Badanie indukowanej przez nanocząstki miedzi programowanej śmierci komórek u bakterii

Podsumowanie

Nanocząsteczki miedzi działają jak środki przeciwdrobnoustrojowe, generując reaktywne formy tlenu. W tym miejscu przedstawiono procedury wykazujące, że nanocząstki miedzi są skuteczne przeciwko trzem klinicznie istotnym patogenom i że pewne zaprogramowane szlaki śmierci komórki są zaangażowane w ten proces bakteriobójczy.

Streszczenie

Ostatnio, obawy związane z wielolekoopornymi patogenami i nieuleczalnymi infekcjami wzrosły z powodu nadużywania i niewłaściwego stosowania antybiotyków. Nanomateriały, takie jak nanocząstki metali i tlenków metali, zyskały popularność w dziedzinie biomedycyny jako potencjalne nowe strategie zwalczania patogenów wielolekoopornych. W badaniu tym zbadano zastosowanie nanocząstek miedzi (CuNPs) jako środka bakteriobójczego przeciwko trzem powszechnym patogenom oportunistycznym nabytym w szpitalu - Escherichia coli (E. coli), Acinetobacter baumannii (A. baumannii) i Staphylococcus aureus (S. aureus) - które w coraz większym stopniu rozwijają oporność na leki. Przedstawiono szczegółowe protokoły syntezy CuNP o dwóch rozmiarach (20 nm i 60 nm) i oceny ich skuteczności bakteriobójczej za pomocą testów kolonii. Zbadano mechanizmy działania przeciwdrobnoustrojowego leżącego u podstaw CuNP, oceniając zmiany w produkcji reaktywnych form tlenu. Ponadto zastosowano cztery modulatory, które hamują funkcje ludzkich białek, w celu zbadania potencjalnego udziału szlaków programowanej śmierci komórki (PCD) w zabijaniu bakterii. Dzięki takiemu podejściu sugeruje się potencjalne pojawienie się szczepów opornych na miedź, opierając się na badaniach nad białkami homeostazy miedzi, w tym zależnymi od miedzi regulatorami transkrypcji. Odkrycia te zapewniają kompleksową metodologię badania bakteriobójczego działania CuNP i ich potencjalnej roli w zwalczaniu oporności na antybiotyki.

Wprowadzenie

Bakterie oporne na leki są poważnym powodem do niepokoju w medycynie. Ich szybkie pojawienie się zmniejszyło skuteczność konwencjonalnych antybiotyków, powodując więcej powikłań klinicznych. Stanowią one poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego i stwarzają pilne zapotrzebowanie na nowe środki przeciwdrobnoustrojowe. Jednym z kierunków badań są nanomateriały. Nanomateriały mają unikalne właściwości fizykochemiczne, które pozwalają im wchodzić w interakcje z drobnoustrojami w sposób zagrażający ich żywotności. Na przykład nanocząstki srebra (AgNPs) indukują stres oksydacyjny u bakterii, powodując dysfunkcję białek, rozerwanie błony, uszkodzenie DNA i ostatecznie śmierć komórki¹. Z drugiej strony nanocząstki złota (AuNPs) są znane ze swoich właściwości przeciwgrzybiczych i mogą wzmacniać bakteriobójcze działanie antybiotyków, służąc jako nośniki².

Dodatkowo, nanocząstki miedzi (CuNPs) również przyciągnęły znaczną uwagę ze względu na ich silne działanie przeciwbakteryjne i niskie koszty produkcji. Badania sugerują, że CuNP wykazują szerokie spektrum działania bakteriobójczego poprzez zakłócenie aktywności enzymatycznej i wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS)³. Dodatni ładunek CuNPs ułatwia ich przenikanie do bakterii, zwiększając ich wychwyt komórkowy⁴. Mechanizm ten sprawia, że CuNPs są obiecującą opcją do powlekania powierzchni, np. na implantach, w celu zapobiegania infekcjom³. Interesującym odkryciem jest jednak to, że bakteriobójcze działanie CuNP wydaje się być zależne od wielkości. Niektóre badania wykazały, że mniejsze CuNP wykazują wyższą aktywność przeciwbakteryjną, prawdopodobnie ze względu na lepszy stosunek powierzchni do objętości⁵.

