W tym miejscu opisujemy protokoły uzyskiwania pierwotnych kultur ludzkich komórek nabłonka kanalików nerkowych (HRTEC) z kory nerkowej w celu opracowania monowarstwowych i trójwymiarowych kultur na macierzy zewnątrzkomórkowej (3D-HRTEC).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Rozwój hodowli pierwotnych komórek nabłonka ludzkich kanalików nerkowych w warunkach jednowarstwowych i trójwymiarowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Hodowle pierwotne ludzkich komórek nabłonka kanalików nerkowych (HRTEC) są izolowane z nerek pobranych od pacjentów pediatrycznych poddawanych nefrektomii, wskazanej przez Oddział Nefrologii Dziecięcej Szpitala General de Pediatría Pedro de Elizalde, Buenos Aires, Argentyna. Makroskopowo normalna kora nerkowa jest wycinana z rdzenia nerki i cięta na fragmenty. Fragmenty kory są następnie trawione w roztworze Hanka, uzupełnione 0,1% kolagenazą typu 1 i filtrowane przez siatkę o wielkości porów 70 μm w celu oddzielenia kanalików nerkowych od kłębuszków nerkowych. Kanaliki nerkowe poddawane są ponownemu trawieniu kolagenazą w celu wyizolowania komórek nabłonkowych. Na koniec trawienie enzymatyczne zostaje zatrzymane, a komórki nabłonkowe hoduje się w kolbach zawierających RPMI 1640 z suplementami poniżej 5% CO2w temperaturze 37 °C aż do konfluencji. Komórki HRTEC mogą być hodowane jako monowarstwy na płytkach 96-dołkowych, szkiełka nakrywkowe na płytkach 24-dołkowych lub uchwyty do kultur komórkowych pokryte kolagenem. Ponadto uzyskuje się trójwymiarowe hodowle ludzkich komórek nabłonka kanalików nerkowych (3D-HRTEC) z komórek HRTEC wysianych na matrycy błony podstawnej (BM). Monitorowana jest agregacja komórek i tworzenie rurkowatych struktur kształtowych. Od wielu lat używamy kultur pierwotnych HRTEC do badania cytotoksycznego działania wywołanego przez toksynę Shiga w nerkach dziecięcych, co prowadzi do zmian patofizjologicznych prowadzących do zespołu hemolityczno-mocznicowego (HUS). Zarówno hodowle HRTEC, jak i 3D-HRTEC mogą być wykorzystywane do oceny wpływu różnych toksyn, leków syntetycznych, czynników biologicznych, hormonów itp., W szczególności na nabłonek kanalików proksymalnych nerki.
Wprowadzenie
W naszej grupie wykorzystano pierwotne hodowle ludzkich komórek nabłonka kanalików nerkowych (HRTEC) opracowanych w monowarstwach i w warunkach trójwymiarowych (3D-HRTEC) do zbadania w nerkach dziecięcych cytotoksycznego działania toksyny Shiga typu 2 (Stx2) wywołanej po zakażeniu przewodu pokarmowego bakterią Escherichia coli wytwarzającą toksynę Shiga (STEC).
Stx1 i Stx2 (Stxs) są głównymi czynnikami wirulencji STEC, które mogą powodować pobiegunkowy zespół hemolityczno-mocznicowy (HUS)1. HUS jest powikłaniem ogólnoustrojowym, które dotyka około 5-10% dzieci zakażonych STEC i składa się z niedokrwistości hemolitycznej, małopłytkowości i ostrego uszkodzenia nerek u dzieci (AKI), wymagającego leczenia wspomagającego2. W Argentynie STEC-HUS jest chorobą endemiczną z roczną częstością występowania 6,52 przypadków na 100 000 dzieci poniżej 5 roku życia (najwyższa na świecie), stanowiącą jedną z głównych przyczyn ostrego uszkodzenia nerek3. Chociaż śmiertelność wynosi mniej niż 4%3, u około 50% pacjentów rozwijają się następstwa nerkowe, które stanowią drugą najczęstszą przyczynę przeszczepienia nerki w naszym kraju 4,5.
Przed internalizacją i wywarciem działania cytotoksycznego Stx2 wiąże się specyficznie z receptorem globotriaozyloceramidu glikolipidowego (Gb3) ulegającym ekspresji na powierzchni komórek narządów docelowych6. Nerka jest głównym narządem uszkodzonym przez Stxs z powodu obecności komórek wrażliwych na Stx, które wyrażają duże ilości biologicznie aktywnych receptorów Gb3 w komórkach nabłonka nerkowego i śródbłonka 7,8.
