Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie sztywności błony retikulum endoplazmatycznego związanego z mitochondriami za pomocą indukcyjnych biosensorów FRET

132 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67914

⸱

7 sierpnia 2026

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, MassGeneral Institute for Neurodegenerative Disease, Henry and Allison McCance Center for Brain Health, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School,

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę pomiaru wartości FRET indukcyjnych biosensorów FRET ukierunkowanych na RE (oznaczonych CFP) lub mitochondria (oznaczone YFP) in vitro, aby ocenić szczelność błon mitochondriów związanych z RE (MAMs), która wpływa na generację Aβ, a metoda ta może być wykorzystana do wstępnego przesiewania syntetycznych lub naturalnych czynników modyfikujących MAM jako potencjalne leki przeciw Alzheimerowi.

Streszczenie

Wiele badań wykazało, że liczba, długość i szerokość szczeliny (grubość) kontaktów ER-mitochondria, lub błon związanych z mitochondriami (MAM), wpływa na ich role biologiczne. Nasze wcześniejsze prace wykazały, że stabilizacja ciasnych MAM, charakteryzujących się szerokością szczeliny około 7 nm, prowadzi do wzrostu poziomu amyloidu β (Aβ), podczas gdy obecność luźnych MAM, o szerokości szczeliny około 40 nm, zmniejsza produkcję Aβ w trójwymiarowym (3D) neuronalnym modelu choroby Alzheimera (AD). Aby zbadać wpływ MAM o różnych szerokościach szczelin, ER- i mitochondria-ukierunkowane biosensory FRET (Förster Resonance Energy Transfer) - ER-CFP (cyjanowy białkowy fluorofor) i Mito-YFP (żółty białkowy fluorofor) - zostały opracowane w celu ilościowego określenia ciasnych MAM (szerokość szczeliny poniżej 10 nm) w przeciwieństwie do luźnych lub nie-MAM. FRET występuje, gdy donor fluoroforu (CFP) i akceptor fluoroforu (YFP) znajdują się w odległości 10 nm od siebie, co czyni ten system odpowiednim do oceny bliskości MAM. Ten protokół opisuje zastosowanie spektralnej raportowej FRET do mierzenia stopnia formowania się ciasnych MAM.

Wprowadzenie

Kontakty między siateczką śródpłazmoną związane z mitochondriami (MERCs), które są izolowane biochemicznie jako błony ER związane z mitochondriami (MAMs), są zaangażowane w kilka zaburzeń neurodegeneracyjnych, w tym w chorobę Alzheimera (AD)1. Niedawno zaproponowany „hipotezy MAM” sugeruje, że MAMs odgrywają centralną rolę w generowaniu amyloidu β (Aβ), inicjując w ten sposób patogenną kaskadę choroby Alzheimera. Ta kaskadą obejmuje tworzenie się splątków neurofibrylarnych (NFTs), dyshomeostazy wapnia i neurozapalenie2. MAMs składają się z bogatych w cholesterol, podobnych do raftów lipidowych mikrodomen w siateczki śródplazmowej i zewnętrznej błonie mitochondrialnej (OMM), połączonych przez specyficzne białka kotwiczące, które przyczyniają się do ich różnorodności strukturalnej i funkcjonalnej3. Stabilizacja kontaktów ER-mitochondria wpływa na różne procesy komórkowe, w tym na sygnalizację wapnia ER i apoptozę4,5. Szacuje się, że 5%-20% mitochondria tworzy fizyczne kontakty z ER w celu ustanowienia MAMs6. Kilka badań wskazało, że liczba, długość i szerokość przerwy (grubość) między ER i mitochondriami w miejscach MAM są ważnymi determinantami ich funkcyjnych ról. Kryo-mikroskopia elektronowa i analizy in vivo wątroby myszy wykazały, że stan metaboliczny hepatocytów modyfikuje zarówno grubość (ważącą od 14 nm do 20 nm) jak i długość (ważącą od 145 nm do 270 nm) MAMs7.

