Artykuł metodologiczny

Uproszczony, bezoznakowy, w czasie rzeczywistym 50% testu zakaźnego hodowli tkanek (TCID50) z impedancją do automatycznego ilościowania miana wirusowego

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67956

⸱

9 stycznia 2026

 ,  ,  ,  , 
1Agilent Technologies, Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

Opisany tutaj test TCID50 wykorzystuje bezoznakowe pomiary impedancji w czasie rzeczywistym oraz moduł Virology systemu, aby obiektywnie monitorować efekty cytopatyczne (CPE) wywołane wirusem w czasie rzeczywistym. Ten uprościony test znacznie skraca czas pracy praktycznej, jednocześnie wspierając wysokoprzepustowe, ilościowe pomiary kinetyczne CPE oraz umożliwiając zautomatyzowane, w czasie rzeczywistym obliczenia TCID50.

Streszczenie

Pomiar miana wirusowego, czyli stężenia wirusa w próbce, jest podstawową procedurą w badaniach wirusologicznych. Choć są niezbędne, tradycyjne metody, takie jak test płytki nazębnej czy test TCID50, mogą być czasochłonne, wymagają barwienia lub oznakowania odczynników i często wymagają subiektywnej interpretacji, zwłaszcza gdy efekty cytopatyczne (CPE) są subtelne lub trudne do zmierzenia za pomocą obrazowania. Na przykład testy TCID50 mogą wykorzystywać barwniki żywotności, takie jak MTT czy MTS, podczas gdy testy na płytkach nazębnych opierają się na obrazowaniu i barwieniu do wizualizacji blaszek wirusowych, co może wprowadzać zmienność. Co więcej, te tradycyjne metody oferują jedynie statyczny obraz zakaźności wirusów, ograniczając zdolność do wychwycenia dynamicznych interakcji między wirusami a komórkami permisywnymi. Aby przezwyciężyć obecne ograniczenia w pomiarze miaru wirusa, opracowano uprościony test TCID50 wykorzystujący technologię opartą na impedancji, który obiektywnie, nieinwazyjnie i w czasie rzeczywistym mierzy CPE, eliminując potrzebę etykietowania. W tym badaniu do weryfikacji testu impedancji-TCID50 użyto dwóch modeli komórek dopuszczających do wirusa: adenowirusa znakowanego przez GFP (Adv-GFP) w komórkach HEK293A oraz wirusa grypy A (IAV) w komórkach MDCK. Proces pracy jest prosty i obejmuje siewowanie komórek, szczepienie przeciwwirusów, monitorowanie w czasie rzeczywistym oraz automatyczną analizę TCID50 przez oprogramowanie. Przez cały okres infekcji wartości TCID50 były automatycznie obliczane przez oprogramowanie systemu przy użyciu wzoru Reed-Muench we wszystkich zarejestrowanych punktach czasowych. Wartości TCID50 IAV uzyskane za pomocą odczytów impedancji były porównywalne z tymi uzyskanymi przez konwencjonalny test TCID50 oparty na barwieniu kryształowym fioletem. Wyniki te pokazują, że ilościowość wirusa można precyzyjnie i efektywnie osiągnąć za pomocą pomiaru impedancji w połączeniu z modułem wirusologii oprogramowania systemu. Nowy test usprawnia tradycyjne metody, jednocześnie dostarczając lepszego wglądu w dynamikę wirusa, wspierając tym samym zaawansowane badania wirusologiczne i rozszerzając potencjalne zastosowania kliniczne.

Wprowadzenie

W miarę szybkiego rozwoju badań wirusologicznych, dokładne określenie zakaźności wirusa pozostaje kluczowe dla zrozumienia mechanizmów wirusowych, opracowywania terapii przeciwwirusowych oraz oceny skuteczności szczepionek. Jednym z najważniejszych zabiegów jest pomiar miana wirusowego, czyli stężenia cząstek wirusowych w próbce. Test TCID50, który określa liczbę cząstek wirusa zakaźnego potrzebnego do produkcji CPE w 50% zaszczepionych komórek, jest jedną z najczęściej stosowanych metod określania funkcjonalnego miara wirusa. Ten szeroko stosowany test końcowy jest szczególnie cenny dla wirusów, które nie tworzą blaszek i może stanowić alternatywę dla testu płytkowego1.

Ogólnie test TCID50 trwa od 2 do 14 dni, w zależności od wirusa i komórek dopuszczających. CPE, w tym zmiany w proliferacji komórek, morfologii i żywotności, ocenia się za pomocą (1) pomiaru kolorymetrycznego po dodaniu odczynników, takich jak test MTT (3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazolium) oraz MTS (3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-5-(3-karboksymetoksyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium), przy użyciu czytnika płytek2, lub (2) wizualną ocenę morfologicznych lub związanych z hodowlą zmian za pomocą platform obrazowania optycznego – na przykład ocenę CPE poprzez pomiar procentu konfluencji3, lub (3) wizualne wykrywanie CPE przez barwienie fioletowe kryształów po utrwaleniu dołków objętych wirusem formaliną lub paraformaldehydem (PFA). Dodatnia częstotliwość infekcji wirusowych, uzyskana na podstawie liczby replik pozytywnych CPE przy każdym rozcieńczeniu wirusa, stanowi podstawę obliczeń TCID50. Rozcieńczenie, przy którym 50% hodowli wykazuje CPE, jest statystycznie obliczane przy użyciu ustalonych wzorów4, takich jak Reed-Muench, Spearman-Karber i Improved-Karber, a wynik podaje się jako TCID50 na mililitr (TCID50/mL).

Tradycyjne testy TCID50 i płytki nazębnej są powszechnie uznawane za złoty standard funkcjonalnej ilościowej ilościowej analizy i mogą dostarczyć nieocenionych informacji. Jednak te testy są często żmudne, czasochłonne i wymagają ręcznego barwienia do wizualizacji CPE, co skutkuje niską przepustowością, zwiększonym ryzykiem błędów ludzkich oraz subiektywnością. W przypadku wysoce zakaźnych lub śmiertelnych wirusów minimalizacja czasu narażenia na nie oraz redukcja odpadów zawierających wirusy w dodatkowych etapach, takich jak barwienie, są ważnymi czynnikami poprawiającymi bezpieczeństwo biologiczne. Z wyjątkiem testu TCID50 opartego na obrazowaniu bez oznakowania, większość testów TCID50 i blaszki nazębnej to również testy końcowe, co może skutkować nieoptymalnym czasem oceny miana i ograniczać możliwość obserwacji dynamicznych interakcji między wirusami a komórkami gospodarza. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano i wprowadzono uproszczeniony, wolny od oznakowania i działający w czasie rzeczywistym test TCID50. Chociaż koncepcyjnie podobny do konwencjonalnego testu TCID50, nowa metoda wykorzystuje odczyty impedancji komórkowej, rejestrowane i analizowane przez system RTCA MP, aby obiektywnie i nieprzerwanie monitorować infekcje w czasie.

