Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Testy behawioralne do optogenetycznej manipulacji obwodami neuronalnymi u Drosophila melanogaster

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67964

⸱

7 lutego 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Neuroscience, Virginia Tech, 2Academy of Integrated Science, Virginia Tech, 3Fairfax County Public Schools, Westfield High School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia metody manipulacji optogenetycznej u Drosophila melanogaster, wykorzystując CsChrimson i GtACR2 do aktywacji i wyciszania określonych neuronów. Opisano cztery eksperymenty wykorzystujące optogenetykę do badania zachowań termotaktycznych i smakowych, dostarczając wglądu w podstawowe mechanizmy neuronalne rządzące tymi procesami.

Streszczenie

Optogenetyka stała się podstawową techniką w neurobiologii, umożliwiając precyzyjną kontrolę aktywności neuronalnej poprzez stymulację światłem. W niniejszym badaniu przedstawiono łatwe do wdrożenia konfiguracje do stosowania metod optogenetycznych u Drosophila melanogaster. Dwa narzędzia optogenetyczne, CsChrimson, kanał kationowy aktywowany światłem czerwonym i GtACR2, kanał anionowy aktywowany światłem niebieskim, zastosowano w czterech podejściach eksperymentalnych. Trzy z tych podejść obejmują eksperymenty na pojedynczej muchy: (1) optogenetyczny test preferencji położeniowej termotaktycznej światła niebieskiego ukierunkowany na wrażliwe na temperaturę komórki grzewcze, (2) test preferencji pozycyjnej optogenezy światła czerwonego aktywujący neurony wyczuwające gorycz oraz (3) test odpowiedzi na rozszerzenie trąbki aktywujący neurony wyczuwające słodycze. Czwarte podejście (4) to konfiguracja labiryntu much w celu oceny zachowań unikających przy użyciu wielu much. Możliwość manipulowania aktywnością neuronalną w czasie i przestrzeni oferuje potężny wgląd w przetwarzanie sensoryczne i podejmowanie decyzji, podkreślając potencjał optogenetyki w pogłębianiu naszej wiedzy na temat funkcji neuronalnych. Metody te zapewniają dostępne i solidne ramy dla przyszłych badań w neuronauce w celu lepszego zrozumienia określonych ścieżek neuronowych i ich wyników behawioralnych.

Wprowadzenie

Optogenetyka pojawiła się jako potężna technika łącząca optykę i genetykę w neurobiologii, zapewniająca precyzyjną, nieinwazyjną kontrolę nad aktywnością neuronalną poprzez stymulację światłem1. W Drosophila melanogaster, szeroko stosowanym organizmie modelowym, narzędzia optogenetyczne umożliwiają aktywację i hamowanie określonych neuronów, umożliwiając naukowcom modulowanie obwodów neuronalnych. Wśród zastosowanych narzędzi CsChrimson i GtACR (rodopsyny kanału anionowego Guillardia theta) zapewniają uzupełniające się podejścia do celowania neuronalnego. CsChrimson kanałrrodopsyna, wrażliwy na światło czerwone kanał kationowy z zielonych alg, ułatwia aktywację neuronów poprzez depolaryzację pod wpływem światła czerwonego, ze szczytową aktywacją przy około 590 nm2. CsChrimson oferuje lepszą penetrację tkanek niż poprzednie rodopsyny kanałowe i redukuje artefakty behawioralne wywołane światłem w badaniach Drosophila2. Natomiast GtACR, który obejmuje warianty takie jak GtACR2, jest kanałem chlorkowym bramkowanym światłem, który wycisza neurony poprzez hiperpolaryzację3,4. GtACR2 przewodzi aniony i jest aktywowany przez niebieskie światło z aktywacją szczytową około 470 nm4. CsChrimson i GtACR2 są aktywowane przez różne długości fal świetlnych, zapewniając precyzyjną i niezależną kontrolę aktywności neuronalnej bez aktywacji krzyżowej5.

Drosophila jest skutecznym modelem do badań neurobiologicznych ze względu na swoją opłacalność, łatwość hodowli i silne reakcje behawioralne na bodźce środowiskowe, w tym zachowania atrakcyjne i unikające6. Jego niewielki rozmiar i półprzezroczysty naskórek zwiększają przenikanie światła, zwłaszcza światła czerwonego o dużej długości fali, umożliwiając skuteczną manipulację optogenetyczną7,8. Podczas gdy komórki Drosophila nie są w stanie wyprodukować wystarczającej ilości siatkówki, kluczowego kofaktora dla funkcjonalności rodopsyn kanałowych, dodanie siatkówki do ich diety kompensuje to ograniczenie, zapewniając skuteczną aktywację narzędzi optogenetycznych9.