MAMs są również wschodzącymi jako potencjalnymi celami terapeutycznymi dla różnych zaburzeń, w tym raka i zaburzeń metabolicznych. Grubość MAM lub szerokość przerwy reguluje przeżycie komórek. Stałościowe stabilizatory MAM, MAM 1X i MAM 9X, zaprojektowane w celu stabilizacji ciasnych (6 nm ± 1 nm szerokości przerwy) i luźnych MAM (24 nm ± 3 nm szerokości przerwy) odpowiednio, wykazały, że stabilizacja ciasnych MAM dramatycznie zwiększyła generację Aβ w nowym 3D modelu hodowli neuronalnej choroby Alzheimera. W przeciwieństwie do tego, stabilizacja luźnych MAM nie miała wpływu8. W ten sposób, konwersja stabilizacji ciasnych MAM na luźne MAM może być korzystna w celu obniżenia patogenezy amyloidowej. Strukturalne i funkcjonalne złożoności oraz brak precyzyjnej ilościowej analizy stopnia stabilizacji MAM sprawiają, że dostosowanie MAM dla odkrycia leków jest wyzwaniem. Nowatorska analiza oparta na obrazowaniu komórek żywych i kymografii prędkości aksonalnej mitochondria związanych z ER wykazała, że prędkość aksonalna mitochondria może być użyta jako wskaźnik do ilościowego pomiaru stabilizacji MAM, ponieważ ściślejszy kontakt z ER znacząco zmniejszył prędkość aksonalną mitochondria w porównaniu z wolnymi mitochondriami8,9. Korzystając z indukowanego stabilizatora MAM w komórkach Neuro 2A (N2AAPP) ekspresujących hAPP8, stwierdziliśmy, że zwężanie przerw MAM zwiększa generację Aβ w sposób zależny od dawki8. Indukcyjne stabilizatory MAM to plazmidy ekspresji kodujące ER-celowe białka biosensorowe oznaczone epitopem CFP (cyjanowy białko fluorescencyjny) i mitochondria-celowe białka biosensorowe oznaczone epitopem YFP (żółte białko fluorescencyjne) połączone z domenami wiązania FK506 rapamycin-indukcyjnego FRB lub 12-kDa FK506-wiązającego białka (FKBP). Białka biosensorowe zostały oznaczone jako ER-CFP i Mito-YFP odpowiednio. CFP jest fluoroforem donorowym, który przenosi energię na akceptorowy fluorofor YFP, gdy są one oddzielone o >10 nm. Komórki (N2AAPP) ekspresujące indukowalne białka biosensorowe zwiększyły generację Aβ po leczeniu rapamyciną8, sugerując, że zwiększenie ciasnych MAM zwiększyło generację Aβ. Te metody będą przydatne do przesiewowych badań małych cząsteczek modulatorów MAM i ich efektywnej koncentracji wymaganej do osiągnięcia stabilizacji optymalnego poziomu ciasnych MAM, które zamienią patogenne („zwiększające Aβ”) w terapeutyczne („obniżające Aβ”) MAM bez całkowitego destabilizowania kontaktów ER i mitochondria, ważnych dla przeżycia komórek.

Model eksperymentalny
W badaniu tym użyto komórek Neuro2A(N2A) ekspresujących konstytutywnie APP751 (N2AAPP). Komórki te uwalniają wykrywalne poziomy Aβ do warunkowego medium (CM) w porównaniu z naiwnymi komórkami N2A. Komórki N2AAPP były utrzymywane w DMEM uzupełnionym o 10% FBS, 100 U/mL penicylinę, 100 µg/mL streptomycynę i 2 mM L-glutaminian uzupełniony o 200 µg/mL G418, jak opisano wcześniej10.

