Artykuł metodologiczny

Szybka izolacja pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z ludzkiego mleka matki

805 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67954

⸱

14 listopada 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics/Division of Neonatology and Center of Glial Biology in Medicine, University of Alabama at Birmingham School of Medicine, 2School of Health Professions/Department of Clinical and Diagnostic Sciences, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Biological Sciences, Alabama State University, 4Department of Pediatric Surgery, Washington University-St. Louis

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten został zaprojektowany tak, aby przyspieszyć i umożliwić skuteczną izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od mleka matki o wysokiej czystości.

Streszczenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV), nanocząstki wielkości około 20-1000 nm średnicy, szybko zyskują uwagę ze względu na swój potencjał terapeutyczny. Konkretnie, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z mleka matki (HBMDEV) wykazano, że w eksperymentalnych modelach martwiczego zapalenia jelit, choroby jelit, która dotyka głównie wcześniaki, powodując śmiertelność sięgającą nawet 50%. Jednak tradycyjne techniki izolacji pęcherzyków zewnętrznych, takie jak ultrawirowanie różnicowe, chromatografia wykluczająca rozmiar itp., są albo czasochłonne, albo wymagają specjalistycznego aparaturowania, z czego żadna z tych metod nie jest praktyczna w warunkach klinicznych. Dlatego potrzebna jest prosta metoda izolacji, która umożliwi szybkie reaktywne podanie HBMDEVs pacjentom. Proponowana jest tutaj kombinacja wirowania mleka matki w celu usunięcia tłuszczu i zanieczyszczeń komórkowych, połączona z szybką ultrafiltracją pozostałego mleka odtłuszczonego, co daje wysoką wydajność i funkcjonalne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe. Zastosowanie tej techniki może umożliwić wykorzystanie HBMDEV-ów jako praktycznej opcji terapeutycznej w środowisku klinicznym.

Wprowadzenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to wszechobecne nanocząstki o wielkości około 20-1000 nm, albo przez szlaki endosomalne (gdy ciała mikropęcherzykowe łączą się z błoną plazmatyczną, co ułatwia uwalnianie ładunku komórkowego do przestrzeni zewnątrzkomórkowej), albo przez szlaki błony plazmatycznej (czyli pączkujące). EV zawierają ładunek komórkowy gospodarza, taki jak lipidy, białka, kwasy nukleinowe, różne metabolity i inne składniki w zależności od ich źródła. Ponadto EV odgrywają ważną rolę w komunikacji międzykomórkowej, angiogenezie, immunosupresji, przebudowie mikrośrodowiska guza, progresji nowotworów itd.1,2,3,4. Warto zauważyć, że ludzkie mleko matki (HBM) jest bogate w EV i łatwo dostępne dlakarmiących matek. Ostatnio EV pochodzące z ludzkiego mleka matki (HBMDEV) zyskują na znaczeniu jako terapeutyczne wektory leczenia chorób 1,2. Noworodki z przedwczesną lub niską masą urodzeniową są podatne na kilka infekcji, w tym martwicze zapalenie jelit. Martwicze zapalenie jelit, charakteryzujące się martwicą jelita lub jelita grubego, może występować od łagodnego zapalenia jelit po niewydolność narządów wieloukładowych, z śmiertelnością niemowląt sięgającą nawet 50%6. Wstępne leczenie EV pochodzącymi z mleka matki wystarcza, aby chronić przed zapaleniem jelit w eksperymentalnych modelach NEC in vitro oraz in vivo 2,7. Dlatego wykorzystanie HBMDEV-ów może być realną opcją leczenia NEC w warunkach klinicznych.

Pomimo terapeutycznych obietnic HBMDEV, istnieją znane ograniczenia stosowane przy obecnych technikach izolacji, ponieważ są one czasochłonne lub wymagają specjalistycznego sprzętu, co nie jest powszechnie praktyczne w środowisku klinicznym. "Złoty standard" izolacji EV obejmuje kilka cykli różnicowej ultrawirowania, która choć daje satysfakcjonującą wydajność EV, może wpłynąć na ich integralność i funkcjonalność 8,9. Dodatkowo, czas ultrawirowania może wynosić co najmniej 2 godziny, co jest kosztownym zasobem w warunkach klinicznych9. Zestawy izolacyjne okazały się zarówno oszczędzać czas, jak i być w pewnym stopniu opłacalne. Jednak izolacja przy użyciu takich metod skutkuje również niskimi wydajnościami, a co za tym idzie niską skalowalnością. Dlatego potrzebne są techniki izolacji HBMDEV, które są zarówno oszczędzające czas, jak i opłacalne, nie tracąc przy tym wydajności EV.

