofilmu C. difficile i rola, jaką odgrywa w chorobie, nie są dobrze poznane. Ostatnie odkrycia sugerują rolę biofilmów w nawrocie choroby28,34. Tworzenie biofilmu jest istotnym czynnikiem wirulencji 22,23,24,25, a w infekcjach bakteryjnych, takich jak te wywołane przez Staphylococcus aureus i Pseudomo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Podziękowania

J.A.R. zaprojektował badanie i protokół oraz napisał rękopis. A.S. i P.Z. przeprowadzili eksperymenty i pomogli udoskonalić protokół. Praca ta była wspierana przez fundusze start-upowe z University of Texas at San Antonio (UTSA) dla J.A.R., a A.S. była wspierana przez program UTSA MARC (T34GM145507). Autorzy pragną podziękować Medicines for Malaria Venture (MMV, Szwajcaria) za udostępnienie biblioteki Global Health Priority Box.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
KWAS OCTOWY SAF-CT ACS 500MLFisher ScientificA38S500
AGAR BAKTERIOLOGICZNY GR 1KGFisher ScientificAC443570010
Czytnik płytek BioTek Synergy H1Fisher ScientificBTH1MG
BUTELKA EKSTRAKTU DROŻDŻOWEGO 500GFisher ScientificDF0127179
NAPAR Z SERCA MÓZGUFisher Scientific
Crystal Violet USP grade 100GVWR97061-850Do barwienia biofilmów do testów biomasy
CytoOne 96-dołkowa płytka TC, płaska dno, przezroczysta, oddzielnie owinięta z pokrywkami, 50/opakowanieUSA ScientificCC7682-7596
D-(+)-Glukoza, bezwodnaFisher Scientific50712744
Dimetylosulfotlenek do biologii molekularnej (DMSO)Millipore SigmaD8418-250ML
FIDAXOMICIN 250MGFisher ScientificAC468312500
L-CYSTEINA 98+% 1KGFisher Scientific AAA104350BDla podłoża C. difficile
METANOL 99,8 AKROSEAL 1LTFisher ScientificAC364390010
METRONIDAZOL, 99% 5GRFisher ScientificAC210340050
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS) 10XFisher ScientificBP3991
Odczynnik do żywotności komórek PrestoBlueFisher ScientificA13262
SILVERSEAL OPAQUE ADHES 100/CSFisher Scientific7000379Służy do uszczelniania płytek leków matki i córki przed przechowywaniem
TAUROCHOLAN SODU 100MG VWR100291-598
WANKOMYCYNAFisher ScientificBP29581
CM1135R

