Ten artykuł przedstawia obszerny protokół dla PmbExM, techniki mikroskopii ekspansyjnej zaprojektowanej specjalnie dla biofilmów Proteus mirabilis. PmbExM wykorzystuje stopniową obróbkę enzymatyczną próbek biofilmu w celu uzyskania izotropowej, 4,3-krotnej ekspansji, umożliwiającej analizę w superrozdzielczości organizacji przestrzennej struktur komórkowych i subkomórkowych w tych siedzących zbiorowiskach drobnoustrojów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie biofilmu Proteus mirabilis w superrozdzielczości za pomocą mikroskopii ekspansyjnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dostęp do szczegółowych informacji wizualnych i danych ilościowych z próbek mikrobiologicznych przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii optycznej jest ograniczony przez barierę dyfrakcyjną. Jednym z rozwiązań zwiększających rozdzielczość jest mikroskopia ekspansywna (ExM), innowacyjna i ekonomiczna technika superrozdzielczości, która fizycznie powiększa próbki o około czterokrotne ich pierwotne rozmiary. Dla pomyślnej ekspansji niezbędna jest homogenizacja właściwości mechanicznych materiału biologicznego. Biofilmy to społeczności bakteryjne, przylegające do powierzchni i osadzone w wytwarzanej przez nie macierzy zewnątrzkomórkowej; wymagają one dostosowania protokołów ExM do ich unikalnych elementów konstrukcyjnych. W artykule przedstawiono biofilm Proteus mirabilis ExM (PmbExM), wyspecjalizowany wariant ExM, który umożliwia superrozdzielczą wizualizację biofilmów P. mirabilis hodowanych przez 48 godzin. Protokół koncentruje się na ukierunkowanej degradacji kluczowych składników strukturalnych próbek poprzez seryjne trawienie enzymatyczne, zoptymalizowane w pobliżu ich warunków teoretycznych. PmbExM wykorzystuje kombinację enzymów, w tym α-amylazy, celulazy i hydrolazy glikozydów litykazy do hydrolizy polisacharydów; mutanolizyna do hydrolizy peptydoglikanu; i proteinazy K do hydrolizy białek. Te procedury trawienia są niezależne od procesu żelowania, co pozwala na modyfikacje w celu spełnienia określonych wymagań homogenizacji w różnych modelach biofilmu. Ta zdolność adaptacyjna oferuje ogromny potencjał do zastosowania w różnych gatunkach bakterii i warunkach wzrostu. ExM zastosowano do różnych gatunków biofilmu o ogólnie nieoptymalnych współczynnikach ekspansji. Natomiast PmbExM osiąga teoretyczny maksymalny współczynnik rozszerzalności standardowego hydrożelu akryloamidowo-akrylowego ExM, bez znacznego zniekształcenia morfologii lub topologii. Celem tej pracy jest zapewnienie dostępnego protokołu super-rozdzielczości do wizualizacji architektury, montażu oraz cech komórkowych i wewnątrzkomórkowych biofilmów P. mirabilis.
Wprowadzenie
Mikroskopia fluorescencyjna jest szeroko stosowanym narzędziem do badania architektury, składu i funkcji biofilmu1. Jednak zdolność mikroskopii optycznej do rozpoznawania strukturalnych, komórkowych i subkomórkowych cech biofilmów jest ograniczona przez barierę dyfrakcyjną. Mikroskopia ekspansywna (ExM) to innowacyjna, dostępna i łatwa w użyciu technika superrozdzielcza, która ma ogromny potencjał w ujawnianiu struktury biofilmu poza granicą dyfrakcji2,3. ExM zwiększa rozdzielczość poprzez izotropowe rozszerzanie próbek biologicznych około czterokrotnie w stosunku do ich pierwotnego rozmiaru. Metoda polega na polimeryzacji in-situ pęczniejącego hydrożelu jonowego w całej próbce i zachowaniu względnego przestrzennego układu celów molekularnych przy ostrożnym stosowaniu4,5.
Aby ExM działało poprawnie, homogenizacja właściwości mechanicznych materiału biologicznego jest kluczowym krokiem6. Standardowe warianty ExM zostały opracowane na hodowlach komórek i tkanek ssaków, gdzie skutecznie osiągnęły homogenizację tylko poprzez trawienie proteolityczne proteinazy K4,5 lub denaturacja miękkich białek za pomocą detergentów i autoklawowanie7, co daje izotropową 4-krotną ekspansję. Jednak w przypadku bakterii i biofilmów bakteryjnych ściana komórkowa peptydoglikanu i elementy matrycy EPS, takie jak polisacharydy strukturalne, stanowią przeszkodę przed ekspansją2,3,8,9.
Ten artykuł opisuje procedury Mikroskopii Ekspansji Biofilmu Proteus mirabilis (PmbExM), dostosowanego wariantu ExM zaprojektowanego do rozszerzania biofilmów P. mirabilis, klinicznie istotnej pałeczki Gram-ujemnej związanej z wysoką opornością na antybiotyki i infekcjami dróg moczowych związanymi z cewnikiem10. PmbExM wykorzystuje kombinację mutanolizyny, α-amylazy, celulazy, litykazy i enzymatycznej proteinazy K do hydrolizy ściany komórkowej peptydoglikanu, polisacharydów i białek. Wyniki pokazują, że metoda ta pozwala osiągnąć 4,3-krotną ekspansję izotropową 48-godzinnych biofilmów P. mirabilis. Technika ta umożliwia wizualizację w superrozdzielczości architektury, montażu i cech wewnątrzkomórkowych biofilmu P. mirabilis poprzez podwójne barwienie3. Ponadto PmbExM można dostosować do innych modeli biofilmu poprzez dostosowanie zabiegów enzymatycznych do docelowych składników biofilmu specyficznych dla danego gatunku.
Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu procedur związanych z żelowaniem, trawieniem, rozszerzaniem i mocowaniem próbek biofilmu dla PmbExM. Ponadto praca ta przedstawia warunki wzrostu bakterii, formaty próbek i techniki barwienia fluorescencyjnego stosowane przez autorów, a także procedurę przetwarzania i analizy danych, która może być łatwo zastosowana przez badaczy z ograniczonym doświadczeniem w przetwarzaniu obrazu. Aby uzyskać bardziej obszerny i szczegółowy przewodnik na temat przetwarzania i analizy obrazu, zapoznaj się z Castagnini, D. et al.3.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Cały proces PmbExM przedstawiono podsumowująco na Ryc. 1. Skład wszystkich nazwanych roztworów (np. roztworu monomeru, roztworu do trawienia proteinazą K itp.) użytych w tej pracy znajduje się w Pliku uzupełniającym 1. Analogicznie, w Pliku uzupełniającym 2, Pliku uzupełniającym 3 oraz Pliku uzupełniającym 4 opisano uproszczoną procedurę przetwarzania i analizy danych, z której mogą korzystać badacze bez dużego doświadczenia w przetwarzaniu obrazów. Protokół można wygodnie przeprowadzić w okresie od 2,5 do 3 tygodni: pierwszy tydzień poświęca się na czyszczenie i sterylizację szkiełek nakrywnych, wzrost biofilmu oraz utrwalanie próbek; drugi tydzień na barwienie próbek i właściwy protokół PmbExM, a trzeci na montowanie próbek i akwizycję obrazów. Dodatkowo należy uwzględnić 1 tydzień wcześniejszych przygotowań wymaganych materiałów i roztworów. Szczegółowe informacje na temat odczynników, materiałów, sprzętu i oprogramowania wykorzystanego w tym badaniu wymieniono w Tabeli materiałów.
Rycina 1: Kotwiczenie, polimeryzacja, trawienie i dializa w protokole PmbExM w celu skutecznej ekspansji, obserwacji i analizy biofilmu P. mirabilis. Lewa kolumna identyfikuje sześć stanów próbki w wybranych krokach protokołu ekspansji. Proces rozpoczyna się od utrwalonej, permeabilizowanej i barwionej próbki biofilmu, przechodzi przez cztery stany pośrednie aż do końcowego stanu żelowego i rozszerzonego, gotowego do mikroskopii i analizy obrazu w super-rozdzielczości. Macierz EPS biofilmu pokazana jest na zielono, ściana komórkowa bakterii reprezentowana jest przez fioletowe linie, ogólna białkowa struktura komórki pokazana jest na szaro, a polimer ExM akrylamid-akrylan przedstawiony jest jako faliste niebieskie linie. Wszystkie enzymy zaangażowane w proces są reprezentowane przez symbole Pac-Mana: 3 glikozydohydrolazy (zielone) do hydrolizy egzopolisacharydów: $\alpha$-amylaza, celulaza i litykaza; mutanolizyna (fioletowa) do degradacji peptydoglikanowej ściany komórkowej oraz proteinaza K (szara) do ogólnego trawienia białek. Kolory symboli Pac-Mana odpowiadają odpowiednim strukturom docelowym. Wszystkie obiekty przedstawione z niskim stopniem krycia lub przerywanymi krawędziami reprezentują stan degradacji enzymatycznej. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Castagnini, D. et al.3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
1. Czyszczenie i sterylizacja szkiełek podstawowych do tworzenia biofilmu
- Poddać 12 mm szklane szkiełka nakrywki działaniu ultradźwięków w 1 M wodorotlenku sodu przez 20 min w temperaturze pokojowej, a następnie obficie opłukać wodą dejonizowaną.
- Poddać szkiełka nakrywki działaniu ultradźwięków w 70% (v/v) etanolu przez 15 min w temperaturze pokojowej, a następnie opłukać 95% (v/v) etanolem.
- Pozostawić szkiełka nakrywki do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej.
- Sterylizować w autoklawie.
2. Wzrost biofilmu Proteus mirabilis
- Hodować P. mirabilis w 10 mL bulionu Luria Bertani (LB) przez 24 h w temperaturze 37 °C bez wytrząsania.
UWAGA: W badaniu tym wykorzystano komercyjnie dostępny szczep referencyjny P. mirabilis (patrz Tabela materiałów), jednak zaleca się użycie dowolnego łatwo dostępnego szczepu P. mirabilis. - Pobrać 1 mL z kultury i dodać do 9 mL świeżego, jałowego bulionu LB w celu przygotowania zawiesiny bakteryjnej o rozcieńczeniu 1:10.
- Sprawdzić gęstość optyczną (OD) zawiesiny bakteryjnej 1:10 przy 600 nm, aby wyniosła 0,1. W razie potrzeby skorygować wartość, dodając niewielkie objętości świeżego LB lub kultury P. mirabilis, aż do uzyskania OD600 = 0,1.