Protokół ten ma na celu opracowanie krok po kroku metody szybkiego izolowania pojazdów elektrycznych od HBM przy użyciu istniejących klinicznie dostępnych narzędzi zatwierdzonych przez FDA. Aby to osiągnąć, zastosowano standardową wirówkę oraz kliniczny system przedłużania filtrów do izolacji EV od HBM. Te pęcherzyki mieszczą się w oczekiwanym zakresie rozmiarów, mają morfologię zgodną ze znanymi EV, są wzbogacone o markery EV i funkcjonalnie podobne do EV izolowanych tradycyjnymi technikami izolacji ultrawirówki. W związku z tym protokół izolacji EV HBM może umożliwić praktyczną, szybką izolację i zastosowanie EV odizolowanych od HBM w warunkach klinicznych.

Protokół

Mleko matki zostało pobrane w Regionalnej Jednostce Intensywnej Terapii Uniwersytetu Alabamy w Birmingham (UAB). Pobrane próbki pobierano po rozmrożeniu mleka matki dla pacjentki, a pacjentka nie była w stanie przyjąć całego karmienia. Te karmienia są zazwyczaj wyrzucane, ale zostały zebrane w celach badawczych. Próbki pobrano od osób zdezidentyfikowanych i przechowywano w temperaturze −80 °C aż do czasu przeprowadzenia eksperymentów. Kolekcja została zatwierdzona przez Protokół Rady Przeglądu Wewnętrznego UAB N160203002. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Izolacja pęcherzyków zewnętrznych (różnicowa ultrawiringa)

  1. W szafce do biobezpieczeństwa rozcieńczaj mleko matki w stosunku 1:10 w sterylnym PBS w stożkowej probówce o pojemności 15 mL.
  2. Wiruj mleko matki w dawce 300 x g przez 10 minut w 4 °C. Po wirowaniu powinny powstać 3 wyraźne warstwy: tłuszcz mleczny (warstwa górna), mleko serwatkowe lub odtłuszczone (warstwa wodna środkowa) oraz komórki i inne zanieczyszczenia (granulowane na dole). W szafce biobezpieczeństwa filtruj warstwy tłuszczu mlecznego i serwatki przez filtr o pojemności 70 μm (co ułatwia usuwanie tłuszczu), pozostawiając granulat niezakłócony. Przenieś przepływ do nowej rurki.
  3. Wiruj próbkę w 2600 x g przez 10 minut w 4 °C. W tym etapie usuwane są pozostałości tłuszczu mlecznego, komórek i zanieczyszczeń. W szafie bezpieczeństwa biologicznego przefiltruj supernatant przez filtr o średnicy 70 μm. Przelej supernatant do rurki ultrawirówki. Przed ultrawirowaniem należy potwierdzić, że w probówce znajduje się co najmniej 10 ml płynu.
  4. Ultrawirówka próbki w dawce 20 000 x g przez 45 minut w 4 °C. Po ultrawirowaniu mogą powstać trzy warstwy podobne do kroku 1.2: tłuszcz mleczny, mleko serwatkowe lub odtłuszczone oraz komórki i inne zanieczyszczenia. W szafce biobezpieczeństwa filtruj warstwy tłuszczu mlecznego i serwatki przez filtr o pojemności 70 μm, nie naruszając granulacji. Przelej supernatant do stożkowej rurki o pojemności 15 mL.
  5. W szafce do zabezpieczeń biologicznych mleko strzykawkowe filtruje się filtrem 0,22 μm. Przelej supernatant do nowej rurki ultrawirówki. Przed ultrawirowaniem należy potwierdzić, że w probówce znajduje się co najmniej 10 ml płynu.
  6. Ultrawirówka próbki w 110 000 x g przez 70 minut w 4 °C. Aspiracja supernatantu i ponowna zawiesina pelletu w 10 mL sterylnego PBS.
  7. Ponownie ultrawirówkę próbki w 110,00 x g przez 70 minut w 4 °C.
  8. W szafce biobezpieczeństwa ponownie zawiesi pellet w 150-200 μL sterylnego PBS.