Plazmid ekspresji
Plazmid ekspresji został wygenerowany przez połączenie sekwencji docelowanej na mitochondria oznaczonej YFP (żółte białko fluorescencyjne) białka zakotwiczenia kinazy A ssaków [AKAP1(34-63)] i sekwencji docelowanej na ER oznaczonej CFP (cyjanowe białko fluorescencyjne) fosfatazy fosfo

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Reagenty i sprzęt użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli materiałów.

1.Transfekcja

  1. Transfekuj komórki N2AAPP z plazmidem ekspresji MAM-Tav2A (14-18 h).
    1. Przed rozpoczęciem, wysiej 1 × 106 komórek N2AAPPna dołek płytek 6-dołkowych zawierających szklane pokrywy i utrzymuj komórki w pożywce wzrostowej przez 12-16 h.
    2. Transfekuj 1-3 μg plazmidu MAM-Tav2A (Plik uzupełniający 1) za pomocą reagentu transfekcyjnego Lipofectamine zgodnie z protokołem producenta.
    3. Po 12-16 h transfekcji, przeprowadź leczenie lekami.
      UWAGA: Zawsze upewnij się, że komórki są transfekowane plazmidem ekspresyjnym kodującym tylko donor (ER-CFP) lub akceptor (Mito-YFP) do użycia jako tła FRET.

2. Leczenie lekami

  1. Lecz komórki N2AAPP ekspresujące MAM-Tav2A Rapamyką (Rapa) lub Rapalog (Log) (3-6 h).
    1. Przed leczeniem przygotuj roztwory macierzyste (10 mM) Rapa i Log.
    2. Zmień pożywkę na świeżą zawierającą 0 nM, 100 nM lub 250 nM Rapa lub Log.
    3. Po 3 h leczenia dodaj 3,3% paraformaldehydu (PFA) do utrwalenia komórek.
    4. Przygotuj szkielety do mikroskopi konfokalnej fluorescencyjnej, umieszczając jedną kroplę reagentu antyfade.
    5. Zamontuj pokrywy na kropli i delikatnie dociśnij zaciskiem.
      UWAGA: Szklane pokrywy są kruche i wymagają ostrożności. Jako alternatywę dla szklanych pokryw użyj płytek ze szklanym dnem. Główną wadą używania płytek ze szklanym dnem jest to, że nie można używać reagentu antyfade, co utrudnia obrazowanie z powodu blaknięcia fluoroforów. NIE używaj reagentu antyfade zawierającego DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindol), ponieważ jego niebieska fluorescencja zakłóci FRET między CFP i YFP.

3. Mikroskopia konfokalna do fluorescencyjnego przenoszenia rezonansowej energii (FRET)

  1. Umieść szkielety pod mikroskopem odwróconym i wyreguluj ognisko mikroskopu, aż komórki staną się widoczne.
  2. Zbudź fluorofor za pomocą lasera o długości fali 440 nm i zrób zdjęcia przy emisji 468-503 nm dla donora CFP (FKBP-CFP-ER) lub 525-565 nm dla akceptora YFP (FRB-YFP-Mito).
  3. Wyreguluj intensywność sygnału za pomocą wbudowanego filtra fluorescencyjnego, aż tło się rozproszy (powinno być prawie czyrno).

    4. UWAGA: Do zdobywania obrazów fluorescencyjnych za pomocą mikroskopu konfokalnego użyto oprogramowania NIS Element AR. Zastosowano powiększenie 60x przy rozdzielczości 512 pikseli.
  4. Zapisz obrazy jako pliki.nds.
  5. Przeprowadź spektralną analizę FRET w metodzie ratiometrycznej.

4. Ratiometryczna analiza FRET (6 - 12 h)

UWAGA: Emisję fluorescencyjną z donora ER-CFP (468-503 nm) i akceptora Mito-YFP (525-565 nm) wykryto za pomocą mikroskopu konfokalnego. Oprogramowanie ImageJ zostało użyte do ilościowej oceny średniej intensywności fluorescencji pikseli po odjęciu tła. Obliczono stosunek intensywności emisji YFP do CFP i użyto go jako odczyt dla spektralnej analizy FRET.