- Umieścić szklane krawtki o średnicy 12 mm (wcześniej oczyszczone i wysterylizowane) w jałowej polistyrenowej płytce 24-dołkowej (jedna krawtka na dołek).
UWAGA: Należy upewnić się, że cała powierzchnia krawtki dotyka dna dołka. Biofilm utworzy się na stronie krawtki skierowanej ku górze. - Zasiać dołki płytki, dodając 350 µL zawiesiny bakteryjnej o OD600 = 0,1.
UWAGA: Zaleca się zasiewanie tylko wewnętrznych dołków płytki, podczas gdy dołki zewnętrzne (tj. dołki w rzędach A i D oraz w kolumnach 1 i 6) należy wypełnić jałową wodą lub bulionem LB. Wynika to z faktu, że w dołkach zewnętrznych występuje wyższa szybkość parowania cieczy niż w dołkach wewnętrznych, co wpływa na wzrost biofilmu. - Umieścić zasiałą płytkę w inkubatorze, ustawiając ją pod kątem 45 stopni.
UWAGA: Można wykorzystać powszechne materiały laboratoryjne, takie jak probówki wiriówek o pojemności 50 mL lub pudełka na końcówki do mikropipet. Ustawienie pod kątem umożliwi utworzenie granicy faz powietrze-ciecz na powierzchni krawtek, w miejscu, gdzie biofilm P. mirabilis osiągnie największą grubość. - Pozostawić biofilmy do wzrostu przez 48 h w temperaturze 37 °C, bez wytrząsania.
UWAGA: Taki układ wzrostu biofilmu nie nadaje się do inkubacji dłuższej niż 48 h ze względu na ryzyko wysuszenia biofilmu w wyniku odparowania pożywki.
3. Fixacja i przechowywanie próbek biofilmu
- Ostrożnie usunąć pożywkę z dołków i delikatnie przemyć dwa razy szkiełka nakrywki z biofilmem, używając 300 µL sterylnego buforu fosforanowo-solnego (PBS), przez 5 min w temperaturze pokojowej przy bardzo łagodnym mieszaniu.
UWAGA: Aby uniknąć zniszczenia biofilmów podczas wielokrotnej wymiany cieczy, należy stosować małe objętości do inkubacji lub płukania. Objętość 300-400 µL cieczy jest wystarczająca do zanurzenia biofilmów w płytce 24-dołkowej. Zaleca się powolne i metodyczne pipetowanie oraz unikanie bezpośredniego uderzania strumieniem roztworu w biofilmy. - Ostrożnie usunąć PBS i zastąpić go 400 µL 4% (w/v) paraformaldehydu (PFA) w PBS, inkubując przez 20 min w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia biofilmu.
- Usunąć PFA i zastąpić go 300 µL 1% PBST (1% v/v Triton X-100 w PBS) w celu permeabilizacji komórek. Inkubować przez 20 min w temperaturze pokojowej.
- Zastąpić roztwór 1% PBST 300 µL 0,3% PBST (3% v/v Triton X-100 w PBS). Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej.
- Usunąć 0,3% PBST i zastąpić go 300 µL mieszaniną metanolu i 0,3% PBST w stosunku 50:50 w celu odwodnienia próbki. Inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej, a następnie zastąpić mieszaninę 1 mL metanolu absolutnego.
UWAGA: 1 mL metanolu należy dodawać powoli, kierując strumień w stronę ścianek dołka. Większa objętość metanolu zapobiega jego całkowitemu odparowaniu podczas przechowywania próbek. - Próbki przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 dzień, maksymalnie do miesiąca.
UWAGA: Zaleca się uszczelnienie płytek za pomocą elastycznej folii woskowej, aby opóźnić odparowanie metanolu i wysychanie próbek. - Przed użyciem kolejno rehydratować próbki w temperaturze pokojowej, zastępując metanol 300 µL mieszaniną metanolu i 0,3% PBST w stosunku 50:50, a następnie 300 µL 0,3% PBST.
4. Barwienie fluorescencyjne biofilmu
- Próbki rehydratyzowanego biofilmu inkubować z 300 µL koniugatu fluorescencyjnego lektyny aglutyniny z kiełków pszenicy o stężeniu 50 µg/mL (dalej określanego jako koniugat WGA; patrz Tabela materiałów) w PBS przez 20 min w temperaturze pokojowej w celu barwienia ścian komórkowych/kapsułek/egzopolisacharydów.
UWAGA: Prosimy zapoznać się z odpowiednimi tematami dotyczącymi barwienia fluorescencyjnego w sekcji Dyskusja. Od tego momentu chronić próbki przed światłem. - Usunąć roztwór koniugatu WGA i delikatnie przemyć dwukrotnie 300 µL PBS przez 10 min w temperaturze pokojowej.
5. Etapy PmbExM
- Kotwiczenie MA-NHS i polimeryzacja akrylamidu-akrylanu
- Inkubować zabarwione próbki biofilmu z 400 µL 1 mM esteru N-hydroksysukcynimidy kwasu metakrylowego (MA-NHS) w PBS przez 1 h w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.