Udowodniono i zweryfikowano, że biosensoryzacja oparta na impedancji zapewnia jakościowy i ilościowy odczyt złożonego z liczby komórek, morfologii oraz siły przyczepności do substratu komórkowegow sposób wolny od oznakowania, nieinwazyjny 5,6. Wcześniejsze badania wykazały, że CPE indukowane wirusem można dokładnie zmierzyć w czasie rzeczywistym za pomocą pomiarów impedancji RTCA 7,8,9. Zamiast raportować surowe wartości impedancji, systemy używają parametru bezjednostkowego zwanego Indeksem Komórki (CI), który odzwierciedla zmiany impedancji spowodowane zdarzeniami komórkowymi. Na przykład, gdy komórki przylegają do dna, rozprzestrzeniają się i rosną na dnie studni, CI wzrasta. Natomiast gdy komórki obumierają, kurczą się lub odłączają się, na przykład podczas infekcji wirusowej, CI maleje.

Biorąc pod uwagę obiecujące raporty wykorzystujące impedancję do pomiaru CPE, celem tego badania było wykazanie, że test TCID50 oparty na impedancji jest wiarygodną i dokładną alternatywą dla konwencjonalnej ilościowej analizy wirusa. Moduł Virology w oprogramowaniu systemu umożliwia automatyczne obliczanie TCID50 przez cały pomiar CPE w czasie rzeczywistym, usprawniając i skracając proces testowania, jednocześnie dostarczając cennych informacji na temat kinetyki replikacji wirusów i ich interakcji z komórkami permisywnymi.

Protokół

Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Test TCID50 oparty na impedancji

UWAGA: Jak pokazuje Rysunek 1 , test TCID50 oparty na impedancji składa się z czterech etapów: dopuszczającego zasiewania komórek na płytce biosensorowej, przygotowania i szczepienia wirusa rozcieńczającego wirusa, pomiaru CPE w systemie oraz wreszcie analizy danych i obliczeń TCID50 z wykorzystaniem modułu Virology w oprogramowaniu systemu.