2. Izolacja pęcherzyków zewnętrznych (metoda szybkiej filtracji)

  1. W szafce do biobezpieczeństwa rozcieńcz mleko matki (1:10) w sterylnym PBS.
  2. Wiruj mleko matki w dawce 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Po wirowaniu powinny powstać trzy wyraźne warstwy: tłuszcz mleczny (warstwa górna), mleko serwatkowe lub odtłuszczone (warstwa wodna środkowa) oraz komórki i inne zanieczyszczenia (granulowane na dole). W szafce biobezpieczeństwa filtruj warstwy tłuszczu mlecznego i serwatki przez filtr o pojemności 70 μm (co ułatwia usuwanie tłuszczu), pozostawiając granulat niezakłócony. Przenieś przepływ do nowej rurki.
  3. Wiruj próbkę w 2600 x g przez 10 minut w 4°C. W tym etapie usuwane są pozostałości tłuszczu mlecznego, komórek i zanieczyszczeń. W szafie do zabezpieczeń biologicznych filtruj supernatant przez filtr 70 μm. Przelej supernatant do probówki 15 mL.
  4. W szafie do zabezpieczeń biologicznych zapełnij zestaw przedłużki filtra o średnicy 16 cali o pojemności 0,22 μm PBS o pojemności 5,4 mL.
    1. Do układu podstawowego należy wziąć 5,4 mL sterylnego PBS w strzykawce i przepłukać system, aż PBS wyczerpie się z drugiego końca rurki.
  5. Strzykawka filtruje mleko matki przez zestaw przedłużaczy o średnicy 0,22 μm, 16 cali. W tym etapie usuwane są pozostałości tłuszczu mlecznego, komórek i zanieczyszczeń.
    UWAGA: W zależności od ilości zanieczyszczeń w próbce może być potrzebnych więcej niż jeden zestaw przedłużający filtr.
  6. Zbieraj przepływ w stożkowej rurce o pojemności 15 mL.

3. Analiza śledzenia nanosight

  1. Rozcieńcz próbkę (1:1000) w sterylnym PBS. Próbki z szybkim filtrem można stosować nierozcieńczone.
  2. Krótko przeszukaj próbkę. Załaduj 1 ml próbki do strzykawki tuberkulinowej.
  3. Podłącz strzykawkę do aparatu do wstrzykiwania i zabezpiecz ją.
  4. Ustaw pompę wtryskową na 50. Włącz kamerę, aby upewnić się, że widzianych cząstek nie jest ani za dużo, ani za mało. Upewnij się, że przepływ cząstek jest stały, bez przeskoków lub nagłych skoków przepływu próbki.
  5. Ustaw pompę wtryskową na 100. Uruchom protokół.
    UWAGA: Oprogramowanie miało być czytane raz na minutę, co daje łącznie 5 odczytów.
  6. Przeczytaj próbkę.
  7. Przepłukaj nanosight między próbkami za pomocą PBS.
    UWAGA: Do określenia rozmiaru cząstek i stężenia cząstek na mililitr użyto systemu analizy śledzenia nanocząstek. Średnie stężenie próbki ultraodśrodkowanej wynosiło 3,30 e+08 +/- 4,08 e+06 cząstek/mL, podczas gdy metoda szybkiej filtracji wynosiła 5,50e+08 +/- 1,16e+08 cząstek/mL.

4. Ujemne barwienie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych i transmisyjna mikroskopia elektronowa

UWAGA: Próbki o stężeniu egzosomów w zakresie 10–8 były wykorzystywane do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).

  1. Formwar/siatka EM pokryta warstwą węgla i wyładowaniem węgla przez 25 sekund przy 20 mA używa aparatu wyładowania.
  2. Załaduj 7 μL rozwiązania zawieszenia elektrycznego na siatkę i inkubuj przez 1 minutę.
  3. Nadmiar używaj papieru filtrującego Whatman, wciągając od spodu siatki, aby "pociągnąć" próbkę w stronę siatki, a nie od niej.
  4. Natychmiast pokoloruj próbkę 7 μL filtrowanego 1% roztworu octana uranilu (UA) na powierzchni siatki EM za pomocą pipety.
  5. Po 15 sekundach nadmiar roztworu UA był usuwany z siatki poprzez stykanie krawędzi siatki papierem filtracyjnym. Natychmiast (w ciągu 24 godzin) obejrzyj próbkę na TEM przy 80 kv.

5. Stężenie białka

  1. Aceton wytrąca 250 μL oczyszczonych EV (1:4) przez 1 godzinę w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Do metody ultrawirowania używaj 100 μL oczyszczonych egzosomów.
  2. Wiruj próbkę w 16 000 x g przez 30 minut.
  3. Suszenie pelletu na powietrzu, a następnie ponowne zawieszenie w 100 μL bufora RIVA.
  4. Stosuj się do protokołu BCA do testów białkowych, aby określić stężenia białek. Absorpcję zmierzono na poziomie 562 nm za pomocą czytnika mikropłyt.
    UWAGA: 1 mL mleka matki zwykle daje około 1,3 μg/mL białka przy ultrawirowaniu oraz około 0,2-1 μg/mL białka przy szybkiej filtracji.