Aby zbadać efekty manipulacji optogenetycznej u Drosophila, opisujemy cztery eksperymenty ukierunkowane na różne obwody neuronalne i zachowania, z których każdy wykorzystuje różne metody do oceny unikania lub atrakcyjnych odpowiedzi, począwszy od testów na pojedynczej muchy, a skończywszy na ocenach grupowych. Komórki grzewcze (HC) u Drosophila to neurony termoczuciowe zlokalizowane w arista, reagujące na wzrost temperatury10. Te neurony wyrażają wrażliwe na ciepło kanały jonowe, które wyzwalają zachowanie unikające, kierując muchy z dala od źródeł ciepła10,11. W podejściu 1 zastosowaliśmy optogenetyczny test preferencji położeniowej termotaktycznej w świetle niebieskim w celu manipulowania neuronami HC. Poprzez ekspresję GtACR2 w tych neuronach, zahamowaliśmy ich aktywność po ekspozycji na światło niebieskie. Muchy poddano dwóm opcjom temperatury: 25 °C i 31 °C. W świetle pomieszczenia muchy omijały stronę o temperaturze 31 °C, wykazując typową reakcję termotaktyczną. Jednak aktywacja GtACR2 światłem niebieskim wyciszyła neurony HC. W rezultacie, muchy nie wykazywały znaczącej preferencji temperaturowej, co sugeruje skuteczne hamowanie optogenetyczne. Oprócz oceny funkcji neuronów czuciowych, ekspresja GtACR2 w neuronach czuciowych umożliwia podobne manipulacje optogenetyczne w celu zbadania obwodów neuronalnych niezbędnych dla określonych modalności sensorycznych5.

Receptor smakowy GR66a u Drosophila jest wyrażany w palpach wargowych na dystalnym końcu trąbki i na nogach, pośrednicząc w wykrywaniu gorzkiego smaku12,13. Neurony te wyzwalają zachowania unikające w odpowiedzi na gorzkie substancje. W podejściu 2 użyliśmy testu preferencji pozycyjnej optogenetycznej dla pojedynczej muchy z czerwonym światłem, aby manipulować neuronami wykazującymi ekspresję GR66a. Poprzez ekspresję CsChrimson w tych neuronach, aktywowaliśmy je po ekspozycji na światło czerwone. Muchy umieszczono na arenie, z której jedna połowa była wystawiona na działanie czerwonego światła, a druga połowa filtrowała czerwone światło. Przy braku czerwonego światła muchy nie wykazywały preferencji. Jednak aktywacja CsChrimson światłem czerwonym stymulowała neurony wyczuwające gorycz, co skutkowało znacznym unikaniem oświetlonego obszaru, potwierdzając udaną optogenetyczną aktywację neuronów GR66a. Podobne podejścia zostały zastosowane do zidentyfikowania dalszych obwodów ogniw grzewczych wystarczających do zachowania unikania5.

Skupiliśmy się na optogenetycznej aktywacji zachowań apetytywnych w podejściu 3. Neurony wykazujące ekspresję GR5a, zlokalizowane w czubku smakowym na etykiecie i nogach, wykrywają cukry i kierują zachowaniami żywieniowymi. Aktywacja tych neuronów wyzwala odpowiedź na rozszerzenie trąbki (PER)14. Użyliśmy testu odpowiedzi na wydłużenie trąbki optogenetycznej w czerwonym świetle, aby aktywować neurony GR5a. Poprzez ekspresję CsChrimson w tych neuronach, stymulowaliśmy je czerwonym światłem. Muchy nie wysuwały trąbki w warunkach oświetlenia pomieszczenia. Jednak aktywacja CsChrimson światłem czerwonym doprowadziła do rozszerzenia trąbki bez słodkiego bodźca, wykazując udaną optogenetyczną aktywację neuronów GR5a. Podejście to zostało wykorzystane do zbadania obwodu neuronalnego, w tym neuronów czuciowych smakowych, neuronów projekcji smaku i neuronów ruchowych trąbki15,16.

W podejściu 4 badaliśmy optogenetyczną aktywację zachowań unikających w grupach much, używając testu optogenetycznego labiryntu much, który był testowany na neuronach GR66a za pomocą czerwonego światła. Muchy umieszczono na przecięciu dwóch rur: jednej oświetlonej światłem czerwonym, a drugiej zacienionej. Ekspresja CsChrimson w neuronach GR66a wywołała unikanie. W przypadku braku czerwonego światła, muchy nie wykazywały preferencji, ale aktywacja czerwonego światła doprowadziła do ekspresji GR66a, aby uniknąć czerwonego światła, co sugeruje pomyślną aktywację szlaku. Testy labiryntu much są szeroko stosowane do badania różnych modalności sensorycznych, w tym temperatury, wilgotności i węchu. W połączeniu z optogenetyką, podejście to jest skuteczne w badaniu zarówno zachowań atrakcyjnych, jak i unikających17,18,19.

Te metody dostarczają powtarzalnego szkieletu do badania optogenetycznej aktywacji i hamowania obwodów nerwowych Drosophila. Wykorzystując kombinację różnych rodopsyn kanałowych i dostępnych testów behawioralnych, to badanie potwierdzające słuszność koncepcji pokazuje skuteczność manipulacji optogenetycznej, dostarczając prostych metod manipulowania funkcjami obwodów nerwowych z potencjalnymi szerszymi zastosowaniami w badaniach neurobiologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Szczepy, hodowla much i aspirator do much