  1. Przygotowanie testu: ożywienie i podhodowanie komórek dopuszczających
    UWAGA: Ten etap należy wykonać tydzień przed badaniem. Aby zminimalizować zmienność między eksperymentami, zdecydowanie zaleca się przygotowanie banku komórek dopuszczających do tego samego przejścia do wykorzystania w teście. Nie używaj komórek starszych niż 15 kanałów po zakupie u operatora.
    1. Rozmrażanie kriokonserwowanych komórek permisywnych
      1. Podgrzej podłoże wzrostu komórek w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut. Na przykład Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), uzupełnione o 10% surowicę płodową bydła (FBS) i 1% penicylinę/streptomycynę, było stosowane do HEK293A hodowli.
      2. Rozmroź fiolkę z komórkami z banku komórek, krioprezerwowane do testów TCID50, delikatnie mieszając w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 1-2 minuty, aż pojawi się kilka kryształków lodu; Nie zanurzaj pokrywki. Przetrzyj fiolkę 70% etanolem i włóż ją do laminarnego okapu.
      3. Delikatnie przełóż komórki do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mL i dodaj 9 ml podgrzanego medium wzrostu do komórek.
      4. Wiruj zawiesinę ogniwową w stężeniu 300 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
      5. Usuń supernatant i ponownie zawiesij komórki w 15 mL podgrzanego medium wzrostowego. Przełóż je do nowej kolby T75.
      6. Hodować komórki do konfluencji 80%-90% w inkubatorze 37 °C z 5%CO2.
    2. Subhodowla komórek permisywnych.
      1. Monitoruj komórki, aż osiągną łączność 80%-90%.
      2. Usuń medium zawierające surowicę z kolby i delikatnie opłuj monowarstwę komórki za pomocą soli fizjologicznej Dulbecco bez Mg i Ca, buforowanej fosforanem (DPBS).
      3. Trypsynizuj komórki, równomiernie rozprowadzając 2 mL roztworu 0,05% trypsyny/EDTA na kolbkę T75 i zostawiając kolbę w inkubatorze 37 °C na 1-3 minuty.
        UWAGA: Nie przesadzaj z trypsynizacją komórek, ponieważ może to być dla nich szkodliwe.
      4. Zatrzymaj trypsynizację, dodając 8 mL podłoża zawierającego surowicę, aby rozcieńczyć pierwotną objętość trypsyny co najmniej pięciokrotnie. Przelej 2,5 mL zawiesiny ogniwowej do nowej kolby T75, a następnie dodaj 8 mL pożywki hodowlanej.
        UWAGA: Unikaj używania świeżo rozmrożonych komórek dopuszczających do testu TCID50. Zamiast tego używaj komórek hodowanych przy łączności 80%-90%. Aby zmniejszyć zmienność międzyeksperymentalną, ożywione komórki powinny być utrzymywane maksymalnie przez dwa tygodnie po rozmrożaniu. Aby zapewnić wysoką żywotność i proliferację komórek podczas dwutygodniowej hodowli: (1) zmieniać podłoże wzrostu co najmniej dwa razy w tygodniu; (2) podhodowla komórek, gdy osiągają 80%-90% zbiegu się. Przy dłuższej konserwacji dłuższej niż dwa tygodnie wymagana jest walidacja.
  2. Miażdżenie wirusa
    UWAGA: Ten krok należy wykonać w dniu 1.
    1. Pomiar tła płyty biosensora
      1. Ostrożnie przelej 50 μL podgrzanego medium do każdego dołku za pomocą pipety wielokanałowej, stosując technikę pipetowania odwrotnego, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków i zapewnić stałą ilość dawkowania.
      2. Włóż tablicę do stacji tablicy; otwórz oprogramowanie systemu i wybierz moduł Virologia przed rozpoczęciem eksperymentu. Wprowadź odpowiednie notatki na zakładce Notatki Exp oraz wprowadź informacje o komórkach, w tym nazwę i numer komórki, w podzakładce Komórka zakładki Układ po wybraniu odpowiednich studni. Alternatywnie, informacje komórkowe można wprowadzać po seedingu.
        UWAGA: Przed dodaniem komórek do dołków płyty należy wykonać pomiar tła płyty. Odczyty tła dla wszystkich studni powinny wynosić od -0,063 do 0,063.
      3. Na zakładce Harmonogram kliknij przycisk Dodaj krok, aby dodać Krok 1, który jest przeznaczony do pomiaru tła tablicy. Następnie rozpocznij nagrywanie, klikając przycisk Start .
      4. Zdejmij płytkę ze stacji i włóż ją z powrotem do okapu do wysiewu komórek.
    2. Dozwolne zasiewanie komórek na 96-dołkownicą płytę biosensorową
      1. Trypsynizuj komórki dopuszczające z kolby T75.
      2. Policz komórki i dostosuj zawiesinę komórkową do pożądanego stężenia. W tym badaniu stężenie HEK293A wyniosło 60 000 komórek/mL.
      3. Do każdej studni płyty dodaj 100 μL zawiesiny komórkowej.
        UWAGA: Odpowiednia gęstość komórek jest niezbędna. Nieoptymalna gęstość zasiewów może skutkować eksperymentalnym artefaktem. Dlatego przed przeprowadzeniem testu TCID50 należy zoptymalizować gęstość siewnictwa.
      4. Zostaw płytkę w okapie w temperaturze pokojowej przez 30 minut po dodaniu komórek, pozwalając komórkom rozłożyć się równomiernie na dnie dołku.
        UWAGA: Brak wykonania tego kroku może skutkować dużymi różnicami między studnią.
      5. Włóż talerz do stacji talerzowej w inkubatorze 37 °C z 5%CO2.
      6. Przejdź do zakładki Harmonogram w oprogramowaniu i dodaj Krok 2 , używając domyślnych ustawień nagrywania: 100 przebiegów i 15-minutowy interwał. To zainicjuje monitorowanie impedancji/CI co 15 minut, umożliwiając ocenę przywiązania i proliferacji komórek w czasie rzeczywistym jako krok kontroli jakości komórek (QC) przed szczepieniem na wirusa.
        UWAGA: Dzień 2 – Aby zmaksymalizować powtarzalność i spójność testów w różnych eksperymentach, kluczowe jest ocenenie funkcjonowania komórek w systemie przed przejściem do kolejnego kroku. Ponieważ CI odzwierciedla przywiązanie i wzrost komórek, wartości CI w okresie 20-28 godzin po zasiewaniu stanowią kluczowy parametr kontroli jakości. Zarówno wartość, jak i kinetyka CI są specyficzne dla komórki. W tym badaniu dla HEK293A komórek zasianych po 6 000 komórek na dołek i hodowanych przez 20-28 godzin, CI powinno przekraczać 2. Jeśli CI nie osiągnie 2 w ciągu 20-28 godzin po zasiewaniu, hodowla komórek HEK293A uznawana jest za niedostateczną kontrolę jakości (QC) i kolejny test TCID50 nie zostanie przeprowadzony. To kryterium zapewnia wysoką powtarzalność wyników eksperymentalnych.
    3. Przygotowanie seryjnego rozcieńczenia wirusa
      1. Oblicz całkowitą objętość podłoża (DMEM + 2% FBS + 1% penicylina/streptomycyna) potrzebnego do przygotowania rozcieńczeń i podgrzej go w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut. Medium zostanie użyte do reszty eksperymentu.
      2. Szybko rozmroz fiolkę z alikwotowanym zapasem wirusa w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 1-2 minuty, aż wszystkie kryształki lodu stopią się.
      3. Przygotuj wirusy rozcieńczone seryjnie 10 razy, przelewając 20 μL zapasu wirusa do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL zawierającej 180 μL podgrzanego medium na każdym etapie. Pipetować w górę i w dół, aby zapewnić dokładne wymieszanie podłoża i wirusa.
        UWAGA: Nie zanurzaj końcówki pipety zbyt głęboko w roztworze wirusowym, aby zapobiec przenoszeniu nadmiaru resztek wirusowych poza końcówkę, co mogłoby skutkować nieprawidłowymi rozcieńczeniami.
      4. Aby zapobiec wahaniom odczytów impedancji spowodowanym dodaniem próbek przeziębienia, wyrównaj rozcieńczenia wirusa, inkubując je w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez 20 minut przed szczepieniem.
    4. Wprowadź informacje o leczeniu wirusów na zakładce Layout
      1. Na zakładce Layout na tablicy w oprogramowaniu; Wybieranie dołków do leczenia miarkami wirusowymi; kliknij podzakładkę Treatment i wpisz początkową rozcieńczenie, na przykład 0,001 (10-3) w tym eksperymencie; wpisz 10 jako "Czynnik Rozcieńczenia"; wybierz kierunek rozcieńczania, w tym przypadku od lewej do prawej. Rozcieńczenie wirusa będzie automatycznie obliczane na podstawie układu płyty wejściowej i wyświetlane w każdej odpowiadającej jej studni.
      2. Następnie wpisz objętość szczepienia wirusa i kliknij przycisk Aplikuj , aby zapisać wszystkie informacje o leczeniu. Ten krok jest niezbędny do dokładnego obliczenia TCID50/mL podczas analizy danych.
      3. Przypisz doły, które nie będą leczone wirusami, jako negatywne kontrole, wybierając odpowiednie dołki, a następnie sprawdzając Negatywny Ctrl w zakładce Typ studni w zakładce Leczenie .
        UWAGA: Studnie kontroli ujemnej muszą być oznaczone i dodane do strony Układu; pominięcie uniemożliwi obliczenia TCID50.
    5. Szczepienie wirusa
      1. Gdy będziesz gotowy, naciśnij przycisk Pauza w programie, aby zatrzymać pobieranie danych. Zdejmij płytkę ze stacji i umieść ją w laminarnym mascie.
      2. Ostrożnie usuń medium hodowlane z dołków płyty za pomocą pipety wielokanałowej.
      3. Delikatnie dodaj 50 μL rozcieńczenia wirusa za pomocą pipety wielokanałowej na górę monowarstwy komórki, unikając zakłóceń hodowli komórkowej.
      4. Włóż płytę z powrotem do Stacji i dodaj Krok 3 , używając domyślnych ustawień nagrywania (100 przesunięcia i 15-minutowy interwał) na zakładce Harmonogram , aby wznowić impedancję nagrywania co 15 minut przez 2 godziny, pozwalając wirusowi przywiązać się do komórek.
      5. Po 2 godzinach szczepienia przeciwwirusa wstrzymaj nagrywanie i usuń płytkę ze stacji na laminarny maskę.
      6. Powoli dodawaj 150 μL podgrzanego medium do dołków za pomocą pipety wielokanałowej, unikając zakłóceń monowarstwy komórki; zwróć płytę na Stację.
      7. Konsumuj Krok 3 , klikając Start na zakładce Harmonogram . Sygnały impedancji są mierzone nieprzerwanie co 15 minut przez cały okres szczepienia.
    6. Obliczenie TCID50 w trakcie lub po zakończeniu testu TCID50
      1. Na zakładce Analiza danych wybierz i dodaj wszystkie studnie użyte w testie do wykresu wykresowego. Oś y wykresu jest określana przez opcję wybraną z rozwijanego menu osi Y .
      2. Przejdź do sekcji Parametry . Wybierz TCID50 z listy rozwijanej Parametrów, aby rozpocząć obliczenia TCID50.
      3. Wybierz wykres słupkowy do obliczeń TCID50 w określonym punkcie czasowym lub wybierz Zależny od czasu TCID50 , aby wygenerować przebieg TCID50 w pożądanym okresie podczas szczepienia. TCID50/mL zostanie obliczony i wyświetlony po kliknięciu przycisku wykonania.

