Testy behawioralne do optogenetycznej manipulacji obwodami neuronalnymi u Drosophila melanogaster

Ainul Huda; Thomas J. Vaden; Hua Bai; Riley T. Rawls; Rebecca J. Peppers; Charlotte F. Monck; Henry D. Holley; Allison N. Castaneda; Lina Ni

doi:10.3791/67964

Artykuł metodologiczny

Testy behawioralne do optogenetycznej manipulacji obwodami neuronalnymi u Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/67964

⸱

7 lutego 2025

Ainul Huda^*¹ , Thomas J. Vaden^*¹ , Hua Bai¹ , Riley T. Rawls¹ , Rebecca J. Peppers² , Charlotte F. Monck¹ , Henry D. Holley¹ , Allison N. Castaneda¹^,³ , Lina Ni¹

¹School of Neuroscience, Virginia Tech, ²Academy of Integrated Science, Virginia Tech, ³Fairfax County Public Schools, Westfield High School

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia metody manipulacji optogenetycznej u Drosophila melanogaster, wykorzystując CsChrimson i GtACR2 do aktywacji i wyciszania określonych neuronów. Opisano cztery eksperymenty wykorzystujące optogenetykę do badania zachowań termotaktycznych i smakowych, dostarczając wglądu w podstawowe mechanizmy neuronalne rządzące tymi procesami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetyka stała się podstawową techniką w neurobiologii, umożliwiając precyzyjną kontrolę aktywności neuronalnej poprzez stymulację światłem. W niniejszym badaniu przedstawiono łatwe do wdrożenia konfiguracje do stosowania metod optogenetycznych u Drosophila melanogaster. Dwa narzędzia optogenetyczne, CsChrimson, kanał kationowy aktywowany światłem czerwonym i GtACR2, kanał anionowy aktywowany światłem niebieskim, zastosowano w czterech podejściach eksperymentalnych. Trzy z tych podejść obejmują eksperymenty na pojedynczej muchy: (1) optogenetyczny test preferencji położeniowej termotaktycznej światła niebieskiego ukierunkowany na wrażliwe na temperaturę komórki grzewcze, (2) test preferencji pozycyjnej optogenezy światła czerwonego aktywujący neurony wyczuwające gorycz oraz (3) test odpowiedzi na rozszerzenie trąbki aktywujący neurony wyczuwające słodycze. Czwarte podejście (4) to konfiguracja labiryntu much w celu oceny zachowań unikających przy użyciu wielu much. Możliwość manipulowania aktywnością neuronalną w czasie i przestrzeni oferuje potężny wgląd w przetwarzanie sensoryczne i podejmowanie decyzji, podkreślając potencjał optogenetyki w pogłębianiu naszej wiedzy na temat funkcji neuronalnych. Metody te zapewniają dostępne i solidne ramy dla przyszłych badań w neuronauce w celu lepszego zrozumienia określonych ścieżek neuronowych i ich wyników behawioralnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetyka pojawiła się jako potężna technika łącząca optykę i genetykę w neurobiologii, zapewniająca precyzyjną, nieinwazyjną kontrolę nad aktywnością neuronalną poprzez stymulację światłem¹. W Drosophila melanogaster, szeroko stosowanym organizmie modelowym, narzędzia optogenetyczne umożliwiają aktywację i hamowanie określonych neuronów, umożliwiając naukowcom modulowanie obwodów neuronalnych. Wśród zastosowanych narzędzi CsChrimson i GtACR (rodopsyny kanału anionowego Guillardia theta) zapewniają uzupełniające się podejścia do celowania neuronalnego. CsChrimson kanałrrodopsyna, wrażliwy na światło czerwone kanał kationowy z zielonych alg, ułatwia aktywację neuronów poprzez depolaryzację pod wpływem światła czerwonego, ze szczytową aktywacją przy około 590 nm². CsChrimson oferuje lepszą penetrację tkanek niż poprzednie rodopsyny kanałowe i redukuje artefakty behawioralne wywołane światłem w badaniach Drosophila². Natomiast GtACR, który obejmuje warianty takie jak GtACR2, jest kanałem chlorkowym bramkowanym światłem, który wycisza neurony poprzez hiperpolaryzację³^,⁴. GtACR2 przewodzi aniony i jest aktywowany przez niebieskie światło z aktywacją szczytową około 470 nm⁴. CsChrimson i GtACR2 są aktywowane przez różne długości fal świetlnych, zapewniając precyzyjną i niezależną kontrolę aktywności neuronalnej bez aktywacji krzyżowej⁵.

Drosophila jest skutecznym modelem do badań neurobiologicznych ze względu na swoją opłacalność, łatwość hodowli i silne reakcje behawioralne na bodźce środowiskowe, w tym zachowania atrakcyjne i unikające⁶. Jego niewielki rozmiar i półprzezroczysty naskórek zwiększają przenikanie światła, zwłaszcza światła czerwonego o dużej długości fali, umożliwiając skuteczną manipulację optogenetyczną⁷^,⁸. Podczas gdy komórki Drosophila nie są w stanie wyprodukować wystarczającej ilości siatkówki, kluczowego kofaktora dla funkcjonalności rodopsyn kanałowych, dodanie siatkówki do ich diety kompensuje to ograniczenie, zapewniając skuteczną aktywację narzędzi optogenetycznych⁹.