UWAGA: MA-NHS jest estrem aktywowanym, który ulega łatwo hydrolizie w środowisku wodnym, dlatego próbki należy poddać działaniu tego odczynnika natychmiast po przygotowaniu roztworu 1 mM w PBS. - Przeprowadzić trzy delikatne przemycia przez 10 min przy użyciu 300 µL PBS w temperaturze pokojowej.
- Usunąć PBS i zastąpić go 300 µL roztworu monomeru. Inkubować przez noc (O.N.) w temperaturze 4 °C.
- Przygotować przedkomory do żelowania. Jako podstawę wykorzystać szkiełko przedmiotowe, a na nim umieścić dwa kawałki złożonej dwustronnej taśmy klejącej, które będą pełnić rolę dystansów o grubości 400 µm. Rozmieścić dystansery w odległości 8-10 mm od siebie.
UWAGA: Sposób konstrukcji przedkomory do żelowania przedstawiono na Rysunku 2A. Zastosowana tutaj taśma dwustronna miała grubość około 100 µm, dlatego została przycięta i złożona, aby stworzyć dystansery o wymiarach 3 mm x 5 mm x 0,4 mm. Należy zmierzyć grubość dostępnej taśmy dwustronnej i odpowiednio ją przygotować. Absorpcja roztworu żelującego przez taśmowe dystansery jest pomijalna. Jako alternatywę dla taśmy dwustronnej można użyć okrągłych szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm, sklejonych kroplami wody i ułożonych warstwowo do osiągnięcia wymaganej wysokości. - Przygotować komory wilgotnościowe, aby chronić próbki przed wysychaniem podczas polimeryzacji.
UWAGA: Zwyczajne pudełko na końcówki do mikropipet można łatwo przekształcić w komorę wilgotnościową, usuwając plastikowy stelaż końcówek i zastępując go mokrymi ręcznikami papierowymi. - Przygotować świeżą partię roztworu żelującego, dokładnie mieszając objętości roztworu monomeru, 10 % (w/v) N, N, N', N'-tetrametylloetylenodiaminy (TEMED), 0,5 % (w/v) 4-hydroksy-TEMPO (4-HT) oraz 10 % (w/v) nadtlenku amonu (APS) w proporcji odpowiednio 47:1:1:1. APS należy zmieszać z pozostałymi odczynnikami roztworu żelującego dopiero po wykonaniu kroków do punktu 5.1.5 włącznie.
UWAGA: Całkowita objętość przygotowanego roztworu żelującego zależy od liczby przetwarzanych próbek biofilmu. Na przykład, aby przetworzyć trzy próbki biofilmu, należy przygotować 900 µL roztworu żelującego, mieszając 846 µL roztworu monomeru z 18 µL 10 % (w/w) TEMED, 18 µL 0,5 % (w/w) 4-HT i 18 µL 10 % (w/w) APS. Aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji, APS musi zostać dodany na końcu do mieszaniny i dopiero wtedy, gdy próbki, przedkomory i komory wilgotnościowe będą gotowe do użycia. Wszystkie wymienione odczynniki oraz niedawno przygotowany roztwór żelujący należy utrzymywać w schłodzeniu podczas tego kroku. - Natychmiast po przygotowaniu roztworu żelującego delikatnie usunąć roztwór monomeru i zastąpić go 300 µL roztworu żelującego. Inkubować w 4 °C przez 5 min.
- Podczas trwania kroku 5.1.7 usunąć pozostałą warstwę ochronną pasków taśmy dwustronnej umieszczonych na szkiełkach przedmiotowych, a w przestrzeni między nimi nanieść 40 µL roztworu żelującego.
- Po zakończeniu kroku 5.1.7 wyjąć każde szkiełko nakrywkowe z biofilmem z jego dołka i położyć je na kropli 40 µL roztworu żelującego naniesionej wcześniej na szkiełko przedmiotowe. Ułożyć szkiełko nakrywkowe tak, aby biofilm na jego powierzchni stykał się z roztworem żelującym.
- Zakończyć konstrukcję komory żelowania, delikatnie dociskając szkiełko nakrywkowe z biofilmem za pomocą pęsety, aby zapewnić jego przyleganie do dystanserów z taśmy dwustronnej.
UWAGA: Ta kanapkową konstrukcja stanowi tzw. komorę żelowania (Rysunek 2B). - Pozostawić próbki do polimeryzacji wewnątrz komory wilgotnościowej i inkubować przez 2 h w 37 °C bez mieszania.
- Zwizualizować próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym (patrz krok 6.2.1) bez rozmontowywania komór żelowania w celu wykonania zdjęć przed ekspansją.
UWAGA: Nie pozostawiać żelowanych próbek poza komorą wilgotnościową przez więcej niż godzinę, ponieważ żele przed ekspansją są podatne na wysychanie, co czyni próbkę nieużyteczną. Procedury akwizycji obrazu przed ekspansją opisano w kroku SF2.3 (Plik uzupełniający 2). - Rozmontować komory żelowania i przyciąć nadmiar żelu wokół obszaru zainteresowania w próbce biofilmu za pomocą skalpela chirurgicznego.