  1. Szczepy i ich utrzymanie
    1. Szczepy wykorzystane w eksperymentach obejmują HC-Gal410, Gr5a-Gal420 (Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC): 57592), Gr66a-Gal421 (BDSC: 57670), UAS-GtACR23, UAS-CsChrimson2 (BDSC: 55136). Muchy hodowano w temperaturze 25 °C na standardowej pożywce kukurydzianej w cyklu 12 h światła : 12 h ciemności.
      UWAGA: 1 L pożywki kukurydzianej zawiera 1 L dH2O, 79 g dekstrozy, 7,5 g agaru, 24 g płatków drożdżowych, 57 g mączki kukurydzianej, 2,1 g metylo-4-hydroksybenzoesanu (rozpuszczonego w 11,1 mL etanolu), 6 g tetrahydratu wodorotartaranu sodowo-potasowego oraz 0,9 g chlorku wapnia.
  2. Hodowla much i przygotowanie do eksperymentu
    1. Wyselekcjonować muchy w wieku od 0 do 3 dni. W momencie przeprowadzania eksperymentów muchy będą miały od 3 do 6 dni, co zapewni spójność ze względu na wiek (Rysunek 1A).
    2. Na 3 dni przed rozpoczęciem eksperymentów podzielić każdy genotyp na cztery grupy: ATR - światło pokojowe, ATR + światło pokojowe, ATR - światło czerwone lub niebieskie oraz ATR + światło czerwone lub niebieskie.
    3. Przygotować roztwór zapasowy ATR o stężeniu 80 mM poprzez rozpuszczenie ATR w 100% etanolu. Pożywkę dla grup ATR + uzupełnić o 400 µM ATR.
    4. Pożywkę dla grup ATR - uzupełnić o taką samą stężenie etanolu, ale bez dodatku ATR.
    5. Wszystkie grupy hodować w ciemności22.
    6. Muchy Gr5a>CsChrimson głodzić przez 16-24 godziny w fiolkach zawierających jedynie wilgotną chusteczkę. Fiolki ATR + zawierają 400 µM ATR zmieszanego z wodą, natomiast fiolki ATR - zawierają dH2O zmieszaną z taką samą stężeniem etanolu.
  3. Aspirator do much
    1. Złożyć aspirator do much (Rysunek 1B), używając plastikowej rurki, siatki na owady oraz dwóch pipet transferowych o pojemności 3 mL.
    2. Odciąć końcówki i gruszki pipet transferowych, upewniając się, że końcówka ssąca umożliwia swobodne przejście muchy. Taka konstrukcja pozwala na delikatne odsysanie much poprzez wdech, co minimalizuje ryzyko ich uszkodzenia i ułatwia wydajne zbieranie oraz przenoszenie poszczególnych osobników.
    3. Przykryć plastikową rurkę siatką na owady i przymocować końce pipet do rurki za pomocą Parafilmu.

2. Test preferencji pozycyjnej termotaktycznej z optogenetyczną stymulacją światłem niebieskim dla pojedynczej muchy

  1. Drosophila szczepy i hodowla much
    1. Skrzyżować linię driver HC-Gal410 z UAS-GtACR23, aby uzyskać genotyp eksperymentalny HC>GtACR2. Muchy HC>GtACR2 wykazują ekspresję GtACR2 w komórkach termocentrycznych.
      UWAGA: Należy zapewnić równą liczbę much samców i samic dla każdego wariantu badawczego.
  2. Przygotowanie i przeprowadzenie testu eksperymentalnego
    1. Ustawić dwie stalowe płyty na osobnych płytkach grzejnych tak, aby ich krawędzie się stykały. Na górze położyć plastikową koszulkę, przymocowując ją taśmą, aby zminimalizować przesuwanie. Na koszulce położyć arkusz białego papieru, aby zredukować szum tła (Rysunek 1C).
      UWAGA: Biały papier należy wymieniać na początku każdego eksperymentu lub w przypadku jego zabrudzenia.
    2. Na białym papierze umieścić przezroczystą plastikową osłonę (wysokość 2 mm × szerokość 58 mm × długość 83 mm). Osłona ta pozwala muchy na swobodne chodzenie, jednocześnie uniemożliwiając jej latanie.
    3. W dnie pudełka ze styropianu (wysokość 27 cm × szerokość 22 cm × długość 16 cm) wyciąć otwór, aby przymocować kamerę i niebieskie światło (1,000 mA) około 12 cm nad powierzchnią eksperymentalną.
    4. Ustawić kamerę i niebieskie światło w taki sposób, aby zminimalizować odblaski, zapewniając jednocześnie możliwość aktywacji.
      UWAGA: Może być wymagany test wstępny w celu określenia zakresu aktywacji niebieskiego światła.
    5. Skonfigurować kamerę do rejestracji z następującymi ustawieniami: timelapse 1 s, wąskie pole widzenia, 4000 × 3000 pikseli.
    6. Dostosować ustawienia płytek grzejnych, aby utrzymać temperaturę powierzchni 25 ± 1 °C i 31 ± 1 °C na odpowiednich stalowych płytach.
      UWAGA: W przypadku wariantów wymagających temperatury poniżej 25 °C niezbędne są alternatywne metody chłodzenia, takie jak ogniwa Peltiera lub lód. Jeśli temperatura stalowych płyt przekroczy pożądane poziomy, należy spryskać powierzchnię wodą destylowaną w celu uzyskania i utrzymania wymaganych warunków. Następnie należy użyć serwetki, aby wchłonąć nadmiar wilgoci z plastikowej koszulki.
    7. Przed i po każdej próbie monitorować temperatury za pomocą sondy temperatury powierzchniowej.
      UWAGA: Precyzyjna kontrola temperatury jest kluczowa, ponieważ wahania mogą wpływać na wyniki.
    8. Umieścić plastikową osłonę po stronie 25 ˚C. Za pomocą aspiratora do much delikatnie wpuścić jedną muchę pod osłonę. Umieścić pudełko nad obszarem eksperymentalnym, aby stworzyć przyciemnione światło (<10 luksów) i pozwolić musze na aklimatyzację przez 1 min.
    9. Po okresie aklimatyzacji podnieść pudełko i szybko przesunąć plastikową osłonę, ustawiając jej środek w linii z granicą stalowych płyt, aby zapewnić równy dostęp do stron 25 °C i 31 °C.
      UWAGA: Podczas tego procesu temperatura powietrza i temperatura wewnątrz osłony po stronie 31 °C wzrastają do około 27 °C w ciągu 5 s (Rysunek uzupełniający 1), co jest wystarczające do aktywacji komórek termocentrycznych11.
    10. Rozpocząć próbę, włączając kamerę i niebieskie światło (20 kLux).
      UWAGA: Nie włączać niebieskiego światła przy normalnym oświetleniu pomieszczenia. Włączyć kamerę i zarejestrować kilka klatek przed włączeniem niebieskiego światła w razie wystąpienia ruchu.
    11. Po upływie ponad 2 min zakończyć próbę, wyłączając kamerę i światło. Usunąć muchy za pomocą aspiratora.
      UWAGA: Zarejestrować kilka dodatkowych klatek w razie ruchu podczas wyłączania kamery.
  3. Analiza behawioralna i statystyczna
    1. Analizować dane tylko z much, które na początku próby pozostają po stronie 25 °C.
      ​UWAGA: Odrzucić dane z much rozpoczynających próby po stronie 31 °C, które często wykazują zmienione preferencje23. Odrzucić próby z muchami, które nie zbliżyły się do krawędzi strony 31 °C, aby upewnić się, że dokonały wyboru między temperaturami. Odrzucić dane z much, które pozostawały w bezruchu przez ponad 30 s.
    2. Wyniki analizować zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami23. Obliczyć indeks preferencji (PI) jako stosunek różnicy czasu, jaki mucha spędziła w każdej strefie temperaturowej, do czasu całkowitego, zgodnie z poniższym wzorem:
      Wzór obliczania PI, (czas w 25°C) - (czas w 31°C) / czas całkowity, przedstawiony w równaniu.
      UWAGA: Szczegóły statystyczne dla eksperymentów podano w legendach do rysunków. Analiza danych jest wykonywana przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do analizy danych.