6. Western blot

  1. Inkubuj 1-objętową próbkę białka z 4-objętowym markerem ścieżki, zmniejsz ilość buforu próbki i gotuj ją przez 7 minut w temperaturze 90°C.
  2. Załaduj i uruchom 10 μg białka na żelu SDS 10% przy napięciu 70 V przez 15 minut. Następnie zwiększ napięcie do 100 V i pracuj przez dodatkowe 90 minut.
  3. Przełóż żel na membranę nitrocelulozową za pomocą aparatu półsuchego przez 30 minut przy napięciu 15 V.
  4. Płucz błonę 3 razy z TBS-0,1% Tween (TBS-T) przez 10 minut każdy.
  5. Blokuj membranę na 30 minut za pomocą roztworu buforu szybkiego blokującego (rozcieńczonego do 1x).
  6. Inkubuj przeciwciała pierwotne (Hsp70-1:1000; CD63-1:1000 i CD9-1:1000) w 1x roztworze buforowym, przez noc w temperaturze 4°C na kołyskach10, 11, 12.
  7. Płucz błonę trzy razy przez 10 minut za każdym razem TBS-T.
  8. Dodaj (H+L) HRP-sprzężone przeciwciało przeciwmysie wtórne, w rozcieńczeniu 1:1000 dla wszystkich badanych białek (Hsp70, CD9 i CD63) w 2% mleka w TBS-T i inkubuj przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na bujace.
  9. Płucz błonę trzy razy przez 10 minut za każdym razem TBS-T.
  10. Wywołuj za pomocą ECL (1:1) i filmuj z wywoływaniem.

7. Hodowla in vitro komórek IEC-6

  1. Zasiewaj 1,0 x 106 komórek w kolbie T-25 w 5 mL kompletnego nośnika RPMI. Pozwól komórkom przykleić się przez noc.
  2. Usuń całe medium i przemyj 1-2 mL PBS.
  3. Wdech PBS i dodaj 5 ml całkowitych obrotów wolnych od EV.
  4. Dodaj końcowe stężenie 400 μM H2O2 na dołek oraz 10 μg/mL EV jednocześnie do komórek przez noc.
  5. Usuń medium i płucz komórki 1-2 mL PBS.
  6. Aspiruj PBS i dodaj 1 ml trypsyny.
    1. Umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37°C na 5 minut.
  7. Dezaktywuj trypsinę, dodając dwukrotnie większą objętość niż pełny RPMI. Przełóż ogniwa do probówki 15 mL i wiruj w 125 x g przez 5 minut.
  8. Aspiruj supernatant i ponownie zawiesij granulek w 1 mL PBS.
  9. Licz komórki za pomocą licznika komórek.

Wyniki

Izolacja pojazdów elektrycznych za pomocą ultrawirowania i szybkiej izolacji
Dogmatycznie, izolacja EV od HBM polega na wirowaniu w celu usunięcia tłuszczu mlecznego i innych dużych cząstek, następnie filtracji, kilku cyklach ultrawirowania oraz ponownym zawieszeniu próbki wzbogaconej EV w PBS. Metoda szybkiej filtracji wykorzystuje wirowanie do usuwania tłuszczu mlecznego i zanieczyszczeń komórkowych, a następnie filtrację przez filtr przedłużający 0,22 μm, co dodatkowo usuwa resztki zanieczyszczenia, co daje próbkę wzbogaconą EV porównywalną z tradycyjną ultrawirowaniem (Rysunek 1).

Charakterystyka HBMDEV-ów z systemu szybkiej filtracji rozszerzającej filtr
Analiza śledzenia nanosight wykazała porównywalny rozmiar cząstek pomiędzy ultrawirowanymi (Rysunek 2A) a szybkim filtrem izolowanymi HBMDEV-ami (Rysunek 2B). Obie metody wskazują, że izolowane pojazdy elektryczne mają średni rozmiar około 100 nm. EV przenoszą różne ładunki (np. białka, lipidy, miRNA itp.) do wydzielania z komórek gospodarza do ich różnych celów. Dlatego pierwszym badanym białkiem docelowym było białko szoku cieplnego 70 (Hsp70), białko znane z transportu za pomocą EV13. Analiza Western blot pokazuje, że EV izolowane przy użyciu szybkiej filtracji wykazywały podobną ekspresję Hsp70 jak te izolowane ultrawirowaniem (Rysunek 3A i Dodatkowy Rysunek 1A). Dodatkowo, EV można zidentyfikować poprzez powierzchniową ekspresję tetraspanin, takich jak CD9 i CD6314. Analiza Western blot wykazała, że EV izolowane przez szybką filtrację rzeczywiście wyrażają CD9 (Rysunek 3B i Ilustracja Uzupełniająca 2B) oraz CD63 (Rysunek 3C i Ilustracja Uzupełniająca 3C). Na koniec, analiza morfologiczna HBMDEVs za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej wykazała podobną morfologię pęcherzyków między obiema technikami izolacji (Rysunek 4A-D).