Wcześniejsze prace przeprowadzone w HRTEC hodowanych jako monowarstwy wykazały, że Stx2 hamuje syntezę białek, zmniejsza żywotność komórek i proliferację komórek oraz indukuje apoptozę i nekrozę 9,10,11,12. Co więcej, narażenie 3D-HRTEC na Stx2 hamowało migrację komórek i rozwój struktur kanalików o charakterystyce kanalików proksymalnych nerek12,13.
Pierwotne kultury kultur HRTEC i 3D-HRTEC wykorzystano również do oceny wpływu estradiolu na proliferację komórek poprzez pomiar włączenia 5-bromo-2-deoksyurydyny (BrdU) do DNA komórek w fazie S cyklu komórkowego14.
Aby wyizolować komórki nabłonka, zaczynamy od fragmentów nerek uzyskanych z nefrektomii dziecięcej wskazanej do korekcji stanów urologicznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Komisja Bioetyczna Szpitala Ogólnego w Niños Pedro de Elizalde zatwierdziła wykorzystanie ludzkich tkanek nerkowych do opracowania pierwotnych kultur komórkowych do celów badawczych. Uzyskano pisemną świadomą zgodę najbliższej rodziny lub opiekunów w imieniu dzieci na wykorzystanie próbek nerek do badań.
UWAGA: Pierwotne hodowle ludzkich komórek nabłonka kanalików nerkowych (HRTEC) pochodzą od pacjentów pediatrycznych poddawanych nefrektomii, wskazanej do korekcji stanów urologicznych lub resekcji guza, w Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde w Buenos Aires w Argentynie.
1. Opracowanie pierwotnych kultur ludzkich komórek nabłonka kanalików nerkowych (HRTEC)
UWAGA: Fragmenty kory nerkowej są wycinane z nerek pobranych od pacjentów pediatrycznych poddawanych nefrektomii w szpitalu. Pierwotną hodowlę HRTEC przeprowadza się zgodnie z metodą opisaną wcześniej11.
Protokół jest opisany w następujących krokach:
- Fragment nerki należy przechowywać w lodówce w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub zrównoważonym roztworze soli Hanksa (Hanks) do czasu przetworzenia w laboratorium.
- Wyciąć torebkę nerkową za pomocą kleszczy. Oddziel korę nerkową od rdzenia i pokrój ją na małe fragmenty o wielkości około 1 mm.
- Aby przeprowadzić trawienie, umieść fragmenty nerek w sterylnym roztworze Hanksa bez Ca2+ i Mg2+, uzupełnionym 0,1% kolagenazą typu I.
- Inkubować fragmenty nerek przez 30 minut w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
- Aby zatrzymać trawienie, dodać jedną objętość PBS zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i przemyć próbkę trzykrotnie przez odwirowanie w temperaturze 160 × g przez 10 minut każda, w wirówce schłodzonej w temperaturze 4 °C. W każdym wirowaniu wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w tym samym roztworze.
- Przepuścić produkt trawienia przez siatkę porów o wielkości 70 μm, aby przefiltrować kanaliki i wyrzucić kłębuszki nerkowe, które pozostają zatrzymane w filtrze.
- Odwirować przefiltrowane kanaliki w stężeniu 160 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w sterylnym roztworze Hanksa, bez Ca2+ i Mg2+, uzupełnionym 0,2% kolagenazą typu I.
- Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C, wytrząsając.
- Aby zatrzymać trawienie, dodać jedną objętość PBS zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
- Przemyć próbkę trzykrotnie, odwirowując w temperaturze 160 × g, po 10 minut każde, w wirówce schłodzonej w temperaturze 4 °C. W każdym wirowaniu wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w tym samym roztworze.
- Po ostatnim odwirowaniu ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml kompletnej pożywki hodowlanej (RPMI 1640 uzupełniony 5% FBS, L-glutaminą [2 mmol/L], penicyliną [100 U/ml], streptomycyną [100 μg/ml] i suplementem wzrostu komórek śródbłonka [EKGS, 1%]).
- Zawiesinę komórkową należy umieścić w kolbie hodowlanej o średnicy 25cm2 z wentylowaną pokrywką.
- Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze przy 5% CO2 .
- Następnego dnia przemyć hodowlę komórkową 3 razy, wyrzucając płyn z kolby, dodając po 5 ml PBS i dodając do kolby 5 ml kompletnej pożywki hodowlanej. Płukanie te eliminuje czerwone krwinki i fragmenty kanalików, które nie zostały w pełni strawione i nie zostały przyłączone do kolby hodowlanej.
- Inkubować komórki nabłonkowe w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, pozwalając im rosnąć w jednej warstwie aż do zgrywania.
- Zmieniaj pożywkę na świeżą, kompletną pożywkę co 3 dni i codziennie obserwuj hodowlę komórkową pod odwróconym mikroskopem.