2. Test Crystal Violet-TCID50

  1. Osiew komórki permisywne na mikropłycie z 96 dołkami przy optymalnej gęstości zasiewniczej, opisanej w teście TCID50 opartym na impedancji (kroki 1-2).
  2. Wykonaj przygotowanie i inokulację seryjnego rozcieńczania wirusa zgodnie z definicją testu TCID50 opartego na impedancji.
  3. Utrwalanie i barwienie
    1. Po zakończeniu badania delikatnie usuń supernatant z każdego dołka i dodaj 100 μL 4% formdehydu w celu utrwalenia komórek.
    2. Inkubuj w 4 °C przez 1 godzinę, a następnie usuń utrwalacz.
    3. Usztywnione komórki pofarbuj 0,5% Crystal Violet przygotowanym w PBS. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    4. Myj talerz wodą z kranu, aż tło się oczyści. Pozwól talerzowi całkowicie wyschnąć na powietrzu przed nacięciem.
      UWAGA: Odpady kryształowego fioletu są uznawane za niebezpieczne zarówno według RCRA, jak i Kalifornijskiego Kodeksu Regulacyjnego (CCR 66261.24). Zbieraj wszystkie zużyte roztwory fioletowe, zanieczyszczone materiały (np. ręczniki papierowe, rękawiczki) i płucz odpady w wyznaczonym pojemniku na odpady niebezpieczne. Utylizuj odpady za pośrednictwem Organizacji ds. Zdrowia Środowiskowego i Bezpieczeństwa (EH&S) lub licencjonowanego wykonawcy utylizacji odpadów niebezpiecznych w Twojej instytucji.
  4. Punktacja i obliczenia TCID50
    1. Sprawdź wizualnie każdy odwiert pod kątem CPE. Pozytywny odcinek pokazuje częściowe lub całkowite zniszczenie monowarstwy oraz jaśniejsze przebarwienie. Studnia negatywna zachowuje nienaruszoną monowarstwę z ciemnofioletowym barwieniem.
    2. Policz liczbę studni dodatniej i ujemnej dla każdego rozcieńczenia.
    3. Ręcznie oblicz TCID50/mL metodą Reed-Muench, na podstawie objętości inokulacji 150 μL.

Wyniki

Bezetykietowe, w czasie rzeczywistym, dynamiczne monitorowanie CPE z wykorzystaniem impedancji
Aby potwierdzić, że CPE wywołane wirusem można wiarygodnie i ilościowo mierzyć impedancją, najpierw zarejestrowaliśmy zmiany komórkowe w HEK293A komórkach po zakażeniu Adv-GFP, używając systemu RTCA eSight, który jednocześnie mierzy impedancję i rejestruje obrazy żywych komórek z tej samej populacji komórek, dostarczając cennych informacji o zachowaniu komórek. HEK293A komórki zostały zasiane na 96-dołkowej płycie biosensorowej o gęstości zasiewnej 6 000 komórek/dołek przez 24 godziny, a następnie zainfekowane Adv-GFP przy 104 IFU/mL. Impedancja i obrazowanie żywymi komórkami były rejestrowane przez 250 godzin po szczepieniu (Rysunek 2A). Aby zminimalizować zmienność wynikającą z różnic w zasiewaniu komórek i ujawnić względne zmiany po zabiegu, użyto Indeksu Normalizowanych Komórek (NCI) do przedstawienia zbiorowych zmian wzrostu komórek, przyczepności i żywotności komórek w czasie. NCI oblicza się przez podzielenie CI w danym punkcie przez jego CI w punkcie normalizacji (czas przed inokulacją). Ślad kinetyczny NCI niezakażonej grupy kontrolnej (rysunek 2A, ślad) wykazuje stopniowy wzrost w ciągu pierwszych 48 godzin, co wskazuje na ciągłą proliferację komórek. Następuje plateau na końcu testu, co wskazuje, że komórki stały się zbiegiem i pokrywały całą powierzchnię złotych biosensorów. Dla porównania, kinetika NCI z zakażonych wirusem studni spadła poniżej kontroli 50 godzin po szczepieniu i stopniowo spadała, aż osiągnęła zero po 100 godzinach.

Obrazowanie żywych komórek wykonanych z tej samej populacji komórek wizualnie potwierdziło, że sygnał impedancji niezawodnie odzwierciedla stan fizyczny komórek dopuszczających się do rozwoju przez cały kontinuum CPE. Jak pokazano na Rysunku 2A, istnieje odwrotna korelacja między NCI a ekspresją wirusowego GFP w zakażonych HEK293A komórkach zaobserwowanych w ciągu pierwszych 100 godzin przed pełną lizą komórek permisywnych. Ponadto obrazy żywych komórek (Rysunek 2B) zarejestrowane w określonych momentach dodatkowo pokazują status komórek dopuszczających się do zakażenia wirusowego. Wzrost komórek utrzymywał się przez pierwsze 48 godzin po zakażeniu, podczas gdy cząsteczki wirusa pozostawały na niskich poziomach wewnątrz komórek. Jednak wraz z postępem replikacji wirusa i infekcji zaczęła się śmierć komórek, co potwierdzała zmniejszona konfluencja i zwiększony sygnał GFP w komórkach gospodarza. Około 100 godzin po zaszczepieniu ekspresja wirusa GFP zaczęła spadać z powodu znacznej utraty żywotnych komórek permisywnych. To zintegrowane podejście wzmacnia wiarygodność wykrywania CPE indukowanego wirusem przez impedancję, tworząc solidne podstawy dla testu TCID50 opartego na impedancji.

