Artykuł metodologiczny

Technika przewlekłego okna czaszkowego do powtarzających się zapisów korowych podczas znieczulenia u świń

DOI:

10.3791/67931

⸱

6 czerwca 2025

 ,  ,  ,  , 
1Center for Neuroplasticity and Pain, Department of health, science and technology, Aalborg University, 2Department of Cardiovascular Surgery, Department of Clinical Medicine, Aalborg University Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W badaniu przedstawiono skalowalną, wiarygodną i odtwarzalną metodę powtarzających się przewlekłych zapisów korowych w modelu świni. Metoda ma zastosowanie w różnych dziedzinach neuronauki, w tym w badaniach nad bólem i diagnostyce chorób neurologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zapisy korowe są niezbędne do ekstrakcji sygnałów neuronalnych w celu informowania o różnych zastosowaniach, w tym interfejsach mózg-komputer i diagnostyce chorób. Każda aplikacja stawia określone wymagania co do techniki nagrywania, a do długotrwałych nagrań często wybierane są rozwiązania inwazyjne. Jednak inwazyjne metody nagrywania są trudne ze względu na awarię urządzenia i niepożądane reakcje tkanek, które pogarszają długoterminową jakość sygnału.

Aby poprawić wiarygodność i jakość przewlekłych zapisów korowych przy jednoczesnym zminimalizowaniu ryzyka związanego z awarią urządzenia i reakcjami tkankowymi, opracowaliśmy technikę okna czaszkowego. W tym protokole opisujemy metody wszczepienia i dostępu do okna czaszkowego u młodocianych świń rasy landrace, co ułatwia tymczasowe umieszczenie matrycy elektrokortykograficznej (ECoG) na oponie twardej. Dalej opisujemy, w jaki sposób sygnały korowe mogą być rejestrowane za pomocą techniki okna czaszkowego. Dostęp do okienka czaszkowego można powtórzyć kilka razy, ale zaleca się co najmniej 2 tygodnie między operacjami wszczepienia implantu i dostępu, aby ułatwić powrót do zdrowia i gojenie się tkanek.

Podejście oparte na oknie czaszkowym z powodzeniem zminimalizowało typowe tryby awarii elektrod i reakcje tkanek, co z czasem zaowocowało stabilnymi i wiarygodnymi zapisami korowymi. Jako przykład zarejestrowaliśmy potencjały związane ze zdarzeniami (ERP) z pierwotnej kory somatosensorycznej. Metoda ta dostarczyła wysoce wiarygodnych nagrań, które pozwoliły również na ocenę wpływu interwencji (stymulacji wysokiej częstotliwości) na ERP. Brak istotnych awarii urządzeń i zmniejszona liczba używanych elektrod (dwie elektrody, 43 sesje nagraniowe, 16 zwierząt) sugerują poprawę ekonomii badań. Chociaż do umieszczenia elektrod wymagany jest niewielki dostęp chirurgiczny, metoda ta oferuje korzyści, takie jak zmniejszone ryzyko infekcji i lepszy dobrostan zwierząt.

Badanie to przedstawia skalowalną, wiarygodną i odtwarzalną metodę przewlekłych zapisów korowych, z potencjalnymi zastosowaniami w różnych dziedzinach neuronauki, w tym w badaniach nad bólem i diagnozowaniu chorób neurologicznych. Przyszłe adaptacje mogą rozszerzyć jego zastosowanie na inne gatunki i metody zapisu, takie jak zapisy wewnątrzkorowe i techniki obrazowania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnie rzecz biorąc, celem nagrań korowych jest wydobycie informacji z sygnalizacji neuronalnej w mózgu. Informacje te mogą być wykorzystywane na różne sposoby - sterowanie urządzeniem zewnętrznym, komunikacja, diagnoza choroby lub rehabilitacja 1,2,3,4. Każda aplikacja stawia unikalne wymagania dotyczące wymaganej zawartości informacji i rozdzielczości przestrzennej oraz stopnia inwazyjności, która jest uważana za akceptowalną. Dlatego od czasu odkrycia elektroencefalogramu w 1929 r. opracowano rozwiązania rejestrujące o różnym stopniu inwazyjności i rozdzielczości przestrzennej5.

Ogólnie można je podzielić na elektroencefalografię (EEG), elektrokortykografię (ECoG) i zapisy wewnątrzkorowe. EEG to nieinwazyjna metoda rejestrowania, która rejestruje oscylacje neuronalne i potencjały związane ze zdarzeniami (ERP) z całego mózgu. Jego zdolność do definiowania źródeł tej aktywności jest jednak ograniczona ze względu na niską rozdzielczość przestrzenną. ECoG jest bardziej inwazyjną metodą, w której elektrody są umieszczane epi- lub podtwardówkowo, zwykle pokrywając mniejszą część kory. Ma wyższą rozdzielczość przestrzenną i może rejestrować ERP i powierzchniowe potencjały pola lokalnego (LFP). Dzięki temu może dokładniej zlokalizować źródło aktywności mózgu, co czyni go pomocnym np. w identyfikacji pochodzenia padaczki ogniskowej. Zapis wewnątrzkorowy jest najbardziej inwazyjną metodą rejestracji i może rejestrować aktywność impulsową z pojedynczych neuronów znajdujących się powierzchownie lub głęboko w mózgu, a LFP z objętości neuronów wokół elektrod. Sygnały te mają bardzo wysoką rozdzielczość przestrzenną i zawartość informacyjną, ale są wytwarzane przez ograniczony podzbiór neuronów (1-10 neuronów na kanał)6.