Kilka laboratoriów wykazało, że EV mają właściwości ochronne, które wspierają przeżywalność komórek podczas stresu komórkowego 2,3,7. Podobnie jak wcześniej opublikowane raporty, EV izolowane metodą szybkiej filtracji są w stanie chronić komórki nabłonkowe jelit (IEC-6) przed śmiercią komórki indukowaną nadtlenkiem wodoru2 (Rysunek 5A,B). Dane te sugerują, że HBMDEV-y izolowane metodą szybkiej filtracji nie tylko posiadają cechy porównywalne do tych izolowanych za pomocą różnicowej ultrawirówki, ale także funkcjonalnie podobne.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat przedstawiający różnice między ultrawirowaniem a metodami szybkiej filtracji izolowanych EV od ludzkiego mleka matki. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Analiza śledzenia nanosight EV izolowanych z ludzkiego mleka matki przy użyciu ultrawirowania i metody szybkiej filtracji. (A) NTA EV z ludzkiego mleka matki (rozcieńczone 1:1000 w 1x PBS) wyizolowanych za pomocą ultrawirowania. Przedstawione dane to pojedyncza reprezentacja 3-4 niezależnych badań. (B) NTA dotyczących ludzkich EV z mlekiem matki izolowanych za pomocą szybkiej filtracji. Przedstawione dane to pojedyncza reprezentacja 3-4 niezależnych badań. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Analiza Western blot EV izolowanych za pomocą ultrawirowania i szybkiej filtracji. (A) Jednosekundowa ekspozycja 10 μg białka szoku cieplnego 70 (Hsp70). "L" oznacza drabinę, "U" oznacza ultrawirowanie, a "R" oznacza szybką filtrację. Próbki pobrane przez szybką filtrację były dodatkowo koncentrowane przez wirowanie w 110 000 × g przez 70 minut, wykonywane dwukrotnie. Pokazane zdjęcie przedstawia jedno z czterech niezależnych badań. (B) Dwudziestosekundowa ekspozycja 10 μg CD9. "L" oznacza drabinę, "U" oznacza ultrawirowanie, a "R" oznacza szybką filtrację. Próbki szybkiej filtracji koncentrowano przez wirowanie w napięciu 110 000 × g przez 70 minut, wykonywano dwukrotnie. Pokazane zdjęcie przedstawia jedno z czterech niezależnych badań. (C) Dwudziestosekundowa ekspozycja 10 μg CD63. "L" oznacza drabinę, "U" oznacza ultrawirowanie, a "R" oznacza szybką filtrację. Próbki szybkiej filtracji koncentrowano przez wirowanie w napięciu 110 000 × g przez 70 minut, wykonywano dwukrotnie. Pokazane zdjęcie przedstawia jedno z czterech niezależnych badań. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4: Analiza EV mikroskopią transmisyjną izolowanych za pomocą ultrawirówki i szybkiej filtracji. (A) Mikrografia elektronowa EV izolowanych przy ultrawirowaniu przy powiększeniu 8 000×. Skala = 800 nm. Pokazane zdjęcie przedstawia jedno z trzech niezależnych badań. (B) Mikrogram elektronowy EV izolowany za pomocą ultrawirowania przy powiększeniu 20 000×. Skala = 200 nm. Pokazane zdjęcie przedstawia jedno z trzech niezależnych badań. (C) Mikrografia elektronowa EV izolowanych przy użyciu szybkiej filtracji przy powiększeniu 8 000×. Skala = 800 nm. EV koncentrowano przez wirowanie przy 110 000 × g przez 70 minut, wykonywano dwukrotnie. Pokazane zdjęcie przedstawia jedno z trzech niezależnych badań. (D) Mikrografia elektronowa EV izolowanych przy użyciu szybkiej filtracji przy powiększeniu 20 000×. Skala = 200 nm. EV koncentrowano przez wirowanie przy 110 000 × g przez 70 minut, wykonywano dwukrotnie. Pokazane zdjęcie przedstawia jedno z trzech niezależnych badań. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-5
Rysunek 5: Analiza funkcjonalna EV izolowanych za pomocą ultrawirowania i szybkiej filtracji. (A) Żywotność komórek IEC-6 hodowanych w wolnym od EV pełnym nośniku RPMI-1640. Komórki były leczone przez noc jednocześnie 400 μM H2O2 oraz 10 μg/mL EV. Pokazane dane reprezentują jedno z dwóch niezależnych badań. (B) Liczba komórek IEC-6 hodowanych w bezpłodnym medium RPMI-1640 wolnym od EV. Komórki były leczone przez noc jednocześnie 400 μM H2O2 oraz 10 μg/mL EV. Pokazane dane reprezentują jedno z dwóch niezależnych badań. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Ilustracja uzupełniająca 1: Charakterystyka Hsp70 w elektrowniach typu Western blot izolowana za pomocą ultrawirowania i szybkiej filtracji. Jednosekundowa ekspozycja na 10 μg białka szoku cieplnego 70 (Hsp70). "L" oznacza drabinę, "U" oznacza ultrawirowanie, a "R" oznacza szybką filtrację. Próbki szybkiej filtracji koncentrowano przez wirowanie w napięciu 110 000 × g przez 70 minut, wykonywano dwukrotnie. Każda próbka reprezentuje pojedynczy replikat biologiczny. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Ilustracja uzupełniająca 2: Charakterystyka CD9 w elektrowniach izolowanych za pomocą ultrawirowania i szybkiej filtracji zachodniej (Western blot ).Pięciominutowa ekspozycja 10 μg CD9. "L" oznacza drabinę, "U" oznacza ultrawirowanie, a "R" oznacza szybką filtrację. Próbki szybkiej filtracji koncentrowano przez wirowanie w 110 000 × g przez 70 minut, wykonywano dwukrotnie. Każda próbka reprezentuje pojedynczy replikat biologiczny. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Ilustracja uzupełniająca 3: Charakterystyka CD63 w elektrowniach izolowanych za pomocą ultrawirowania i szybkiej filtracji zachodniej (Western blot). Dziesięciominutowa ekspozycja 10 μg CD63. "L" oznacza drabinę, "U" oznacza ultrawirowanie, a "R" oznacza szybką filtrację. Próbki szybkiej filtracji koncentrowano przez wirowanie w 110 000 × g przez 70 minut, wykonywano dwukrotnie. Każda próbka reprezentuje pojedynczy replikat biologiczny. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