Automatyczne obliczenia TCID50 na podstawie odczytu impedancji
Dokładne zidentyfikowanie dodatnich otworów CPE jest kluczowe dla wiarygodnych obliczeń TCID50. Aby ocenić, czy test TCID50 oparty na impedancji może precyzyjnie i obiektywnie rozróżnić dodatnie i ujemne CPE przy wsparciu modułu wirusologii oprogramowania, HEK293A komórki zostały zasiane w ilości 6 000 komórek/dołek przez 24 godziny przed inokulacją i poddane serii dziesięciokrotnych rozcieńczeń Adv-GFP, przy użyciu ośmiu replikatów (dołków) dla każdego rozcieńczenia. CPE indukowany przez Adv był rejestrowany w czasie rzeczywistym w systemie RTCA. Na Rysunku 3A ślady kinetyczne impedancji, przedstawione jako NCI, zostały zarejestrowane i automatycznie wykreślone przez cały eksperyment. Spadek NCI po szczepieniu ujawnia wyraźne CPE zależne od dawki, co potwierdza silna korelacja między ilością dodanego wirusa a tempem spadku sygnału impedancji. Komórki narażone na wysokie obciążenia wirusowe, od 10-3 do 10-7 rozcieńczenia, wykazywały gwałtowne i stałe spadki NCI, co odzwierciedla solidne i jednolite CPE w odwiertach replikowanych. Dla porównania, przy rozcieńczeniu wirusa 10-8 , ślad kinetyczny wykazywał dużą zmienność od samego początku, co skutkowało znacząco większymi odchyleniami standardowymi NCI, szczególnie powyżej 100 godzin po szczepieniu. Gdy ładunek wirusowy był dalej obniżany poniżej progu potrzebnego do wywołania infekcji, w tym przypadku rozcieńczenia 10-10 , NCI stało się nie do odróżnienia od kontrolnych u negatywnych testów. Dane te sugerują, że przy rozcieńczeniu 10-8 wirus nie był w stanie indukować CPE we wszystkich powtarzających się dołkach przy podobnej kinetyce; 2) to rozcieńczenie byłoby linią podziału między stężeniami powodującymi CPE we wszystkich powtórzeniach a tymi, które indukują CPE tylko w niektórych lub w żadnym z replikatów; Ten binarny wynik, zainfekowany (wskazany zmianami CI wywołanymi przez CPE) lub niezainfekowany (brak zmiany CI), stanowi podstawę do obliczania TCID50 przy użyciu metod statystycznych w oprogramowaniu systemowym. Dlatego głęboka zmienność NCI obserwowana przy określonych stężeniach wirusa jest kluczowym wskaźnikiem występowania częściowego zakażenia i może być kluczowa dla ekstrapolacji potrzebnej do obliczenia TCID50.

Podobnie jak w klasycznym testie TCID50, próg dodatniego CPE musi zostać zdefiniowany, zanim wbudowane oprogramowanie będzie mogło automatycznie zidentyfikować otwory CPE-dodatnie. Ponieważ różne wirusy i modele komórek permisywnych mogą wymagać różnych progów, oprogramowanie pozwala użytkownikom konfigurować i dopracowywać te kryteria w module Virologia. Na podstawie danych empirycznych zastosowano domyślny próg oprogramowania dla dodatniego CPE, definiowany jako wartość NCI zdrowia leczonego wirusem będącego ponad trzy odchylenia standardowe poniżej średniej NCI grupy kontrolnej (niezaszczepionej), tj. NCI leczonej< (NCI-3 X SD)neg ctrl. Poszczególne studnie oceniano następnie jako dodatnie (+) lub ujemne (-) (Rysunek 3B). W tym przypadku TCID50/mL Adv-GFP został następnie obliczony za pomocą wzoru Reed-Muencha, jednego z formuł zawartych w oprogramowaniu. Poza wyborem lub definiowaniem kryteriów dla dodatniego CPE, nie było wymaganych ręcznych działań do obliczeń TCID50, ponieważ oprogramowanie w pełni automatyzowało proces.

Dynamiczne śledzenie TCID50 podczas infekcji wirusowej
Aby określić odpowiedni czas trwania testu TCID50, wartości Adv-GFP TCID50 zostały wyodrębnione w pożądanych punktach po zakażeniu, zaczynając od 30 godzin i kontynuując w krokach po 30 godzinach do 240 godzin. Celowo wybrano 30-godzinny przyrost, ponieważ replikacja adenowirusa trwa około 30 godzini 10 godzin. Wartości TCID50 Adv-GFP zostały wykreślone w zależności od czasu (Rysunek 4). Warto zauważyć stopniowe zwiększanie wartości TCID50, które trwa do około 150 godzin po zaszczepieniu. Za tym punktem pojawia się plateau, wskazująca na równowagę, w której efekty cytopatyczne prawdopodobnie osiągnęły nasycenie. Wzrost zależny od czasu, a następnie stabilizacja, sugeruje typową krzywą replikacji wirusa. Faza początkowa charakteryzuje się aktywnym rozprzestrzenianiem się wirusa, kończącym się szczytem odzwierciedlającym maksymalny wpływ cytopatyczny w danych warunkach eksperymentalnych. Faza plateau TCID50 może odzwierciedlać biologiczny sufit, w którym proces infekcji wirusowej angażuje większość komórek dopuszczalnych, co skutkuje znaczną śmiercią komórek i zatrzymuje dalszą replikację wirusa. Bieg kinetyczny TCID50 sugeruje, że badanie można przerwać sześć do siedmiu dni po szczepieniu w modelu adenowirusa-HEK293A, ponieważ stała wartość TCID50 wynosiła 8,9 × 109 TCID50/mL już po 150 godzinach.

Ilościowa identyfikacja miana wirusa grypy A za pomocą testu TCID50 opartego na impedancji
Aby zbadać, czy test TCID50 oparty na impedancji można rozszerzyć na inne modele wirusa-gospodarza, przeprowadzono test TCID50 w komórkach MDCK zakażonych IAV. Chociaż uwzględniał drobne różnice w pożywce zakażeń specyficznym dla IAV, procedura testu podstawowego pozostała zgodna z tą ustaloną dla adenowirusa. Rysunek 5A pokazuje NCI komórek MDCK w czasie po szczepieniu z rozcieńczeniami IAV w zakresie od 1 x 10-2 do 5 x 10-9. Podobnie jak wyniki obserwowane w komórkach zakażonych Adv HEK293 A, dołki kontrolne niezainfekowane/ujemne wykazywały stałe i spójne NCI w replikacjach. Jednak zakażone wirusem otwory wykazały zmianę NCI zależną od dawki. Przy niskich dawkach, 6,4 i 1,3 x 10-7 rozcieńczeń, zaobserwowano duże odchylenie standardowe. Sugeruje to, że przy tych rozcieńczeniach stężenie wirusa zbliżało się do TCID50.

Studnie CPE-dodatnie zidentyfikowano przy użyciu tych samych kryteriów i progu co w modelu Adv-HEK293A, konkretnie potrójnego odchylenia standardowego poniżej średniej studni kontrolnych ujemnych. Wartości TCID50 oparte na impedancji dla IAV były również określane w różnych momentach po zaszczepieniu. Rysunek 5B pokazuje średnie wartości TCID50 z dwóch niezależnych eksperymentów. Z wyjątkiem wczesnego punktu czasowego 60 godzin, wartości TCID50 z okresu 90-150 godzin po infekcji wykazały dobrą stabilność i spójność, co wskazuje, że test TCID50 oparty na impedancji dla IAV można niezawodnie ukończyć w cztery dni zamiast pięciu. Ta spójność wzmacnia odporność metody opartej na impedancji, potwierdzając jej elastyczność i niezawodność w różnych patogenach wirusowych.