Aby wydobyć informacje z mózgu przez dłuższe okresy (miesiące-lata), interfejs musi być stabilny i niezawodny, aby pozyskane sygnały nadal reprezentowały te same informacje przez cały okres. Zapisy EEG wymagają częstej wymiany elektrod, co sprawia, że ich wiarygodność jest zmienna od bardzo niskiej do bardzo wysokiej 7,8,9,10. Metody ECoG i wewnątrzkorowe są zatem często wybierane do długotrwałych zapisów. Jednak obie te metody wymagają, aby stan elektrody rejestrującej, jak również tkanki, pozostał stabilny w czasie. Podczas gdy elektroda zwykle pozostaje w tym samym miejscu, interfejs elektroda-tkanka może ulec zmianie z powodu reakcji tkankowych lub trybów awarii elektrody 11,12,13,14. Reakcje tkankowe obejmują śmierć neuronów, krwotok, biofouling, reakcję na ciało obce, glejozę, enkapsulację, infekcję, zapalenie opon mózgowych i ekstruzję opon mózgowo-rdzeniowych15. Reakcje te pogarszają możliwości zapisu elektrod12,13. Typowe tryby uszkodzenia elektrod to rozwarstwienie lub wyciek na izolowanych częściach, rozwarstwienie lub pękanie powłoki powierzchni elektrody, uszkodzenie drutu i przemieszczenie elektrody11,12.

Aby przezwyciężyć tryby awarii elektrod, rozważyliśmy wykonalność tymczasowego rozwiązania do umieszczania elektrod, które rozwiązuje również wiele wyzwań związanych z reakcjami tkanek, a mianowicie śmierć neuronów, reakcję ciała obcego, glejozę, enkapsulację i ekstruzję opon mózgowych. Co więcej, konsekwentne rozmieszczenie elektrod było wymogiem w celu uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych zapisów neuronalnych. Ponieważ elektroda została umieszczona nadoponowo w odległości kilku milimetrów od tkanki nerwowej, ruch elektrody nie powinien przekraczać 1 mm. Okienko czaszki zostało zaprojektowane z wymiarami zapobiegającymi nadmiernemu ruchowi między umieszczeniami elektrod. Wraz z rozwojem techniki okna czaszkowego dążymy do poprawy długoterminowej niezawodności i jakości sygnału oraz wyeliminowania ryzyka awarii elektrody.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten został zatwierdzony przez Duńską Administrację Weterynarii i Żywności przy Ministerstwie Żywności, Rolnictwa i Rybołówstwa Danii (numer protokołu 2020-15-0201-00514). Zabiegom poddano łącznie 16 samic świń rasy landrace. Zwierzęta po przybyciu do placówki ważyły około 20 kg, co oznacza, że miały około 2 miesięcy. Ważyły około 30 kg po implantacji i 40-60 kg pod koniec badania. Procedury obejmują chirurgię implantacji, chirurgię dostępu i operację terminalną (ryc. 1).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Kalendarium procedur eksperymentalnych. Operacja dostępu (Faza II) może być powtarzana kilka razy. Zaleca się odstęp co najmniej 2 tygodni między operacjami w celu rekonwalescencji i gojenia się ran między operacjami. Skrót: ERP = event-related potential. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Chirurgia implantacji (Faza I)

UWAGA: Wydrukowane w 3D okno czaszkowe z kwasem polimlekowym (PLA) (ryc. 2) jest wszczepiane, aby ułatwić wielokrotne zapisy z pierwotnej kory somatosensorycznej świni. Rejestrowane są ERP spowodowane elektryczną stymulacją nerwu łokciowego. Zabieg chirurgiczny i zamknięcie rany wykonuje się tak, aby można było uzyskać dostęp do okna czaszki, a następnie je zamknąć.

figure-protocol-2
Ryc. 2: Konstrukcja okna czaszkowego. (A) Widok z boku okna czaszki wskazujący wysokość ścian i podstawę, która jest przymocowana do czaszki. (B) Widok z góry wskazujący średnicę wdowy czaszkowej, otwory na, przestrzeń nasadki i okno. Nasadka okienka czaszki to cylinder o średnicy 22 mm i wysokości 1 mm, który dokładnie mieści się w przestrzeni nasadki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Implantacja okienka czaszkowego
    1. Przygotowanie do zabiegu
      UWAGA: Procesor danych (RZ2), stacja robocza (WS8) i komputer są włączane przed rozpoczęciem operacji. Notatki chirurgiczne są sporządzane w arkuszu kalkulacyjnym co najmniej co 15 minut przez niesterylnego badacza w celu udokumentowania parametrów życiowych (tętno, spO2, CO2 w końcówce oddechu, temperatura rdzenia), poziomów znieczulenia (szybkość infuzji propofolu, szybkość infuzji fentanylu, procent sewofluranu), etap operacji i wszelkie nieprawidłowości.
      1. Uspokoić zwierzę za pomocą domięśniowego wstrzyknięcia 0,15 ml/kg mieszaniny Zoletil (1 ml zawierał 8,3 mg Tiletaminy, 8,3 mg Zolazepamu, 8,3 mg Xylacin i 1,7 mg Butophanolu).
        UWAGA: W tym konkretnym badaniu ketamina została pominięta w mieszaninie Zoletil, aby uniknąć blokowania receptorów NMDA.
      2. Przewieź zwierzę na salę operacyjną. Zaintubuj zwierzę i podłącz je do respiratora mechanicznego.
      3. Umieść cewnik do żył usznych, aby podać propofol, fentanyl i sól fizjologiczną.
      4. Podawać znieczulenie chirurgiczne: Sewofluran 1-2%, propofol (10 mg/ml podawany w infuzji 8 mg∙kg-1∙h-1), fentanyl (50 μg/ml podawany w infuzji 20 μg∙kg-1∙h-1). Nałóż ochronny lubrykant do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Zdezynfekuj skórę dwa razy za pomocą 0,5% chlorheksydyny okrężnymi ruchami od środka na zewnątrz.
      5. Zaznacz miejsce nacięcia za pomocą sterylnego markera przed sterylnym nałożeniem. Zidentyfikuj punkt bregma, rysując proste linie między każdym uchem a okiem przeciwległym; punkt bregma znajduje się na przecięciu tych linii (rysunek 3A). Upewnij się, że nacięcie jest lekko boczne do linii środkowej po stronie przeciwnej do stymulowanej kończyny przedniej.
      6. Umieść metalową płytkę pod zasłonami i upewnij się, że jest ona prawidłowo umieszczona i stabilna przed rozpoczęciem zabiegu.
    2. Dostęp do czaszki
      UWAGA: W tej i kolejnych częściach protokołu wszystkie zabiegi są wykonywane przez sterylnego chirurga, chyba że wskazano inaczej.
      1. Wykonaj początkowe nacięcie w skórze właściwej skalpelem nieco bocznie do linii środkowej, jak pokazano w kroku 1.1.1.5. Kontynuuj nacięcie przez skórę za pomocą kauteryzatora.
        UWAGA: Nie przedłużaj nacięcia zbyt daleko do przodu, aby uniknąć dużych zatok czołowych świni. Jeśli potrzebujesz więcej miejsca, przedłuż nacięcie po tylnej stronie.
      2. Umieść retraktor i przytrzymaj skórę za pomocą kleszczy i przetnij beznaczyniową tkankę łączną między okostną a tkanką podskórną (ryc. 3B), aby zapewnić skórze większą elastyczność i ułatwić szycie w kroku 1.4. Dostosuj zwijacz do uzyskanej elastyczności.
      3. Naciąć okostną i odsunąć ją od czaszki za pomocą windy do okostnej. Przytrzymaj okostną na bok za pomocą retraktora.
    3. Dostęp do opony twardej
      1. Wywierć otwór o średnicy 10 mm z przodu do linii szwu strzałkowego i bocznie do szwu środkowego (ryc. 3C). Zacznij od średnicy 15 mm, aby uzyskać otwór o średnicy 10 mm na poziomie opony twardej, ponieważ zaokrąglone wiertło spowoduje lekko stożkowy otwór.
      2. Dopasuj okienko czaszki do otworu na wczesnym etapie, aby zapewnić dobre dopasowanie.
      3. Przełącz się na mniejsze wiertło, gdy opona twarda stanie się widoczna, aby osiągnąć maksymalną szerokość otworu na poziomie opony twardej. Przytnij krawędzie za pomocą Rongeurs.
    4. Implantacja okienka czaszkowego
      1. Upewnij się, że okno czaszki mieści się w otworze i do jego dna i zdecyduj o jego głębokości. Chociaż jest to zależne od zwierząt, upewnij się, że ściany okna czaszki sięgają opony twardej, aby zapewnić dobre dopasowanie, ale nie wywieraj nacisku na mózg w żadnym miejscu.
      2. Zaznacz otwory na za pomocą wiertarki ręcznej, przytrzymując okienko czaszki na miejscu.
      3. Zdejmij okienko czaszki i wywierć otwory o głębokości co najmniej 4 mm. Przebij czaszkę w poszukiwaniu jednej ze, aby użyć jej jako podłoża/odniesienia dla nagrań korowych.
      4. Umieścić okienko czaszki (ryc. 3) i wyjąć igłę z zestawu do infuzji motylkowej. Zmierz głębokość otworów na przez okno czaszki za pomocą motyla. Włóż i dokręć o odpowiedniej długości do otworu.
        UWAGA: Zbyt długa śruba nie zdoła skutecznie zamocować nasadki szyby czaszki.
      5. Umieść łącznik w kształcie litery U pod jedną śrubą, która przebija czaszkę i dotyka opony twardej.
        UWAGA: Ważne jest, aby długość tej była większa niż grubość czaszki, aby odrastająca kość nie zapobiegła kontaktowi z oponą twardą.
  2. Implantacja drutu obwodowego
    UWAGA: Zabieg ten można wykonać równocześnie z implantacją okienka czaszkowego. Jest to procedura sterylna. Aby zapobiec zanieczyszczeniu pola operacyjnego lub czaszki, należy nosić sterylny strój.
    1. Wszczepianie drutów w pobliżu nerwu łokciowego
      1. Zastosuj stymulację elektryczną o natężeniu 5 mA do skóry, dotykając skóry w tylnej dystalnej części kończyny przedniej dwoma igłami (nie penetrującymi) lub innym sterylnym kawałkiem metalu w odległości 2 cm od siebie. Poszukaj wyraźnego zgięcia kopyta, które wskazuje, że nerw biegnie między tymi dwoma punktami.
        UWAGA: Kończyna może wymagać obrócenia do tyłu, aby tylna część była łatwiej dostępna.
      2. Włóż dwie igły prostopadle do przebiegu nerwu w odległości około 2 cm od siebie. Ponownie przekłuć skórę w odległości około 3 cm od punktu wprowadzenia (Rysunek 4A).
      3. Sprawdzić lokalizację za pomocą bodźca testowego nałożonego na igły o natężeniu 2 mA; Upewnij się, że widoczny jest wyraźny ruch kopyta.
      4. Przełóż druty Coonera przez igły i usuń igły, pozostawiając druty Cooner częściowo pod skórą. Upewnij się, że nieizolowana część w środku przewodu znajduje się pod skórą obu przewodów (Rysunek 4B).
        UWAGA: Jeśli kończyna została obrócona do tyłu, ostrożnie obróć ją do przodu.
      5. Podłącz każde złącze krokodylkowe do odizolowanego końca dwóch przewodów Cooner.
    2. Ustalanie progu motorycznego
      1. Znajdź próg silnika metodą góra-dół16,17; zacznij od 100 μA, zwiększając go krokami co 50 μA, obserwując i wyczuwając reakcję motoryczną w okolicy kopyta. Próg poniżej 1 mA jest zazwyczaj wykonalny.
      2. Zaprogramuj STG tak, aby dostarczał 100 prostokątnych dwufazowych symetrycznych bodźców o szerokości impulsu 200 μs przy 2x progu motorycznym, a następnie 100 bodźców przy 10-krotności progu motorycznego.
  3. Rejestracja sygnałów korowych
    1. Poproś niesterylnego badacza o ustawienie przedwzmacniacza na miejscu i podłączenie go do procesora danych (RZ2) za pomocą kabli światłowodowych.