Aby zbadać efekty manipulacji optogenetycznej u Drosophila, opisujemy cztery eksperymenty ukierunkowane na różne obwody neuronalne i zachowania, z których każdy wykorzystuje różne metody do oceny unikania lub atrakcyjnych odpowiedzi, począwszy od testów na pojedynczej muchy, a skończywszy na ocenach grupowych. Komórki grzewcze (HC) u Drosophila to neurony termoczuciowe zlokalizowane w arista, reagujące na wzrost temperatury¹⁰. Te neurony wyrażają wrażliwe na ciepło kanały jonowe, które wyzwalają zachowanie unikające, kierując muchy z dala od źródeł ciepła¹⁰^,¹¹. W podejściu 1 zastosowaliśmy optogenetyczny test preferencji położeniowej termotaktycznej w świetle niebieskim w celu manipulowania neuronami HC. Poprzez ekspresję GtACR2 w tych neuronach, zahamowaliśmy ich aktywność po ekspozycji na światło niebieskie. Muchy poddano dwóm opcjom temperatury: 25 °C i 31 °C. W świetle pomieszczenia muchy omijały stronę o temperaturze 31 °C, wykazując typową reakcję termotaktyczną. Jednak aktywacja GtACR2 światłem niebieskim wyciszyła neurony HC. W rezultacie, muchy nie wykazywały znaczącej preferencji temperaturowej, co sugeruje skuteczne hamowanie optogenetyczne. Oprócz oceny funkcji neuronów czuciowych, ekspresja GtACR2 w neuronach czuciowych umożliwia podobne manipulacje optogenetyczne w celu zbadania obwodów neuronalnych niezbędnych dla określonych modalności sensorycznych⁵.

Receptor smakowy GR66a u Drosophila jest wyrażany w palpach wargowych na dystalnym końcu trąbki i na nogach, pośrednicząc w wykrywaniu gorzkiego smaku¹²^,¹³. Neurony te wyzwalają zachowania unikające w odpowiedzi na gorzkie substancje. W podejściu 2 użyliśmy testu preferencji pozycyjnej optogenetycznej dla pojedynczej muchy z czerwonym światłem, aby manipulować neuronami wykazującymi ekspresję GR66a. Poprzez ekspresję CsChrimson w tych neuronach, aktywowaliśmy je po ekspozycji na światło czerwone. Muchy umieszczono na arenie, z której jedna połowa była wystawiona na działanie czerwonego światła, a druga połowa filtrowała czerwone światło. Przy braku czerwonego światła muchy nie wykazywały preferencji. Jednak aktywacja CsChrimson światłem czerwonym stymulowała neurony wyczuwające gorycz, co skutkowało znacznym unikaniem oświetlonego obszaru, potwierdzając udaną optogenetyczną aktywację neuronów GR66a. Podobne podejścia zostały zastosowane do zidentyfikowania dalszych obwodów ogniw grzewczych wystarczających do zachowania unikania⁵.

Skupiliśmy się na optogenetycznej aktywacji zachowań apetytywnych w podejściu 3. Neurony wykazujące ekspresję GR5a, zlokalizowane w czubku smakowym na etykiecie i nogach, wykrywają cukry i kierują zachowaniami żywieniowymi. Aktywacja tych neuronów wyzwala odpowiedź na rozszerzenie trąbki (PER)¹⁴. Użyliśmy testu odpowiedzi na wydłużenie trąbki optogenetycznej w czerwonym świetle, aby aktywować neurony GR5a. Poprzez ekspresję CsChrimson w tych neuronach, stymulowaliśmy je czerwonym światłem. Muchy nie wysuwały trąbki w warunkach oświetlenia pomieszczenia. Jednak aktywacja CsChrimson światłem czerwonym doprowadziła do rozszerzenia trąbki bez słodkiego bodźca, wykazując udaną optogenetyczną aktywację neuronów GR5a. Podejście to zostało wykorzystane do zbadania obwodu neuronalnego, w tym neuronów czuciowych smakowych, neuronów projekcji smaku i neuronów ruchowych trąbki¹⁵^,¹⁶.

W podejściu 4 badaliśmy optogenetyczną aktywację zachowań unikających w grupach much, używając testu optogenetycznego labiryntu much, który był testowany na neuronach GR66a za pomocą czerwonego światła. Muchy umieszczono na przecięciu dwóch rur: jednej oświetlonej światłem czerwonym, a drugiej zacienionej. Ekspresja CsChrimson w neuronach GR66a wywołała unikanie. W przypadku braku czerwonego światła, muchy nie wykazywały preferencji, ale aktywacja czerwonego światła doprowadziła do ekspresji GR66a, aby uniknąć czerwonego światła, co sugeruje pomyślną aktywację szlaku. Testy labiryntu much są szeroko stosowane do badania różnych modalności sensorycznych, w tym temperatury, wilgotności i węchu. W połączeniu z optogenetyką, podejście to jest skuteczne w badaniu zarówno zachowań atrakcyjnych, jak i unikających¹⁷^,¹⁸^,¹⁹.