Walidacja testu TCID50 opartego na impedancji przy użyciu konwencjonalnej metody TCID50
Aby zweryfikować TCID50 pochodzący z impedancji do pomiaru stężenia IAV, przeprowadzono równolegle testy TCID50 z wykorzystaniem dwóch alternatywnych metod: obrazowania bez etykiet oraz barwienia fioletowego kryształowego. Krótko mówiąc, komórki MDCK zostały przygotowane i zasiane w mikromiareczkach z 96 dołkami. Następnego dnia komórki zostały zaszczepione serią rozcieńczeń IAV przez 5 dni. W testie TCID50 opartym na obrazowaniu obrazowanie na żywych komórkach wykonywano co 4 godziny. W badaniu walidacyjnym oceniono stężenia dziesięciu próbek IAV. Współbieg komórek w studniach objętych wirusami porównywano z ujemnymi, niezainfekowanymi studniami za pomocą oprogramowania systemu. Jednak analiza obrazowania komórek MDCK była szczególnie trudna, co ilustruje Rysunek 6A. Dokładne różnicowanie między komórkami a pustymi przestrzeniami było trudne ze względu na płaską morfologię i słabo zdefiniowane krawędzie komórek MDCK, co utrudniało wiarygodną identyfikację studni CPE-dodatnich za pomocą analizy obrazowej. Zastosowanie bardziej zaawansowanego i zaawansowanego oprogramowania do analizy obrazowania może zwiększyć dokładność obliczeń TCID50 w takich przypadkach11. W tym przypadku ocena TCID50 oparta na obrazowaniu bez etykiet zakończyła się niepowodzeniem przy użyciu obecnego oprogramowania systemowego. W badaniu barwienia kryształowego fioletu – TCID50 komórki zostały utrwalone i zabarwione 5. dnia po inokulacji, zgodnie z sekcją protokołu. Rysunek 6B pokazuje silną korelację liniową między wartościami TCID50 opartymi na impedancji a barwieniu kryształowym fioletem, z równaniem regresji y = 0,9582x i R² = 0,9979. Ta analiza porównawcza podkreśla wiarygodność metody opartej na impedancji do pomiaru miarza wirusowego oraz jej przydatność do testów TCID50.

figure-results-1
Rysunek 1: Workflow testowania TCID50 oparty na impedancji. Krok 1: Zezwalające zasiewanie komórek na płytce biosensora. Zasiewaj komórki permisywne na płytce z optymalną gęstością zasiewną. Wzrost komórek jest następnie monitorowany w systemie w ramach procedury kontroli jakości komórek (QC). Krok 2: przygotowanie i szczepienie na wirusa. Przygotuj seryjnie rozcieńczone zapasy wirusa za pomocą zdefiniowanego przez użytkownika współczynnika rozcieńczania. Usuń płytę z systemu i dodaj wirusy do wgłębień płyty w laminarnym kapcie. Krok 3: Pomiar CPE i ocena dołków CPE-dodatnich za pomocą oprogramowania modułu Virology. Wróć płytę do systemu i wznow nagrywanie CPE indukowanego wirusem w czasie rzeczywistym. Oprogramowanie automatycznie identyfikuje studnie CPE-dodatnie na podstawie zdefiniowanego przez użytkownika progu wykrywania CPE. Krok 4: Obliczenia TCID50. Dzięki aktualnemu ocenianiu dołków z dodatnim testem CPE w porównaniu z szczepieniem na wirusa, oprogramowanie modułu Virology może obliczać wartości TCID50 w dowolnym momencie testu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: CPE indukowane adenowirusem oceniano przy użyciu metod opartych zarówno na impedancji, jak i obrazowania (A) Dynamiczne profilowanie impedancji (lewa oś y) i zielonej fluorescencji (prawa oś y) w HEK293A komórkach w czasie po zakażeniu Adv-GFP. Normalizowany indeks komórek dla komórek zakażonych adenowirusem (NCI Adv, czerwona linia), komórek kontrolnych ujemnych (NCI NC, linia) oraz całkowitej intensywności GFP zintegrowanej (GFP Adv-zakażony, zielona linia) jest wykreślany w zależności od czasu. Całkowita intensywność GFP odzwierciedla ekspresję GFP w komórkach permisywnych i służy jako wskaźnik infekcji wirusowej. Liczby (1-6) wzdłuż Indeksu Normalizowanych Komórek odpowiadają określonym punktom czasowym podczas procesu infekcji. Dane przedstawione są jako średnia ± SD (N = 8). (B) Sekwencyjne obrazy HEK293A komórek przed i po zakażeniu Adenowirusem-GFP. (1) Obraz bazowy (0 h) jest następowany po zdjęciach 48 h (2), 72 h (3), 96 h (4), 120h (5) i 200h (6) po zakażeniu, ilustrujących zmiany wzrostu komórek, żywotności oraz fluorescencji adenowirusa GFP w czasie. Skala = 160 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