EV zyskują na sobie uwagę, ponieważ literatura sugeruje, że mogą regulować różne mechanizmy zapalne i oferować korzyści ochronne 2,7. Jednak ograniczeniem praktycznego zastosowania EV w warunkach klinicznych jest czas potrzebny na izolację EV i uzyskanie wystarczającej wydajności 8,15. Tutaj przedstawiono krok po kroku protokół szybkiej i efektywnej izolacji pojazdów elektrycznych od HBM za pomocą zatwierdzonego przez FDA systemu filtracji. Użyteczność tej metody zmniejsza tradycyjne metody izolacji EV o połowę, nie tracąc przy tym wydajności. Dlatego protokół ten może umożliwić praktyczne terapeutyczne zastosowanie EV pochodzących z mleka matki w warunkach klinicznych, jeśli terapia EV zostanie zatwierdzona w dającej się przewidzieć przyszłości.

Istniejące protokoły izolacji EV wykazały stałą i skuteczną wydajność EV z ich źródła płynu. Jednak tradycyjne metody izolacji, czy to złoty standard, różnicowa ultrawirówka, czy zastosowanie komercyjnych zestawów, nie są pozbawione ograniczeń. Izolacja EV za pomocą różnicowej ultrawirówki, choć skuteczna, jest czasochłonna przy protokołach obejmujących łączne czasy obrotu minimalnie ~3 h 2,8,15. Czas izolacji połączony z protokołami umożliwiającymi właściwe ilościowe określenie liczby EV uczyniłby ich wykorzystanie w warunkach czasowych w warunkach klinicznych wyzwaniem. Co więcej, zestawy komercyjne, choć skuteczne, są kosztowne. Ponadto liczba próbek do przetworzenia w zestawie jest niska, biorąc pod uwagę wysokie koszty tych zestawów – 8,15.