Te metody dostarczają powtarzalnego szkieletu do badania optogenetycznej aktywacji i hamowania obwodów nerwowych Drosophila. Wykorzystując kombinację różnych rodopsyn kanałowych i dostępnych testów behawioralnych, to badanie potwierdzające słuszność koncepcji pokazuje skuteczność manipulacji optogenetycznej, dostarczając prostych metod manipulowania funkcjami obwodów nerwowych z potencjalnymi szerszymi zastosowaniami w badaniach neurobiologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Szczepy, hodowla much i aspirator muchy

Szczepy i utrzymanie
1. Szczepy użyte w eksperymentach to HC-Gal4¹⁰, Gr5a-Gal4²⁰ (Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC): 57592), Gr66a-Gal4²¹ (BDSC: 57670), UAS-GtACR2³, UAS-CsChrimson² (BDSC: 55136). Tył leci w temperaturze 25 °C na standardowym podłożu z mąki kukurydzianej w 12-godzinnym cyklu światła:12-godzinny cykl ciemny.
  UWAGA: 1 l pożywki z mąki kukurydzianej zawiera 1 l dH₂O, 79 g dekstrozy, 7,5 g agaru, 24 g płatków drożdżowych, 57 g mąki kukurydzianej, 2,1 g metylo-4-hydroksybenzoesanu (rozpuszczonego w 11,1 ml etanolu), 6 g czterowodnego winianu sodu potasu i 0,9 g chlorku wapnia.
Hodowla much i przygotowanie doświadczalne
1. Sortuj muchy w wieku od 0 do 3 dni. Do czasu eksperymentów muszki będą miały od 3 do 6 dni, zapewniając spójność związaną z wiekiem (Rysunek 1A).
2. Podziel każdy genotyp na cztery grupy na 3 dni przed przeprowadzeniem eksperymentów: ATR w pomieszczeniu -, ATR w świetle pomieszczenia +, ATR w świetle czerwonym lub niebieskim -oraz ATR w świetle czerwonym lub niebieskim +.
3. Przygotować roztwór podstawowy ATR o stężeniu 80 mM, rozpuszczając ATR w 100% etanolu. Uzupełnij karmę o 400 μM ATR do grup ATR+.
4. Uzupełnij karmę o tym samym stężeniu etanolu, ale bez ATR, do grup ATR.
5. Umieść wszystkie grupy w ciemności²².
6. Starve Gr5a>CsChrimson leci przez 16-24 godziny w fiolkach zawierających tylko wilgotną tkankę. Fiolki ATR + zawierają 400 μM ATR zmieszanego z wodą, podczas gdy ATR - fiolki zawierają dH₂O zmieszane z tym samym stężeniem etanolu.
Aspirator muchowy
1. Zmontuj aspirator muchowy (Rysunek 1B) za pomocą plastikowej rurki, siatki przeciw owadom i dwóch pipet transferowych o pojemności 3 ml.
2. Odetnij końcówki i gruszki pipet transferowych, upewniając się, że końcówka ssąca muchy umożliwia wygodne przejście muchy. Taka konstrukcja umożliwia delikatne zasysanie much poprzez wdychanie, minimalizując szkody i ułatwiając sprawne zbieranie i przenoszenie pojedynczych much.
3. Ułóż siatkę przeciw owadom na plastikowej rurce i przymocuj końcówki gruszki pipety do rurki za pomocą Parafilm.