figure-results-3
Rysunek 3: CPE zależne od dawki adenowirusa-GFP w komórkach HEK293A mierzone impedancją. (A) HEK293A komórki zostały zasiane w płycie biosensorowej o gęstości 6 000 komórek/dołek, a 24 godziny później zainfekowane serią 10-krotnie rozcieńczonych adenowirusów-GFP. Dane przedstawione są jako średnia ± SD (N = 8). Wstawka: Znormalizowany indeks komórkowy dołków zakażonych adenowirusem-GFP przy rozcieńczeniu 10-8 . Dane z rozcieńczeń 10-9, 10-11 i 10-12 zostały pominięte dla jasności. (B) Pojedyncze dołki/replikacje przy każdym rozcieńczeniu wirusa były oceniane jako CPE-dodatnie (+) lub CPE-ujemne (-). Każda kolumna płytki była traktowana innym rozcieńczeniem wirusowym, z gradientem rozcieńczenia od najniższego w kolumnie 1 do najwyższego w kolumnie 10. Kolumny 11 i 12 były dołkami kontrolnymi ujemnymi, bez leczenia wirusowego. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4: Przebieg czasowy wartości TCID50 wyprowadzony na podstawie pomiarów impedancji CPE w komórkach HEK293 po zakażeniu adenowirusem-GFP. TCID50/mL adenowirusa-GFP został obliczony w określonych punktach czasowych za pomocą modułu Virology z pięciu eksperymentów. Chociaż moduł Virology dostarcza trzy wzory obliczeniowe TCID50, do obliczeń TCID50 wybrano wzór Reeda-Muencha. Dane są prezentowane jako średnia ± SD (N = 5). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-5
Rysunek 5: Ocena miana wirusa grypy A z wykorzystaniem testu TCID50 opartego na impedancji. (A) Zależne od dawki CPE IAV w komórkach MDCK mierzone impedancją. Komórki MDCK zostały zasiewane na płytce biosensorowej w ilości 8 000 komórek/dołek i zainfekowane 24 godziny później pięciokrotnym seryjnym rozcieńczeniem wirusa grypy. Dane są przedstawiane jako średnia ± SD (N = 8). Dane z rozcieńczenia 2,6 × 10⁸ zostały pominięte dla jasności. (B) Przebieg czasowy wartości TCID50 wyprowadzony na podstawie pomiarów impedancji w komórkach MDCK zakażonych IAV. Do obliczeń TCID50 zastosowano metodę Reeda-Muencha. Dane przedstawiane są jako średnia ± SD (N = 2). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-6
Rysunek 6: Korelacja między testami TCID50 opartymi na impedancji a barwieniem kryształowym fioletem. (A) Obraz komórek MDCK zaszczepionych IAV. Skala = 160 μm. (B) Porównanie wartości TCID50/mL uzyskanych metodami opartymi na impedancji i barwieniu krysztalicznym fioletem wykonano na dziesięciu próbkach IAV. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-7
Rysunek 7: Reprezentatywne interfejsy oprogramowania modułu wirusologii systemu. Oprogramowanie usprawnia proces testowania TCID50 oparty na impedancji. (1) Układ płyt do rejestrowania projektu eksperymentu; (2) Indeks komórki lub Indeks Normalizacji był automatycznie wykreślany i wyświetlany przez oprogramowanie podczas szczepienia wirusa; (3) oprogramowanie zapewnia elastyczność w określaniu kryteriów i wyborów pozytywnych CPE dla formuły obliczeniowej TCID50; (4) TCID50/mL można określić w dowolnym momencie podczas badania. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Dyskusja

W tym badaniu wykazano zastosowanie impedancji do wyznaczania miarza wirusa za pomocą modeli adenowirusa-HEK293A oraz wirusa grypy A-MDCK. Inni potwierdzili także solidne i wiarygodne wykrywanie CPE indukowanego wirusem za pomocą systemów RTCA w szerokim zakresie wirusów, w tym ortopoxwirusie12, wirusie zachodniego Nilu (WNV) i zapaleniu mózgu St. Louis (SLEV)13, wirusie chikungunya14, wirusie zakaźnego bursalu8, chimerycznej żółtej febry dengi15, wirusie zapalenia wątroby typuA 16, SARS-CoV-217 oraz wirusie dengi9.

Rejestracja CPE w czasie rzeczywistym poprzez impedancję umożliwia wykrywanie specyficznych dla wirusa spadków wartości CI zależnych od czasu w niektórych modelach komórek dopuszczających wirusa. Fang i in. jako pierwsi wykazali, że parametr kinetyczny charakteryzujący CPE indukowany przez flawiwirusa, CIT50 — definiowany jako czas do 50% spadku impedancji komórkowej — jest odwrotnie proporcjonalny do dawki zakaźnej wirusa w określonym zakresie. Wykazano również, że CIT50 jest proporcjonalny do odwrotności miana przeciwciał neutralizujących13. Od tego czasu Charretier i in. z Sanofi Pasteur badali metodę analizy komórek w czasie rzeczywistym opartą na impedancji (RTCA) do określania miarów zakaźnych wirusa podczas opracowywania szczepionki i procesu15 przeciwko chimerycznej żółtej febrze i dengze (CYD). Charretier i in.15 dodatkowo potwierdzili tę impedancyjną dawkę zakaźną 50% (CCID50) za pomocą testu CCID50 opartego na barwieniu immunobarwnym. Wykazano, że metoda RTCA oparta na impedancji jest około 5 razy mniej pracochłonna i 3,5 razy bardziej opłacalna niż standardowy test CCID50 w warunkach przemysłowych. W naszym badaniu udowodniono walidację TCID50 opartej na impedancji względem tradycyjnego testu Crystal Violet TCID50 dla CPE indukowanego przez IAV. Ponadto wykorzystano moduł oprogramowania Virology w oprogramowaniu RTCA. Studnie CPE-dodatnie były automatycznie identyfikowane na podstawie kryteriów zdefiniowanych przez użytkownika dla studni CPE-dodatnich w oprogramowaniu; w naszym przypadku stopień CI spada w porównaniu do kontrol ujemnych. TCID50 był następnie obliczany przez oprogramowanie odpowiednio, co umożliwiło dokładne określenie miana bez polegania na CIT50 i ryzyka, że próbka wypadnie poza optymalny zakres. Ustalenie odpowiedniego progu dla dołków CPE-dodatnich jest kluczowe, ponieważ bezpośrednio wpływa na czułość i swoistość testu. Zaleca się, aby użytkownicy określali kryteria specyficzne dla wirusa, porównując zmiany indeksu komórkowego z wynikami zwalidowanej metody konwencjonalnej. Te empirycznie wyprowadzone progi można następnie konfigurować i udoskonalać w module Virologia oprogramowania.

Podobnie jak w innych testach komórkowych, stan komórek permisywnych stosowanych w testach TCID50 opartych na impedancji jest kluczowy dla oceny sukcesu testu i jakości wyników. Aby zapewnić wysoką proliferację i żywotność komórek, zaleca się świeże, niskoprzepuszczalne komórki. Dodatkowo, utworzenie banku komórek permisywnych w tym samym przejściu może poprawić powtarzalność w różnych eksperymentach. Jak wskazano na Rysunku 3A, gdy komórki permisywne znajdowały się w optymalnych warunkach, generowały stabilne i spójne sygnały impedancji w niezainfekowanych kontrolach przez cały okres testu. Stanowiła wiarygodną bazową referencję do ustalenia progu dla dołków CPE, co skutkowało precyzyjnym określeniem miaru wirusowego. Ponadto test TCID50 oparty na impedancji jest wyjątkowo zdolny do przeprowadzania kontroli jakości komórek permisywnych przed oceną miarza wirusa. Charakterystyczny kinetyczny profil CI zdrowych komórek permisywnych służy jako wiarygodny wskaźnik kontroli jakości, zapewniając, że do ilościowego określenia wirusa wykorzystywane są wyłącznie żywotne i spójne populacje komórek, co zwiększa powtarzalność i dokładność testu.