Ten protokół oferuje rozwiązanie tych ograniczeń, które oszczędza czas i pieniądze bez rezygnacji z wydajności czy czystości EV. Aby protokół był skuteczny, należy podjąć kluczowe kroki podczas jego realizacji. Rozcieńczenie i początkowa wiracja mleka matki są niezbędne do usunięcia zanieczyszczeń i tłuszczu z mleka z próbki mleka. Usunięcie tych zanieczyszczeń jest kluczowe dla zapobiegania zatkaniu systemu przedłużającego filtra, a tym samym eliminuje konieczność użycia wielu filtrów dla jednej próbki. Dodatkowo, przepłukanie systemu przedłużania filtra PBS jest kluczowe, ponieważ przygotowuje się do próbki. Gruntowanie pomaga zapewnić, że próbka nie zostanie utracona podczas procesu gruntowania. Należy zauważyć, że w zależności od zawartości próbki mleka matki, może być potrzebnych więcej niż jeden zestaw przedłużający filtr, niezależnie od rozcieńczenia i wirowania próbki przed filtracją. W przypadku takiego zdarzenia można użyć więcej niż jednego filtra; jednak nowy zestaw przedłużający filtr musi zostać zagruntowany przed filtracją próbki.

Ten protokół jest skuteczny i spójny w izolowaniu EV od ludzkiego mleka matki, jednak istnieje kilka ograniczeń, które należy uwzględnić. Konieczne są kroki wirówki (~20 minut łącznie między obiema spinami) przed filtracją próbki. Próby filtrowania rozcieńczonej próbki bez wirowania prowadzą do powtarzających się zatorów systemu przedłużającego filtra, utraty próbki oraz wydłużenia czasu do protokołu izolacji EV. Co więcej, próba nie była czysta, co potwierdzają analizy NTA i TEM. Próby wykorzystania próbek, które nie były wirowane przed filtracją, mogą wprowadzać niepożądane zanieczyszczenia do próbki, co może powodować efekty poza celem, w zależności od przyszłego zastosowania izolowanych EV w dalszej fazie. Dodatkowo, protokół ten został wdrożony wyłącznie w odniesieniu do izolacji EV od ludzkiego mleka matki. Dlatego skuteczność tego protokołu w izolacji EV od innych płynów nie została zbadana. Biorąc pod uwagę wodny charakter wszystkich płynów ustrojowych, nie przewiduje się, że wystąpią jakiekolwiek różnice w czystości i wydajności EV, jeśli ten protokół zostanie użyty do izolacji EV od innych źródeł.

Należy również zauważyć, że protokół ten jest skuteczny w izolowaniu małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEV). Według NTA, pojazdy elektryczne pochodzące z HBM miały rozmiar ~100 nm, co sugeruje, że w próbie nie było większych EV. Powodem jest to, że próbki zostały przefiltrowane za pomocą filtra 0,22 μm, który jest głównie używany do izolacji egzosomów i innych mniejszych EV, będących głównym celem laboratorium w czasie prowadzenia tego badania. Teoretycznie wykorzystanie filtra o większych porach może umożliwić izolację większych EV. Jednak te pytania wykraczają poza zakres niniejszego badania.

EV pochodzące z ludzkiego mleka matki stanowią naturalne źródło terapeutyczne, które jest łatwo dostępne do zastosowań klinicznych. Jednym z ograniczeń w przenoszeniu pracy z EV do środowiska klinicznego jest praktyczna izolacja EV, którą mogłaby wykorzystać każda placówka. Protokół ten został zaprojektowany, aby przezwyciężyć to ograniczenie i można go łatwo stosować w warunkach szpitalnych oraz wdrażać przy użyciu istniejącego, zatwierdzonego przez FDA systemu filtracyjnego, dostępnego komercyjnie lub zakupionego za znacznie niższą cenę niż standardowa ultrawirówka. Ta metoda jest opłacalna i daje bogatą w EV i czystą próbkę z systemu filtracyjnego już stosowanego w warunkach klinicznych.

Oświadczenia

Autor(i) zadeklarowali brak potencjalnych konfliktów interesów dotyczących badań, autorstwa i/lub publikacji tego artykułu.