2. Optogenetyczny termotaktyczny test preferencji pozycyjnej pojedynczej muchy

Szczepy Drosophila i hodowla much
1. Krzyż HC-Gal4¹⁰ linii sterownika do UAS-GtACR2³, co daje eksperymentalny genotyp HC>GtACR2. HC>GtACR2 muchy wyrażają GtACR2 w ogniwach grzewczych.
  UWAGA: Upewnij się, że dla każdego warunku użyto równej liczby much męskich i żeńskich.
Przygotowanie i wykonanie testu eksperymentalnego
1. Wyrównaj dwie stalowe płyty na oddzielnych płytach grzejnych, tak aby ich krawędzie się stykały. Umieść plastikową osłonę arkusza na górze, zabezpieczając ją taśmą, aby zminimalizować ruch. Umieść kawałek białego papieru na ochraniaczu arkusza, aby zredukować sygnały szumów tła (Rysunek 1C).
  UWAGA: Wymień białą papier na początku każdego eksperymentu lub po zabrudzeniu.
2. Umieść przezroczystą plastikową okładkę (2 mm wysokości × 58 mm szerokości × 83 mm długości) na białym papierze. Ta osłona pozwala muchy swobodnie chodzić, jednocześnie zapobiegając jej lataniu.
3. Wytnij otwór na dnie pudełka z pianki polistyrenowej (27 cm wysokości × 22 cm szerokości × 16 cm długości), aby przylegał do kamery i niebieskiego światła (1000 mA) około 12 cm nad powierzchnią eksperymentalną.
4. Ustaw kamerę i niebieskie światło, aby zminimalizować odblaski podczas włączania aktywacji.
  UWAGA: W celu określenia zakresu aktywacji niebieskiego światła może być wymagany test wstępny.
5. Ustaw kamerę tak, aby nagrywała z następującymi ustawieniami: 1 s timelapse, wąskie pole, 4000 × 3000 pikseli.
6. Dostosuj ustawienia płyty grzejnej, aby utrzymać temperaturę powierzchni 25 ± 1 °C i 31 ± 1 °C na odpowiednich płytach stalowych.
  UWAGA: W warunkach wymagających temperatur poniżej 25 °C konieczne są alternatywne metody chłodzenia, takie jak urządzenia Peltiera lub lód. Jeśli temperatura blach stalowych przekroczy pożądany poziom, spryskaj powierzchnię wodą destylowaną, aby osiągnąć i utrzymać wymagane warunki. Następnie użyj serwetki, aby wchłonąć nadmiar wilgoci z plastikowej osłony arkusza.
7. Przed i po każdej próbie monitoruj temperaturę za pomocą sondy temperatury powierzchni.
  UWAGA: Precyzyjna kontrola temperatury ma kluczowe znaczenie, ponieważ wahania mogą wpływać na wyniki.
8. Umieść plastikową osłonę po stronie 25 °C. Za pomocą aspiratora muchowego delikatnie wypuść pojedynczą muchę pod pokrywę. Umieść pudełko nad obszarem eksperymentalnym, aby wytworzyć przyćmione światło (<10 luksów) i pozwól muszce zaaklimatyzować się przez 1 minutę.
9. Po okresie aklimatyzacji podnieś pudełko i szybko wyreguluj plastikową pokrywę, ustawiając ją tak, aby środek pokrywy był wyrównany z granicą płyty stalowej, aby zapewnić równomierne pokrycie boków 25 °C i 31 °C.
  UWAGA: Podczas tego procesu temperatura powietrza i temperatura wewnątrz pokrywy po stronie 31 °C wzrastają do około 27 °C w ciągu 5 sekund (rysunek uzupełniający 1), co jest wystarczające do aktywacji ogniw grzewczych¹¹.
10. Rozpocznij próbę, włączając kamerę i niebieskie światło (20 kLux).
  UWAGA: Nie włączaj niebieskiego światła w warunkach oświetlenia pomieszczenia. Włącz aparat i nagraj kilka klatek, zanim włączysz niebieskie światło w przypadku ruchu.
11. Po upływie ponad 2 minut zakończ próbę, wyłączając kamerę i światło. Usuń muchy za pomocą aspiratora.
  UWAGA: Nagraj kilka dodatkowych klatek w przypadku ruchu po wyłączeniu aparatu.
Analiza behawioralna i statystyczna
1. Analizuj tylko dane od much, które pozostają po stronie 25 °C na początku próby.
  UWAGA: Odrzuć dane z much rozpoczynających próby po stronie 31 °C, które często wykazują zmienione preferencje²³. Odrzuć próby z udziałem much, które nie zbliżają się do krawędzi strony o temperaturze 31 °C, upewniając się, że dokonały wyboru między temperaturami. Odrzuć dane od much, które pozostają nieruchome przez ponad 30 sekund.
2. Przeanalizuj wyniki, korzystając z procedur opisanych wcześniej²³. Oblicz wskaźnik preferencji (PI) jako stosunek różnicy czasu, jaki mucha spędziła w każdej strefie temperatury, do czasu całkowitego, jak pokazano w poniższym wzorze:
  
  UWAGA: Szczegóły statystyczne dotyczące eksperymentów znajdują się w legendach rycin. Analiza danych odbywa się za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy danych.

3. Test preferencji pozycyjnej optogenezy dla pojedynczej muchy na czerwonym świetle

Szczepy Drosophila i hodowla much
1. Przekroczyć linię sterownika Gr66a-Gal4²¹ do UAS-CsChrimson², co daje eksperymentalny genotyp Gr66a>CsChrimson. Muchy Gr66a>CsChrimson wyrażają CsChrimson w neuronach o gorzkim smaku.
  UWAGA: Upewnij się, że dla każdego warunku użyto równej liczby much męskich i żeńskich.
Przygotowanie i wykonanie testu eksperymentalnego
1. Przeprowadź test w ciemnym pomieszczeniu lub zaciemnionym otoczeniu, aby zapewnić kontrolowaną aktywację CsChrimson (Rysunek 1D).
2. Umieść kamerę około 45 cm nad powierzchnią doświadczalną.
  1. Używaj kamery bez filtra podczerwieni. Jeśli kamera jest wyposażona w wewnętrzny krótkoprzepustowy filtr podczerwieni, który blokuje fale dłuższe niż 700 nm, należy go wyjąć.
  2. Przyklej filtr długoprzepustowy 830 nm do soczewki za pomocą super kleju, aby uchwycić długości fal podczerwonych. Ta regulacja jest niezbędna do rejestrowania ruchu much w warunkach światła podczerwonego.
3. Umieść źródło światła czerwonego²⁴ około 45 cm nad powierzchnią eksperymentalną, zapewniając natężenie światła około 2,5 kLux (1,000 mA).
  UWAGA: Zalecana jest odpowiednia ochrona oczu, która może odfiltrować czerwony laser/światło. Laserowe okulary ochronne pomagają zapobiegać potencjalnym uszkodzeniom oczu spowodowanym bezpośrednią ekspozycją na intensywne czerwone światło.
4. Użyj światła podczerwonego, aby zwizualizować muchy w konfiguracji. Utrzymuj go włączonego przez cały czas trwania eksperymentu.
  UWAGA: Unikaj oślepiania w obszarze eksperymentalnym spowodowanego światłem podczerwonym; Odblaski mogą komplikować analizę danych.
5. Użyj kleju, aby przymocować filtr długoprzepustowy podczerwieni 780 nm do połowy plastikowej osłony.
  UWAGA: Użyj dowolnego filtra długoprzepustowego, który blokuje długości fal poniżej 780 nm. Strona bez filtra przepuszcza światło czerwone i podczerwień, podczas gdy strona filtrowana przepuszcza tylko światło podczerwone.
6. Umieść matowy materiał pod obszarem eksperymentu, aby zminimalizować szumy tła.
7. Umieść pojedynczą muchę pod przezroczystą plastikową osłoną (2 mm wysokości × 58 mm szerokości × 83 mm długości) za pomocą aspiratora muchy i pozwól jej zaaklimatyzować się przez 1 minutę.
8. Poczekaj, aż mucha będzie widoczna po stronie niefiltrowanej. Rozpocznij próbę, włączając kamerę i zapalając czerwone światło.
  UWAGA: Kamera jest podatna na ruch natychmiast po uruchomieniu. Dokładnie zabezpiecz kamerę podczas nagrywania i włącz kamerę na kilka sekund przed nagrywaniem, aby uniknąć nieprawidłowych ruchów, które mogą skomplikować analizę. Nie włączaj czerwonego światła do momentu rozpoczęcia próby.
9. Rejestruj ruch muchy przez 1 min.
  UWAGA: Odrzuć próby, w których mucha nie zbliża się do linii środkowej lub nie porusza się przez więcej niż 15 sekund.
10. Po upływie 1 minuty zakończ próbę, wyłączając kamerę i światło. Usuń muchy za pomocą aspiratora.
  UWAGA: Nagraj kilka dodatkowych klatek, aby uniknąć efektów ruchu po wyłączeniu aparatu.
Analiza behawioralna i statystyczna
1. Przeanalizuj wyniki, korzystając z procedur opisanych wcześniej²³. Oblicz wskaźnik preferencji (PI) jako stosunek różnicy czasu spędzonego przez muchę na obszarze bez filtra i obszarze z filtrem do czasu całkowitego, jak pokazano według następującego wzoru:
  