3. Test preferencji pozycyjnej pojedynczej muchy z wykorzystaniem optogenetyki światła czerwonego

  1. Drosophila szczepy i hodowla much
    1. Skrzyżować linię sterującą Gr66a-Gal421 z UAS-CsChrimson2, aby uzyskać genotyp eksperymentalny Gr66a>CsChrimson. Muchy Gr66a>CsChrimson wykazują ekspresję CsChrimson w neuronach smaku gorzkiego.
      UWAGA: Należy upewnić się, że w każdym wariancie eksperymentalnym wykorzystano taką samą liczbę samców i samic.
  2. Konfiguracja i przeprowadzenie testu eksperymentalnego
    1. Test należy przeprowadzić w ciemni lub w zaciemnionym pomieszczeniu, aby zapewnić kontrolowaną aktywację CsChrimson (Rysunek 1D).
    2. Umieścić kamerę w odległości około 45 cm nad powierzchnią eksperymentalną.
      1. Należy użyć kamery bez filtra podczerwieni. Jeśli kamera posiada wewnętrzny filtr podczerwieni typu short-pass, który blokuje długości fal powyżej 700 nm, należy go usunąć.
      2. Przykleić filtr podczerwieni typu long-pass 830 nm do obiektywu za pomocą superkleju, aby zarejestrować długości fal podczerwieni. Ta modyfikacja jest niezbędna do zapisu ruchu much w warunkach oświetlenia podczerwienią.
    3. Umieścić źródło światła czerwonego24 w odległości około 45 cm nad powierzchnią eksperymentalną, zapewniając natężenie światła około 2,5 kLux (1 000 mA).
      UWAGA: Zaleca się stosowanie odpowiednich środków ochrony oczu filtrujących czerwony laser/światło. Gogle ochronne przed laserem pomagają zapobiec potencjalnemu uszkodzeniu oczu w wyniku bezpośredniej ekspozycji na intensywne czerwone światło.
    4. Do wizualizacji much w obrębie układu należy użyć światła podczerwonego. Powinno być ono włączone przez cały czas trwania eksperymentu.
      UWAGA: Należy unikać odblasków w obszarze eksperymentalnym wywołanych światłem podczerwonym, ponieważ mogą one utrudnić analizę danych.
    5. Za pomocą kleju przymocować filtr podczerwieni typu long-pass 780 nm do połowy plastikowej osłony.
      UWAGA: Można użyć dowolnego filtra long-pass, który blokuje długości fal poniżej 780 nm. Strona niefiltrowana przepuszcza światło czerwone i podczerwień, natomiast strona filtrowana przepuszcza wyłącznie światło podczerwone.
    6. Pod obszarem eksperymentalnym umieścić materiał czarny matowy, aby zminimalizować szum tła.
    7. Za pomocą aspiratora do much umieścić jedną muchę pod przezroczystą plastikową osłoną (wysokość 2 mm × szerokość 58 mm × długość 83 mm) i pozostawić ją na 1 min w celu aklimatyzacji.
    8. Odczekać, aż mucha pojawi się po stronie niefiltrowanej. Rozpocząć próbę, włączając kamerę i światło czerwone.
      UWAGA: Kamera jest podatna na drgania bezpośrednio po uruchomieniu. Należy dokładnie zamocować kamerę przed nagrywaniem i włączyć ją na kilka sekund przed rozpoczęciem zapisu, aby uniknąć nieprawidłowych ruchów, które mogą utrudnić analizę. Światła czerwonego nie należy włączać przed rozpoczęciem próby.
    9. Rejestrować ruch muchy przez 1 min.
      UWAGA: Próby, w których mucha nie zbliżyła się do linii środkowej lub nie poruszała przez ponad 15 s, należy odrzucić.
    10. Po 1 min zakończyć próbę, wyłączając kamerę i światło. Muchy należy usunąć za pomocą aspiratora.
      UWAGA: Należy zarejestrować kilka dodatkowych klatek, aby uniknąć efektów ruchu podczas wyłączania kamery.
  3. Analiza behawioralna i statystyczna
    1. Wyniki należy przeanalizować zgodnie z procedurami opisanymi wcześniej23. Obliczyć wskaźnik preferencji (PI) jako stosunek różnicy czasu spędzonego przez muchę w obszarze bez filtra i w obszarze z filtrem do czasu całkowitego, zgodnie z następującym wzorem:
      Wzór na PI: (czas bez filtra - czas z filtrem) / czas całkowity; równanie do analizy danych.
      UWAGA: Szczegóły statystyczne dla eksperymentów znajdują się w legendach do rysunków. Analiza danych jest wykonywana przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do analizy danych.

4. Optogenetyczna reakcja wyprostowania trąbka indukowana światłem czerwonym

  1. Drosophila szczepy i hodowla much
    1. Skrzyżować linię sterującą Gr5a-Gal420 z UAS-CsChrimson2, co pozwoli uzyskać genotyp eksperymentalny określany jako Gr5a>CsChrimson. Muchy Gr5a>CsChrimson wykazują ekspresję CsChrimson w neuronach receptorowych smaku słodkiego.
      UWAGA: Należy upewnić się, że w każdym wariancie zastosowano taką samą liczbę samców i samic.
    2. Głodzić muchy przez 16-24 h z dodatkiem ATR (ATR +) lub bez (ATR -) przed przeprowadzeniem testu.
      UWAGA: Może być wymagany dłuższy okres głodzenia, aby wywołać silną odpowiedź.
  2. Przygotowanie i przeprowadzenie testu eksperymentalnego
    1. Zanestetyzować muchy poprzez chłodzenie na lodzie (Rysunek 1E).
      UWAGA: Należy unikać bezpośredniego kontaktu much z lodem. Czas chłodzenia należy ograniczyć do około 1 min; przedłużone chłodzenie może prowadzić do problemów z regeneracją oraz do śmiertelności.
    2. Używając końcówki pipety 1000 µL, nanieść 7-10 małych kropek kleju na szkiełka przedmiotowe.
      UWAGA: Małe krople kleju na szkiełku gwarantują, że mucha nie zostanie w nim zatopiona, a także zapobiegają przyklejeniu kleju do jej trąbki lub odnóży.
    3. Umieścić jedną muchę stroną brzuszną do góry na każdej kropce kleju. Należy upewnić się, że tułów i skrzydła stykają się z klejem, aby zminimalizować ruchy. Rozłożyć skrzydła na boki, aby zwiększyć powierzchnię przylegania.
      UWAGA: Należy unikać umieszczania much zbyt blisko siebie, co mogłoby nieumyślnie aktywować kilka osobników podczas naświetlania.
    4. Pozostawić klej do wyschnięcia na około 10 min.
    5. Przenieść szkiełka do komory wilgotnościowej (plastikowego pudełka z mokrymi ręcznikami papierowymi) i pozostawić muchy do regeneracji na 2 h.
    6. Umieścić szkiełko pod mikroskopem. Za pomocą strzykawki podać kroplę wody, aby nasycić muchy i zapobiec wysuwaniu trąbki wywołanemu pragnieniem.
    7. Ręcznie skierować wskaźnik laserowy, aby naświetlić trąbkę/głowę pojedynczej muchy czerwonym światłem (700 lux), obserwując odpowiedź PER pod mikroskopem.
      UWAGA: Ochrona oczu filtrująca czerwony laser/światło jest niezbędna podczas obserwacji czerwonego światła pod mikroskopem.
    8. Obserwować i rejestrować wysuwanie trąbki w oknie czasowym 30 s. Każdą muchę ocenić zgodnie z następującym systemem zapisu: 0 oznacza brak wysuwania, 0,5 oznacza wysuwanie trwające 1-2 s, 1 oznacza wysuwanie trwające ponad 3 s.
    9. Po przetestowaniu wysuwania trąbki indukowanego światłem, zbadać odpowiedź na 4% sacharozę za pomocą strzykawki. Wypuścić kroplę sacharozy z końcówki igły i zbliżyć ją do trąbki muchy.
      UWAGA: Odrzucić dane z much, które nie zareagowały na kroplę sacharozy.
  3. Analiza behawioralna i statystyczna
    1. Przeprowadzić analizę statystyczną przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do analizy danych.
      UWAGA: Szczegóły statystyczne dotyczące eksperymentów znajdują się w legendach do rysunków.

5. Optogenetyczny test labiryntowy dla much z wykorzystaniem światła czerwonego

  1. Drosophila – linie i hodowla much
    1. Skrzyżować linię driver Gr66a-Gal421 z UAS-CsChrimson2, aby uzyskać genotyp eksperymentalny Gr66a>CsChrimson. Muchy Gr66a>CsChrimson wykazują ekspresję CsChrimson w neuronach smaku gorzkiego.
      UWAGA: Należy upewnić się, że każda grupa zawiera równą liczbę samców i samic.
  2. Montaż labiryntu dla much
    1. Zbudować labirynt dla much zgodnie z Rysunkiem 1F.
      UWAGA: Alternatywnie można wydrukować komponenty labiryntu w technologii druku 3D i złożyć je zgodnie z wcześniejszymi szczegółowymi opisami25.
    2. Uciąć trzy plastikowe probówki hodowlane o pojemności 5 mL na odpowiednie długości, aby stworzyć probówkę załadowczą, nieosłoniętą przezroczystą probówkę testową oraz probówkę testową osłoniętą folią. Zamocować probówki do labiryntu zgodnie z Rysunkiem 1F.
      1. W zależności od materiału, z którego wykonano labirynt, należy uciąć probówki testowe tak, aby zapewnić taką samą odległość dla każdego warunku testowego. W przypadku labiryntu przezroczystego należy skrócić nieosłoniętą probówkę testową, a w przypadku labiryntu nieprzezroczystego – probówkę osłoniętą folią, bazując na długości komory holdingowej.
  3. Przygotowanie i wykonanie testu eksperymentalnego
    1. W warunkach ciemności lub słabego oświetlenia umieścić 10 samców i 10 samic w probówce załadowczej. Połączyć probówkę załadowczą z komorą holdingową. Przechylić windę i delikatnie opukać probówkę, aby przenieść muchy do komory holdingowej.
      UWAGA: Obniżyć windę tak, aby otwarta była tylko połowa komory holdingowej. Taka manipulacja ułatwia przeniesienie much z probówki załadowczej do komory holdingowej.
    2. Po przeniesieniu much do komory holdingowej użyć windy, aby obniżyć muchy na poziom między otworem probówki załadowczej a otworami probówek testowych. Następnie usunąć probówkę załadowczą.
    3. Ustawić labirynt w odległości około 13 cm od źródła czerwonego światła (1000 mA), nie włączając światła.
    4. Obniżyć windę, aż komora holdingowa wyrówna się z otworami probówek testowych, umożliwiając muchom swobodne przemieszczanie się między probówką osłoniętą folią a nieosłoniętą probówką testową. Jednocześnie włączyć czerwone światło, aby aktywować CsChrimson. Upewnić się, że natężenie czerwonego światła na powierzchni nieosłoniętej probówki testowej wynosi około 40 kLux.
      UWAGA: Nie włączać czerwonego światła, dopóki komora holdingowa nie zostanie obniżona i wyrównana z otworami probówek testowych. Ze względu na intensywną jasność czerwonego światła zaleca się stosowanie odpowiednich środków ochrony oczu, które filtrują czerwony laser/światło.
    5. Muchy wybierają między probówką naświetlaną czerwonym światłem a probówką zacienioną przez jedną minutę.
    6. Po 1 min podnieść windę na poziom między otworem probówki załadowczej a otworami probówek testowych. Policzyć muchy w każdej probówce.
      UWAGA: Liczone są tylko muchy aktywne i nieuszkodzone.
    7. Po każdej próbie oczyścić windę i labirynt dla much za pomocą dH2O.
  4. Analiza danych i statystyka
    1. Obliczyć indeks preferencji (PI) jako stosunek różnicy w liczbie much między probówkami nieosłoniętymi a osłoniętymi do całkowitej liczby much, zgodnie z poniższym wzorem:
      Wzór na indeks preferencji (PI) dla analizy behawioralnej; równanie do obliczania wyników eksperymentu.
      UWAGA: Szczegóły statystyczne dla eksperymentów znajdują się w opisach rysunków. Analiza danych jest przeprowadzana przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do analizy danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Test preferencji pozycyjnej termotaktycznej pojedynczej muchy z wykorzystaniem optogenetyki światłem niebieskim
Przetestowano cztery warunki: światło pokojowe bez suplementacji ATR (room light, ATR -), światło pokojowe z suplementacją ATR (room light, ATR +), światło niebieskie bez suplementacji ATR (blue, ATR -) oraz światło niebieskie z suplementacją ATR (blue, ATR +). Pierwsze trzy warunki służyły jako kontrole. W eksperymentach kontrolnych muchy unikały strony o temperaturze 31 °C. W warunkach św...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Manipulacje optogenetyczne przekształciły dziedzinę neurobiologii, umożliwiając precyzyjną kontrolę obwodów neuronalnych z dokładnością czasoprzestrzenną27. Obwód neuronalny obejmuje populacje neuronów połączonych ze sobą synapsami, pełniących określone funkcje po aktywacji. Konektom całego mózgu Drosophila został ukończony, oferując kompleksowy wgląd w szlaki synaptyczne w mózgu Drosophila 28,29. Chociaż konektom może pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów w związku z publikacją niniejszego artykułu. Wszyscy autorzy ujawnili wszelkie potencjalne konflikty i zapewniają, że nie mają żadnych powiązań finansowych ani osobistych, które mogłyby wpłynąć na pracę przedstawioną w tym badaniu.

Podziękowania

Schematy ideowe dla wszystkich rysunków zostały stworzone za pomocą Biorender.com. Praca ta była wspierana przez NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) do L.N. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowywaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sterownik LED 1000 mALuxeon Star3021-D-E-1000
5 ml Probówki hodowlane VWR, plastikowe, z dwupozycyjnymi nasadkami FiltrVWR60818-664
780 / IR 780 nm 100 mm x 100 mmLee FiltersBH #LE8744Przycięte do około 47 x 100 pasuje do plastikowej osłony
Agfabric 6,5 stopy x 15 stóp Siatka na owady Siatka ogrodowa do ochrony roślin Warzywa Kwiaty OwoceHome DepotEIBNW6515
Wszystkie trans siatkówkoweAluminiowa płyta Sigma-Aldrich116-31-4
(30,5 cm x 30,5 cm x 0,6 cm)Amazonzakupiony od Amazon
Czarne plastikowe pudełkoLI-COR929-97101
CHLOREK WAPNIA ANHYDRO 25GRThermo Fisher Scientific 
CX405 Kamera ręczna z przetwornikiem CMOS Exmor RSONYHDR-CX405
s “ Klej szkolny"Elmer
, czysty (200 proof)Sigma-AldrichE7023
Mieszadło do gorącej płyty Fisherbrand IsotempFisher ScientificSP88850200
Linia muchowa: Gr5a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center57592
Linia muchowa: Gr66a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center57670
Linia muchowa: HC-Gal4 (II)Dr. Marco Gallio LabMiły prezent
Linia muchowa: UAS-CsChrimsonBloomington Drosophila Stock Center55136
Linia muchowa: UAS-GtACR2/TM6BDr. Quentin Gaudry LabMiły prezent
Flystuff 62-101 Żółta mąka kukurydziana (11,3 kg), żółta, 11,3 kg / jednostkęGenesee Scientific62-101
Flystuff 62-107 Nieaktywne suche drożdże, 10 kg, płatki odżywcze, 10 kg/jednostkęGenesee Scientific62-107
Flystuff 66-103 Nutri-Fly Drosophila Agar, Gelidium, 100 mesh, 5 kg (11,02 lbs)/szt.Genesee Scientific66-103
FreeMascot OD 8+ 190 nm– 420 nm / 600 nm– Długość fali 1100 nm Fioletowe / czerwone / podczerwone laserowe okulary ochronne Bezpłatna maskotka B08LGMQ65Szakupiony od Amazon
GoPro Hero8 BlackGoPro6365359
filtry LEE 100 i razy; 100 mm Infra Red #87 Filtr poliestrowy na podczerwieńB& H PhotoLE8744
Filtr długoprzepustowy, kolorowe szkło, 50.8 x 50.8 mm, 830 nm Cut-on, RG830NewportFSQ-RG830
4-hydroksybenzoesan metylu, 99%, Thermo Scientific ChemicalsThermo Fisher Scientific 
MicroWell Mini Taca 60 dołków, niskoprofilowa NS PSThermal Scientific NUNC 439225Pokrywki są używane jako "plastikowa osłona"
Olympus Plastics 24-160RS, 1000 i mikro; L Ergonomiczne końcówki do pipet Olympus Low Binding, Racked, Sterylne, 8 stojaków po 96 końcówek/jednostkęEppendorf24-160RS
Parafilm M Folia uszczelniającaHeathrow ScientificHS234526B4 cale x 125 stóp
Chlorek potasu, ACS, 99,0-100,5%, Thermo Fisher Naukowy 
PrismGraphPadVersion 9oprogramowanie do analizy danych
Samco Pipety z podziałkąThermo Fisher Scientific 225Szkiełka podstawowe 3 ml
Fisher Scientific12-544-2  5 mm x 75 mm x 1,0 mm
Mikroskop stereoskopowyOLYMPUSCZ61
Pudełko styropianowe (27 cm wysokości i razy; 22 cm szerokości i razy 16 cm długości)
SacharozaFisher Scientific225911
Sonda temperatury powierzchniFluke80PK-3A
StrzykawkaBD Integra305270
Tate & Lyle 457 Dekstroza, Tate & Lyle, Pow, Tate & Lyle 457 Dekstroza, Tate & Lyle, proszek, 50 funtów / jednostkęGenesee Scientific62-113
Identyfikowalny kalibrowany termometr termoparowy z dużymi cyframiIdentyfikowalny przez cple-parmer  UX-91210-07Fisherbrand Identable BigDigit Type K Termometr
Potrójne niebieskie diody LED na prawą burtęDostawa07007-PB000-D470 nm
Potrójna czerwona dioda LED na prawą burtęZasilacz07007-PD000-F627 nm
Przezroczysta rurka PVC Tygon 1/4" ID, 3/8" OD, 5 stóp Długość Firma zaopatrzeniowa McMaster Carr 6516T21 
Oświetlacz podczerwieni Univivi, 850nm 12 diod LED Szerokokątny oświetlacz podczerwieni do noktowizoraUnivivi4331910725
Wakefield Termiczny okrągły radiator 25,4 mm Gwiazda LED - 882-100ABWakefield-Vette882-100AB
Bezprzewodowy prezenterDinoFire StoreB01410YNAMzakupiony w Amazon
długoprzepustowy AC297150250Alkohol etylowy 126960025AA1159530

Bibliografia

  1. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  2. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  3. Mauss, A. S., Busch, C., Borst, A. Optogenetic neuronal silencing in drosophila during visual processing. Sci Rep. 7 (1), 13823(2017).
  4. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Neuroscience. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
  5. Castaneda, A. N., et al. Functional labeling of individualized postsynaptic neurons using optogenetics and trans-tango in drosophila (flipsot). PLoS Genet. 20 (3), e1011190(2024).
  6. Fischer, F. P., et al. Drosophila melanogaster as a versatile model organism to study genetic epilepsies: An overview. Front Mol Neurosci. 16, 1116000(2023).
  7. Aragon, M. J., et al. Multiphoton imaging of neural structure and activity in drosophila through the intact cuticle. Elife. 11, e69094(2022).
  8. Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of drosophila behaviors through channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. Eur J Neurosci. 26 (9), 2405-2416 (2007).
  9. Kono, M., Goletz, P. W., Crouch, R. K. 11-cis- and all-trans-retinols can activate rod opsin: Rational design of the visual cycle. Biochemistry. 47 (28), 7567-7571 (2008).
  10. Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the drosophila brain. Cell. 144 (4), 614-624 (2011).
  11. Ni, L., et al. A gustatory receptor paralogue controls rapid warmth avoidance in drosophila. Nature. 500 (7464), 580-584 (2013).
  12. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  13. Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of drosophila. J Neurosci. 34 (21), 7148-7164 (2014).
  14. Dethier, V. G. The Hungry Fly: A Physiological Study of the Behavior Associated with Feeding. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1976).
  15. Shiu, P. K., Sterne, G. R., Engert, S., Dickson, B. J., Scott, K. Taste quality and hunger interactions in a feeding sensorimotor circuit. Elife. 11, e79887(2022).
  16. Kim, H., Kirkhart, C., Scott, K. Long-range projection neurons in the taste circuit of drosophila. Elife. 6, e23386(2017).
  17. Sayeed, O., Benzer, S. Behavioral genetics of thermosensation and hygrosensation in drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 6079-6084 (1996).
  18. Coya, R., Martin, F., Calvin-Cejudo, L., Gomez-Diaz, C., Alcorta, E. Validation of an optogenetic approach to the study of olfactory behavior in the t-maze of drosophila melanogaster adults. Insects. 13 (8), 662(2022).
  19. Chu, L. A., Tai, C. Y., Chiang, A. S. Thirst-driven hygrosensory suppression promotes water seeking in drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (34), e2404454121(2024).
  20. Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. Drosophila gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (Suppl 2), 14526-14530 (2003).
  21. Dunipace, L., Meister, S., Mcnealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the drosophila gustatory system. Curr Biol. 11 (11), 822-835 (2001).
  22. Ratnayake, K., et al. Blue light excited retinal intercepts cellular signaling. Sci Rep. 8 (1), 10207(2018).
  23. Huda, A., Omelchenko, A. A., Vaden, T. J., Castaneda, A. N., Ni, L. Responses of different drosophila species to temperature changes. J Exp Biol. 225 (11), jeb243708(2022).
  24. Tyrrell, J. J., Wilbourne, J. T., Omelchenko, A. A., Yoon, J., Ni, L. Ionotropic receptor-dependent cool cells control the transition of temperature preference in drosophila larvae. PLoS Genet. 17 (4), e1009499(2021).
  25. Fu, Z., Huda, A., Kimbrough, I. F., Ni, L. Using drosophila two-choice assay to study optogenetics in hands-on neurobiology laboratory activities. J Undergrad Neurosci Educ. 22 (1), A45-A50 (2023).
  26. Joseph, R. M., Heberlein, U. Tissue-specific activation of a single gustatory receptor produces opposing behavioral responses in drosophila. Genetics. 192 (2), 521-532 (2012).
  27. Riemensperger, T., Kittel, R. J., Fiala, A. Optogenetics in drosophila neuroscience. Methods Mol Biol. 1408, 167-175 (2016).
  28. Dorkenwald, S., et al. Neuronal wiring diagram of an adult brain. Nature. 634 (8032), 124-138 (2024).
  29. Schlegel, P., et al. Whole-brain annotation and multi-connectome cell typing of drosophila. Nature. 634 (8032), 139-152 (2024).
  30. Talay, M., et al. Transsynaptic mapping of second-order taste neurons in flies by trans-tango. Neuron. 96 (4), 783-795.e4 (2017).
  31. Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (per) assay in drosophila. J Vis Exp. (3), e193(2007).
  32. Pulver, S. R., Hornstein, N. J., Land, B. L., Johnson, B. R. Optogenetics in the teaching laboratory: Using channelrhodopsin-2 to study the neural basis of behavior and synaptic physiology in drosophila. Adv Physiol Educ. 35 (1), 82-91 (2011).
  33. Titlow, J. S., Johnson, B. R., Pulver, S. R. Light activated escape circuits: A behavior and neurophysiology lab module using drosophila optogenetics. J Undergrad Neurosci Educ. 13 (3), A166-A173 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Aktywacja CsChrimsoninhibicja GtACR2test preferencji pozycyjnejodruch wysuwania tr bkitest labiryntowy dla muszekprzetwarzanie sensoryczne
Testy behawioralne do optogenetycznej manipulacji obwodami neuronalnymi u Drosophila melanogaster
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.