    2. Zmniejsz sewofluran do 0,5-1% (połowa jego poziomu chirurgicznego) i monitoruj częstość akcji serca, wydechy CO2 i ciśnienie krwi (jeśli jest dostępne), aby zapewnić odpowiednią i stabilną głębokość znieczulenia. W razie potrzeby zwiększ zarówno propofol, jak i fentanyl.
    3. Poproś niesterylnego badacza o przymocowanie headstage'u do przedwzmacniacza (SI8) i umieszczenie headstage'u (ZIF-clip) w uchwycie headstage, który jest zamontowany na mikromanipulatorze ze statywem magnetycznym.
    4. Umieść sterylną zasłonę wokół mikromanipulatora i przymocuj część samoprzylepną do sceny głównej i uchwytu sceny głównej (Rysunek 5A).
    5. Poproś niesterylnego badacza, aby zabezpieczył mikromanipulator za pomocą podstawki magnetycznej, zanurzył elektrodę μECoG w alkoholu i umieścił ją w głowicy (ZIF-clip).
      UWAGA: Poczekaj, aż elektroda wyschnie przed umieszczeniem jej na oponie twardej. Pamiętaj, aby dotykać tylko sterylnego drapowania zakrywającego scenę główną, ponieważ elektroda μECoG nie jest sterylna.
    6. Umieść μECoG na miejscu za pomocą mikromanipulatora i prowadź za pomocą wacika. Podłącz przewody uziemiające μECoG do uziemiającej za pomocą złącza krokodylkowego.
    7. Zmniejsz sewofluran do 0%, monitoruj tętno, wydychane CO2 i ciśnienie krwi (jeśli jest dostępne), aby zapewnić odpowiednią i stabilną głębokość znieczulenia, w razie potrzeby zwiększ zarówno propofol, jak i fentanyl.
    8. Podgląd sygnałów w synapsie; typowy zakres sygnału wynosi do ±100 μV.
      1. Jeśli sygnał wygląda jak pogrubiona linia (wskazująca na szum linii), poproś sterylną osobę o wykonanie następujących czynności: zbadaj obwody uziemiające i utrzymuj uziemiającą i połączenia w stanie suchym i odizolowanym od pobliskich tkanek. Zbadaj, czy inne okablowanie jest odizolowane od ciała świni i narzędzi chirurgicznych. Jeśli nie, użyj sterylnej gazy, aby odizolować okablowanie od ciała lub narzędzi chirurgicznych.
      2. Jeśli amplituda sygnału jest większa niż ±100 μV (wskazująca na artefakty ruchu), upewnij się, że elektroda jest zawieszona i spoczywa na mózgu oraz że okablowanie nie porusza się, gdy świnia się porusza, z powodu wentylacji lub elektrycznej stymulacji nerwu łokciowego.
      3. Jeśli amplituda sygnału jest mniejsza niż ± 20 mV (co wskazuje na słaby kontakt lub głębokie znieczulenie), upewnij się, że μECoG spoczywa na mózgu, a opona twarda i elektroda są nawodnione; W razie potrzeby wlej trochę soli fizjologicznej na elektrodę. Upewnij się, że sewofluran został wyłączony i zmniejszyć szybkość infuzji propofolu (i ewentualnie fentanylu). Wykonaj stymulację testową i sprawdź, czy wywołane reakcje są widoczne. Upewnij się, że nieizolowana część przewodu obwodowego znajduje się całkowicie pod skórą.
        UWAGA: Wywołane reakcje można zazwyczaj rozróżnić w pojedynczych przebiegach online, ale można to również ocenić offline, biorąc średnio 5-10 bodźców. Jeśli szczyt jest widoczny w momencie wyzwolenia, jest to artefakt stymulacji. Artefakt stymulacji będzie zakłócał analizę danych.
    9. Umieść sterylną gazę na elektrodzie, aby utrzymać dobry kontakt z tkanką. Wlej sól fizjologiczną o temperaturze ciała na gazę, aby zapobiec wysuszeniu tkanki.
      UWAGA: Ponieważ te nagrania są znieczuleniem zewnątrzoponowym, dokładna temperatura nie jest istotna. W przypadku nagrań podtwardówkowych jest to bardziej krytyczne.
    10. Poczekaj, aż elektroda się uspokoi (30 min) i udokumentuj rozmieszczenie elektrody oraz konfigurację złącza uziemiającego, aby zapewnić podobne kolejne nagrania (Rysunek 5B-D). Rozpocznij nagrywanie i odczekaj 30 s przed uruchomieniem programu stymulacji co 10 minut.
      UWAGA: Regularnie sprawdzaj między nagraniami, czy gaza na elektrodzie pozostaje nawodniona i w razie potrzeby wlej sól fizjologiczną o temperaturze ciała.
    11. Wykonaj interwencję po trzech rundach stymulacji (aby służyć jako punkt odniesienia przed interwencją). Powtarzaj stymulację przez kolejne dziewięć rund.
      UWAGA: Kontynuuj regularne sprawdzanie między nagraniami, czy gaza na elektrodzie pozostaje nawodniona i w razie potrzeby wlej sól fizjologiczną.
  4. Zamknięcie miejsca wszczepienia implantu
    1. Zdejmij gazę z elektrody i wyjmij elektrodę za pomocą mikromanipulatora, delikatnie prowadząc ją wacikiem.
    2. Poproś niesterylnego badacza o wyjęcie i przechowywanie mikromanipulatora, elektrody, sceny czołowej i przedwzmacniacza oraz wyczyść elektrodę zgodnie ze wskazówkami producenta, szybko spłukując wodą dejonizowaną w celu usunięcia pozostałości tkanek. Namocz elektrodę na maksymalnie 4 godziny w płynie do czyszczenia soczewek, aby usunąć tkanki i białka z powierzchni elektrody, a następnie ponownie spłucz wodą dejonizowaną, aby usunąć środek do czyszczenia soczewek z powierzchni elektrody. Przed przechowywaniem zanurz elektrodę w alkoholu izopropylowym.
    3. Umieść nasadkę okna czaszki, aby zamknąć okno czaszki, upewniając się, że dokładnie pasuje do okna czaszki. Nie wymaga dodatkowego mocowania; Nacisk skóry na implant utrzyma go na miejscu.
    4. Umieść woreczek z antybiotykiem na pokrywie okna czaszki i zamknij skórę podskórnie pojedynczymi wchłanialnymi szwami przy użyciu techniki zakopanego pionowego szwu materaca (ryc. 6A). Zakładać szwy w odległości 5-10 mm, co zapewnia miejsce na założenie szwów skórnych. Nie wiąż trzech ostatnich szwów po ich założeniu. Zamiast tego zawiąż te trzy szwy, gdy wszystkie szwy zostaną założone.
      UWAGA: Zawiązanie ostatnich trzech szwów po założeniu wszystkich trzech zapewnia, że jest wystarczająco dużo miejsca na założenie ostatnich szwów.
    5. Ciągłe szwy śródskórne należy umieszczać w skórze w sposób ciągły. Rozpocznij szew śródskórny 1-2 cm bocznie od miejsca nacięcia i tuneluj pod skórą do warstwy skórnej skóry, ale poniżej jej powierzchni (ryc. 6B), aby uniknąć nadmiernego zadrapania i poluzowania szwów. Zawiąż węzeł na bocznym końcu szwu.
      UWAGA: Propofol i fentanyl można wyłączyć podczas tej procedury, ponieważ mają one kilka minut czasu przebudzenia.
    6. Umieść szew ciągły między szwami podskórnymi, aż do osiągnięcia drugiej strony nacięcia.
      UWAGA: Ważne jest, aby szew wychodził w skórze właściwej, ale nie przebijał skóry, aby zwierzę było mniej zdolne do drapania szwów.
    7. Tunel szwu 1-2 cm bocznie do nacięcia do bocznego miejsca wyjścia i zawiązać węzeł (ryc. 6B). Nałóż klej tkankowy na miejsce nacięcia.
    8. Podawać meloksykam zawiesinę doustną (2 ml, dwa razy na dobę, doustnie) i amoksycylinę (2 ml dziennie, wstrzyknięcie domięśniowe) przez pierwsze 3 dni po zabiegu; Pierwszy zastrzyk podaje się w okresie okołooperacyjnym.
  5. Powrót zwierzęcia do kojca domowego
    1. Zdejmij sterylne zasłony ze zwierzęcia i odłącz zwierzę od respiratora, gdy tylko zaobserwuje się ruch.
    2. Przenieść zwierzę do kojca domowego i trzymać je oddzielnie od współlokatora przez jedną noc.
      UWAGA: Świnie są rozdzielane po operacji, ponieważ normalne jest, że gwałtownie próbują obudzić partnera z kojca, co skutkuje ranami po ugryzieniach. Świnie powinny mieć możliwość kontaktu z pyskiem.

figure-protocol-3
Rycina 3: Implantacja okna czaszkowego. (A) Oczekiwane położenie punktu bregma jest identyfikowane i oznaczane na świni przed sterylnym ułożeniem, ponieważ może to być trudne do odróżnienia w późniejszym czasie. (B) Po nacięciu skóry jałowe zapalenie tkanki dolnej rozluźnia się za pomocą nożyczek. (C) W czaszce wierci się otwór o średnicy 15 mm, a krawędzie usuwa się za pomocą rongeurs. Uwydatnione są linie szwów koronalnych i strzałkowych. (D) Okienko czaszki jest wszczepiane i mocowane za pomocą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-4
Ryc. 4: Implantacja drutów obwodowych. (A) Dwie igły 23 G są umieszczane w skórze, przez którą wprowadzane są druty Coonera. (B) Igły są usuwane, a druty pozostawia się w skórze połączonej ze stymulatorem za pomocą zacisków krokodylkowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-5
Rysunek 5: Konfiguracja nagrywania korowego. (A) Układ elektrod umieszcza się na oponie twardej, a uchwyt sceny głównej i mikromanipulator znajdują się w sterylnym rękawie podczas operacji implantacji, gdzie nacięcie jest dłuższe i bardziej boczne. (B) Zbliżenie μECoG w zestawie rejestracyjnym podczas operacji dostępu, gdzie nacięcie jest bardziej przyśrodkowe. (C) Konfiguracja uziemienia, w której wszystkie przewody uziemiające i odniesienia na ECoG są zwarte i połączone za pomocą złącza U ze śrubą okołoczaszkową. (D) Zbliżenie na scenę główną i uchwyt sceny głównej podczas operacji dostępu. μECoG umieszcza się na oponie twardej. Skróty: ECoG = elektrokortykografia; μECoG = mikroECoG. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-6
Rycina 6: Technika szycia. (A) Schemat techniki podskórnego zakopania materaca pionowego. (B) Schemat techniki ciągłego szwu śródskórnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Operacja dostępu (Faza II)

UWAGA: Po 2-4 tygodniach okno czaszkowe jest otwierane w celu wykonania dalszych zapisów sygnałów korowych z S1. Operacja i zamknięcie rany są ponownie wykonywane w taki sposób, aby można było uzyskać dostęp do okna czaszki i ponownie je zamknąć.

  1. Przygotowanie do zabiegu
    UWAGA: Kroki 2.1.1-2.1.6 są podobne do kroków 1.1.1.1-1.1.1.6.
    1. Uspokoić zwierzę za pomocą mieszaniny zoletilu (5 ml zoletilu [tiletamina 25 mg/ml i zolazepam 25 mg/ml], 6,25 ml ksylazyny (20 mg/ml) i 2,5 ml butorfanolu (10 mg/ml)).
      UWAGA: W tym konkretnym badaniu ketamina została pominięta w mieszaninie zoletil, aby uniknąć blokowania receptorów NMDA.
    2. Przetransportować zwierzę na salę operacyjną oraz zaintubować je i przewietrzyć.
    3. Umieść cewnik do żył usznych. Podawać propofol, fentanyl i sól fizjologiczną przez cewnik.
    4. Podawać znieczulenie chirurgiczne: Sewofluran 1-2%, propofol (10 mg/ml podawany w infuzji 8 mg∙kg-1∙h-1), fentanyl (50 μg/ml podawany w infuzji 20 μg∙kg-1∙h-1).
    5. W razie potrzeby oznacz miejsce nacięcia sterylnym markerem przed sterylnym nałożeniem. Zidentyfikuj punkt bregma, rysując proste linie między każdym uchem a okiem przeciwległym; bregma znajduje się na przecięciu tych linii (rysunek 3A).
      UWAGA: Początkowe nacięcie jest zazwyczaj nadal widoczne. Nowe nacięcie należy umieścić co najmniej 30 mm od początkowego nacięcia, aby uniknąć większości tkanki bliznowatej i ułatwić zamknięcie rany.
    6. Umieść metalową płytkę pod zasłonami i upewnij się, że jest ona prawidłowo umieszczona i stabilna przed rozpoczęciem zabiegu.
  2. Dostęp do okna czaszkowego
    UWAGA: Kroki 2.2.1-2.2.3 są podobne do kroków 1.1.2.1-1.1.2.3.
    1. Wykonaj początkowe nacięcie w skórze właściwej skalpelem nieco bocznie do linii środkowej, jak pokazano w kroku 2.1.5. Kontynuuj nacięcie przez skórę za pomocą kauteryzatora.
      UWAGA: W przypadku eksperymentu terminalnego nacięcie można wykonać w tym samym miejscu, co pierwotne nacięcie.
    2. Umieść retraktor i przytrzymaj skórę za pomocą kleszczy i przetnij beznaczyniową tkankę łączną między okostną a tkanką podskórną (ryc. 3B), aby zapewnić skórze większą elastyczność i ułatwić szycie w kroku 1.4. Dostosuj zwijacz do uzyskanej elastyczności.
      UWAGA: Jeśli jest to eksperyment terminalny, ten krok można pominąć.
    3. Naciąć okostną i odłączyć ją od czaszki za pomocą windy okostnej. Przytrzymaj okostną na bok za pomocą retraktora.
    4. Zdejmij zaślepkę okienka czaszki i usuń wszelkie łączniki z otworu, wykonując delikatne okrężne ruchy wacikiem, aż do osiągnięcia opony twardej.
  3. Implantacja drutu obwodowego
    1. Powtórz krok 1.2.
  4. Rejestracja sygnałów korowych
    1. Powtórz krok 1.3.
  5. Zamknięcie miejsca wszczepienia implantu
    1. Powtórz krok 1.4.
      UWAGA: Jeśli jest to eksperyment terminalny, ten krok można pominąć.

3. Operacja terminalna (Faza III)

UWAGA: Po 2-4 tygodniach okno czaszkowe jest otwierane w celu wykonania dalszych zapisów sygnałów korowych z S1. Kroki 2.2-2.5 są powtarzane, jak opisano powyżej, a następnie krok 3.1.

  1. Eutanazja
    UWAGA: Rurkę cewnika do żył usznych należy przepłukać solą fizjologiczną, aby zapobiec utlenianiu barbituranu.
    1. Przepłukać cewnik do żył usznych solą fizjologiczną.
    2. Podłączyć strzykawkę z przedawkowaniem pentobarbitalu (10 ml, 400 mg/ml) i wstrzyknąć pentobarbital przez cewnik do żył usznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z techniki okna czaszkowego, sygnały korowe zarejestrowano w 43 sesjach u 16 zwierząt. Zwierzęta zagoiły się prawidłowo po operacji i były trzymane w parach przez cały czas trwania badania i codziennie monitorowane przy użyciu schematu dobrostanu w tabeli uzupełniającej S1. Wszystkie zwierzęta przez cały czas otrzymywały ocenę 0, co świadczy o doskonałym dobrostanie. Rycina 7 pokazuje, że okna rzeczywiście zostały umieszczone nad obszarem S1 kory świni. Pewne bli...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znaczenie rozwoju tej techniki polega na usunięciu trybów uszkodzenia elektrod, zmniejszeniu odpowiedzi tkanek, a tym samym poprawie niezawodności inwazyjnych technik zapisu korowego. Podczas badania nie wystąpiły żadne tryby awarii elektrod, a w całym badaniu użyto łącznie dwóch matryc ECoG, w tym 16 zwierząt i 43 sesji nagraniowych. Ma to dodatkowy pozytywny wpływ na gospodarkę badawczą. Stosując tradycyjne, w pełni wszczepione metody 12,26,27, wymagane byłoby co najmniej 16 macierzy ECoG przy założeniu, że nie wystąpi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować opiekunom zwierząt i technikom z laboratorium dla zwierząt w Szpitalu Uniwersyteckim w Aalborgu. Centrum Neuroplastyczności i Bólu (CNAP) jest wspierane przez Duńską Narodową Fundację Badawczą (DNRF121). Rysunek 6 i Rysunek 8 zostały utworzone w BioRender.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Implantacja okienka czaszkowego
SkalpelJednorazowe, ostrze 10
Pęseta
Gaza
Kauteryzator
Winda okostnapłaska, szerokość 10 mm
Zwijacz Weitlanera3x4 ząb,, 16,5 cm
System wierteł chirurgicznych Midas Rex Legend EHS z rysikiemRozwiązania chirurgiczne firmy Medtronic, Fort Worth, Stany Zjednoczone
Wiertła precyzyjne Legend Ball  Rozwiązania chirurgiczne firmy Medtronic, Fort Worth, Stany Zjednoczone7BA40F-MN oraz 7BA60F-MNGłowica typu MedNext o średnicy 4 i 6 mm
Sterylna osłona wiertarki
StrzykawkaPojemność 5 ml
Słony
Ssania
Linijka
Patyczki kosmetyczne
Rongeur powiedział:szczęka prosta, 15 cm, rozmiar końcówki 3 x 20 mm
Wiertarka ręczna 2,5 mm z uchwytem
Zestaw do infuzji motyla
Sześć M3 o długości 6-14 mm
Śrubokręt 
Trzy rozmiary okienka czaszkowego wydrukowanego w 3D (głębokość 4, 5 i 6 mm) i nasadki
Deizolowane złącze w kształcie litery U
Złącze krokodylkowe
Genta-coll wchłanialna gąbka do antybiotyków
Szew wchłanialny VYCRIL Etyka2-0 26 mm okrągły korpus
Szew niewchłanialny monocrylEtyka3-0 Cięcie wsteczne 24 mm
Uchwyt na igłę
Nożyczki
Miejscowy adhezyjny klej tkankowyLeukosan powiedział:
Implantacja drutu obwodowego
Dwa częściowo nieizolowane przewody Coonera
UWAGA: 1-2 cm przewodów jest nieizolowanych w środku i na jednym z końców
Dwie igły o rozmiarze 23
Gaza
Programowalny stymulator sterowany przez komputer PC z systemem MC_stimulusMultichannel Systems, Reutlingen, NiemcySTG4008
Dwa złącza krokodylkowe
Nagrania korowe
Metalowa płytka do mikromanipulatora magnetycznego 
Magnetyczny stojak na mikromanipulator
Mikromanipulator
Uchwyt na scenę główną
32-kanałowa scena czołowa ZIF-clipTDT, Alachua, Floryda, Stany Zjednoczone
32-kanałowa mikroelektrokortykografia (&mikro; ECoG) tablica Neuronexus, Ann Arbor, Stany ZjednoczoneE32-1000-30-200
Aparatura rejestrująca TDT zawierająca przedwzmacniacz SI8, procesor danych RZ2 oraz stację roboczą WS8 TDT, Alachua, Floryda, Stany Zjednoczone
Znieczulenie & Analgezja
Zoletil 50 WeterynarzVirbac, Carros, Francja
Rompun (Zxylacin)Elanco Zdrowie Zwierząt Monheim; Niemcy
Torbugesic (Butorfanol)Intervet International, Boxmeer, HolandiaObecnie stosuje się inny preparat (dolorex)
KetaminolIntervet International, Boxmeer, Holandia
PropofolBaxter Holding, Utrecht, Holandia
FentanyluB. Braun, Melsungen, Niemcy
Kamera MetacamBorhringer Ingelheim Vetmedica, Ingelheim, Niemcy
Noromox powiedział:Scanvet Animal Health, Fredensborg, Dania
PięciokątLeVet, Oudewater, Holandia

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitchell, P., et al. Assessment of safety of a fully implanted endovascular brain-computer interface for severe paralysis in 4 patients: the Stentrode with thought-controlled digital switch (switch) study. JAMA Neurol. 80 (3), 270(2023).
  2. Steinmetz, N. A., et al. Neuropixels 2.0: a miniaturized high-density probe for stable, long-term brain recordings. Science. 372 (6539), eabf4588(2021).
  3. Neuralink's first-in-human clinical trial is open for recruitment. , Neuralink. https://neuralink.com/blog/first-clinical-trial-open-for-recruitment/ (2023).
  4. Duun-Henriksen, J., et al. A new era in electroencephalographic monitoring? Subscalp devices for ultra-long-term recordings. Epilepsia. 61 (9), 1805-1817 (2020).
  5. Szostak, K. M., Grand, L., Constandinou, T. G. Neural interfaces for intracortical recording: requirements, fabrication methods, and characteristics. Front Neurosci. 11, 665(2017).
  6. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
  7. Morand-Beaulieu, S., Perrault, M. -A., Lavoie, M. E. Test-retest reliability of event-related potentials across three tasks. Journal of Psychophysiology. 36 (2), 100-117 (2022).
  8. Ip, C. -T., et al. Pre-intervention test-retest reliability of EEG and ERP over four recording intervals. Int J Psychophysiol. 134, 30-43 (2018).
  9. Qin, H., Ding, L., Duan, W., Lei, X. Test-retest reliability of EEG: a comparison across multiple resting-state and task-state experiments. Xin Li Xue Bao. 55 (10), 1587(2023).
  10. Höller, Y., et al. Reliability of EEG measures of interaction: a paradigm shift is needed to fight the reproducibility crisis. Front Hum Neurosci. 11, 441(2017).
  11. Colachis, S. C., et al. Long-term intracortical microelectrode array performance in a human: a 5 year retrospective analysis. J Neural Eng. 18 (4), 0460d7(2021).
  12. Barrese, J. C., et al. Failure mode analysis of silicon-based intracortical microelectrode arrays in non-human primates. J Neural Eng. 10 (6), 066014(2013).
  13. Szymanski, L. J., et al. Neuropathological effects of chronically implanted, intracortical microelectrodes in a tetraplegic patient. J Neural Eng. 18 (4), 0460b9(2021).
  14. Meijs, S., et al. Influence of fibrous encapsulation on electro-chemical properties of TiN electrodes. Med Eng Phys. 38 (5), 468-476 (2016).
  15. Kim, A., et al. Investigating immunomodulatory biomaterials for preventing the foreign body response. Bioengineering. 10 (12), 1411(2023).
  16. Janjua, T. A. M., et al. The effect of peripheral high-frequency electrical stimulation on the primary somatosensory cortex in pigs. IBRO Neurosci Rep. 11, 112-118 (2021).
  17. Meijs, S., Andreis, F. R., Janjua, T. A. M., Graven-Nielsen, T., Jensen, W. High-frequency electrical stimulation increases cortical excitability and mechanical sensitivity in a chronic large animal model. Pain. 166 (2), e18-e26 (2025).
  18. Branco, M. P., Geukes, S. H., Aarnoutse, E. J., Ramsey, N. F., Vansteensel, M. J. Nine decades of electrocorticography: a comparison between epidural and subdural recordings. Eur J Neurosci. 57 (8), 1260-1288 (2023).
  19. Meijs, S., Andreis, F. R., Janjua, T. A. M., Jensen, W. Reliability of a cranial window for chronic epidural recordings from the pig primary somatosensory cortex. Annu Int Conf IEEE Eng Med Biol Soc. 2024, 1-4 (2024).
  20. García, A., Calleja, J., Antolín, F. M., Berciano, J. Peripheral motor and sensory nerve conduction studies in normal infants and children. Clin Neurophysiol. 111 (3), 513-520 (2000).
  21. Thomas, J. E., Lambert, E. H. Ulnar nerve conduction velocity and H-reflex in infants and children. J Appl Physiol. 15 (1), 1-9 (1960).
  22. Liu, X. -G., Sandkühler, J. Characterization of long-term potentiation of C-fiber-evoked potentials in spinal dorsal horn of adult rat: essential role of NK1 and NK2 receptors. J Neurophysiol. 78 (4), 1973-1982 (1997).
  23. Sandkühler, J., Liu, X. Induction of long-term potentiation at spinal synapses by noxious stimulation or nerve injury: LTP in spinal cord induced by noxious stimulation. Eur J Neurosci. 10 (7), 2476-2480 (1998).
  24. van den Broeke, E. N., et al. The effect of high-frequency conditioning stimulation of human skin on reported pain intensity and event-related potentials. J Neurophysiol. 108 (8), 2276-2281 (2012).
  25. van den Broeke, E. N., Lambert, J., Huang, G., Mouraux, A. Central sensitization of mechanical nociceptive pathways is associated with a long-lasting increase of pinprick-evoked brain potentials. Front Hum Neurosci. 10, 531(2016).
  26. Fallegger, F., Trouillet, A., Lacour, S. P. Subdural soft electrocorticography (ECoG) array implantation and long-term cortical recording in minipigs. J Vis Exp. (193), e64997(2023).
  27. Palma, M., et al. Chronic recording of cortical activity underlying vocalization in awake minipigs. J Neurosci Methods. 366, 109427(2022).
  28. Salatino, J. W., Ludwig, K. A., Kozai, T. D. Y., Purcell, E. K. Glial responses to implanted electrodes in the brain. Nat Biomed Eng. 1 (11), 862-877 (2017).
  29. Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J Neurosci Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
  30. Meijs, S., et al. Biofouling resistance of boron-doped diamond neural stimulation electrodes is superior to titanium nitride electrodes in vivo. J Neural Eng. 13 (5), 056011(2016).
  31. Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: a review of cranial window technology for optical access to the brain. J Neurosci Methods. 354, 109100(2021).
  32. O'Sullivan, K. P., Orazem, M. E., Otto, K. J., Butson, C. R., Baker, J. L. Electrical rejuvenation of chronically implanted macroelectrodes in nonhuman primates. J Neural Eng. 21 (3), 036056(2024).
  33. Holdgraf, C., et al. iEEG-BIDS, extending the Brain Imaging Data Structure specification to human intracranial electrophysiology. Sci Data. 6 (1), 102(2019).
  34. Mercier, M. R., et al. Advances in human intracranial electroencephalography research, guidelines and good practices. Neuroimage. 260, 119438(2022).
  35. Löscher, W., Worrell, G. A. Novel subscalp and intracranial devices to wirelessly record and analyze continuous EEG in unsedated, behaving dogs in their natural environments: a new paradigm in canine epilepsy research. Front Vet Sci. 9, 1014269(2022).
  36. Waziri, A., et al. Intracortical electroencephalography in acute brain injury. Ann Neurol. 66 (3), 366-377 (2009).
  37. Hartings, J. A., et al. Prognostic value of spreading depolarizations in patients with severe traumatic brain injury. JAMA Neurol. 77 (4), 489(2020).
  38. Takara, S., Kida, H., Inoue, T. Development of implantable devices for epilepsy: research with cats, dogs, and macaques in biomedical engineering. Advanced Robotics. 38 (14), 983-1007 (2024).
  39. Gierthmuehlen, M., et al. Mapping of sheep sensory cortex with a novel microelectrocorticography grid. J Comp Neurol. 522 (16), 3590-3608 (2014).
  40. Thielen, B., Meng, E. A comparison of insertion methods for surgical placement of penetrating neural interfaces. J Neural Eng. 18 (4), 041003(2021).
  41. MaassenVanDenBrink, A., Chan, K. Y. Neurovascular pharmacology of migraine. Eur J Pharmacol. 585 (2-3), 313-319 (2008).
  42. Costine-Bartell, B. A., et al. 2-photon imaging of fluorescent proteins in living swine. Sci Rep. 13 (1), 14158(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Elektrokortykografia wichroniczne rejestracjepotencja y wywo anedost p do opony twardejstymulacja wysokocz stotliwo ciowatechniki neuronaukowedobrostan zwierz tinterfejs m zg komputer

Powiązane artykuły