  UWAGA: Szczegóły statystyczne dotyczące eksperymentów znajdują się w legendach rycin. Analiza danych odbywa się za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy danych.

4. Odpowiedź na rozszerzenie trąbki optogenetycznej czerwonego światła

Szczepy Drosophila i hodowla much
1. Skrzyżuj linię sterownika Gr5a-Gal4²⁰ do UAS-CsChrimson², co daje eksperymentalny genotyp określany jako Gr5a>CsChrimson. Muchy Gr5a>CsChrimson wyrażają CsChrimson w neuronach receptorów słodkiego smaku.
  UWAGA: Upewnij się, że dla każdego warunku użyto równej liczby much męskich i żeńskich.
2. Głodze muchy przez 16-24 godziny z ATR (ATR +) lub bez (ATR -) przed testem.
  UWAGA: Dłuższe okresy głodu mogą być wymagane do wywołania silnej reakcji.
Przygotowanie i wykonanie testu eksperymentalnego
1. Znieczulenie much poprzez chłodzenie na lodzie (Rysunek 1E).
  UWAGA: Unikaj bezpośredniego kontaktu much z lodem. Ogranicz czas schładzania do około 1 minuty; Długotrwałe chłodzenie może powodować problemy z regeneracją i śmiertelność.
2. Użyj końcówki pipety o pojemności 1000 μl, aby nałożyć 7-10 małych kropek kleju na szkiełka podstawowe.
  UWAGA: Małe krople kleju na szkiełku zapewniają, że mucha nie zostanie zanurzona i zapobiegają przywieraniu kleju do trąbki lub nóg.
3. Umieść jedną muchę, brzuszną stroną do góry, na każdej kropce kleju. Upewnij się, że klatka piersiowa i skrzydła stykają się z klejem, aby zminimalizować ruch. Przechyl skrzydła na każdą stronę, aby zwiększyć powierzchnię kleju.
  UWAGA: Unikaj umieszczania much zbyt blisko siebie, ponieważ mogą one przypadkowo aktywować wiele much podczas ekspozycji na światło.
4. Pozostaw klej do wyschnięcia na około 10 minut.
5. Przenieś szkiełka do pojemnika na wilgoć (plastikowego pudełka z mokrymi ręcznikami papierowymi) i pozwól muchom dojść do siebie przez 2 godziny.
6. Umieść szkiełko pod mikroskopem. Użyj strzykawki, aby dostarczyć kroplę wody, aby nasycić muchy, zapobiegając rozszerzeniu się trąbki wywołanemu pragnieniem.
7. Ręcznie przytrzymaj czerwony wskaźnik laserowy, aby świecić czerwonym światłem na trąbkę/głowę pojedynczej muchy (700 luksów), obserwując odpowiedź PER przez mikroskop.
  UWAGA: Ochrona oczu, która może odfiltrować czerwony laser/światło, jest niezbędna podczas obserwacji czerwonego światła przez mikroskop.
8. Obserwuj i rejestruj przedłużenie trąbki w ciągu 30 sekund. Oceń każdą muchę za pomocą następującego systemu nagrywania: 0 oznacza brak przedłużenia, 0,5 oznacza wydłużenie 1-2 s, 1 oznacza, że wydłużenie trwa ponad 3 s.
9. Po przetestowaniu wywołanego światłem wydłużenia trąby, zbadaj reakcję na 4% sacharozy za pomocą strzykawki. Usunąć kroplę sacharozy na końcu igły i zbliżyć ją do trąbki muchowej.
  UWAGA: Wyrzuć dane od much, które nie reagują na kropelkę sacharozy.
Analiza behawioralna i statystyczna
1. Wykonuj analizę statystyczną za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy danych.
  UWAGA: Szczegóły statystyczne dotyczące eksperymentów znajdują się w legendach rycin.