Generacja ROS powoduje rozległe uszkodzenia komórek i bakterii, w tym peroksydację lipidów, dysfunkcję białek, fragmentację DNA i hamowanie glukoneogenezy/glikogenolizy, a także bierze udział w martwicy lub programowanej śmierci komórki (PCD)^6,7,8. Ostatnie badania wykazały, że u bakterii istnieją systemy PCD o trybach działania i efektorach podobnych do tych w systemach eukariotycznych⁹. Społeczności bakteryjne mogą indukować PCD w odpowiedzi na stres, w tym stres oksydacyjny, poprzez system toksyna-antytoksyna (TA)¹⁰. Mówiąc prościej, układ toksyna-antytoksyna składa się z toksyn, które mogą zakłócać podstawowe procesy komórkowe i antytoksyn, które mogą tworzyć stabilne kompleksy z toksynami, aby zahamować ich toksyczność w normalnych warunkach wzrostu. Większość bakterii i archeonów zawiera loci TA w swoich genomach, często obecne w wielu kopiach pozachromosomalnego i chromosomalnego DNA. Istnieje kilka rodzajów systemów TA, przy czym szczególnym zainteresowaniem cieszy się TA typu II (znany jako moduł MazE/MazF). W warunkach stresu antytoksyny ulegają degradacji, dzięki czemu toksyny mogą hamować swoje cele komórkowe. U E. coli i S. aureus toksyna MazF jest aktywowana w odpowiedzi na warunki stresowe, takie jak stres oksydacyjny, wysoka temperatura i głód aminokwasów. W konsekwencji ekspresja antytoksyny MazE ulega zmniejszeniu, uwalniając toksynę MazF¹⁰. Badania wykazały, że MazF umożliwia syntezę białek, które pozwalają małej subpopulacji przetrwać w niesprzyjających warunkach, podczas gdy większość populacji ulega śmierci komórki za pośrednictwem mazEF. Ta śmierć komórki może być albo zależna od ROS, gdzie ROS indukuje hamowanie transkrypcji lub translacji, albo niezależna od ROS, gdzie uszkodzenie DNA wyzwala szlaki śmierci¹¹.

To badanie bada mechanizmy, za pomocą których CuNP wywołują śmierć bakterii. Zamiast skupiać się wyłącznie na systemie TA, cztery modulatory PCD, wcześniej używane w naszych badaniach^7,12, zostały wykorzystane do zbadania potencjalnych szlaków PCD u bakterii.

Badając bakteriobójcze działanie CuNP o dwóch różnych rozmiarach (20 i 60 nm) przy różnych stężeniach, oraz wykorzystując metody takie jak testy kolonii, wykrywanie ROS i modulatory PCD (SBI, Z-VAD, NSA i Wortmannin), badania te podkreślają, że PCD nie występuje wyłącznie w organizmach wielokomórkowych, ale występuje również w społecznościach bakteryjnych pod wpływem stresu. Dostarczając szczegółowych protokołów, prace te mają na celu umożliwienie naukowcom oceny skuteczności CuNP i mechanizmów bakteriobójczych w ich własnych systemach. Co więcej, odkrycia te pogłębiają wiedzę na temat bakteryjnej PCD i wspierają rozwój terapii opartych na CuNP w celu zwalczania bakterii opornych na antybiotyki.

Protokół

Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie nanocząstek miedzi

1. Pozyskaj komercyjne nanoproszki miedzi (25 nm i 60-80 nm) ze źródła komercyjnego.
2. Użyj 1,0 mM dodecylosiarczanu sodu (SDS) jako dyspergatora dla dwóch wielkości nanocząstek 1 mg/ml.
3. Rozproszyć nanocząstki w kąpieli ultradźwiękowej przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. W pełni zdyspergowane nanocząstki są następnie gotowe do wykorzystania w kolejnych eksperymentach.

2. Przygotowanie bakterii

1. Pozyskać szczep E. coli (Migula) Castellani i Chalmers 25922 oraz szczep A. baumannii Bouvet i Grimont z American Type Culture Collection. Zdobądź S. aureus z Centrum Zbierania i Badań nad Zasobami Biologicznymi.
2. Wyhodować bakterie w bulionie Luria-Bertani (LB) w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C.
3. Rozcieńczyć kultury bakteryjne w pożywce LB do gęstości optycznej około 0,5 przy długości fali 600 nm (OD₆₀₀).