Podziękowania

Obrazy i liczby zostały wygenerowane przy użyciu biorender.com. Badania opisane w tej publikacji zostały poparte przez UAB High Resolution Imaging Facility. Prace te były wspierane przez NIH/NICHD 5R21HD104481.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(H+L) HRP-sprzężony anty-myszBio-Rad1721011
(H+L) HRP-sprzężony antykrólikBio-Rad1706515
Filtr strzykawkowy 0,20Fisherbrand09-719C
Sitnik komórek 0,70 umCorning431751
1,5 mln Tris HCLWykonane we własności
Probówki 15 mLFalcon352096
Zestaw przedłużaczy filtrów 16 caliB-BRAUNFE2012F
1M Tris HCLTeknovaT1068
1x PBSGibco10010-031
Probówki 50 mLFalcon353070
5x redukująca bufor próbekThermo Scientific39000
AcylamideFisher Science  BP1410-1
Amfocerycyna BGibco15290-018
Aparat AMT NanoSprint43 Mark-IIAMT
AntyantyGibco15240-062
Anty-CD63NovusbioNBP2-32830
Anti-CD9Invitrogen10626D
APSThermo Scientific17874
Zestaw do testowania białek BCAPierce23227
Lampy BeckmanaBeckman coulter  344059
BrightStar ECL ChemiluminescencyjnyAlkali ScientificXR92
Egzosomowy wyczerpany FBSFisher ScientificNC0464480
Bufor Szybkiego BlokowaniaPierce37575
Serum bydlęce płodoweTechnologie życia10082147
HSP70InvitrogenMA3-006
Insulina ludzkaSigma-AldrichI9278-5ML
Nadtlenek wodoruFisher ScientificH325-500
IEC-6 ATCCCRL-1592
JEOL 1400 FLASH TEMJEOL USA Inc
Bufor próbki zmniejszający znacznik torowyThermo Scientific39000
Mleko w proszkuBioworld30620074-1
Nanosight NS 300Malvern Instruments Ltd.
Błona nitrocelulozowaTechnologie życia88018
Aparat wyładowania PELCO easiGlowTed Pella
Mini tabletki inhibitora proteazyPierceA32955
Bufor RIPAPierce89901
RPMI 1640Fisher Science  11875119
SDSFisher Science  BP2436-200
Kolba T-25Thermo Scientific156367
TBSWykonane we własności
TEMEDBio-Rad161-0801
Trypsyna EDTAGibso25200-056
Tween 20Thermo ScientificJ20605-AP

Bibliografia

  1. Galley, J. D., Besner, G. E. The therapeutic potential of breast milk-derived extracellular vesicles. Nutrients. 12 (3), 745(2020).
  2. Martin, C., et al. Human breast milk-derived exosomes attenuate cell death in intestinal epithelial cells. Innate Immun. 24 (5), 278-284 (2018).
  3. Hock, A., et al. Breast milk-derived exosomes promote intestinal epithelial cell growth. J Pediatr Surg. 52 (5), 755-759 (2017).
  4. Alexander, M., et al. Exosome-delivered microRNAs modulate the inflammatory response to endotoxin. Nat Commun. 6, 7321(2015).
  5. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma, and breast milk exosomes contain RNA: Uptake by macrophages. J Transl Med. 9, 9(2011).
  6. Chan, C. C., et al. Type I interferon sensing unlocks dormant adipocyte inflammatory potential. Nat Commun. 11 (1), 2745(2020).
  7. Miyake, H., et al. Human breast milk exosomes attenuate intestinal damage. Pediatr Surg Int. 36 (2), 155-163 (2020).
  8. Gao, J., et al. Recent developments in isolating methods for exosomes. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1100892(2022).
  9. Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Sci Rep. 9 (1), 5335(2019).
  10. Gandhi, J., Naik, M. N., Mishra, D. K., Joseph, J. Proteomic profiling of Aspergillus flavus endophthalmitis-derived extracellular vesicles in an in vivo murine model. Med Mycol. 60 (9), myac064(2022).
  11. Palinski, W., et al. Lysosome purinergic receptor p2x4 regulates neoangiogenesis induced by microvesicles from sarcoma patients. Cell Death Dis. 12 (9), 797(2021).
  12. Tantengco, O. aG., Radnaa, E., Shahin, H., Kechichian, T., Menon, R. Cross talk: Trafficking and functional impact of maternal exosomes at the feto-maternal interface under normal and pathologic statesdagger. Biol Reprod. 105 (6), 15621576(2021).
  13. Caruso Bavisotto, C., et al. Exosomal hsp60: A potentially useful biomarker for diagnosis, assessing prognosis, and monitoring response to treatment. Expert Rev Mol Diagn. 17 (9), 815-822 (2017).
  14. Feng, X., et al. Latest trend of milk-derived exosomes: Cargos, functions, and applications. Front Nutr. 8, 747294(2021).
  15. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

EV w mleku kobiecymszybka filtracjaultracentryfugacjaizolacja egzosomówWestern blottransmisyjna mikroskopia elektronowaanaliza NanoSightmarker CD63
Szybka izolacja pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z ludzkiego mleka matki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.