5. Test labiryntu optogenetycznego dla much czerwonych latarni

Szczepy Drosophila i hodowla much
1. Przekroczyć linię sterownika Gr66a-Gal4²¹ do UAS-CsChrimson², co daje eksperymentalny genotyp Gr66a>CsChrimson. Muchy Gr66a>CsChrimson wyrażają CsChrimson w neuronach o gorzkim smaku.
  UWAGA: Upewnij się, że każda grupa zawiera równą liczbę samców i samic much.
Montaż labiryntu muchowego
1. Zrób labirynt much, jak pokazano na Rysunek 1F.
  UWAGA: Alternatywnie, wydrukuj w 3D elementy labiryntu much, składając je zgodnie z wcześniej szczegółowymi szczegółami²⁵.
2. Przytnij trzy plastikowe probówki hodowlane o pojemności 5 ml na odpowiednią długość, aby uzyskać probówkę ładującą, odkrytą przezroczystą probówkę testową i probówkę testową pokrytą folią. Przymocuj rurki do labiryntu much, jak pokazano na Rysunek 1F.
  1. W zależności od materiału labiryntu, przytnij rurki testowe, aby zapewnić równą odległość dla każdego warunku testowego. W zależności od długości komory przetrzymującej, skróć odkrytą probówkę testową w przezroczystym labiryncie, jednocześnie skracając rurkę testową pokrytą folią, jeśli labirynt jest nieprzezroczysty.
Przygotowanie i wykonanie testu eksperymentalnego
1. W ciemności lub przy słabym oświetleniu umieść 10 samców i 10 samic w rurze ładującej. Podłączyć rurkę załadowczą do komory przetrzymującej. Przechyl windę i delikatnie postukaj w rurkę, aby przenieść muchy do komory przetrzymywania.
  UWAGA: Opuść podnośnik tak, aby otwarta była tylko połowa komory przetrzymania. Ta manipulacja ułatwia przenoszenie much z rury ładującej do komory przetrzymywania.
2. Po przeniesieniu much do komory przetrzymywania użyj windy, aby opuścić muchy między rurą ładującą a otworami rurki testowej. Następnie wyjmij rurkę ładującą.
3. Ustaw labirynt muchowy w odległości około 13 cm od źródła światła czerwonego (1000 mA) bez włączania światła.
4. Opuść windę, aż komora trzymająca zrówna się z otworami probówek testowych, umożliwiając muchom swobodne poruszanie się między owinięta folią a odkrytą probówką probówki. W tym samym czasie włącz czerwone światło, aby aktywować CsChrimson. Upewnij się, że natężenie światła czerwonego na powierzchni odkrytej probówki wynosi około 40 kLux.
  UWAGA: Nie włączaj czerwonego światła, dopóki komora trzymania nie zostanie opuszczona i wyrównana z otworami probówek. Ze względu na intensywną jasność czerwonego światła zalecana jest odpowiednia ochrona oczu, która może odfiltrować czerwony laser/światło.
5. Muchy wybierają między rurką naświetlaną na czerwone światło a rurką zacienioną przez jedną minutę.
6. Po 1 minutach podnieś podnośnik między rurą załadowczą a otworami rury testowej. Policz muchy w każdej tubie.
  UWAGA: Liczone są tylko aktywne i nieranne muchy.
7. Wyczyść windę lotniczą i labirynt muchowy za pomocą dH₂O po każdej próbie.
Analiza danych i statystyki
1. Obliczyć wskaźnik preferencji (PI) jako stosunek różnicy w liczbie much między rurkami odkrytymi i zakrytymi do całkowitej liczby much, jak pokazano według następującego wzoru:
  
  UWAGA: Szczegóły statystyczne dotyczące eksperymentów znajdują się w legendach rycin. Analiza danych odbywa się za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy danych