Bibliografia

  1. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S88-S92 (2012).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
  3. Sheitoyan-Pesant, C., et al. Clinical and healthcare burden of multiple recurrences of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 62 (5), 574-580 (2016).
  4. Abou Chakra, C. N., Pepin, J., Sirard, S., Valiquette, L. Risk factors for recurrence, complications and mortality in Clostridium difficile infection: A systematic review. PLoS One. 9 (6), e98400(2014).
  5. Aslam, S., Hamill, R. J., Musher, D. M. Treatment of Clostridium difficile-associated disease: Old therapies and new strategies. Lancet Infect Dis. 5 (9), 549-557 (2005).
  6. Brown, K. A., Khanafer, N., Daneman, N., Fisman, D. N. Meta-analysis of antibiotics and the risk of community-associated Clostridium difficile infection. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2326-2332 (2013).
  7. Dicks, L. M. T., Mikkelsen, L. S., Brandsborg, E., Marcotte, H. Clostridium difficile, the difficult "kloster" fuelled by antibiotics. Curr Microbiol. 76 (6), 774-782 (2019).
  8. Sholeh, M., et al. Antimicrobial resistance in Clostridioides (Clostridium) difficile derived from humans: A systematic review and meta-analysis. Antimicrob Resist Infect Control. 9 (1), 158(2020).
  9. Peng, Z., et al. Update on antimicrobial resistance in Clostridium difficile: Resistance mechanisms and antimicrobial susceptibility testing. J Clin Microbiol. 55 (7), 1998-2008 (2017).
  10. Dilnessa, T., Getaneh, A., Hailu, W., Moges, F., Gelaw, B. Prevalence and antimicrobial resistance pattern of Clostridium difficile among hospitalized diarrheal patients: A systematic review and meta-analysis. PLoS One. 17 (1), e0262597(2022).
  11. Hopkins, R. J., Wilson, R. B. Treatment of recurrent Clostridium difficile colitis: A narrative review. Gastroenterol Rep (Oxf). 6 (1), 21-28 (2018).
  12. Bartlett, J. G. Treatment of antibiotic-associated pseudomembranous colitis. Rev Infect Dis. 6 (Suppl 1), S235-S241 (1984).
  13. Merino, E., Salavert, M. Treatment of Clostridioides difficile infection: From guidelines to clinical practice. Rev Esp Quimioter. 35 (Suppl 3), 97-101 (2022).
  14. Pepin, J., et al. Increasing risk of relapse after treatment of Clostridium difficile colitis in Quebec, Canada. Clin Infect Dis. 40 (11), 1591-1597 (2005).
  15. Cornely, O. A., Miller, M. A., Louie, T. J., Crook, D. W., Gorbach, S. L. Treatment of first recurrence of Clostridium difficile infection: Fidaxomicin versus vancomycin. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S154-S161 (2012).
  16. Mcfarland, L. V., Elmer, G. W., Surawicz, C. M. Breaking the cycle: Treatment strategies for 163 cases of recurrent Clostridium difficile disease. Am J Gastroenterol. 97 (7), 1769-1775 (2002).
  17. Mcfarland, L. V., et al. A randomized placebo-controlled trial of Saccharomyces boulardii in combination with standard antibiotics for Clostridium difficile disease. JAMA. 271 (24), 1913-1918 (1994).
  18. Kamboj, M., et al. Relapse versus reinfection: Surveillance of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 53 (10), 1003-1006 (2011).
  19. Figueroa, I., et al. Relapse versus reinfection: Recurrent Clostridium difficile infection following treatment with fidaxomicin or vancomycin. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S104-S109 (2012).
  20. Castro-Cordova, P., et al. Entry of spores into intestinal epithelial cells contributes to recurrence of Clostridioides difficile infection (vol 12, 1140, 2021). Nat Commu. 13 (1), 2456(2021).
  21. Orazi, G., O'toole, G. A. "It takes a village": Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms. J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00619 (2019).
  22. Costerton, J. W., et al. Bacterial biofilms in nature and disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
  23. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
  24. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  25. Donlan, R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  26. Scherr, T. D., Heim, C. E., Morrison, J. M., Kielian, T. Hiding in plain sight: Interplay between Staphylococcal biofilms and host immunity. Front Immunol. 5, 37(2014).
  27. Thomsen, K., et al. Animal models of chronic and recurrent Pseudomonas aeruginosa lung infection: Significance of macrolide treatment. Apmis. 130 (7), 458-476 (2022).
  28. Normington, C., et al. Biofilms harbour Clostridioides difficile, serving as a reservoir for recurrent infection. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 16(2021).
  29. Frost, L. R., Cheng, J. K. J., Unnikrishnan, M. Clostridioides difficile biofilms: A mechanism of persistence in the gut. PLoS Pathog. 17 (3), e1009348(2021).
  30. Meza-Torres, J., Auria, E., Dupuy, B., Tremblay, Y. D. N. Wolf in sheep's clothing: Clostridioides difficile biofilm as a reservoir for recurrent infections. Microorganisms. 9 (9), 1922(2021).
  31. James, G. A., et al. Analysis of Clostridium difficile biofilms: Imaging and antimicrobial treatment. J Antimicrob Chemother. 73 (1), 102-108 (2018).
  32. Brauer, M., et al. What's a biofilm?-how the choice of the biofilm model impacts the protein inventory of Clostridioides difficile. Front Microbiol. 12, 682111(2021).
  33. Poquet, I., et al. Clostridium difficile biofilm: Remodeling metabolism and cell surface to build a sparse and heterogeneously aggregated architecture. Front Microbiol. 9, 2084(2018).
  34. Crowther, G. S., et al. Comparison of planktonic and biofilm-associated communities of Clostridium difficile and indigenous gut microbiota in a triple-stage chemostat gut model. J Antimicrob Chemother. 69 (8), 2137-2147 (2014).
  35. Crowther, G. S., et al. Development and validation of a chemostat gut model to study both planktonic and biofilm modes of growth of Clostridium difficile and human microbiota. PLoS One. 9 (2), e88396(2014).
  36. Dawson, L. F., Valiente, E., Faulds-Pain, A., Donahue, E. H., Wren, B. W. Characterisation of Clostridium difficile biofilm formation, a role for spo0a. PLoS One. 7 (12), e50527(2012).
  37. Dubois, T., et al. A microbiota-generated bile salt induces biofilm formation in Clostridium difficile. NPJ Biofilms Microbiomes. 5 (1), 14(2019).
  38. Abdelkhalek, A., Mohammad, H., Mayhoub, A. S., Seleem, M. N. Screening for potent and selective anticlostridial leads among fda-approved drugs. J Antibiot (Tokyo). 73 (6), 392-409 (2020).
  39. Chen, J., Lu, Y., Du, Y., Wang, H., Wu, Q. Recent development of small-molecular inhibitors against Clostridioides difficile infection. Bioorg Chem. 125, 105843(2022).
  40. Katzianer, D. S., Yano, T., Rubin, H., Zhu, J. A high-throughput small-molecule screen to identify a novel chemical inhibitor of Clostridium difficile. Int J Antimicrob Agents. 44 (1), 69-73 (2014).
  41. Pal, R., Dai, M., Seleem, M. N. High-throughput screening identifies a novel natural product-inspired scaffold capable of inhibiting Clostridioides difficile in vitro. Sci Rep. 11 (1), 10913(2021).
  42. Sun, X., et al. Mouse relapse model of Clostridium difficile infection. Infect Immun. 79 (7), 2856-2864 (2011).
  43. Edwards, A. N., Mcbride, S. M. Isolating and purifying Clostridium difficile spores. Methods Mol Biol. 1476, 117-128 (2016).
  44. Romo, J. A., Kumamoto, C. A. Characterization of the effects of Candida gastrointestinal colonization on Clostridioides difficile infection in a murine model. Methods Mol Biol. 2542, 271-285 (2022).
  45. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. Chapter 9 (Unit9A), 1(2009).
  46. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Plating methods. J Vis Exp. (63), e3064(2012).
  47. Dapa, T., Unnikrishnan, M. Biofilm formation by Clostridium difficile. Gut Microbes. 4 (5), 397-402 (2013).
  48. O'toole, G. A. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis Exp. (47), e2437(2011).
  49. Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J Bacteriol. 195 (3), 545-555 (2013).
  50. Morais, M., et al. Comparative biofilm-forming ability between Clostridioides difficile strains isolated in Latin America and the epidemic nap1/027 strain. Front Cell Infect Microbiol. 12, 1033698(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

tworzenie biofilmutest metabolicznywrażliwość na lekipomiar biomasyprzesiewanie lekównawracająca infekcjacel terapeutyczny

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.