UWAGA: Przycinanie żeli jest wysoce zalecane w celu ułatwienia manipulacji i montażu ekspandowanych próbek. Dodatkowo, aby zachować orientację przestrzenną obszaru zainteresowania w próbkach, należy przyciąć żele do asymetrycznego kształtu lub pozostawić w żelu charakterystyczne wycięcie dla łatwego rozpoznania właściwej orientacji. - Umieścić szkiełka nakrywkowe z przyciętymi żelami w nowej płytce 24-dołkowej, stroną żelu do góry.
UWAGA: Na tym etapie żelowane próbki powinny pozostać przytwierdzone do oryginalnego szkiełka nakrywkowego.
- Inkubować zabarwione próbki biofilmu z 400 µL 1 mM esteru N-hydroksysukcynimidy kwasu metakrylowego (MA-NHS) w PBS przez 1 h w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.
- Trawienie enzymatyczne I-III i barwienie DNA
UWAGA: Homogenizacja właściwości mechanicznych próbek biofilmu P. mirabilis odbywa się poprzez serię trawień enzymatycznych, które autorzy podzielili na 3 etapy w zależności od struktury biologicznej przeznaczonej do degradacji: hydroliza polisacharydów (Trawienie I), hydroliza peptydoglikanu (Trawienie II) i hydroliza białek (Trawienie III).- Trawienie I
- Zanurzyć próbki w 1 mL roztworu trawiącego z α-amylazą. Inkubować O.N. w 50 °C.
UWAGA: Stosuje się duże objętości (tj. 0,5-1 mL) roztworu enzymatycznego, aby zapobiec wysychaniu próbek ze względu na wysoką temperaturę inkubacji. - Usunąć roztwór α-amylazy i płukać żele przez 5 min w temperaturze pokojowej przy użyciu 300 µL buforu do trawienia celulazą.
- Usunąć bufor do trawienia celulazą i zastąpić go 500 µL roztworu trawiącego z celulazą. Inkubować przez 2 h w 45 °C.
- Usunąć roztwór trawiący z celulazą i płukać żele przez 5 min w temperaturze pokojowej przy użyciu 300 µL buforu do trawienia litykazą.
- Usunąć bufor do trawienia litykazą i zastąpić go 500 µL roztworu trawiącego z litykazą. Inkubować przez 2 h w 30 °C.
- Zanurzyć próbki w 1 mL roztworu trawiącego z α-amylazą. Inkubować O.N. w 50 °C.
- Trawienie II
- Usunąć roztwór trawiący z litykazą i płukać żele przez 5 min w temperaturze pokojowej przy użyciu 300 µL buforu do trawienia mutanolizyną.
- Usunąć bufor do trawienia mutanolizyną i zastąpić go 1 mL roztworu trawiącego z mutanolizyną. Inkubować O.N. w 55 °C.
- Trawienie III
- Usunąć roztwór trawiący z mutanolizyną i płukać żele przez 5 min w temperaturze pokojowej przy użyciu 300 µL buforu do trawienia proteinazą K. Usunąć bufor do trawienia proteinazą K i zastąpić go 500 µL roztworu trawiącego z proteinazą K. Inkubować przez 2 h w 37 °C.
- (OPCJONALNIE) Barwienie DNA
- Usunąć roztwór proteinazy K i płukać żele 300 µL 10x PBS przez 5 min w temperaturze pokojowej.
- Usunąć 10x PBS i zastąpić go 300 µL 5 µM czerwonego fluorescencyjnego barwnika kwasów nukleinowych w 10x PBS na 30 min w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Uwagi dotyczące barwienia DNA w procedurach ExM znajdują się w sekcji Dyskusja.
- Trawienie I
- Ekspansja
- Usunąć roztwór proteinazy K (lub roztwór barwiący DNA, jeśli wykonano opcjonalny krok 5.2.4) i przenieść żele do 60-milimetrowej szalki Petriego. Umieścić jeden żel na szalkę.
UWAGA: Użyć małego płaskiego pędzla, aby przesunąć żel na jego szkiełko nakrywkowe. Chwycić szkiełko nakrywkowe pęsetą laboratoryjną i użyć go jako platformy dla żelu. Podczas wyjmowania z dołka płytki wspomagać się pędzlem, aby zapobiec zsunięciu się żelu ze szkiełka. Unikać składania się żeli. - Wypełnić szalkę Petriego nadmiarową wodą dejonizowaną, całkowicie zanurzyć żel i inkubować przy łagodnym mieszaniu w temperaturze pokojowej przez 20 min. Wymienić wodę 4-5 razy.
UWAGA: Należy pamiętać, że ekspandujący żel staje się praktycznie niewidoczny po zanurzeniu w wodzie. Ustawić szalkę Petriego pod światło, aby ułatwić lokalizację żelu i uniknąć jego uszkodzenia przez ssanie pipety Pasteura lub mikropipety podczas wymiany wody.
- Usunąć roztwór proteinazy K (lub roztwór barwiący DNA, jeśli wykonano opcjonalny krok 5.2.4) i przenieść żele do 60-milimetrowej szalki Petriego. Umieścić jeden żel na szalkę.
Rycina 2: Komora żelowania i montaż próbki. (A) Komora przed żelowaniem. Na szkiełku przedmiotowym umieść 2 przekładki z taśmy dwustronnej (żółte). Szkiełko nakrywkowe (
= 12 mm) spoczywa na górze jako punkt odniesienia odległości. (B) Komora żelowania. Bakteryjny biofilm (zielony) tworzy się na dolnej powierzchni szkiełka nakrywkowego. Przekładki o grubości 400 µm (pomarańczowe) są wykonane z wycięć taśmy dwustronnej o grubości 100 µm. Przekładki umożliwiają zanurzenie całej próbki w żelu i zapobiegają przelewaniu się roztworu żelującego z krawędzi komory, co chroni próbkę przed zmiażdżeniem między szkiełkiem przedmiotowym a nakrywkowym. (C) Wydrukowane w 3D komory obrazowania (odwiedź poniższy link, aby uzyskać dostęp do plików .stl https://github.com/scianlab/ExM). Rozszerzona próbka żelu (lewa) oraz rozszerzona próbka żelu zanurzona w wodzie dejonizowanej (prawa). Rozszerzone żele stają się niemal niewidoczne po zanurzeniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
6. Obserwacja i analiza
- Montaż rozszerzonych próbek
- Przygotuj komory obrazujące poprzez pokrycie ich poli-lizyną w celu unieruchomienia próbki podczas obrazowania11: Namocz szklaną powierzchnię komory obrazującej (patrz Tabela materiałów) w 0,1% (w/v) poli-L-lizynie przez 20 min w temperaturze pokojowej.
- Usuń roztwór poli-L-lizyny i przeprowadź dwa płukania nadmiarem wody dejonizowanej. Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 1 h lub umieść w inkubatorze w temperaturze 37 °C, aby przyspieszyć proces suszenia.
- Po piątym cyklu dializy z kroku 5.3.2, usuń wodę pokrywającą żele i za pomocą małego płaskiego pędzla przesuń próbkę na szklaną lamą o wymiarach 24 mm x 50 mm. Użyj prostokątnej lamy jako platformy dla żelu i podnieś go z szalki Petriego.
- Usuń nadmiar wody z żelu za pomocą ręcznika papierowego, aby zapobiec blokowaniu bezpośredniego kontaktu między powierzchnią żelu a powłoką poli-lizyny na szklanej powierzchni komory obrazującej.
- Ostrożnie umieść żel na szklanej powierzchni komory obrazującej, unikając uwięzienia pęcherzyków powietrza między żelem a szkłem.
UWAGA: Szklana powierzchnia komory obrazującej powinna być całkowicie sucha. Jeśli wykonano obrazy przed rozszerzeniem, należy zadbać o prawidłową orientację rozszerzonego żelu, aby ułatwić odnalezienie wcześniej zarejestrowanych pól widzenia w próbce przed rozszerzeniem. - Dodaj wodę dejonizowaną, aż żel zostanie całkowicie zanurzony (patrz Rysunek 2C).
UWAGA: Rozszerzone żele muszą pozostać nawodnione przez cały proces obrazowania, aby uniknąć kurczenia się podczas akwizycji.
- Akwizycja obrazów
- Wizualizuj i rejestruj obrazy próbek na dostępnym fluorescencyjnym mikroskopie o rozdzielczości ograniczonej dyfrakcją.
UWAGA: Autorzy wykorzystali konfokalny mikroskop z dyskiem rotującym, z obiektywem imersyjnym wodnym 63x o aperturze numerycznej (NA) 1,2. Do wzbudzenia fluoroforów zastosowano linie lasera półprzewnikowego o długościach 488 i 647 nm. Obrazy rejestrowano za pomocą 16-bitowej cyfrowej kamery CMOS sterowanej przez dedykowane oprogramowanie (patrz Tabela materiałów). Rozmiar woksela ustawiono na 64,4 mm x 64,4 mm x 200 nm (osie XYZ).
- Wizualizuj i rejestruj obrazy próbek na dostępnym fluorescencyjnym mikroskopie o rozdzielczości ograniczonej dyfrakcją.
- Przetwarzanie obrazów
- Informacje na temat procedury cyfrowego przetwarzania obrazów w celu segmentacji bakterii (sekcja SF2.1), pomiaru szerokości komórek (sekcja SF2.2), wyznaczenia EF (sekcja SF2.3) oraz dopasowania obrazów dla warunków przed i po rozszerzeniu (sekcja SF2.4) znajdują się w Pliku uzupełniającym 2.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Metoda PmbExM zwiększyła rozmiar biofilmu P. mirabilis 4,3-krotnie, zachowując jego morfologię i topologię
Rysunek 3A-D dowodzi fizycznego powiększenia komórek biofilmu P. mirabilis oraz zwiększenia rozdzielczości uzyskanej dzięki tej technice. Co więcej, zaobserwowano to nie tylko w cienkich obszarach biofilmu, gdzie komórki organizują się w układzie przypominającym monowarstwę, ale ta...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Krytyczne kroki PmbExM
Podobnie jak w przypadku każdego wariantu ExM, jednym z najbardziej krytycznych etapów protokołu jest homogenizacja właściwości mechanicznych próbki. W przypadku PmbExM osiąga się to poprzez szereg zabiegów enzymatycznych. Niewystarczające trawienie może skutkować niskim poziomem EF i potencjalnym uszkodzeniem morfologii i/lub topologii biofilmu, co prowadzi do nieoptymalnej rozdzielczości i niewiarygodnych wyników. I odwrotnie, zbyt agresywne trawienie, zwłaszcza zabiegi prot...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że nie ma finansowych ani osobistych konfliktów interesów związanych z tą pracą.
Podziękowania
Autorzy wyrażają swoją wdzięczność dr Juanowi Eduardo Rodríguezowi i prof. dr Ulrichowi Kubitschekowi (U-Bonn) za ich wkład we wdrażanie technik ekspansji w SCIAN-Lab. Praca została sfinansowana ze środków ANID ICM P09-015-F (SH, DC, KP, JJW), FONDECYT 1211988 (SH, DC, KP), FONDECYT 3220832 (JJW), FONDEQUIP EQM210020 (DC, KP, JJW, JT, NCH, PS, SH); Núcleo SELFO NCN2024_068 (SH, KP, JJW), CORFO 16CTTS- 66,390, MINEDUC grant RED 21994 (SH), BASAL FB210005 (SH), DAAD 57519605 (SH, NC), Centro CTI230006 (SH), FONDEF ID 23I10337 (SH) oraz Regional Binational Project Cooperación SUR-SUR AUCI / AGCID BIL-URY-2019-661 (SH, NCH, PS, MJG).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| &alfa;-Amylaza z Bacillus sp. | Sigma-Aldrich | 10070 | Mineralizacja polisacharydowa |
| 0,1% (w/v) roztwór wodny poli-L-lizyny | Sigma-Aldrich | P8920 | Unieruchomienie próbki do obrazowania |
| Szkiełka nakrywkowe szklane 12 mm | Chemglass Life Sciences | CLS-1760 | Komponent komory żelowej |
| 16-bitowa kamera C13440-20CU | Hamamatsu Photonics | Niedostępna | kamera cyfrowa CMOS do akwizycji obrazu |
| Szkiełka nakrywkowe szklane 24 mm x 50 mm | Chemglass Life Sciences | CLS-1764 Manipulacja | /obsługa próbek |
| Komora obrazowania wydrukowana w 3D | Własny | projekt-opcja | komory obrazowania |
| 4-hydroksy-2,2,6,6-tetrametylopirydyno-1-oksyl (4-hydroksy-TEMPO) | Sigma-Aldrich | 176141 | Składnik roztworu żelującego |
| 6-dołkowa szklana płyta denna z czarnymi | ściankami CelVis | P06-1.5H-N | Opcja komory obrazowania |
| Kwas octowy | Sigma-Aldrich | 818755 | Enzymatyczny składnik buforowy |
| Akrylamid | Sigma-Aldrich | A4058 | Składnik roztworu monomeru |
| Nadsiarczan amonu | Sigma-Aldrich | A3678 | Składnik roztworu żelującego |
| Mikroskop Axiovert 200 | Zeiss | Niedostępny | Mikroskop konfokalny |
| Chlorek wapnia | Sigma-Aldrich | C8106 | Enzymatyczny składnik buforowy |
| C-Apochromat 63x 1,2 NA Obiektyw do zanurzania w wodzie | Zeiss | Niedostępne | Obiektyw mikroskopu |
| Celulaza od Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | 22178 | Trawienie polisacharydowe |
| Chamlide CMB 35 mm miska magnetyczna | Instrument | Niedostępne | Opcja komory obrazowania |
| Roztwór podstawowy odczynnika kotwiczącego Sigma-Aldrich 472301 MA-NHS | |||
| Fosforan disodowy | Sigma-Aldrich | S3264 | Enzymatyczny składnik buforowy |
| Etanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Czyszczenie i sterylizacja |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy | Merck | 324503 | Enzymatyczny składnik buforowy |
| Polistyren Falcon 24-dołkowe Corning | 351147 | Platforma procedur ogólnych | |
| Oprogramowanie | FIJINational Institutes of | Health-Oprogramowanie | do przetwarzania obrazów |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | Enzymatyczny składnik buforowy |
| Chlorowodorek guanidyny | Thermo Scientific | 24115 | Enzymatyczny składnik |
| buforowy Huygens Software | obrazowania objętości | przywracania obrazu | |
| Kwas solny | Supelco | 1.00317 | Przygotowanie buforu |
| Bibułka Kimwipes | Fisher Scientiffic | 06-666 | Usuwanie nadmiaru wody |
| Pęseta laboratoryjna | Mikroskopia elektronowa Sciences | M5E | Ogólna manipulacja/obsługa próbek |
| Bulion Luria Bertani | Invitrogen | 12795-027 | Pożywka wzrostowa biofilmu |
| Lyticase z Arthrobacter luteus | Sigma-Aldrich | L4025 | Trawienie polisacharydowe |
| Chlorek magnezu | Sigma-Aldrich | D5652 | Enzymatyczny składnik buforowy |
| Kwas metakrylowy N-hydroksysukcynimidyl ester | Sigma-Aldrich | 730300 | Odczynnik kotwiczący |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Odwadnianie i przechowywanie próbki |
| MicrobeJ | - | - | Wtyczka oprogramowania do przetwarzania obrazu |
| Szkiełka mikroskopowe | Chemglass Life Sciences | CG-8221 | Składnik komory żelowej |
| Fosforan monosodowy | Sigma-Aldrich | S9638 | Enzymatyczny składnik buforowy |
| Mutanolizyna z Streptomyces globisporus | Sigma-Aldrich | M990 | Trawienie peptydoglikanem |
| N, N, N', N'-tetrametyloetylenodiamina | Sigma-Aldrich | T7024 | Składnik roztworu żelującego |
| N,N′-metylenobisakryloamid | Sigma-Aldrich | M1533 | Składnik roztworu monomeru |
| Nunc 40,4 mm szklane dno szalki Petriego | Thermo Fisher | 12-567-400 | Opcja komory obrazowania |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | 158127 | Utrwalanie próbki |
| Bufor fosforanowy sól fizjologiczna | Sigma-Aldrich | 79383 | Składnik roztworu monomeru, Mycie, Bufor enzymatyczny |
| Proteinaza K z Engyodontium album | Invitrogen | 25530-031 | Trawienie białek |
| Proteus mirabilis ATCC 12453 | Mikrobiologia | 0440P | Przedmiot badania |
| Mały płaski pędzel | Lokalny sklep z narzędziami | - | manipulacja/obsługa próbek |
| Octan sodu | Sigma-Aldrich | 241245 | Enzymatyczny składnik buforowy |
| Akrylan sodu | Sigma-Aldrich | 408220 | Składnik roztworu monomeru |
| Wodorowęglan sodu | Sigma-Aldrich | S5761 | Enzymatyczny składnik buforowy |
| Chlorek | soduSigma-Aldrich | S9888 | Składnik roztworu monomeru, Składnik buforowy enzymu |
| Wodorotlenek sodu | Sigma-Aldrich | 221465 | Czyszczenie szkiełek |
| Linia laserowa na ciele stałym | Omicron | Niedostępne | Linia lasera wzbudzającego 488, 568 i 647 nm Barwienie |
| kwasami nukleinowymi SYTO 61 | Invitrogen | S11343 | Barwnik fluorescencyjny |
| Tris(hydroksymetylo)aminometan chlorowodorek | SAFC | 108219 | Enzymatyczny składnik buforowy |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Permeabilizacja próbki, Enzymatyczny składnik buforowy |
| Oprogramowanie do przechwytywania Volocity 7.0.0 | kontrolera akwizycji | Quorum | Technologies-Microscoy |
| wirujących dysków Volocity ViewVox | Perkin-Elmer | Niedostępne | System wirujących dysków do konfokalnych mikroskop |
| Aglutynina z kiełków pszenicy – Alexa Fluor 488 fluorescencyjny koniugat lektyny | Invitrogen | W11261 | Barwnik fluorescencyjny |
Bibliografia
- Franklin, M. J., Chang, C., Akiyama, T., Bothner, B. New technologies for studying biofilms. Microbiol Spectr. 3 (4), 10(2015).
- Valdivieso González, D., Jara, J., Almendro-Vedia, V. G., Orgaz, B., López-Montero, I. Expansion microscopy applied to mono- and dual-species biofilms. NPJ Biofilms Microbiomes. 9 (1), 92(2023).
- Castagnini, D., et al. Proteus mirabilis biofilm expansion microscopy yields over 4-fold magnification for super-resolution of biofilm structure and subcellular DNA organization. J Microbiol Methods. 220, 106927(2024).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging- Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nat Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Gao, R., Asano, S. M., Boyden, E. S. Q&A: Expansion microscopy. BMC biology. 15 (1), 50(2017).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nat Biotechnol. 34 (9), 987-992 (2016).
- Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLoS biology. 17 (10), e3000268(2019).
- Kunz, T. C., et al. The expandables: Cracking the staphylococcal cell wall for expansion microscopy. Front Cell Infect Microbiol. 11, 644750(2021).
- Jacobsen, S. M., Shirtliff, M. E. Proteus mirabilis biofilms and catheter-associated urinary tract infections. Virulence. 2 (5), 460-465 (2011).
- Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: Protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. 80 (1), e56(2018).
- Yokogawa, K., Kawata, S., Nishimura, S., Ikeda, Y., Yoshimura, Y. Mutanolysin, bacteriolytic agent for cariogenic streptococci: partial purification and properties. Antimicrob Agents Chemother. 6 (2), 156-165 (1974).
- Hurst, P. L., Nielsen, J., Sullivan, P. A., Shepherd, M. G. Purification and properties of a cellulase from Aspergillus niger. Biochem J. 165 (1), 33-41 (1977).
- Scott, J. H., Schekman, R. Lyticase: Endoglucanase and protease activities that act together in yeast cell lysis. J Bacteriol. 142 (2), 414-423 (1980).
- Bano, S., Qader, S. A. U., Aman, A., et al. Purification and characterization of novel α-amylase from Bacillus subtilis KIBGE HAS. AAPS PharmSciTech. 12, 255-261 (2011).
- Kaplan, J. B., et al. Genes involved in the synthesis and degradation of matrix polysaccharide in Actinobacillus actinomycetemcomitans and Actinobacillus pleuropneumoniae biofilms. J Bacteriol. 186 (24), 8213-8220 (2004).
- Kaplan, J. B., et al. Recombinant human DNase I decreases biofilm and increases antimicrobial susceptibility in staphylococci. J Antibiot. 65 (2), 73-77 (2012).
- Schlapp, G., Scavone, P., Zunino, P., Härtel, S. Development of 3D architecture of uropathogenic Proteus mirabilis batch culture biofilms: A quantitative confocal microscopy approach. J Microbiol Methods. 87 (2), 234-240 (2011).
- Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nat Cell Biol. 21 (1), 72-84 (2019).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