  1. Otwórz Image J (Fiji).
  2. Przeciągnij plik.nds na Image J lub kliknij Plik -> Otwórz i wybierz Obraz.
  3. Na następnym ekranie zaznacz pole Podziel kanały.
  4. Kliknij panel C = 0.
  5. Kliknij Analizuj -> Zmieść.
    UWAGA: Zapisz wartość średnią na potrzeby dalszej kalkulacji.
  6. Kliknij Obróbka -> Matematyka -> Odejmij.
  7. Wprowadź wartość średnią.
  8. Powtórz krok 4 dla panelu C = 1.
  9. Kliknij narzędzie selekcji Freehand.
  10. Okrągli zainteresowaną komórkę, a następnie naciśnij Ctrl+T, aby zarejestrować ją w ROI.
  11. Kliknij Pokaż wszystko na dole ROI, aby pokazać to, co już wybrano.
  12. Zaznacz wszystkie zaznaczone komórki i kliknij Zmieść, zapisz te wartości do programu Excel.
  13. Kliknij panel C = 1 i kliknij Pokaż wszystko.
  14. Zaznacz wszystkie komórki i kliknij Zmieść ponownie i zapisz te wartości do osobnej kolumny w programie Excel.
  15. W programie Excel utwórz funkcję, aby umieścić wartości sygnału donora nad odbiorcą (C0/C1). To jest stosunek FRET.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ratiometryczna analiza FRET komórek N2AAPP wzbogaconych metodą FACS, wykazujących ekspresję MAM-Tav2A, wykazała zależny od dawki wzrost poziomu Aβ40 po zastosowaniu rapamycyny8. Rapamycyna działa poprzez hamowanie szlaku sygnalizacyjnego mTOR (mammalian target of rapamycin), co z kolei obniża ekspresję TREM2 (Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 2) w mikrogleju, prowadząc do zmniejszonego oczyszczania z blaszek Aβ w modelach mysich choroby Alzh...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Modulacja MAM jest nowym obszarem badań z potencjalnymi implikacjami dla różnych zaburzeń, w tym raka, zaburzeń metabolicznych i chorób neurodegeneracyjnych13. Wiele substancji farmaceutycznych, w tym antagonista dynieiny LDC-3/Dynarrestin, lek przeciwcukrzycowy metformina i substancja przeciwnowotworowa sulforafan, zakłócają MAM i są obecnie testowane w badaniach przedklinicznych i klinicznych na raka i zaburzenia metaboliczne. Te substancje farmaceutyczne modulowują kontakty ER-mitochondria lub ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Głęboko dziękujemy dr. Rudolphowi E. Tanziemu, profesorowi Massachusetts General Hospital (MGH), za jego pogłębione komentarze dotyczące rękopisu. Dziękujemy dr. Masato Maesakowi, adiunktowi w MGH, za udostępnienie swojej ekspertyzy w dziedzinie testów FLIM. Dziękujemy dr. Györgyowi Hajnóczkyemu, profesorowi Thomas Jefferson University w Filadelfii, za hojne udostępnienie nam plazmidów ekspresyjnych kodujących ER-CFP lub Mito-YFP. To badanie było wspierane przez Cure Alzheimer's Fund dla RB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BSAFisher Scientific501781532
Konfokalny mikroskop Olympus FV3000RS (Tokio, Japonia)N/A
DMEM z suplementem GlutaMAXGibco/Thermo Fisher Scientific10564011
EDTA  Life Technologies41116134
Płytki 6-dołkowe Falcon VWR International41122107
GAPDH Poliklonalne przeciwciałoThermo Fisher ScientificPA1-988
Żelatina VWR International9000-70-8
Geneticin (G418 siarczan)Gibco/Thermo Fisher Scientific10131035
GFP monoclonalne przeciwciałoInvitrogenMA5-15256
Graphpad Prism N/APrism 9, wersja 9.5.0N/A
HeparynaSigma-Aldrich H0200000
Oprogramowanie ImageJ ImageJ 1.53aN/A
Odwrócony mikroskop konfokalny Nikon (C2 Eclipse Ti2)N/A
Lipofectamine2000Invitrogen11668027
MS Excel  Microsoft Excel, wersja 2302N/A
NaCl  Fisher Scientific7647145
NuPAGE 4–12% Bis-Tris gel  InvitrogenNP0321BOX
Penicylina/Streptomycyna/Amfoterycyna B Lonza 17-745E
PhotoshopAdobe Photoshop CC 20.0.10 N/A
Tris-HCL, pH 7.6  Boston BioProducts42000000
Triton X-100  Sigma-AldrichT8787
Trypsyna-EDTAGibco/Thermo Fisher Scientific25200056
Tween 20Fisher Scientific501657287

Bibliografia

  1. Martino Adami, P. V., et al. Perturbed mitochondria-ER contacts in live neurons that model the amyloid pathology of Alzheimer's disease. J Cell Sci. 132 (20), 229906(2019).
  2. Area-Gomez, E., Schon, E. A. On the pathogenesis of Alzheimer's disease: The MAM hypothesis. FASEB J. 31 (3), 864-867 (2017).
  3. Fujimoto, M., Hayashi, T. New insights into the role of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane. Int Rev Cell Mol Biol. 292, 73-117 (2011).
  4. Prudent, J., et al. MAPL SUMOylation of Drp1 stabilizes an ER/mitochondrial platform required for cell death. Mol Cell. 59 (6), 941-955 (2015).
  5. Carpio, M. A., et al. controls apoptosis by Ca2+ through ER-mitochondrial contact sites. Cell Rep. 34 (10), 108827(2021).
  6. Degechisa, S. T., Dabi, Y. T., Gizaw, S. T. The mitochondrial associated endoplasmic reticulum membranes: A platform for the pathogenesis of inflammation-mediated metabolic diseases. Immun Inflamm Dis. 10 (7), e647-e658 (2022).
  7. Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: Structure and signaling functions. Trends Cell Biol. 28 (7), 523-540 (2018).
  8. Zellmer, J. C., et al. Stabilization of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes regulates Aβ generation in a three-dimensional neural model of Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 21 (2), e14417(2024).
  9. Zellmer, J. C., Lomoio, S., Tanzi, R. E., Bhattacharyya, R. Quantitative analysis of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) stabilization in a neural model of Alzheimer's disease (AD). J Vis Exp. (215), e66129(2025).
  10. Bhattacharyya, R., et al. The neuronal-specific isoform of BIN1 regulates beta-secretase cleavage of APP and Abeta generation in a RIN3-dependent manner. Sci Rep. 12 (1), 3486-3500 (2022).
  11. Shi, Q., et al. Microglial mTOR activation upregulates Trem2 and enhances β-amyloid plaque clearance in the 5XFAD Alzheimer's disease model. J Neurosci. 42 (27), 5294-5313 (2022).
  12. Wilmington, S. R., Matouschek, A. An inducible system for rapid degradation of specific cellular proteins using proteasome adaptors. PLoS One. 11 (4), e0152679(2016).
  13. Magalhaes Rebelo, A. P., et al. Chemical modulation of mitochondria-endoplasmic reticulum contact sites. Cells. 9 (7), 1637-1655 (2020).
  14. De Vos, K. J., et al. VAPB interacts with the mitochondrial protein PTPIP51 to regulate calcium homeostasis. Hum Mol Genet. 21 (6), 1299-1311 (2012).
  15. Yang, M., et al. Mitochondria-associated ER membranes: The origin site of autophagy. Front Cell Dev Biol. 8, 595(2020).
  16. Filadi, R., et al. Mitofusin 2 ablation increases endoplasmic reticulum-mitochondria coupling. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (17), E2174-E2181 (2015).
  17. Filadi, R., et al. On the role of Mitofusin 2 in endoplasmic reticulum-mitochondria tethering. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2266-E2267 (2017).
  18. Xie, Q., et al. ABT737 reverses cisplatin resistance by regulating ER-mitochondria Ca2+ transduction in human ovarian cancer cells. Int J Oncol. 49 (6), 2507-2519 (2016).
  19. Tsunoda, T., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1 modulates the acquisition of cisplatin resistance in bladder cancer cell lines. Oncogene. 24 (8), 1396-1402 (2005).
  20. Tubbs, E., et al. Sulforaphane improves disrupted ER-mitochondria interactions and suppresses exaggerated hepatic glucose production. Mol Cell Endocrinol. 461, 205-214 (2018).
  21. Bhattacharyya, R., et al. Axonal generation of amyloid-beta from palmitoylated APP in mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes. Cell Rep. 35 (7), 109134(2021).
  22. Alhazmi, H. A., Albratty, M. An update on the novel and approved drugs for Alzheimer disease. Saudi Pharm J. 30 (12), 1755-1764 (2022).
  23. Rountree, S. D., et al. Effectiveness of antidementia drugs in delaying Alzheimer's disease progression. Alzheimers Dement. 9 (3), 338-345 (2013).
  24. Hadwen, J., et al. Transcriptomic RNAseq drug screen in cerebrocortical cultures: Toward novel neurogenetic disease therapies. Hum Mol Genet. 27 (18), 3206-3217 (2018).
  25. Ray, B., et al. Rivastigmine modifies the α-secretase pathway and potentially early Alzheimer's disease. Transl Psychiatry. 10 (1), 47(2020).
  26. Bailey, J. A., Ray, B., Greig, N. H., Lahiri, D. K. Rivastigmine lowers Aβ and increases sAPPα levels, which parallel elevated synaptic markers and metabolic activity in degenerating primary rat neurons. PLoS One. 6 (7), e21954(2011).
  27. Ziegler, D. V., Martin, N., Bernard, D. Cellular senescence links mitochondria-ER contacts and aging. Commun Biol. 4 (1), 1323(2021).
  28. Neikirk, K., et al. Call to action to properly utilize electron microscopy to measure organelles to monitor disease. Eur J Cell Biol. 102 (4), 151365(2023).
  29. Liu, X., et al. Mitochondrial 'kiss-and-run': Interplay between mitochondrial motility and fusion-fission dynamics. EMBO J. 28 (20), 3074-3089 (2009).
  30. Szymanski, J., et al. Interaction of mitochondria with the endoplasmic reticulum and plasma membrane in calcium homeostasis, lipid trafficking and mitochondrial structure. Int J Mol Sci. 18 (7), ijms18071576(2017).
  31. Tikhomirova, M. S., et al. A role for endoplasmic reticulum dynamics in the cellular distribution of microtubules. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (15), e2104309119(2022).
  32. Stacchiotti, A., et al. Perspective: Mitochondria-ER contacts in metabolic cellular stress assessed by microscopy. Cells. 8 (1), 8010005(2018).
  33. Cieri, D., et al. SPLICS: A split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
  34. Giacomello, M., Pellegrini, L. The coming of age of the mitochondria-ER contact: A matter of thickness. Cell Death Differ. 23 (9), 1417-1427 (2016).
  35. Dai, J., et al. Impaired axonal transport of cortical neurons in Alzheimer's disease is associated with neuropathological changes. Brain Res. 948 (1), 138-144 (2002).
  36. Trimmer, P. A., Borland, M. K. Differentiated Alzheimer's disease transmitochondrial cybrid cell lines exhibit reduced organelle movement. Antioxid Redox Signal. 7 (9-10), 1101-1109 (2005).
  37. Quinti, L., et al. Neurotherapeutics in the Era of Translational. Smith, R. A., Kaspar, B. K., Svendsen, C. N. , Academic Press. 311-331 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

BiologiaWydanie 234Wydanie 234Ten miesiąc w JoVEWydanie

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.