3. Ocena żywotności komórek

1. Test kolonii
   1. Użyj podstawowych roztworów CuNP (1 mg/ml) do przygotowania różnych stężeń dwóch rozmiarów CuNP, w tym 0 μg/ml, 1 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml i 100 μg/ml.
   2. Podzielić kultury bakterii przygotowane w kroku 2.3 na probówki do mikrowirówek i odwirować przy 3300 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Zachowaj granulki bakteryjne i dodaj różne stężenia odpowiednio dwóch rozmiarów CuNP, delikatnie pipetując.
   4. Traktuj granulki bakteryjne z PBS i 70% alkoholem jako odpowiednio kontrolę negatywną i pozytywną.
   5. Inkubować wszystkie poddane działaniu substancji bakterie, wytrząsając z prędkością 200 obr./min w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
   6. Po inkubacji umyj wszystkie leczone bakterie PBS i rozprowadź je na płytkach agarowych LB. Umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 24 godziny.
   7. Następnego dnia należy policzyć liczebność kolonii w każdej grupie poddanej działaniu substancji i przeprowadzić analizę statystyczną. Zaleca się przeprowadzenie tego w trzech egzemplarzach w celu uzyskania dokładności statystycznej.
2. Badanie mechanizmu bakteriobójczego
   1. Przygotować bakterie zgodnie z opisem w kroku 3.1.2 i potraktować je 5 μM SBI-0206965 (SBI) przez 2 godziny, 0,5 μM nekrosulfonamidu (NSA) przez 1 godzinę, 100 nM wortmanniny (Wort) przez 30 minut lub 100 nM Z-VAD-FMK (Z-VAD) przez 30 minut.
   2. Bakterie należy traktować jednocześnie różnymi stężeniami roztworów CuNP o dwóch rozmiarach, jak opisano w kroku 3.1.1, w obecności lub bez obecności 5 μM SBI, 0,5 μM NSA, 100 nM brzeczki i 100 nM Z-VAD.
   3. Odwirować bakterie po zabiegach z modulatorem (etap 3.2.1) i usunąć supernatanty.
   4. Zawiesić osady bakteryjne w roztworach przygotowanych w kroku 3.2.2 i inkubować je wytrząsając z prędkością 200 obr./min w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
   5. Potraktuj bakterie odpowiednio 70% etanolem i PBS jako kontrolą pozytywną i negatywną. Użyć roztworu bez CuNP jako ślepej próby kontrolnej CuNP (0 μg/ml; próba) w tych samych warunkach inhibitora dla każdej grupy. Inkubować wszystkie próbki przez dodatkowe 24 godziny.
   6. Po inkubacji dodać do kultur odczynnik żywotności komórek w stosunku objętościowym 1:10. Inkubować kultury przez kolejne 2 godziny, wytrząsając w temperaturze 37 °C.
   7. Odwirować kultury (etap 3.1.2) po 2 godzinach inkubacji. Przenieść fluorescencyjne supernatanty na płytki 96-dołkowe. Zmierz fluorescencję przy użyciu długości fali wzbudzenia 560 nm i długości fali emisji 590 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
   8. Rozcieńczyć pozostały supernatant do ^10-5 i ^10-4 i rozprowadzić go na płytkach agarowych LB w celu hodowli.
   9. Policz pojedyncze kolonie następnego dnia.

4. Wykrywanie reaktywnych form tlenu

1. Przygotuj kultury bakterii zgodnie z opisem w kroku 2.3 i podziel je na probówki do mikrowirówek.
2. Traktuj bakterie w różnych warunkach stresu jako dodatnie grupy kontrolne indukujące ROS (dane nie są pokazane w wynikach). Zabiegi są opisane w krokach 4.2.1-4.2.4.
   1. Wystawić bakterie na działanie światła UV o długości fali 405 nm przez 3 godziny. Inkubować bakterie w temperaturze 45 °C przez 2 godziny.
   2. Następnie inkubować bakterie w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
   3. Traktować bakterie 3%_H2O2 przez 30 min.
   4. Utrzymywać bakterie w temperaturze 37 °C w bulionie LB jako kontrolę ujemną.
3. Przygotować różne stężenia CuNP zgodnie z opisem w kroku 3.1.1 i traktować bakterie CuNP o długości fali 20 nm lub 60 nm w stężeniach 1 μg/ml, 5 μg/mL, 10 μg/ml i 100 μg/ml przez 24 godziny.
4. Umyj inkubowane bakterie dwukrotnie PBS, aby usunąć wszelkie pozostałe nanocząsteczki.
5. Przygotować barwnik dioctanu 2′,7′-dichlorodihydrofluoresceiny (_H2DCFDA) w PBS o końcowym stężeniu 5 μM.
6. Zawiesić osady bakteryjne w 5 μM_H2DCFDA i zmierzyć intensywność fluorescencji przy emisji 520/30 nm za pomocą cytometru przepływowego.
   UWAGA: Intensywność zielonej fluorescencji FL1 koreluje z poziomem ROS w kulturze poddanej działaniu substancji. Zaleca się wykonanie tego w trzech egzemplarzach w celu uzyskania dokładności statystycznej.

Wyniki

Przeciwbakteryjne działania CuNP o dwóch rozmiarach w trzech patogenach
Trzy oportunistyczne patogeny (E. coli, S. aureus i A. baumannii) wykorzystano do zbadania działania bakteriobójczego CuNPs. Bakterie traktowano 0 μg/ml, 1 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml i 100 μg/ml 20 nm lub 60 nm CuNPs, a aktywność bakteriobójczą określono przy użyciu minimalnego stężenia bakteriobójczego (MBC) pochodzącego z liczby kolonii. Nasze wyniki wykazały pozytywne działanie bakteriobójcze...

Dyskusja

W badaniu tym zbadano działanie przeciwdrobnoustrojowe i mechanizmy CuNP w dwóch rozmiarach i różnych stężeniach przeciwko E. coli, S. aureus i A. baumannii. Korzystając z ustalonych protokołów, zaobserwowano, że działanie bakteriobójcze wywołane przez CuNP obejmuje stres oksydacyjny i potencjalną aktywację PCD. Jednak wzajemne oddziaływanie między homeostazą metali a reakcjami bakterii na stres pozostaje w dużej mierze niezbadane. Wcześniejsze badania zidentyfikowały strategie oporności bakter...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Acinetobacter baumannii Szczep Bouvet i Grimont	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA	17978	Bakterie do eksperymentu z toksojnością CuNP
Bio-Rad iMark Microplate Reader	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA	168-1130	Służy do pomiaru absorbancji w testach żywotności bakterii.
Przepuszczalny komórkowo dioctan 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny  (H2DCFDA)	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA	D6883	Służy do wykrywania reaktywnych form tlenu (ROS) w leczonych komórkach bakteryjnych.
Nanocząstki miedzi (CuNPs) 25 nm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	774081	Służy do przygotowania roztworu podstawowego CuNP
Nanocząstki miedzi (CuNPs) 60-80 nm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	774103	Służy do przygotowania roztworu podstawowego CuNP
Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA	25922	Bakterie do eksperymentu z toksowalnością CuNP
Cytometr przepływowy Gallios	Beckman Coulter, Brea, CA, USA		Używany do analizy cytometrii przepływowej w wielu eksperymentach, w tym wykrywania reaktywnych form tlenu.
Agar LB	FocusBio, Miaoli, Tajwan	LBA500	Używany do hodowli bakterii
Bulion Luria-Bertani (LB)	Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA	244620	Używany do hodowli bakterii
Necrosulfonamid (NSA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	480073	Stosowany jako modulator do wstępnego leczenia w badaniach szlaku śmierci bakteryjnej.
Odczynnik do żywotności komórek PrestoBlue	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	P50200	Służy do oceny żywotności komórek za pomocą fluorescencji.
SBI-0206965 (SBI)	BioVision, Milpitas, CA, USA	9580	Stosowany jako modulator do leczenia wstępnego w badaniach szlaku śmierci bakteryjnej.
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	L4509	Stosowany jako dyspergator nanocząstek miedzi w celu zmniejszenia agregacji.
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA Centrum Zbierania i Badań nad Zasobami Biologicznymi (BCRC), Hsinchu, Tajwan	13567	Bakterie do eksperymentu toksowalności CuNP
Wielomodowy czytnik mikropłytek Varioskan LUX	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	VLBLATGD2	Służy do pomiaru fluorescencji w testach żywotności komórek
Wortmannin (Wort)	Abcam, MA, USA	ab120148	Stosowany jako modulator do wstępnego leczenia w badaniach szlaku śmierci bakteryjnej.
Z-VAD-FMK (Z-VAD)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	V116	Stosowany jako modulator do leczenia wstępnego w badaniach szlaku śmierci bakteryjnej.