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednolotowy optogenetyczny termotaktyczny test preferencji pozycyjnej światła niebieskiego
Badano cztery warunki: światło w pomieszczeniu bez suplementacji ATR (światło w pomieszczeniu, ATR -), światło w pomieszczeniu z suplementacją ATR (światło w pomieszczeniu, ATR +), światło niebieskie bez suplementacji ATR (niebieskie, ATR -) i światło niebieskie z suplementacją ATR (niebieskie, ATR +). Pierwsze trzy warunki służyły jako kontrole. W eksperymentach kontrolnych muchy unikały strony o temperaturze ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Manipulacje optogenetyczne przekształciły dziedzinę neurobiologii, umożliwiając precyzyjną kontrolę obwodów neuronalnych z dokładnością czasoprzestrzenną²⁷. Obwód neuronalny obejmuje populacje neuronów połączonych ze sobą synapsami, pełniących określone funkcje po aktywacji. Konektom całego mózgu Drosophila został ukończony, oferując kompleksowy wgląd w szlaki synaptyczne w mózgu Drosophila ^28,29. Chociaż konektom może pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów w związku z publikacją niniejszego artykułu. Wszyscy autorzy ujawnili wszelkie potencjalne konflikty i zapewniają, że nie mają żadnych powiązań finansowych ani osobistych, które mogłyby wpłynąć na pracę przedstawioną w tym badaniu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematy ideowe dla wszystkich rysunków zostały stworzone za pomocą Biorender.com. Praca ta była wspierana przez NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) do L.N. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowywaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sterownik LED 1000 mA	Luxeon Star	3021-D-E-1000
5 ml Probówki hodowlane VWR, plastikowe, z dwupozycyjnymi nasadkami Filtr	VWR	60818-664
780 / IR 780 nm 100 mm x 100 mm	Lee Filters	BH #LE8744	Przycięte do około 47 x 100 pasuje do plastikowej osłony
Agfabric 6,5 stopy x 15 stóp Siatka na owady Siatka ogrodowa do ochrony roślin Warzywa Kwiaty Owoce	Home Depot	EIBNW6515
Wszystkie trans siatkówkowe	Aluminiowa płyta Sigma-Aldrich	116-31-4
(30,5 cm x 30,5 cm x 0,6 cm)	Amazon		zakupiony od Amazon
Czarne plastikowe pudełko	LI-COR	929-97101
CHLOREK WAPNIA ANHYDRO 25GR	Thermo Fisher Scientific
CX405 Kamera ręczna z przetwornikiem CMOS Exmor R	SONY	HDR-CX405
s “ Klej szkolny"	Elmer
, czysty (200 proof)	Sigma-Aldrich	E7023
Mieszadło do gorącej płyty Fisherbrand Isotemp	Fisher Scientific	SP88850200
Linia muchowa: Gr5a-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	57592
Linia muchowa: Gr66a-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	57670
Linia muchowa: HC-Gal4 (II)	Dr. Marco Gallio Lab		Miły prezent
Linia muchowa: UAS-CsChrimson	Bloomington Drosophila Stock Center	55136
Linia muchowa: UAS-GtACR2/TM6B	Dr. Quentin Gaudry Lab		Miły prezent
Flystuff 62-101 Żółta mąka kukurydziana (11,3 kg), żółta, 11,3 kg / jednostkę	Genesee Scientific	62-101
Flystuff 62-107 Nieaktywne suche drożdże, 10 kg, płatki odżywcze, 10 kg/jednostkę	Genesee Scientific	62-107
Flystuff 66-103 Nutri-Fly Drosophila Agar, Gelidium, 100 mesh, 5 kg (11,02 lbs)/szt.	Genesee Scientific	66-103
FreeMascot OD 8+ 190 nm– 420 nm / 600 nm– Długość fali 1100 nm Fioletowe / czerwone / podczerwone laserowe okulary ochronne	Bezpłatna maskotka	B08LGMQ65S	zakupiony od Amazon
GoPro Hero8 Black	GoPro	6365359
filtry LEE 100 i razy; 100 mm Infra Red #87 Filtr poliestrowy na podczerwień	B& H Photo	LE8744
Filtr długoprzepustowy, kolorowe szkło, 50.8 x 50.8 mm, 830 nm Cut-on, RG830	Newport	FSQ-RG830
4-hydroksybenzoesan metylu, 99%, Thermo Scientific Chemicals	Thermo Fisher Scientific
MicroWell Mini Taca 60 dołków, niskoprofilowa NS PS	Thermal Scientific	NUNC 439225	Pokrywki są używane jako "plastikowa osłona"
Olympus Plastics 24-160RS, 1000 i mikro; L Ergonomiczne końcówki do pipet Olympus Low Binding, Racked, Sterylne, 8 stojaków po 96 końcówek/jednostkę	Eppendorf	24-160RS
Parafilm M Folia uszczelniająca	Heathrow Scientific	HS234526B	4 cale x 125 stóp
Chlorek potasu, ACS, 99,0-100,5%,	Thermo Fisher Naukowy
Prism	GraphPad	Version 9	oprogramowanie do analizy danych
Samco Pipety z podziałką	Thermo Fisher Scientific	225	Szkiełka podstawowe 3 ml
	Fisher Scientific	12-544-2	5 mm x 75 mm x 1,0 mm
Mikroskop stereoskopowy	OLYMPUS	CZ61
Pudełko styropianowe (27 cm wysokości i razy; 22 cm szerokości i razy 16 cm długości)
Sacharoza	Fisher Scientific	225911
Sonda temperatury powierzchni	Fluke	80PK-3A
Strzykawka	BD Integra	305270
Tate & Lyle 457 Dekstroza, Tate & Lyle, Pow, Tate & Lyle 457 Dekstroza, Tate & Lyle, proszek, 50 funtów / jednostkę	Genesee Scientific	62-113
Identyfikowalny kalibrowany termometr termoparowy z dużymi cyframi	Identyfikowalny przez cple-parmer	UX-91210-07	Fisherbrand Identable BigDigit Type K Termometr
Potrójne niebieskie diody LED na prawą burtęDostawa		07007-PB000-D	470 nm
Potrójna czerwona dioda LED na prawą burtęZasilacz		07007-PD000-F	627 nm
Przezroczysta rurka PVC Tygon 1/4" ID, 3/8" OD, 5 stóp Długość	Firma zaopatrzeniowa McMaster Carr	6516T21
Oświetlacz podczerwieni Univivi, 850nm 12 diod LED Szerokokątny oświetlacz podczerwieni do noktowizora	Univivi	4331910725
Wakefield Termiczny okrągły radiator 25,4 mm Gwiazda LED - 882-100AB	Wakefield-Vette	882-100AB
Bezprzewodowy prezenter	DinoFire Store	B01410YNAM	zakupiony w Amazon