Dla każdego nowego wirusa przed wdrożeniem należy również przeprowadzić optymalizację i walidację testu impedancyjnego TCID50. Kluczowe czynniki, takie jak warunki hodowli komórkowej, w tym ośrodek podstawowy i stężenie FBS, są kluczowe dla uzyskania powtarzalnych danych impedancji komórkowej oraz zwiększenia czułości detekcji CPE, co podkreśliły wcześniejsze badania 6,16. W tym kontekście technologia oparta na impedancji bez etykiet i impedancji w czasie rzeczywistym okazała się prostym, wydajnym i cennym narzędziem do optymalizacji warunków hodowli komórkowych podczas opracowywania testu16.

Ograniczeniem testu impedancji-TCID50 są wirusy, które nie powodują CPE, ponieważ test opiera się na CPE do generowania zmian w odczytzie impedancji, co stanowi podstawę obliczeń TCID50. W takich przypadkach może być konieczne zidentyfikowanie alternatywnego modelu komórek permisywnych, który może wykazywać CPE indukowane wirusem, lub zastosowanie metody immunodostainingu, pod warunkiem posiadania odpowiedniego przeciwciała przeciwko danemu antygenowi wirusowemu. Niemniej jednak badanie wykazało zdolność systemu RTCA MP do wychwytywania zależnego od dawki CPE i skutecznego rozróżniania populacji komórek zakażonych od niezakażonych za pomocą obiektywnego i czułego odczytu impedancji.

Wprowadzenie analizy zależnej od czasu TCID50 stanowi istotny postęp w porównaniu z tradycyjnymi pomiarami punktów końcowych. Upraszcza proces optymalizacji testu TCID50, ponieważ optymalny punkt czasu na obliczenie i raportowanie miana wirusowego można łatwo uzyskać z jednego testu w czasie rzeczywistym. Chociaż testy TCID50 oparte na obrazowaniu i bez etykiet mogą również dostarczać wartości TCID50 o rozdzielczości czasowej, ich zastosowanie ogranicza się do modeli komórek wirusowych, które wykazują CPE rozpoznawalne przez algorytmy oprogramowania obrazowania, co pokazano w modelu IAV-MDCK (Rysunek 6A). Ponadto stosowanie impedancji bez etykiet do wykrywania CPE eliminuje komplikacje związane z używaniem różnych odczynników i wieloetapowych przepływów pracy, które mogą zwiększać ryzyko błędów ludzkich. Oprócz uproszczenia przepływu pracy, moduł Virologia w oprogramowaniu systemu usprawnia również proces testowania. Najpierw zaczyna się od łatwego harmonogramu eksperymentów do automatycznego nagrywania sterowanego przez system. Po każdym pomiarze następuje spontaniczne, spontaniczne wyróżnianie CPE-dodatnie, a kończy się automatycznym obliczeniem TCID50 dla prostego ilościowego określenia cząstek wirusa zakaźnego (Rysunek 7). Ta automatyzacja znacznie skraca czas pracy praktycznej, co jest kluczowym usprawnieniem, zwłaszcza przy obsłudze wysoce zakaźnych wirusów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% trypsyna 0,53 mM EDTA  (1x)Corning25-052-CI
12 zbiorników odczynników kanałowychVistaLab Technologies3054-1011
Adenowirus-GFPVector Biolabs 1060
Medium DMEMATCC30-2002
Tablica E-Plate VIEW 96Agilent300601020
Surowica bydła płodowaAvantor97068-085
Komórka Hek293AThermo Fisher Scientific    R70507
Roztwór penicyliny i streptomycynyHyCloneSV30010
Fosforanowa sól fizjologiczna (1x)HyCloneSH30256.01
Agaroza plakowaLonza50101
system xCELLigence RTCA eSightAgilentS2833AA
System xCELLigence RTCA MPAgilent380601040

Bibliografia

  1. Smither, S. J., et al. Comparison of the plaque assay and 50% tissue culture infectious dose assay as methods for measuring filovirus infectivity. J Virol Methods. 193 (2), 565-571 (2013).
  2. Pourianfar, H. R., Javadi, A., Grollo, L. A colorimetric-based accurate method for the determination of enterovirus 71 titer. Indian J Virol. 23 (3), 303-310 (2012).
  3. Hochdorfer, D., Businger, R., Hotter, D., Seifried, C., Solzin, J. Automated, label-free TCID50 assay to determine the infectious titer of virus-based therapeutics. J Virol Methods. 299, 114318(2022).
  4. Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the Calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virol Sin. 36 (1), 141-144 (2021).
  5. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (17), 7896-7900 (1991).
  6. Atienza, J. M., et al. Dynamic and label-free cell-based assays using the real-time cell electronic sensing system. Assay Drug Dev Technol. 4 (5), 597-607 (2006).
  7. Cheung, C. Y., Leung, C. K., Peiris, J. S. Potential of the real-time and label-free cell sensor impedance technology to transform cell-based infectivity assays for influenza viruses. Influenza Other Respir Viruses. 5 (Suppl 1), 151-154 (2011).
  8. Ebersohn, K., Coetzee, P., Venter, E. H. An improved method for determining virucidal efficacy of a chemical disinfectant using an electrical impedance assay. J Virol Methods. 199, 25-28 (2014).
  9. Goh, V. S. L., et al. Evaluation of three alternative methods to the plaque reduction neutralizing assay for measuring neutralizing antibodies to dengue virus serotype 2. Virology J. 21 (1), (2024).
  10. Crisostomo, L., Soriano, A. M., Mendez, M., Graves, D., Pelka, P. Temporal dynamics of adenovirus 5 gene expression in normal human cells. PLOS One. 14 (1), e0211192(2019).
  11. Wang, T. E., et al. Differentiation of cytopathic effects (CPE) induced by influenza virus infection using deep convolutional neural networks (CNN). PLoS Comput Biol. 16 (5), e1007883(2020).
  12. Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochem Biophys Res Commun. 401 (1), 37-41 (2010).
  13. Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. J Virol Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
  14. Marlina, S., Shu, M. -H., Abubakar, S., Zandi, K. Development of a real-time cell analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasites & Vectors. 8 (1), (2015).
  15. Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. J Virol Methods. 252, 57-64 (2018).
  16. Lebourgeois, S., et al. Development of a real-time cell analysis (RTCA) method as a fast and accurate method for detecting infectious particles of the adapted strain of Hepatitis A virus. Front Cell Infect Microbiol. 8, (2018).
  17. Suryadevara, N., et al. Real-time cell analysis: A high-throughput approach for testing SARS-CoV-2 antibody neutralization and escape. STAR Protoc. 3 (2), 101387(2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pomiar impedancjimonitorowanie w czasie rzeczywistymefekt cytopatycznytest bez u ycia znacznik wseryjne rozcie czanie wirusazautomatykowana kwantyfikacja wirusakom rki HEK293Akom rki MDCK
Uproszczony, bezoznakowy, w czasie rzeczywistym 50% testu zakaźnego hodowli tkanek (TCID50) z impedancją do automatycznego ilościowania miana wirusowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.