2. Opracowanie trójwymiarowych kultur HRTEC (3D-HRTEC)
UWAGA: Ta sekcja zawiera kroki tworzenia kultur trójwymiarowych (3D-HRTEC). Posiewy 3D-HRTEC wykonuje się zgodnie z metodą opisaną wcześniej12.
- Użyj macierzy BM z mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm. Ta matryca BM jest dostarczana w stanie zamrożonym i w tym stanie pozostaje stała. Rozmrozić roztwór matrycy BM przez noc w łaźni lodowej w lodówce w temperaturze 4 °C, zgodnie ze wskazaniami producenta.
- Schłodzić końcówki w zamrażarce przed umieszczeniem matrycy BM i pozostawić płytkę wielodołkową na lodzie, aby zapobiec zestaleniu się matrycy podczas procesu.
- Pobrać porcję płynnej matrycy BM (150 ml/cm2) i umieścić ją w każdym dołku płytki, aby przykryć dno studzienki. Inkubować płytkę w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby przekształcić matrycę BM w stan żelowy.
- W międzyczasie, aby odłączyć zlewające się kultury pierwotne HRTEC, wyrzuć pożywkę hodowlaną z kolby i dodaj 1 ml 0,25% trypsyny i 0,02% roztworu EDTA.
- Rozprowadzić ciecz na całej powierzchni kolby i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych.
- Obserwuj pod odwróconym mikroskopem, czy wszystkie komórki się odłączyły.
- Zawiesić komórki w 10 ml pożywki hodowlanej lub PBS, przenieść je do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 160 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w kompletnej pożywce hodowlanej zawierającej te same suplementy, które są stosowane w hodowlach pierwotnych HRTEC.
- Policz liczbę komórek w komorze Neubauera.
- Nasiona 4 × 104 komórki/150 μl na studzienkę na matrycę BM. Inkubować hodowlę komórkową przez kilka dni w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, w wilgotnej atmosferze i przy 5% CO2 .
- Zmieniaj podłoże co 2 dni na świeże podłoże.
- Monitoruj agregację komórek i tworzenie struktur rurkowatych pod odwróconym mikroskopem optycznym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zlewające się kultury pierwotne HRTEC wykazywały podobną morfologię obserwowaną pod mikroskopem świetlnym (ryc. 1). Komórki charakteryzowano immunofluorescencją, jak opisano w naszych poprzednich publikacjach, przy użyciu przeciwciał przeciwko akwaporynie 1 (AQP1) i PECAM CD31 9,12,13. Badania immunofluorescencyjne wykazały, że ponad 90% HRTEC było dodatnich na obecność AQP1, co pokazuje, że ich poc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Posiewy pierwotne należy wykonać w tym samym dniu nefrektomii. Hodowle pierwotne HRTEC mogą być stosowane w zakresie od 1 do 5 pasaży, aby zagwarantować stabilność morfogenetyczną komórek. Po piątym pasażu komórki zaczynają zmieniać swoją morfologię, wykazując wygląd podobny do fibroblastów lub wzrost wakuoli i mogą przejść w stan spoczynku.
Jeśli używany jest większy fragment nerki, DNA uwalniane w procesie lizy komórek po trawieniu może zakłócać proces mycia. W takim przypadku zaleca się uży...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni zespołowi urologii dziecięcej w "Sección de Cirugía Pediátrica, Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde" w Buenos Aires w Argentynie za dostarczenie próbek nerek. Prace te zostały wsparte grantami dla C. Silbersteina z Uniwersytetu w Buenos Aires (UBACYT20020190100072BA) oraz dla C. Ibarry i C. Silbersteina z Krajowej Rady Badań Naukowych i Technicznych (CONICET: PUE 0041). Prace te były częściowo wspierane przez Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED) (za pośrednictwem Red STEC/SUH Nº 224RT0152).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kolagenaza typu I | Sigma Merck, St Louis, MO, Stany Zjednoczone | 637958 | |
| Suplement na wzrost komórek śródbłonka | Sigma Merck, St Louis, MO, Stany Zjednoczone | E2759 powiedział: | |
| Macierz błony podstawnej Matrigel | BD Biosciences, Stany Zjednoczone; Sigma Merck, St Louis, MO, Stany Zjednoczone | 356234 | |
| 70 μ m Filtr siatkowy porów | BD Bioscience, MA, Stany Zjednoczone | Zobacz materiał CSS010070 | |
| Pożywka RPMI 1640 z L-glutaminą | Sigma Merck, St Louis, MO, Stany Zjednoczone | Czynnik chłodniczy R8758-500ml | |
| Hanksa' Zbilansowany roztwór soli Nie zawiera Ca2+ i Mg2+ | Gibco Invitrogen, Nowy Jork, Stany Zjednoczone | 14175046 | |
| Roztwór trypsyny-EDTA | Sigma Merck, St Louis, MO, Stany Zjednoczone | Zobacz materiał T4049 TGL |
Bibliografia
- Rivas, M., Chinen, I., Miliwebsky, E., Masana, M. Risk factors for Shiga toxin-producing Escherichia coli-associated human diseases. Microbiol Spectr. 2 (5), (2014).
- Gianantonio, C. A., Vitacco, M., Mendilaharzu, F., Gallo, G. E., Sojo, E. T. The hemolytic-uremic syndrome. Nephron. 11 (2), 174-192 (1973).
- Alconcher, L. F., et al. Hemolytic uremic syndrome associated with Shiga toxin-producing Escherichia coli infection in Argentina: update of serotypes and genotypes and their relationship with severity of the disease. Pediatr Nephrol. 36 (9), 2811-2817 (2021).
- Alconcher, L. F., Lucarelli, L. I., Bronfen, S., Meni Battaglia, L., Balestracci, A. Dynamic evolution of kidney function in patients with STEC-hemolytic uremic syndrome followed for more than 15 years: unexpected changes. Pediatr Nephrol. 40 (1), 143-150 (2025).
- Monteverde, M. L., et al. A decrease in the incidence of Shiga toxin-related hemolytic uremic syndrome as a cause of kidney transplantation at an Argentine Referral Center. Pediatr Transplant. 27 (4), e14489(2023).
- Sandvig, K., van Deurs, B. Entry of ricin and Shiga toxin into cells: molecular mechanisms and medical perspectives. EMBO J. 19 (22), 5943-5950 (2000).
- Obrig, T. G. Escherichia coli Shiga toxin mechanisms of action in renal disease. Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).
- Karpman, D., et al. Apoptosis of renal cortical cells in the hemolytic-uremic syndrome: in vivo and in vitro studies. Infect Immun. 66 (2), 636-644 (1998).
- Pistone Creydt, v, Silberstein, C., Zotta, E., Ibarra, C. Cytotoxic effect of Shiga toxin-2 holotoxin and its B subunit on human renal tubular epithelial cells. Microbes Infect. 8, 410-419 (2006).
- Silberstein, C., Pistone Creydt, V., Gerhardt, E., Nuñez, P., Ibarra, C. Inhibition of water absorption in human proximal tubular epithelial cells in response to Shiga toxin-2. Pediatr Nephrol. 23, 1981-1990 (2008).
- Márquez, L. B., et al. Effects of Escherichia coli subtilase cytotoxin and Shiga toxin 2 on primary cultures of human renal tubular epithelial cells. PLoS One. 9, e87022(2014).
- Márquez, L. B., Araoz, A., Repetto, H. A., Ibarra, F. R., Silberstein, C. Effects of Shiga toxin 2 on cellular regeneration mechanisms in primary and three-dimensional cultures of human renal tubular epithelial cells. Microb Pathog. 99, 87-94 (2016).
- Sánchez, D. S., et al. Eliglustat prevents Shiga toxin 2 cytotoxic effects in human renal tubular epithelial cells. Pediatr Res. 91 (5), 1121-1129 (2022).
- Sánchez, D. S., et al. Estradiol stimulates cell proliferation through classic estrogen receptors and GPER-1 in human renal tubular epithelial cell primary cultures. Biochem Biophys Res Commun. 512, 170-175 (2019).
- Fernandez Miyakawa, M., Zabal, O., Silberstein, C. Clostridium perfringens epsilon toxin is cytotoxic for human renal tubular epithelial cells. Hum Exp Toxicol. 30, 275-282 (2011).
- Chen, J., et al. Cooperative application of transcriptomics and ceRNA hypothesis: ln cRNA-00742/miR-116 targets CD74 to mediate vanadium-induced mitochondrial apoptosis in duck liver. J Hazard Mater. 480, 135904(2024).
- Chen, J., et al. Copper toxicity in the liver of broiler chicken: insights from metabolomics and AMPK-mTOR mediated autophagy perspective. Poult Sci. 103 (9), 104011(2024).
- Zhang, T., et al. Role of Caveolin-1 on the molybdenum and cadmium exposure induces pulmonary ferroptosis and fibrosis in the sheep. Environ Pollut. 334, 122207(2023).
- Fujiki, K., et al. Blockage of Akt activation suppresses cadmium-induced renal tubular cellular damages through aggrephagy in HK-2 cells. Sci Rep. 14, 14552(2024).
- Joun, J. I. H., et al. Antioxidative effects of molybdenum and its association with reduced prevalence of hyperuricemia in the adult population. PLoS One. 19 (8), e0306025(2024).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