długoprzepustowy AC297150250Alkohol etylowy 126960025AA1159530

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
Mauss, A. S., Busch, C., Borst, A. Optogenetic neuronal silencing in drosophila during visual processing. Sci Rep. 7 (1), 13823(2017).
Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Neuroscience. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
Castaneda, A. N., et al. Functional labeling of individualized postsynaptic neurons using optogenetics and trans-tango in drosophila (flipsot). PLoS Genet. 20 (3), e1011190(2024).
Fischer, F. P., et al. Drosophila melanogaster as a versatile model organism to study genetic epilepsies: An overview. Front Mol Neurosci. 16, 1116000(2023).
Aragon, M. J., et al. Multiphoton imaging of neural structure and activity in drosophila through the intact cuticle. Elife. 11, e69094(2022).
Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of drosophila behaviors through channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. Eur J Neurosci. 26 (9), 2405-2416 (2007).
Kono, M., Goletz, P. W., Crouch, R. K. 11-cis- and all-trans-retinols can activate rod opsin: Rational design of the visual cycle. Biochemistry. 47 (28), 7567-7571 (2008).
Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the drosophila brain. Cell. 144 (4), 614-624 (2011).
Ni, L., et al. A gustatory receptor paralogue controls rapid warmth avoidance in drosophila. Nature. 500 (7464), 580-584 (2013).
Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of drosophila. J Neurosci. 34 (21), 7148-7164 (2014).
Dethier, V. G. The Hungry Fly: A Physiological Study of the Behavior Associated with Feeding. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1976).
Shiu, P. K., Sterne, G. R., Engert, S., Dickson, B. J., Scott, K. Taste quality and hunger interactions in a feeding sensorimotor circuit. Elife. 11, e79887(2022).
Kim, H., Kirkhart, C., Scott, K. Long-range projection neurons in the taste circuit of drosophila. Elife. 6, e23386(2017).
Sayeed, O., Benzer, S. Behavioral genetics of thermosensation and hygrosensation in drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 6079-6084 (1996).
Coya, R., Martin, F., Calvin-Cejudo, L., Gomez-Diaz, C., Alcorta, E. Validation of an optogenetic approach to the study of olfactory behavior in the t-maze of drosophila melanogaster adults. Insects. 13 (8), 662(2022).
Chu, L. A., Tai, C. Y., Chiang, A. S. Thirst-driven hygrosensory suppression promotes water seeking in drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (34), e2404454121(2024).
Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. Drosophila gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (Suppl 2), 14526-14530 (2003).
Dunipace, L., Meister, S., Mcnealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the drosophila gustatory system. Curr Biol. 11 (11), 822-835 (2001).
Ratnayake, K., et al. Blue light excited retinal intercepts cellular signaling. Sci Rep. 8 (1), 10207(2018).
Huda, A., Omelchenko, A. A., Vaden, T. J., Castaneda, A. N., Ni, L. Responses of different drosophila species to temperature changes. J Exp Biol. 225 (11), jeb243708(2022).
Tyrrell, J. J., Wilbourne, J. T., Omelchenko, A. A., Yoon, J., Ni, L. Ionotropic receptor-dependent cool cells control the transition of temperature preference in drosophila larvae. PLoS Genet. 17 (4), e1009499(2021).
Fu, Z., Huda, A., Kimbrough, I. F., Ni, L. Using drosophila two-choice assay to study optogenetics in hands-on neurobiology laboratory activities. J Undergrad Neurosci Educ. 22 (1), A45-A50 (2023).
Joseph, R. M., Heberlein, U. Tissue-specific activation of a single gustatory receptor produces opposing behavioral responses in drosophila. Genetics. 192 (2), 521-532 (2012).
Riemensperger, T., Kittel, R. J., Fiala, A. Optogenetics in drosophila neuroscience. Methods Mol Biol. 1408, 167-175 (2016).
Dorkenwald, S., et al. Neuronal wiring diagram of an adult brain. Nature. 634 (8032), 124-138 (2024).
Schlegel, P., et al. Whole-brain annotation and multi-connectome cell typing of drosophila. Nature. 634 (8032), 139-152 (2024).
Talay, M., et al. Transsynaptic mapping of second-order taste neurons in flies by trans-tango. Neuron. 96 (4), 783-795.e4 (2017).
Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (per) assay in drosophila. J Vis Exp. (3), e193(2007).
Pulver, S. R., Hornstein, N. J., Land, B. L., Johnson, B. R. Optogenetics in the teaching laboratory: Using channelrhodopsin-2 to study the neural basis of behavior and synaptic physiology in drosophila. Adv Physiol Educ. 35 (1), 82-91 (2011).
Titlow, J. S., Johnson, B. R., Pulver, S. R. Light activated escape circuits: A behavior and neurophysiology lab module using drosophila optogenetics. J Undergrad Neurosci Educ. 13 (3), A166-A173 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Aktywacja CsChrimson inhibicja GtACR2 test preferencji pozycyjnej odruch wysuwania tr bki test labiryntowy dla muszek przetwarzanie sensoryczne

Testy behawioralne do optogenetycznej manipulacji obwodami neuronalnymi u Drosophila melanogaster

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły