Artykuł metodologiczny

Model pęcherza moczowego in vitro infekcji dróg moczowych związanej z cewnikiem

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67966

⸱

24 czerwca 2025

 ,  , 
1The Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, The University of Liverpool, 2Department of Life Sciences, The University of Bath

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje model in vitro cewnikowanego układu moczowego, który może być wykorzystany do badania zarówno planktonowych, jak i związanych z biofilmem populacji komórek bakteryjnych w symulowanych infekcjach dróg moczowych związanych z cewnikiem. Model ten może być dalej wykorzystywany do badania skuteczności produktów przeciwdrobnoustrojowych mających na celu kontrolowanie infekcji dróg moczowych.

Streszczenie

Infekcje dróg moczowych związane z cewnikiem (CAUTIs) należą do najczęstszych infekcji związanych z opieką zdrowotną. Tworzenie się biofilmu na cewnikach moczowych jest kluczowym aspektem patogenezy tych zakażeń i często prowadzi do zablokowania cewników i poważnych powikłań, takich jak odmiedniczkowe zapalenie nerek i posocznica. Podejścia do modelowania i badania powstawania biofilmu w tym otoczeniu są niezbędne zarówno dla podstawowego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw patogenezy CAUTI, jak i dla opracowania i solidnej oceny przedklinicznej skutecznych strategii terapeutycznych w celu kontrolowania CAUTI i zablokowania cewnika. Protokół ten opisuje model in vitro cewnikowanych dróg moczowych, który replikuje system zamkniętego drenażu cewnika stosowany w praktyce klinicznej, ułatwiając badanie CAUTI i tworzenia biofilmu cewnika w reprezentatywnych warunkach. Ponadto protokół ten szczegółowo opisuje zastosowanie modelu pęcherza moczowego in vitro do oceny skuteczności produktów do konserwacji cewnika przeciwdrobnoustrojowego, w tym produktów dostępnych obecnie w łańcuchu dostaw NHS.

Wprowadzenie

Cewniki moczowe są jednymi z najczęściej stosowanych urządzeń medycznych, z szacowanym rozpowszechnieniem 19% w placówkach intensywnej terapii1,2,3. Cewniki są stosowane przede wszystkim w celu pomocy w zarządzaniu wydalaniem moczu w przypadku dysfunkcji pęcherza moczowego i są wprowadzane bezpośrednio do pęcherza, umożliwiając oddawanie moczu z pęcherza przez centralny lumen2,3. Cewniki moczowe mogą być używane z przerwami, gdzie są okresowo wprowadzane do pęcherza moczowego w celu odprowadzenia moczu, lub można stosować cewniki na stałe, w których cewniki są pozostawiane na miejscu w pęcherzu moczowym w celu ciągłego odprowadzania moczu3,4. Pomimo ich powszechnego stosowania, cewniki moczowe są największym czynnikiem ryzyka rozwoju zakażeń dróg moczowych (ZUM), które stanowią około jednej piątej zakażeń związanych z opieką zdrowotną5,6. Rzeczywiście, sam cewnik często działa jako początkowe miejsce kolonizacji drobnoustrojów, zapewniając powierzchnię dla uropatogenów, do których mogą przylegać i dalej kolonizować drogi moczowe1,6,7,8. Praktycznie wszyscy pacjenci poddawani długotrwałemu ciągłemu cewnikowaniu (gdzie cewnik pozostaje na miejscu przez ≥28 dni) doświadczą bakteriurii, przy czym ryzyko wzrasta o ~5% na każdy dzień, w którym cewnik znajduje się na miejscu2,9,10,11. Proporcjonalnie, około 80% infekcji dróg moczowych jest związanych z użyciem cewnika moczowego6.

Zakażenia dróg moczowych związane z cewnikiem (CAUTIs) stanowią znaczne obciążenie dla służby zdrowia i często wiążą się z poważniejszymi objawami górnego odcinka przewodu moczowego (takimi jak zapalenie moczowodu i odmiedniczkowe zapalenie nerek) niż niepowikłane ZUM, a także zwiększonym ryzykiem wtórnych infekcji krwi1,7,12,13,14. Standardowe leczenie CAUTI obejmuje antybiotykoterapię, jednak infekcje te są często oporne na leczenie przeciwbakteryjne w wyniku rozwoju złożonych zbiorowisk biofilmu na powierzchni cewnika15,16,17,18,19,20. Rzeczywiście, szacuje się, że ~80% CAUTI wynika z patogenów dróg moczowych tworzących biofilm19. Tworzenie biofilmu charakteryzuje się przyłączaniem komórek bakteryjnych do powierzchni cewnika i rozwojem zbiorowisk osadzonych w rozległej matrycy zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS)21,22,23,24. Produkcja EPS jest cechą charakterystyczną społeczności biofilmu i jest odpowiedzialna za wiele wyłaniających się właściwości wykazywanych przez komórki związane z biofilmem, takich jak podwyższona odporność na środki przeciwdrobnoustrojowe i klirens immunologiczny21,22,24. EPS może odgrywać bezpośrednią rolę w tych fenotypach, fizycznie osłaniając komórki i chroniąc je przed środkami przeciwdrobnoustrojowymi lub efektorami immunologicznymi, a także pośrednio ułatwiając rozwój szerszych aspektów zbiorowisk biofilmu, takich jak fizykochemiczne mikrośrodowisko biofilmu i tworzenie trwałych komórek23,24,25,26. Co więcej, niektóre uropatogeny, w tym Proteus spp., które stanowią ~11% CAUTI, posiadają silne enzymy ureazy, umożliwiające im hydrolizę mocznika obecnego w moczu i powodujące ogólny wzrost pH moczu 2,27,28,29,30. Wzrostowi pH towarzyszy wytrącanie się kryształów fosforanu wapnia i magnezu, które mogą zostać włączone do rosnącego biofilmu, co powoduje biomineralizację i tworzenie gęstych krystalicznych struktur biofilmu, które mogą blokować cewniki. Te krystaliczne biofilmy nie tylko sprawiają, że leczenie jest problematyczne, ale mogą również inicjować poważne powikłania, takie jak odmiedniczkowe zapalenie nerek i posocznica2,28,31,32,33,34.

Złożona nisza środowiskowa w cewnikowanych drogach moczowych i ważna rola tworzenia biofilmu w tych infekcjach, stanowią szczególne wyzwanie w badaniu patogenezy CAUTI. Proste i szeroko stosowane modele laboratoryjne do badania i ilościowego określania powstawania biofilmu, takie jak testy na 96-dołkowych płytkach, są nieodpowiednie do badania tworzenia biofilmu w CATUI, w szczególności biofilmów krystalicznych. Na przykład takie modele nie uwzględniają kluczowych aspektów niszy CAUTI, takich jak złożone środowisko odżywcze dostarczane przez mocz, sposób, w jaki powierzchnia cewnika wpływa na adhezję i późniejszą produkcję biofilmu oraz ciągły przepływ pożywki moczu35,36,37,38,39,40. Ponadto standardowe testy stosowane do określania wrażliwości uropatogenów na środki przeciwdrobnoustrojowe często nie odzwierciedlają rzeczywistej podatności klinicznej. Testy minimalnego stężenia hamującego i testy zawiesiny mikrobiologicznej są często stosowane do wnioskowania o podatności patogenów CAUTI na środki przeciwdrobnoustrojowe, ale zazwyczaj nie symulują ważnych zmiennych środowiska CAUTI, takich jak wpływ, jaki obecność cewnika moczowego i późniejsze tworzenie biofilmu może mieć na wrażliwość na środki przeciwdrobnoustrojowe41,42,43.

To badanie szczegółowo opisuje konfigurację i działanie modelu pęcherza in vitro, który symuluje środowisko cewnikowanego układu moczowego i replikuje standardowy system zamkniętego drenażu cewnika, stosowany w praktyce klinicznej, po raz pierwszy opisany przez Stickler et al.44 w 1999 roku (Rysunek 1). Model ten wykorzystuje cewniki Foleya o standardowych rozmiarach (które są obecnie dostępne w łańcuchu dostaw NHS) oraz sztuczne podłoża moczowe (AUM), jak wcześniej opisano przez Nzakizwanayo i wsp.45do symulacji CAUTI i tworzenia biofilmu. Model pęcherza in vitro składa się z dwuściennej szklanej komory, która działa jak "pęcherz" i ma wylot, przez który można wprowadzić cewnik Foleya do centralnej szklanej komory. W górnej części centralnej szklanej komory znajduje się wlot, przez który AUM może być dostarczane do "pęcherza" z biologicznie odpowiednim natężeniem przepływu za pomocą pompy perystaltycznej, która przepływa przez cewnik przez otwory drenażowe do worka na odpady. Dodatkowo komora zewnętrzna podłączona jest do obwodu łaźni wodnej, co pozwala na utrzymanie modeli w stałej temperaturze. Model pęcherza moczowego in vitro może być inokulowany przez centralną komorę, co pozwala na badanie patogenów CAUTI w biologicznie reprezentatywnej niszy. Ponadto, ponieważ modele są cewnikowane i stale zaopatrywane w świeże AUM, można badać wzrost i dynamikę populacji zarówno komórek planktonowych, jak i komórek związanych z biofilmem.

Poprzednie badania wykorzystywały modele pęcherza in vitro do kilku zastosowań, w tym do fundamentalnego badania tworzenia biofilmu u głównych patogenów CAUTI, w tym Proteus mirabilis i Escherichia coli 43,45,46,47,48,49. Dodatkowo, model in vitro został wykorzystany do oceny skuteczności produktów przeznaczonych do kontroli CAUTI lub zapobiegania blokadom50,51,52. Ostatnio modele zostały wykorzystane do określenia, czy adaptacje i mutacje związane z opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe wpływają na tworzenie biofilmu i patogenezę CAUTI u P. mirabilis43,46. Model pęcherza moczowego in vitro został również wykorzystany do badania nowych terapii przeciwdrobnoustrojowych mających na celu leczenie CAUTI, w tym nowo opracowanych powłok cewników teranotycznych i terapii fagowej47,48. Protokół ten obejmuje przygotowanie i przeprowadzenie modeli pęcherza moczowego in vitro, zliczenie żywotnych komórek planktonowych i związanych z biofilmem odpowiednio z powierzchni modelu i cewnika moczowego oraz pomiar pH moczu w celu monitorowania produkcji ureazy. Szczegółowo opisano również protokoły oceny produktów przeciwdrobnoustrojowych mających na celu leczenie lub zapobieganie CAUTI, w tym roztworów do irygacji pęcherza moczowego i przeciwdrobnoustrojowych żeli nawilżających, które są obecnie dostępne w łańcuchu dostaw NHS.

Protokół

Schematyczny rysunek układu modelu pęcherza in vitro przedstawiono na Rysunku 1. Modele pęcherza in vitro są zaprojektowane tak, aby były kompatybilne ze standardowymi cewnikami Foleya (wymiary pokazane na Rysunku 1 są zgodne ze standardowymi cewnikami o rozmiarze 14 French). Należy wysterylizować cały sprzęt do modelu pęcherza in vitro i przed użyciem zacisnąć wszystkie rurki silikonowe wykorzystywane w obiegu pożywki. Podczas przygotowywania modeli in vitro wymagane jest ścisłe przestrzeganie technik aseptycznych; zaleca się, aby montaż modelu odbywał się w warunkach sterylnych (t.j. w szafce bezpieczeństwa mikrobiologicznego kategorii II lub w komorze z laminarnym przepływem powietrza). W celu określenia istotności statystycznej w eksperymentach z wykorzystaniem modelu pęcherza in vitro zaleca się wykonanie minimum n = 5 powtórzeń. Szczegółowe informacje na temat zastosowanych odczynników i sprzętu znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie sztucznej pożywki moczowej

UWAGA: Ze względu na duże objętości mediów wymagane do eksperymentów oraz zmienność charakterystyczną dla próbek moczu ludzkiego, w modelach pęcherza in vitro zaleca się stosowanie sztucznej pożywki moczowej (AUM). Niniejszy protokół szczegółowo opisuje przygotowanie AUM zgodnie z wcześniejszymi opisami, zoptymalizowane do zastosowania w modelu pęcherza in vitro opracowanym przez Nzakizwanayo i wsp.. (objętość końcowa 5 L)43,45,46,48,53,54.

  1. Przygotowanie roztworu AUM 1
    1. Odważyć następujące związki i dodać je do butelki borokrzemowej o pojemności 1 L wypełnionej 850 mL wody dejonizowanej: 3,25 g sześciowodny chlorku magnezu (MgCl2.6H2O), 23 g chlorku sodu (NaCl), 11,5 g bezwodnego siarczanu sodu (Na2SO4), 3,25 g cytrynianu trisodu (Na3C6H5O7), 0,1 g szczawianu sodu (Na2C2O4), 14 g fosforanu potasu jednodobasowego (KH2PO4), 8 g chlorku potasu (KCl), 5 g chlorku amonu (NH4Cl), 25 g żelatyny oraz 5 g bulionu tryptonowo-sojowego.
  2. Podczas mieszania roztworu AUM zmierzyć pH za pomocą pH-metru i dostosować je do wartości 5,75 (± 0,02), dodając 3 M NaOH lub HCl w zależności od potrzeb.
    UWAGA: NaOH/HCl do regulacji pH należy dodawać do AUM kroplowo, aby zapobiec wytrącaniu się soli z roztworu.
  3. Po dostosowaniu pH roztworu AUM uzupełnić objętość do 1 L wodą dejonizowaną i wysterylizować w autoklawie.
    UWAGA: Po sterylizacji roztwór można przechowywać do trzech miesięcy w temperaturze pokojowej (roztwór AUM 1 należy utylizować w przypadku zaobserwowania wytrąceń lub zmętnienia).
  4. Osobno przygotować roztwór AUM 2, dodając 125 g mocznika (CH4N2O) i 2,45 g chlorku wapnia (CaCl2) do 400 mL sterylnej wody dejonizowanej w sterylnym zlewce o pojemności 500 mL.
    UWAGA: Przygotowanie roztworu mocznika i wapnia 2 wywołuje reakcję endotermiczną, dlatego zaleca się mieszanie i podgrzewanie roztworu AUM 2 do temperatury ~ 50 °C na płycie grzewczej z mieszadłem magnetycznym podczas rozpuszczania związków, aby zapobiec zamarzaniu.
  5. Po rozpuszczeniu mocznika i chlorku wapnia wysterylizować roztwór 2 za pomocą filtracji przy użyciu pompy próżniowej i jednostek filtracyjnych z nitrocelulozy 0,45 µM, przelewając go do sterylnej szklanej butelki o pojemności 500 mL. Po sterylizacji roztwór 2 jest stabilny przez trzy miesiące w temperaturze 4 °C lub przez miesiąc w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Roztwór AUM 2 należy utylizować w przypadku zaobserwowania wytrąceń lub zmętnienia.
  6. W komorze z laminarnym przepływem powietrza lub mikrobiologicznej szafie bezpieczeństwa klasy II aseptycznie połączyć roztwory AUM 1 i 2 z 3,6 L sterylnej wody dejonizowanej w sterylnej szklanej butelce aspiracyjnej o pojemności 5 L. AUM powinno mieć bladożółty kolor i być przezroczyste.
  7. Za pomocą pipety serologicznej pobrać 50 mL całkowitej objętości AUM, przelać do probówki wirówkowej 50 mL i odłożyć do późniejszego użycia.
  8. Zamknąć butelkę aspiracyjną za pomocą gumowego korka lub folii aluminiowej i pozostawić w temperaturze pokojowej do czasu przygotowania modeli in vitro .
  9. Aseptycznie pobrać 10 mL AUM z alikwoty 50 mL, a resztę roztworu zachować do przygotowania inokulum. Za pomocą pH-metru zmierzyć pH 10 mL alikwoty AUM, które powinno wynosić ~pH 6,1 (±0,2). Przygotowany AUM jest stabilny w temperaturze pokojowej przez około miesiąc i powinien zostać utylizowany w przypadku wystąpienia wytrąceń lub zmętnienia.

2. Konfiguracja modelu pęcherza In vitro

  1. Wprowadź cewnik Foleya do centralnej komory szklanej urządzenia in vitro model pęcherza moczowego (schemat szczegółowo przedstawiony w Rycina 1). Przymocuj cewnik, pompując balon za pomocą dostarczonej strzykawki z wodą sterylną, a następnie podłącz worek na odpady do portu cewnika.
  2. Połącz in vitro urządzenie do modelowania pęcherza moczowego45 do zbiornika AUM poprzez podłączanie przewodów. Podłączyć przewody obwodu medium do pompy perystaltycznej zgodnie z instrukcjami producenta, upewniając się, że przewody mają odpowiednie napięcie i nie są nadmiernie rozciągnięte.
  3. Dołącz in vitro modele pęcherza do statywów, a worki na odpady przymocować w statywach poniżej modeli, aby zapewnić przepływ przez modele poprzez grawitacja
  4. Podłącz zewnętrzną komorę modelu pęcherza do cyrkulacyjnej łaźni wodnej poprzez przewody silikonowe (Rycina 1B). Ustaw kąpiel wodną na podgrzewanie do 37 °C i włączyć cyrkulatory zbiorników.
    1. Uruchomić łaźnie wodne na 30 min przed inokulacją w modele pęcherza in vitro, aby zapewnić stabilność temperatury na poziomie 37 °Coraz należy dopilnować, aby poziom wody w łaźni wodnej był odpowiedni przez cały czas trwania eksperymentu.
  5. Zdejmij wszystkie zaciski z przewodów z pożywką i ustaw pompy perystaltyczne na przepływ około 0,75 ml/min, aby odtworzyć ludzką produkcję moczu (~1080 ml/dobę). Rzeczywiste prędkości przepływu zostaną obliczone w trakcie przeprowadzania eksperymentu.
  6. Uruchom AUM za pomocą in vitro modele pęcherza moczowego poprzez pompę perystaltyczną przez 30 min przed inokulacją, aby potwierdzić, że przepływ pożywki jest stały, a sterylny system odpływowy jest szczelny.
  7. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy odprowadzić wszelkie zgromadzone medium z worka na odpady. Objętość medium można zmierzyć w celu obliczenia dokładnych szybkości przepływu (szczegóły w kroku 4).

3. Inokulacja modeli pęcherza in vitro

  1. Przygotuj nocne hodowle dla in vitro modele pęcherza, zawieszając pętlą kolonie bakterii wyhodowane na stałym agarze w 10 ml bulionu LB. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C przy mieszaniu.
    UWAGA: in vitro model pęcherza może być wykorzystywany do badania różnych patogenów wywołujących CAUTI, w tym szczepów ureazopozytywnych, takich jak Proteus mirabilisor odpowiednio zmodyfikować stosowane pożywki wzrostowe.
  2. Odwiruj całą objętość kultury z nocnej inkubacji przy 4500 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej, a następnie odrzucić nadsącz. Osad zawiesić ponownie w 10 ml buforu AUM i zmierzyć absorbancję przy OD595 nm z wykorzystaniem spektrometru.
  3. Znormalizuj zawiesiny kultur do wartości OD595 nm do 1,0 i końcowej objętości 10 ml w AUM, korzystając z następującego równania:
    Równanie prawa Boyle'a \(A_2 \times V_2 / A_1 = V_1\), zależność ciśnienie-objętość.
    gdzie A1 czy absorbancja przy OD600 nm z hodowli nocnej, A2 czy pożądana absorbancja przy OD600 nm inakulum (1,0), V2 jest pożądaną objętością inokulum (10 mL), a V1 jest wymaganą objętością hodowli nocnej do normalizacji.
    UWAGA: 10 ml hodowli o gęstości optycznej (OD)595 nm zawiesina 1,0 zapewni, że modele zostaną zainokulowane przybliżoną dawką 1010 jednostki CFU dla większości szczepów bakteryjnych (zwalidowane dla Proteus mirabilis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus), co odtwarza utrwaloną infekcję. Początkową dawkę inokulum można modyfikować w zależności od użytego gatunku lub modelowanego stadium infekcji (np. można zastosować niższą gęstość inokulum, aby symulować wczesne stadium infekcji)47.
  4. Sterylizować in vitro modele pęcherza za pomocą 70% etanolu i zdejmij korek (wlot medium), aby uzyskać dostęp do komory wewnętrznej. Za pomocą pipety serologicznej usuń 10 ml AUM z objętości znajdującej się wewnątrz modelu pęcherza.
    UWAGA: Podczas szczepienia i pobierania próbek in vitro wyjąć modele z komory centralnej, zapewnić szybki i aseptyczny przebieg pracy, zawsze stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej oraz regularnie odkażać rękawice i powierzchnie 70% etanolem.
  5. Zaszczepić in vitro modele pęcherza moczowego poprzez do komory centralnej, używając całej znormalizowanej zawiesiny o objętości 10 ml, a następnie wymieszać dokładnie za pomocą pipety serologicznej. Odjąć 10 ml z komory centralnej in vitro modele pęcherza za pomocą pipety serologicznej i przenieść do probówki uniwersalnej o pojemności 15 ml w celu późniejszego obliczenia CFU/ml oraz pomiaru pH.
  6. Dokładnie odkaź powierzchnie zewnętrzne modelu pęcherza oraz korka za pomocą 70% etanolu, a następnie ponownie załóż korek. Na krótko wznowij przepływ medium, aby upewnić się, że poziom AUM w komorze centralnej osiągnął otwór obserwacyjny, po czym zatrzymaj przepływ.
  7. Należy pozostawić kultury w modelu pęcherza na 1 h w celu ich adaptacji przed włączeniem przepływu pożywki. poprzez pompę perystaltyczną z prędkością ok. 0,75 mL/min.
  8. Podczas gdy szczepionka się stabilizuje, należy przygotować rozcieńczenia z próbki pobranej z komory centralnej.
    1. Wykonaj rozcieńczenia seryjne 100 µL próbki w 900 µL sterylnym PBS, aż do rozcieńczenia próbki do 10-7Wysiać na płytki 10 µL nanosi się krople rozcieńczeń w trzech powtórzeniach na odpowiednie podłoża stałe, a następnie inkubuje w 37 °C przez noc.
    2. Po inkubacji należy policzyć kolonie na każdej z płytek z rozcieńczeniami i obliczyć dokładną liczbę CFU/ml początkowego inokulum.
      UWAGA: W przypadku użycia gatunków wykazujących tendencję do gromadzenia się (rojenia), tj. Proteus mirabilisużyj agaru MacConkey bez soli (pepton 20,0 g/l, laktoza 10,0 g/l, sole żółciowe 5,0 g/l, czerwień neutralna 0,075 g/l i agar 12,0 g/l), aby zapewnić widoczność pojedynczych kolonii w celu ułatwienia ich liczenia.
  9. Po 1 h inkubacji włącz przepływ medium poprzez uruchomienie pompy perystaltycznej in vitro modele pęcherza moczowego, odnotowując czas ich uruchomienia.

4. Obliczanie szybkości przepływu w modelu pęcherza in vitro

  1. Po zaszczepieniu modeli in vitro i rozpoczęciu przepływu pożywki, należy pozostawić modele do pracy przez 4 h. Na krótko przerwać przepływ pożywki i zebrać całą objętość pozostałego AUM z worka odpadowego do kolby miarowej poprzez port drenażowy. Odnotować zebraną objętość.
    UWAGA: Szybkość przepływu można obliczyć na podstawie objętości pożywki zebranej w kroku 2.7., jednak dokładniejsze wartości szybkości przepływu można uzyskać, prowadząc modele przez dłuższy czas (tj. zalecane 4 h), ponieważ zmniejsza to prawdopodobieństwo, że resztkowe powietrze w przewodach obwodu pożywki wpłynie na obliczoną szybkość przepływu.
  2. Wznowić przepływ pożywki za pomocą pompy perystaltycznej, upewniając się, że port drenażowy worka odpadowego jest zamknięty, aby zachować sterylność układu drenażowego.
  3. Aby obliczyć rzeczywistą szybkość przepływu w modelach in vitro, należy zastosować następujące równanie:
    Równanie szybkości przepływu; wzór objętość/czas, obliczenia analityczne dla badania dynamiki płynów.
    UWAGA: Aby odtworzyć ludzką produkcję moczu, zaleca się szybkości przepływu w zakresie 0.55-1.0 mL/min.
  4. Jeśli obliczona szybkość przepływu pożywki wykracza poza dopuszczalny zakres, należy odrzucić powtórzenie i dostosować liczbę obrotów na minutę (rpm) pompy perystaltycznej, aby zmieścić się w dopuszczalnym zakresie.

5. Pobieranie komórek planktonicznych z modelu pęcherza in vitro

UWAGA: Modele pęcherza in vitro należy rutynowo próbkować w trakcie całego eksperymentu, aby monitorować dynamikę populacji. Wszystkie modele powinny zostać poddane próbkowaniu bezpośrednio po inokulacji, w momencie aktywacji przepływu AUM, 4 h po inokulacji (podczas obliczania szybkości przepływu) oraz w momencie zakończenia pracy z modelami (w przypadku zablokowania lub osiągnięcia predetermined endpoint). W przypadku prowadzenia modeli przez >24 h zaleca się pobieranie próbek co 24 h w celu monitorowania CFU/mL; dodatkowe próbki można pobierać zgodnie z potrzebami użytkownika.

  1. Zdezynfekuj korek modelu pęcherza 70% etanolem, a następnie zdejmij go, aby uzyskać dostęp do komory centralnej.
  2. Omijając końcówkę cewnika i balonik, delikatnie wymieszaj zawartość komory centralnej za pomocą pipety serologicznej.
  3. Za pomocą pipety serologicznej pobierz z komory próbkę o objętości 10 mL i przenieś ją do sterylnej probówki. Natychmiast zdezynfekuj korek 70% etanolem i załóż go z powrotem, aby zamknąć sterylny obwód drenażu.
  4. Za pomocą pipety pobierz 1 mL z próbki i przenieś do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL w celu wykonania rozcieńczeń seryjnych.
  5. Zmierz pH pozostałej części próbki za pomocą pH-metru, upewniając się, że próbka została dokładnie wymieszana, a pH-metr skalibrowany przed użyciem.
  6. Wykonaj rozcieńczenia seryjne zarezerwowanej alikwoty 1 mL z próbki i wysiej na odpowiednie podłoża stałe, zgodnie z opisem w kroku 3.8., wysiewając wszystkie rozcieńczenia.
    UWAGA: Próbki planktoniczne pobrane z modelu pęcherza nadają się do innych analiz, w tym do zastosowań w biologii genomowej lub molekularnej (opcjonalnie).

6. Pobieranie komórek związanych z biofilmem z modelu pęcherza in vitro

  1. Usunięcie i przygotowanie cewnika
    UWAGA: Pobieranie próbek biofilmu z modeli pęcherza in vitro jest analizą końcową, wymagającą dezaktywacji modeli i usunięcia cewników w celu ich przetworzenia.
    1. Odłącz worek na odpady od cewnika i opróżnij model z resztek moczu poprzez spuszczenie powietrza z balonika. Usuń cewnik z dna modelu za pomocą sterylnej pęsety.
    2. Umieść usunięty cewnik na sterylnej płytce i za pomocą sterylnego skalpela przetnij cewnik w wymaganych punktach w celu sekcjonowania (przedstawiono na Rysunku 2).
    3. Upewnij się, że sekcje cewnika są przecięte wzdłużnie w celu odsłonięcia światła; następnie, używając sterylnej pęsety, zanurz sekcję cewnika 3 razy w sterylnym PBS, aby usunąć nieprzylegające komórki.
      UWAGA: Jeśli sekcje cewnika mają być obrazowane w dalszej kolejności, np. za pomocą SEM, pozostaw sekcje o długości 1 cm w całości (nie przecinaj ich wzdłużnie), a zamiast tego usuń nadmiar wilgoci ze światła cewnika sterylnym ręcznikiem papierowym przed utrwaleniem.
  2. Destrukcja biofilmu w celu wyznaczenia CFU/mL
    UWAGA: Protokoły szczegółowo opisujące destrukcję komórek związanych z biofilmem mogą wymagać dalszej optymalizacji, jeśli biofilmy są w znacznym stopniu krystaliczne lub śluzowate.
    1. Inkubuj przygotowaną sekcję cewnika w 0,25% trypsynie w 37 °C przez 30 min. Objętość użytej trypsyny powinna być minimalna, niezbędna do zakrycia cewnika; np. dla sekcji cewnika o długości 1 cm przeciętej prostopadle wystarczające jest 1 mL 0,25% trypsyny.
    2. Po inkubacji poddaj roztwór zawierający cewnik sonikacji przez 10 min. Sekcję cewnika można wówczas usunąć i zutylizować. Aby zdezaktywować trypsynę, roztwór komórek należy natychmiast rozcieńczyć w sterylnym PBS i wysiać w celu zliczenia CFU na odpowiednich podłożach stałych, zgodnie z opisem w kroku 3.8.
  3. Ilościowe oznaczanie biofilmu na cewniku za pomocą barwienia fioletem krystalicznym
    1. Umieść przygotowane sekcje cewnika w dołkach odpowiednio dobranej płytki do mikrodołków o płaskim dnie. Użyj odpowiedniej objętości 0,1% roztworu fioletu krystalicznego, aby całkowicie zanurzyć sekcję cewnika, i inkubuj statycznie w temperaturze pokojowej przez 15 min. Upewnij się, że dołączono również sterylną sekcję cewnika jako kontrolę tła.
    2. Usuń sekcje cewnika z płytki i przenieś je na nową płytkę. Każdą sekcję cewnika przemyj dwukrotnie wodą destylowaną.
    3. Po płukaniu przenieś sekcje cewnika na nową płytkę i przykryj 33% kwasem octowym. Inkubuj przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    4. Usuń sekcję cewnika z płytki, a następnie za pomocą czytnika płytek zmierz OD595 nm dla każdego powtórzenia, wykorzystując dołki zawierające sterylne sekcje cewnika jako kontrole tła.

7. Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe w modelu pęcherza in vitro

UWAGA: Większość środków terapeutycznych ukierunkowanych na zwalczanie zakażeń układu moczowego związanych z cewnikowaniem jest kompatybilna ze standardowymi cewnikami Foleya; należy sprawdzić kompatybilność przed rozpoczęciem eksperymentów z modelem pęcherza in vitro.

  1. Antymikrobowe żele lubrykacyjne
    UWAGA: Aby zasymulować stosowanie środków lubrykacyjnych podczas wprowadzania cewnika, ten krok należy wykonać w trakcie kroku 2.1, bezpośrednio przed wprowadzeniem cewnika Foleya. Po wprowadzeniu cewnika model należy niezwłocznie podłączyć, a krok 2.6 należy pominąć, aby żel nie został rozcieńczony ani odprowadzony przed inokulacją. Inokulacja powinna odbyć się w tym samym dniu, co wprowadzenie cewnika. Środki lubrykacyjne przeznaczone do stosowania z cewnikami są pakowane w pojedyncze, sterylne, jednorazowe strzykawki o objętości 6 mL lub 11 mL. Około 5 mL lubrykantu jest wystarczające, aby wypełnić szyjkę modelu pęcherza oraz pokryć podstawę modelu.
    1. Stosując technikę aseptyczną, wprowadź koniec strzykawki zawierającej środek lubrykacyjny do szyjki modelu pęcherza i wstrzyknij 5 mL żelu, aby wypełnić szyjkę i dotrzeć do podstawy komory.
    2. Obróć model tak, aby podstawa była równomiernie pokryta żelem, następnie wprowadź cewnik Foleya do modelu, przesuwając końcówkę cewnika przez żel, i zabezpiecz go, napełniając balonik w zwykły sposób.
    3. Podłącz model do reszty układu, a następnie napełnij światło modelu moczem, aż zacznie on wyciekać. Gdy tylko mocz zacznie wypływać przez otwór cewnika, zatrzymaj pompę, aby zapobiec utracie żelu przed inokulacją.
      1. Inkubuj modele przez 30 min, aby mocz osiągnął temperaturę 37 °C, a następnie przeprowadź inokulację modeli zgodnie z wcześniejszym opisem, aby zapewnić jednolity czas dyfuzji składników żelu do objętości moczu.
    4. Zinokuluj model zgodnie z opisem w kroku 3.5 i pozostaw go do inkubacji na 1 h przed włączeniem pomp perystaltycznych. W momencie włączania pompy pobierz 1 mL próbki planktonicznej i wysiej rozcieńczenia w celu określenia liczby CFU, zgodnie z opisem w kroku 3.8.
  2. Roztwory do irygacji
    UWAGA: Roztwory do irygacji są często dostępne w dużych opakowaniach zbiorczych lub w postaci pojedynczych, sterylnych, jednorazowych „worków”. W przypadku stosowania pojedynczych roztworów, przed rozpoczęciem eksperymentu upewnij się, że są one kompatybilne z portami drenażowymi używanych cewników. W przypadku stosowania roztworów do irygacji w opakowaniach zbiorczych, należy używać cewników trójswiatełkowych i stosować się do instrukcji producenta w celu określenia objętości/ram czasowych podawania produktu.
    1. Przed rozpoczęciem leczenia uruchom modele in vitro na co najmniej 4 h, aby zapewnić społecznościom związanym z biofilmem odpowiedni czas na uformowanie się. Po 4 h pracy modeli wstrzymaj przepływ medium i pobierz próbkę przed leczeniem z wewnętrznej komory modeli in vitro , zgodnie ze szczegółami w kroku 5.
      UWAGA: W przypadku stosowania roztworów do irygacji w opakowaniach zbiorczych, przejdź do kroku 7.2.5.
    2. W przypadku stosowania pojedynczego „worka” z roztworem do irygacji, odłącz worek na odpady od cewnika i użyj dostarczonego z workiem korka, aby zamknąć worek na odpady. Natychmiast podłącz worek z roztworem do irygacji do cewnika i, wywierając lekki nacisk, wciśnij produkt do światła centralnego. Stosuj zgodnie z instrukcjami producenta (np. aplikacja przez 15 min).
    3. Po zakończeniu zalecanego leczenia pozwól pozostałemu roztworowi odpłynąć z wewnętrznej komory poprzez otwór cewnika do worka z irygantem, a następnie odłącz worek. Pozostała zawartość worka może zostać zutylizowana lub wykorzystana w dalszych analizach.
    4. Zesterylizuj port drenażowy cewnika oraz port połączenia worka na odpady 70% etanolem i połącz je ponownie, tworząc sterylny, zamknięty system drenażu.
      UWAGA: Przejdź do kroku 7.2.7 w przypadku stosowania worków do irygacji.
    5. W przypadku stosowania cewnika trójswiatełkowego, zdezynfekuj port światła irygacyjnego 70% etanolem i niezwłocznie rozpocznij irygację za pomocą sterylnej strzykawki zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Przed irygacją zmierz objętość pozostałego moczu w worku na odpady, aby można było uwzględnić tę wartość w późniejszych obliczeniach czasu zablokowania lub szybkości przepływu.
    6. Po zakończeniu irygacji wyrzuć strzykawkę oraz wszelki pozostały roztwór do irygacji znajdujący się w worku na odpady.
    7. Pobierz próbkę po leczeniu z centralnej komory modelu pęcherza in vitro , zgodnie ze szczegółami w kroku 5, i wznów przepływ AUM poprzez pompę perystaltyczną, aby kontynuować eksperyment.

8. Zakończenie eksperymentów w modelu pęcherza in vitro

UWAGA: Organizmy ureazy-dodatnie, takie jak P. mirabilis, mogą powodować niedrożność cewników moczowych poprzez tworzenie krystalicznego biofilmu. Niedrożność może zatem służyć jako biologicznie istotny punkt końcowy dla modeli pęcherza in vitro i jest identyfikowana wizualnie poprzez całkowite zatkanie otworów cewnika krystalicznymi biofilmami oraz wzrost objętości AUM w komorze centralnej szklanego „pęcherza” (Rycina 3).

  1. Po osiągnięciu przez modele pęcherza in vitro predeterminowanego punktu końcowego, którym może być zator lub określony czas pracy, należy wyłączyć przepływ AUM za pomocą pompy perystaltycznej i pobrać próbkę końcową z komory centralnej zgodnie z opisem w kroku 5.
  2. Wyłączyć przepływ w łaźni wodnej i odłączyć rurki obwodu medium oraz rurki obwodu łaźni wodnej od modeli pęcherza in vitro .
  3. Wyjąć korki z modeli pęcherza in vitro i usunąć całą objętość pozostałego moczu za pomocą pipety serologicznej. Właściwie zutylizować wszelkie zanieczyszczone media (tj. wysterylizować w autoklawie).
  4. Opróżnić worki na odpady i usunąć wszelkie pozostałe media. Odłączyć worki na odpady z cewników od portu cewnika i je zutylizować.
  5. Za pomocą strzykawki powoli spuścić powietrze z baloników cewnika przed usunięciem cewników z modeli.
    UWAGA: W przypadku użycia gatunków bakteryjnych ureazy-dodatnich, cewniki mogą „przykleić się” do szklanych ścianek modeli in vitro . Należy unikać przykładania dużej siły do cewników i zamiast tego przejść do kroku 8.6.
  6. Namoczyć modele in vitro w 5% roztworze środków czyszczących przeciwdrobnoustrojowych (patrz Tabela materiałów) przez noc, a następnie dokładnie wypłukać wodą, aby upewnić się, że usunięto wszelkie pozostałości środka dezynfekcyjnego. Wysterylizować w autoklawie.
    UWAGA: W przypadku użycia gatunków ureazy-dodatnich, dodać 5% w/v kwasu cytrynowego do roztworu dezynfekcyjnego, aby pomóc rozpuścić wszelką biomineralizację w komorze centralnej. Ten roztwór kwasowy pomoże również uwolnić cewniki, które przykleiły się do modeli, poprzez rozkład krystalicznych złogów biofilmu.
  7. Odłączyć rurki obwodu medium od zbiornika AUM i usunąć wszelkie pozostałe media. Przepłukać rurki wodą, aby usunąć pozostałości AUM, a następnie wysterylizować w autoklawie.
  8. Aby obliczyć dokładny czas wystąpienia zatoru, należy odnotować końcową objętość w worku na odpady i użyć równania z kroku 4.4 oraz wcześniej obliczonego natężenia przepływu w celu określenia czasu zatoru.

Wyniki

Prawidłowe funkcjonowanie modelu pęcherza in vitro zależy od stosowania zasad aseptyki oraz uważnego monitorowania mętności medium podczas całego eksperymentu (Rycina 3). Przed inokulacją sterylny AUM w komorze centralnej modelu pęcherza in vitro miał bladożółty kolor i był przejrzysty (Rycina 3A). AUM w zbiorniku z medium powinno pozostać klarowne przez cały czas trwania eksperymentu, ponieważ wszelkie zmiany mętności mogą wskazywać na wytrącanie się soli z roztworu lub kontaminację medium. Jeśli AUM w zbiorniku lub w przewodach obiegu medium stanie się mętne lub wykaże drastyczną zmianę barwy, replikaty należy odrzucić i powtórzyć badanie. Po inokulacji wyraźnie widoczny jest wzrost mętności AUM w komorze centralnej modelu pęcherza in vitro (Rycina 3B). Zmiany mętności są często bardziej wyraźne w przypadku organizmów ureazy-dodatnich, takich jak P. mirabilis, jednak powinny być widoczne po inokulacji również w przypadku organizmów ureazy-ujemnych. Po uruchomieniu przepływu AUM często obserwuje się zmniejszenie jego mętności w wyniku wypłukiwania komórek planktonicznych, co nie oznacza braku żywych komórek w modelu. Monitorowanie poziomu medium w komorze centralnej może służyć również do określenia czasu wystąpienia blokady w przypadku użycia organizmów ureazy-dodatnich (Rycina 3C). Podczas pracy modelu otwór boczny oraz czubek cewnika powinny być całkowicie widoczne, co świadczy o prawidłowym odpływie do worków z odpadami. W momencie wystąpienia blokady poziom AUM w komorze centralnej podniesie się powyżej otworu bocznego i czubka cewnika, co oznacza, że eksperyment jest gotowy do końcowych pomiarów i zakończenia. Podczas eksperymentu efekty ciśnienia w obwodzie medium modelu pęcherza in vitro mogą sprawiać wrażenie, że modele są zablokowane. W przypadku podejrzenia blokady, przed zakończeniem testu należy sprawdzić, czy obwód AUM, cewnik i przewody worka z odpadami są napięte, ponieważ wszelkie pęcherzyki powietrza lub załamania przewodów mogą powodować powstanie „korków powietrznych” i uniemożliwiać drenaż przez cewnik.

Podczas eksperymentów z wykorzystaniem modelu pęcherza in vitro, pobieranie próbek planktonicznych może dostarczyć cennych informacji na temat dynamiki wzrostu w modelu, a także przebiegu CAUTI. Wzrost komórek, pH oraz tworzenie się biofilmu mogą być monitorowane przez cały czas trwania eksperymentu bez konieczności przerywania pracy z modelami (Rycina 4). W przypadku stosowania organizmów ureazy-dodatnich, obliczenia czasu zablokowania mogą służyć jako miara tempa tworzenia biofilmu i być wykorzystane do porównania właściwości różnych szczepów bakteryjnych (Rycina 4). Porównanie szczepu dzikiego P. mirabilis oraz mutanta LPS (insercja mini-tn5 do waaC) wykazało wydłużenie czasu do zablokowania, a tym samym zmniejszenie tworzenia biofilmu u mutanta (Rycina 4). Organizmy ureazy-ujemne zazwyczaj nie blokują modeli pęcherza in vitro, dlatego zaleca się ustalenie określonego punktu końcowego przed rozpoczęciem eksperymentu. W niektórych przypadkach organizmy ureazy-ujemne mogą doprowadzić do zablokowania cewnika. Na przykład szczepy Klebsiella pneumoniae ureazy-ujemne mogą wytwarzać rozległe, śluzowate biofilmy, jednak zazwyczaj zajmuje im to znacznie więcej czasu niż biofilmom ureazy-dodatnim w celu zablokowania odpływu, w związku z czym nadal zaleca się wyznaczenie punktu końcowego.

Pomiar pH podczas eksperymentów z modelem pęcherza może również dostarczyć informacji o różnicach między poszczególnymi szczepami, a także o postępach CAUTI. W przypadku wykorzystania organizmów ureazy-ujemnych, pH w komorze centralnej modelu pęcherza in vitro powinno pozostać w dużej mierze stabilne przez cały okres eksperymentu, choć spodziewane są niewielkie wahania pH wraz ze zmianami dynamiki populacji w czasie trwania doświadczenia. Inokulacja modeli in vitro organizmami ureazy-dodatnimi prowadzi do znacznego wzrostu pH w czasie, przy czym najwyższe wartości pH obserwuje się zazwyczaj w momencie zablokowania, kiedy odczyty pH mogą osiągać wartości rzędu ~8-9 (Rycina 4B).

Wyznaczenie liczby jednostek tworzących kolonie (CFU/mL) w planktonie jest istotnym elementem in vitro modelowanie pęcherza moczowego, co pozwala operatorom ocenić, czy inokulacja przebiegła pomyślnie oraz monitorować postępy eksperymentu. Pomiar CFU/ml na koniec eksperymentu może wykazać różnice w kolonizacji pęcherza moczowego pomiędzy różnymi szczepami bakterii. Podczas porównywania mini-Tn5 szczep mutanty P. mirabilis w porównaniu do typu dzikiego zaobserwowano istotny spadek liczby JCF/ml w momencie blokady (Rycina 4C). Ponadto wyliczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) z biofilmu na powierzchni cewnika oraz kwantyfikacja biomasy biofilmu mogą dostarczyć informacji na temat zdolności różnych patogenów do kolonizacji cewnikowanych dróg moczowych. Do określenia różnic w tworzeniu biofilmu między szczepem typu dzikiego a P. mirabilis szczep HI4320 oraz izolaty pasażowane w chlorheksydynie (Rycina 5). Pomiary gęstości optycznej przy 595 nm wykazały, że izolaty pasażowane w obecności chlorheksydyny wykazywały zmniejszenie tworzenia biofilmu w porównaniu z typem dzikim oraz kontrolami pasażowanymi bez chlorheksydyny.

Ponieważ celem modelu pęcherza in vitro jest dokładne odtworzenie niszy CAUTI, modele te mogą być również wykorzystywane do badania efektów terapeutyków przeciwdrobnoustrojowych ukierunkowanych na leczenie CAUTI w środowisku istotnym klinicznie. W przypadku organizmów ureazy-dodatnich, porównanie czasu wystąpienia niedrożności w modelach leczonych i nieleczonych może dostarczyć cennych informacji na temat skuteczności terapii. Leczenie modeli pęcherza in vitro zaszczepionych P. mirabilis roztworem do irygacji pęcherza zawierającym 0,02% chlorheksydyny znacząco wydłużyło czas do wystąpienia niedrożności w porównaniu z modelami nieleczonymi lub leczonymi 0,9% solą fizjologiczną (Rysunek 6A). Ponadto model pęcherza in vitro może być wykorzystany do badania aktywności bakteriobójczej terapeutyków przeciwdrobnoustrojowych. Monitorowanie zmian w CFU/mL komórek planktonicznych i związanych z biofilmem po zastosowaniu leczenia przeciwdrobnoustrojowego może wskazać, czy terapie są skuteczne. Leczenie modeli pęcherza in vitro zaszczepionych P. mirabilis wykazało redukcję planktonicznych CFU/mL o >7-log natychmiast po zastosowaniu preparatu zgodnie z instrukcją producenta, w porównaniu z modelami nieleczonymi i irygowanymi 0,9% solą fizjologiczną (Rysunek 6B).

Schemat zestawu bioreaktora; schemat pokazujący przepływ mediów i wody, metodologia bioprocesu.
Rysunek 1: Schemat głównych komponentów modelu pęcherza in vitro. (A) Model pęcherza (zamknięty system drenażu): (1) dwuścienna komora szklana symulująca pęcherz (2) wlot mediów, AU jest dostarczane poprzez pompę perystaltyczną do wewnętrznej komory modelu pęcherza (3) wlot wody dostarczanej poprzez cyrkulacyjną łaźnię wodną do komory zewnętrznej (4) wylot wody (5) cewnik Foleya, wprowadzony do komory wewnętrznej (6) punkt połączenia światła drenażowego; punkt połączenia dla worka na odpady/worków do irygacji (7) worek drenażowy zbierający odpływ moczu. (B) Schemat przedstawiający konfigurację modelu pęcherza in vitro oraz kierunek przepływu mediów i wody przez model. Sztuczny mocz jest przechowywany w zbiorniku z mediami (1) w temperaturze pokojowej i dostarczany do modelu poprzez pompę perystaltyczną (2) ze stałą prędkością przepływu ~ 0,75 mL min-1 przez cały czas trwania eksperymentu. Media wpływają do centralnej komory dwuściennego naczynia szklanego reprezentującego pęcherz (3) i odpływają poprzez otwór cewnika Foleya (4) do worka drenażowego (5), co dopełnia sterylny zamknięty system drenażu. Model pęcherza in vitro jest utrzymywany w stałej temperaturze 37 °C poprzez cyrkulacyjną łaźnię wodną (6), która przepływa przez komorę zewnętrzną dwuściennego naczynia szklanego. Linie przerywane reprezentują rurki silikonowe, a strzałki reprezentują kierunek przepływu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat cewnika balonowego, ustawienie w stanie spłaszczonym z kanałami drenażowymi i nadmuciania do procedury medycznej.
Rycina 2: Sekcjonowanie cewników moczowych w celu przetworzenia komórek związanych z biofilmem. Przykładowe punkty na cewniku moczowym do wycięcia w celu późniejszej kwantyfikacji biofilmu. (A) Cewniki są najpierw sekcjonowane poprzecznie w obszarze 8 cm proksymalnie od końcówki/otworów odpływowych (gdzie obserwuje się największą formację biofilmu). Za pomocą skalpela wycina się fragmenty o długości 1 cm, zazwyczaj unikając obszaru zawierającego spłaszczony balon cewnika ze względu na trudności w powtarzalności przetwarzania (1-3). (B) Po wstępnym pocięciu cewników na kawałki o długości 1 cm, wykonuje się kolejne cięcie wzdłuż centralnego światła, aby odsłonić obecny biofilm do dalszej kwantyfikacji, np. oznaczania CFU/mL lub barwienia fioletem krystalicznym. Linie przerywane reprezentują punkty sekcjonowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Układ do chromatografii kolumnowej z buforami, elucją białek, etapami procesu oczyszczania.
Rysunek 3: Etapy eksperymentu z wykorzystaniem modelu pęcherza in vitro. Zdjęcia komory centralnej modelu pęcherza in vitro na różnych etapach eksperymentu. (A) AUM w komorze centralnej modelu pęcherza in vitro przed inokulacją. Pożywka w komorze centralnej jest całkowicie przezroczysta, co świadczy o pomyślnej sterylizacji, a końcówka cewnika i otwory boczne są widoczne powyżej poziomu pożywki, co wskazuje na prawidłowe drenażowanie przez cewnik. (B) Pożywka w komorze centralnej modelu pęcherza in vitro po inokulacji P. mirabilis (4 h po inokulacji). Pomyślna inokulacja objawia się zwiększoną mętnością pożywki. Widoczność końcówki cewnika i otworów bocznych wskazuje, że AUM jest skutecznie odprowadzane przez cewnik i nie doszło do jego zablokowania. (C) Przykład zablokowanego modelu pęcherza in vitro. Inokulacja P. mirabilis oraz następujące po niej tworzenie biofilmu i mineralizacja doprowadziły do zablokowania otworów bocznych cewnika, co uniemożliwiło drenaż i spowodowało podniesienie się poziomu pożywki w komorze centralnej powyżej końcówki cewnika. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy słupkowe porównujące szczepy WT i mutanty: czas zablokowania, pH, CFU/mL, wraz z analizą statystyczną.
Rycina 4: Pomiary końcowe dla modelu pęcherza in vitro prowadzonego do momentu zablokowania. Przykładowe pomiary końcowe w momencie zablokowania w modelu pęcherza in vitro zaszczepionego klinicznym szczepem P. mirabilis, RS47 (WT) oraz szczepem mutantem o osłabionej zdolności tworzenia biofilmu, RS47-2 (Mutant). (A) Czas zablokowania (h) szczepów WT i mutantów P. mirabilis. (B) pH w modelach pęcherza in vitro w momencie zablokowania. (C) CFU/mL komórek planktonicznych w komorze modelu pęcherza in vitro w momencie zablokowania. Wszystkie dane reprezentują średnią z pięciu powtórzeń biologicznych. Słupki błędów przedstawiają błąd standardowy średniej (SEM). *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Clarke et al.46. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy przedstawiający wyniki absorbancji OD_595nm w eksperymencie fotometrycznym wraz z analizą statystyczną.
Rycina 5: Pomiary komórek związanych z biofilmem w modelu pęcherza in vitro . Ilościowe oznaczenie tworzenia biofilmu przez P. mirabilis , porównujące szczep dziki HI4320 z populacjami adaptowanymi, pasażowanymi z dodatkiem lub bez dodatku chlorheksydyny (CHD), poprzez barwienie fioletem krystalicznym i pomiar gęstości optycznej (OD) przy 595 nm. WT: P. mirabilis HI4320; 1, 3, 5: kontrole pasażowania bez ekspozycji na CHD; 2, 4, 6: HI4320 pasażowany w 4 µg/ mL CHD. Wszystkie dane przedstawiają średnią z pięciu powtórzeń biologicznych. Słupki błędów przedstawiają SEM. *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy przedstawiający czas zablokowania i CFU/mL; próbki nieleczone i leczone, istotność statystyczna.
Rysunek 6: Pomiary z modeli pęcherza moczowego in vitro po leczeniu przeciwdrobnologicznym. Próbki planktoniczne pobrano z modelu pęcherza moczowego in vitro zaszczepionego P. mirabilis, po płukaniu 0,02% roztworem przeciwdrobnologicznym chlorheksydyny (100 mL) lub kontrolnym roztworem soli fizjologicznej 0,9%. (A) Czas zablokowania modeli pęcherza moczowego in vitro po płukaniu. (B) Planktoniczne CFU/mL bezpośrednio po leczeniu poprzez płukanie. Wszystkie dane przedstawiają średnią z pięciu powtórzeń biologicznych. Słupki błędów wskazują SEM. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; ***p ≤ 0,0001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Cewnikowane drogi moczowe stanowią złożoną niszę biologiczną, która może być trudna do odtworzenia w środowisku laboratoryjnym. Model pęcherza moczowego in vitro został zaprojektowany w celu symulacji CAUTI i wykorzystuje standardowe cewniki moczowe do odtworzenia sterylnego, zamkniętego systemu drenażu stosowanego w praktyce klinicznej. Cewnikowane drogi moczowe są bardzo podatne na infekcje, o czym świadczą cewniki moczowe będące największym pojedynczym czynnikiem ryzyka rozwoju CAUTI 6,55. Proporcjonalnie, staranna technika aseptyczna ma kluczowe znaczenie dla powodzenia badania modeli pęcherza in vitro. Zmętnienie AUM jest wyraźnym wskaźnikiem sterylności, ponieważ zanieczyszczone lub przeterminowane pożywki z czasem staną się mętne, co będzie wymagało wyrzucenia wszystkich powtórzeń. Podczas zaszczepiania i pobierania próbek z modelu pęcherza moczowego in vitro należy również stosować staranną technikę aseptyczną, ponieważ otwarcie centralnej komory w celu dodania przygotowanego inokulum przerywa sterylny, zamknięty system drenażowy, co sprawia, że model pęcherza in vitro jest podatny na zanieczyszczenie. Aby uniknąć zanieczyszczenia komory centralnej, cewniki o potrójnym prześwicie mogą być używane do pobierania próbek populacji komórek planktonowych (poprzez zaciśnięcie światła odpadowego i opróżnienie przez dodatkowe światło). Oczekuje się, że w ciągu 4 godzin nastąpi pewne wypłukanie, ale może być konieczne rozwiązywanie problemów, jeśli w tym momencie nie zostaną wyliczone żadne żywotne komórki planktonowe. Jeśli po 4 godzinach nie zostaną zliczone żadne żywe komórki, może być konieczne zoptymalizowanie gęstości inokulum lub preparatu AUM, aby lepiej wspierać kolonizację bakteryjną. Dodatkowo, wypłukiwanie inokulum może wskazywać na problem z obwodem pożywki; Załamania w rurkach mogą uniemożliwić odpowiedni drenaż, powodując gromadzenie się toksycznych metabolitów, które mogą utrudniać rozwój bakterii, podczas gdy wszelkie resztki środka dezynfekującego używane do przepłukiwania przewodów mediów mogą mieć działanie bakteriobójcze.

Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie AUM, jak wcześniej opisali Nzakizwanayo i wsp., ponieważ został on wcześniej zatwierdzony do stosowania w modelu pęcherza in vitro z widocznymi patogenami CAUTI, w tym Proteus mirabilis i Escherichia coli 43,45,46,48 . Istnieje jednak możliwość modyfikacji preparatu AUM zastosowanego w protokole w celu selekcji pod kątem wzrostu innych patogenów. Opublikowano wiele różnych formuł AUM, które mogą być stosowane w obiegu medialnym 28,56,57,58,59,60. Dodatkowo AUM w zbiorniku pożywki może być uzupełniany składnikami odżywczymi lub antybiotykami w celu selekcji do wzrostu określonych patogenów. Historycznie rzecz biorąc, modele pęcherza moczowego in vitro były również dostarczane z kałużą ludzkiego moczu, jednak duże ilości pożywki wymagane do przeprowadzenia replikacji modelu pęcherza in vitro mogą sprawić, że pobieranie próbek ludzkich będzie niepraktyczne53,54. Co więcej, skład ludzkiego moczu może się znacznie różnić między próbkami pobranymi od pacjentów, wpływając na odtwarzalność eksperymentu, ponieważ wykazano, że różnice w stężeniu hormonów, soli i białek, a także stan nawodnienia, wpływają na wzrost bakterii i tworzenie biofilmu 38,39,61,62.

Powyższy protokół szczegółowo opisuje inokulację modelu pęcherza in vitro za pomocą ~1010 CFU/ml replikujących CAUTI w późnym stadium. Jednak miejsce inokulacji modelu pęcherza moczowego in vitro może zostać zmodyfikowane w przyszłych testach, aby lepiej odtworzyć wcześniejsze etapy CAUTI, tj. początkową kolonizację cewnika moczowego i wzniesienie do pęcherza moczowego. Ręczne zanieczyszczenie cewników Foleya znanym inokulum bakteryjnym przed skonfigurowaniem modeli in vitro może dostarczyć informacji na temat wczesnych stadiów CAUTI. Rzeczywiście, gęstość inokulum została zmodyfikowana w poprzednich pracach w celu odtworzenia infekcji we wcześniejszym stadium; na przykład Nzakizwanayo i wsp. inokulowane modele pęcherza moczowego in vitro z niższym wyjściowym CFU/ml (ok. 103 CFU/ml) w celu replikacji infekcji we wcześniejszym stadium47. Warto jednak zauważyć, że zmiana gęstości inokulum może spowodować wydłużenie czasu do zablokowania i wymaga dodatkowej walidacji przed eksperymentami.

Ponadto, podczas gdy protokół szczegółowo opisuje inokulację modelu in vitro monokulturą bakteryjną, istnieje możliwość inokulacji modeli patogenami grzybowymi. Wcześniejsze badania sugerowały, że do 8% CAUTI wynika z zakażenia Candida spp., który jest zdolny do wytwarzania biofilmów, które często są oporne na leczenie przeciwgrzybicze27,63. Co więcej, model pęcherza moczowego in vitro może być modyfikowany w celu uwzględnienia badania wielodrobnoustrojowego CAUTI. Rzeczywiście, zasugerowano, że do 86% CAUTI to infekcje wielodrobnoustrojowe, a infekcje te często wiążą się z poważniejszymi objawami i wyższą śmiertelnością niż infekcje jednogatunkowe 27,64,65,69. Modele in vitro mogą być inokulowane wieloma gatunkami w celu zbadania powstawania biofilmów polimikrobiologicznych i progresji CAUTI, ale przed inokulacją należy przeprowadzić staranną walidację społeczności polimikrobiologicznych i modyfikację gęstości inokulum. W poprzednich badaniach wykorzystano model pęcherza in vitro do monitorowania różnic w tworzeniu biofilmu u pojedynczych gatunków P. mirabilis CAUTI w porównaniu z dwugatunkowymi CAUTI z E. faecalis, podkreślając wzajemne oddziaływanie metaboliczne między szczepami, co skutkowało zwiększonym tworzeniem biofilmu w porównaniu z infekcją pojedynczym gatunkiem70.

Główną zaletą wykorzystania modelu pęcherza moczowego in vitro do badania CAUTI, jest możliwość obserwacji powstawania biofilmu na powierzchni standardowego cewnika moczowego. Tworzenie biofilmów w CAUTI jest często inicjowane przez tworzenie się filmów kondycjonujących na świetle cewnika, składających się z organicznych składników moczu, do których mogą przylegać uropatogeny, przed proliferacją i utworzeniem dojrzałych biofilmów 2,18,71,72,73 . Standardowe testy stosowane do badania tworzenia biofilmu często wykorzystują standardowe pożywki bakteryjne zamiast AUM i często opierają się na przyleganiu do mikropłytek lub kołków polistyrenowych, tj. urządzenia z Calgary; jednak wcześniejsze prace sugerowały, że środowisko odżywcze, pH i poziom tlenu w systemie, a także właściwości fizyczne, takie jak przepływ i różnica w strukturze powierzchni (silikon kontra tworzywa sztuczne), mogą wpływać na tworzenie biofilmu 36,37,74,75,76,77,78. Dodatkowo, hodowla bakterii o dużej aktywności ureazy, takich jak P. mirabilis w systemie zamkniętym w AUM, może powodować gromadzenie się toksycznych metabolitów, co może prowadzić do śmierci komórki78,79. Jest to złagodzone w modelu pęcherza in vitro, ponieważ AUM w komorze centralnej jest stale zastępowane świeżymi pożywkami za pośrednictwem obwodu pożywki, co pozwala na badanie biofilmów CAUTI w bardziej istotnych klinicznie warunkach45. Codzienny przebieg modelu pęcherza moczowego in vitro i punkt końcowy wybrany dla modeli w dużej mierze zależy od tego, czy modele są inokulowane organizmami ureazowo-dodatnimi czy ujemnymi. Teoretycznie modele in vitro mogą działać w nieskończoność, jeśli są dostarczane z odpowiednią ilością AUM i jeśli zachowana jest sterylność modelu; Zaleca się jednak, aby przed eksperymentowaniem wybrać punkt końcowy, niezależnie od tego, czy jest to blokada, czy dowolna liczba dni. Ogólnie zaleca się, aby modele in vitro zaszczepione organizmami ureazowo-ujemnymi były uruchamiane przez ≤7 dni w celu symulacji środowiska klinicznego, ponieważ jest to zazwyczaj wystarczające do zaobserwowania tworzenia się biofilmu w większości organizmów, przy jednoczesnym zachowaniu zgodności z interwencjami klinicznymi, ponieważ standardowa najlepsza praktyka wskazuje, że cewniki należy wymienić po widocznym zakażeniu1, 2,3,47,48. Chociaż organizmy ureazowo-dodatnie mogą wytwarzać krystaliczne biofilmy, istnieje duża zmienność wśród szczepów ureazo-dodatnich w czasie do zablokowania modelu pęcherza in vitro, przy czym niektóre szczepy Proteus mirabilis powodują zablokowanie cewnika w czasie krótszym niż 10 godzin, a inne potrzebują ponad 30 godzin na zablokowanie39,46. Standardowy test ureazy może być stosowany przed eksperymentami z modelami pęcherza in vitro w celu określenia, czy należy uruchomić modele do zatkania, czy też do wstępnie zdefiniowanego punktu końcowego80.

Być może głównym ograniczeniem stosowania modelu pęcherza moczowego in vitro do badania tworzenia biofilmu jest to, że pomiary biofilmu są odczytem końcowym, ponieważ wymagają usunięcia i wypreparowania cewnika moczowego. I odwrotnie, próbki planktonu można pobrać z modelu pęcherza in vitro w dowolnym momencie podczas eksperymentów. Dodatkowo, po pobraniu próbek biofilmu z modeli pęcherza moczowego in vitro, można zastosować wiele dodatkowych technik dalszych w celu lepszego ilościowego określenia produkcji biofilmu. W poprzednich badaniach wykorzystano fotometrię płomieniową do ilościowego określenia ilości wapnia i magnezu obecnych w krystalicznych biofilmach, a bardziej złożone barwienia można wykorzystać do dokładnej identyfikacji składników matrycy EPS biofilmów ureazowo-ujemnych 45,73,81,82,83,84.

W pracy opisano również zastosowanie modelu pęcherza moczowego in vitro do badania efektów terapii ukierunkowanych na leczenie CAUTI. Model pęcherza moczowego in vitro symuluje ważne aspekty niszy CAUTI, takie jak zastosowanie AUM, a także klinicznie istotne tworzenie biofilmu i zwiększone obciążenie organiczne obserwowane w CAUTI. Środki terapeutyczne, takie jak antybiotyki, mogą być dodawane bezpośrednio do zbiornika AUM, aby symulować klinicznie istotną biodostępność leku, a wcześniejsze badania wykorzystywały leki o zmienionym przeznaczeniu, takie jak tiorydazyna i fluoksetyna, aby wykazać działanie przeciwbiofilmowe81. Ponadto testy minimalnego stężenia hamującego i testy zawiesiny bakteryjnej są często stosowane w celu wywnioskowania aktywności przeciwdrobnoustrojowej biocydów, chociaż istnieje niewiele dowodów sugerujących, że testy korelują z wrażliwością biocydów w świecie rzeczywistym 41,85,86,87,88. Model pęcherza moczowego in vitro jest korzystny dla testowania produktów biobójczych mających na celu leczenie lub zapobieganie CAUTI, ponieważ obecność cewnika moczowego i bardziej reprezentatywna symulacja niszy CAUTI oznaczają, że produkty takie jak przeciwdrobnoustrojowe żele smarowe i roztwory do irygacji mogą być testowane zgodnie z instrukcjami producenta. W poprzednich badaniach wykorzystano również model pęcherza in vitro w celu określenia skuteczności terapii fagowej i wykazano, że leczenie fagami może wydłużyć czas blokowania modelu pęcherza in vitro o ponad 100 godzin47. Zastosowanie cewnika Foleya o standardowej wielkości w modelu pęcherza moczowego in vitro oznacza również, że nowatorskie, powlekane cewniki mogą być testowane pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Wcześniejsze prace Slate i wsp. wykazano, że cewniki pokryte teranotyczną powłoką cyprofloksacyny mogą wydłużyć czas do zablokowania P. mirabilis o ~60 godzin w pęcherzu in vitro model48. Podkreśla to potencjalne zastosowanie modelu pęcherza moczowego in vitro w badaniach nad nowymi terapiami mającymi na celu leczenie CAUTI, co pozwoli na dokładniejszą ocenę środków przeciwdrobnoustrojowych w biologicznie istotnej symulowanej niszy CAUTI.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Jonathanowi Nzakizwanayo i Dr. Anthony'emu J. Slate'owi za ich wspólną wiedzę w rozwijaniu tego protokołu. Praca na Uniwersytecie w Bath została sfinansowana przez Radę Badań Medycznych GW4 Biomed DTP jako stypendium dla V.B. (MR/N0137941/1). B. V. J. jest również wspierany przez fundusze z Dunhill Medical Trust (RPGF1906\171). Badania przeprowadzone przez O.E.C. zostały sfinansowane przez Kidney Research Northwest (RCN: 1144798). Rysunek 1 jest tworzony za pomocą Biorender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
313 Przedłużenie głowicy pompy Rapid-LoadPompa perystaltyczna Watson-Marlow313- dodatkowe przedłużenie głowicy 
323S/D Pompa o zmiennej prędkości sterowana ręcznieWatson-Marlow323S/DPompa perystaltyczna
3L Worki na łóżka, sterylne z kranami dźwigniowymi Opieka zdrowotna dla niedźwiedzi Great Bear GDW173
Rurka silikonowa utwardzana platyną o średnicy wewnętrznej 3 mmFisher10111801Rurka z małym obwodem AUM (podłącz rurkę pompy do modeli)
Rurka silikonowa utwardzana platyną o średnicy wewnętrznej 5 mmRurkaobwodu Fisher 10539201 Medium AUM (podłącz rurkę pompy do zbiornika AUM
) chlorek amonu (NH4Cl)Fisher11473713
bezwodny siarczan sodu (Na2SO4)Złącze
Azlon Fisher10712807Służy do łączenia różnych długości przewodów w obwodzie AUM
Wieszaki na torby na łóżko Opieka zdrowotna dla niedźwiedzi Great Bear 10705P
Zaciski rurki kurka Bochem, średnica 25 mmFisher11805101
chlorek wapnia (CaCl2)Fisher10021681
Monohydrat kwasu cytrynowego MerckC1909-500GSłuży do usuwania krystalicznego biofilmu z modeli po eksperymentach 
Marka rybacka  Pipety z podziałką szklaną klasy B typu 1Fisher11992168Służy do dostarczania modeli łopatek in vitro z AUM za pomocą zwierciadlanej
żelatynyVWR24360.233
Graphpad prism 10GraphPadV10.0Oprogramowanie analityczne służące do tworzenia wykresów wyników modeli pęcherza moczowego in vitro i analizy statystycznej. 
Miernik pH Hanna HI 2211-02Phillip Harris PP00057414
Model pęcherza moczowego < in vitro>-Sprzęt na zamówienie, jak wcześniej opisano przez Nzakizwanayo i in. (2019).
Instillagel 6 ml żel nawilżającymydoctorshop.co.uk40-006Żele smarujące stosowane w sekcji 7.1.; inni dostawcy są dostępni.
Kartell Plastilab Nierówny łącznik stożkowyFisher 11914289Służy do łączenia przewodów o różnych średnicach
Agar MacConkey bez soli (odwodniony)Fisher10472643Do oznaczania liczby pojedynczych kolonii bakterii rojowych, tj. Proteus mirabilis
chlorek magnezu sześciowodny (MgCl2.6H2O)Fisher10386743
fosforan monopotasowy (KH2PO4)Złącze Fisher10573181
Nalgene w kształcie litery YFisher10186070Służy do uruchamiania wielu obwodów AUM z jednego zbiornika AUM (1-4 modele na zbiornik) 
potasu (KCl)
Pyrex z bocznym gniazdem ze szkła szlifowanego, Pojemność: 5000 mlZbiornik Fisher11347884AUM
Korki gumowe z otworem, Średnica zewnętrzna: 37mm, Czerwona, Średnica: 37mmFisher11517612Stosowany w zbiorniku AUM oraz do zasilania modeli in vitro z AUM
Rozmiar 14 francuski 100% silikonowy cewnik Foleya ze sterylną strzykawką z wodą do pompowania Opieka zdrowotna dla niedźwiedzi Great Bear 4833-0514
chlorek sodu (NaCl)Fisher10735921
szczawian sodu (Na2C2O4)Fisher10442211
Teknon Biocleanse koncentrat biobójczy środek czyszczący 5L Fisher12447580Służy do sterylizacji modeli po eksperymentach
cytrynian trisodowy (Na3C6H5O7)Fisher11434993
bulion sojowy tryptonowyFisher10198002
mocznik (CH4N2O)Fisher10404185
Uro-Tainer M NaCl 0,9%B.BraunFB99833Worek do irygacji pęcherza soli fizjologicznej stosowany w sekcji 7.2. 
Watson-Marlow Pumpsil 1,6 mm rurka silikonowa utwardzana platyną o średnicy wewnętrznejFisher12406280Grube rurki obwodu AUM (do stosowania w pompie perstaltycznej)
stożkowe Fisher 11498717 chlorek Butelka z aspiratorem Fisher 10375810

Bibliografia

  1. Smith, D. R., et al. Epidemiology and health-economic burden of urinary-catheter-associated infection in English NHS hospitals: A probabilistic modelling study. J Hosp Infect. 103 (1), 44-54 (2019).
  2. Stickler, D. J. Bacterial biofilms in patients with indwelling urinary catheters. Nat Clin Pract Urol. 5 (11), 598-608 (2008).
  3. Feneley, R. C., Hopley, I. B., Wells, P. N. Urinary catheters: History, current status, adverse events and research agenda. J Med Eng Technol. 39 (8), 459-470 (2015).
  4. Lapides, J., Diokno, A. C., Silber, S. J., Lowe, B. S. Clean, intermittent self-catheterization in the treatment of urinary tract disease. J Urol. 107 (3), 458-461 (1972).
  5. Suetens, C., et al. Prevalence of healthcare-associated infections, estimated incidence and composite antimicrobial resistance index in acute care hospitals and long-term care facilities: Results from two European point prevalence surveys, 2016 to 2017. Euro Surveill. 23 (46), 1800516(2018).
  6. Nicolle, L. E. Catheter associated urinary tract infections. Antimicrob Resist Infect Control. 3, 23(2014).
  7. Jacobsen, S. M., Stickler, D. J., Mobley, H. L., Shirtliff, M. E. Complicated catheter-associated urinary tract infections due to Escherichia coli and Proteus mirabilis. Clinical Microbiol Rev. 21 (1), 26-59 (2008).
  8. Trautner, B. W., Darouiche, R. O. Role of biofilm in catheter-associated urinary tract infection. Am J Infect Control. 32 (3), 177-183 (2004).
  9. Garibaldi, R. A., Burke, J. P., Dickman, M. L., Smith, C. B. Factors predisposing to bacteriuria during indwelling urethral catheterization. N Engl J Med. 291 (5), 215-219 (1974).
  10. Warren, J. W., et al. Fever, bacteremia, and death as complications of bacteriuria in women with long-term urethral catheters. JInfect Dis. 155 (6), 1151-1158 (1987).
  11. Walker, J. N., et al. High-resolution imaging reveals microbial biofilms on patient urinary catheters despite antibiotic administration. World JUrol. 38 (9), 2237-2245 (2020).
  12. Chant, C., Smith, O. M., Marshall, J. C., Friedrich, J. O. Relationship of catheter-associated urinary tract infection to mortality and length of stay in critically ill patients: A systematic review and meta-analysis of observational studies. Crit Care Med. 39 (5), 1167-1173 (2011).
  13. Clarke, K., et al. Catheter-associated urinary tract infections in adults: Diagnosis, treatment, and prevention. J Hosp Med. 15 (9), 552-556 (2020).
  14. Tambyah, P. A., Maki, D. G. The relationship between pyuria and infection in patients with indwelling urinary catheters: A prospective study of 761 patients. Arch Intern Med. 160 (5), 673-677 (2000).
  15. Flemming, H. C., et al. Biofilms: An emergent form of bacterial life. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 563-575 (2016).
  16. Stewart, P. S., Costerton, J. W. Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. Lancet. 358 (9276), 135-138 (2001).
  17. Stewart, P. S. Mechanisms of antibiotic resistance in bacterial biofilms. Int J Med Microbiol. 292 (2), 107-113 (2002).
  18. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  19. Sabir, N., et al. Bacterial biofilm-based catheter-associated urinary tract infections: Causative pathogens and antibiotic resistance. Am JInfect Control. 45 (10), 1101-1105 (2017).
  20. Touzel, R., Sutton, J., Wand, M. Establishment of a multi-species biofilm model to evaluate chlorhexidine efficacy. JHosp Infect. 92 (2), 154-160 (2016).
  21. Luo, Y., Yang, Q., Zhang, D., Yan, W. Mechanisms and control strategies of antibiotic resistance in pathological biofilms. J Microbiol Biotechnol. 31 (1), 1-7 (2021).
  22. Dincer, S., Uslu, F. M., Delik, A. Antibiotic resistance in biofilm. Bacterial biofilms. , IntechOpen. (2020).
  23. Soto, S. M. Importance of biofilms in urinary tract infections: New therapeutic approaches. Adv Biol. 2014 (1), 543974(2014).
  24. Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends Microbiol. 13 (1), 34-40 (2005).
  25. Otto, S. B., et al. Privatization of biofilm matrix in structurally heterogeneous biofilms. MSystems. 5 (4), e00425-e00520 (2020).
  26. Wood, T. K., Knabel, S. J., Kwan, B. W. Bacterial persister cell formation and dormancy. Appl Environ Microbiol. 79 (23), 7116-7121 (2013).
  27. Gaston, J. R., Johnson, A. O., Bair, K. L., White, A. N., Armbruster, C. E. Polymicrobial interactions in the urinary tract: Is the enemy of my enemy my friend. InfectImmun. 89 (4), (2021).
  28. Griffith, D. P., Musher, D. Á, Itin, C. Urease. The primary cause of infection-induced urinary stones. Invest Urol. 13 (5), 346-350 (1976).
  29. Armbruster, C. E., Mobley, H. L. T., Pearson, M. M. Pathogenesis of Proteus mirabilis infection. EcoSal Plus. 8 (1), 1128(2018).
  30. Jacobsen, S. M., Shirtliff, M. E. Proteus mirabilis biofilms and catheter-associated urinary tract infections. Virulence. 2 (5), 460-465 (2011).
  31. Mobley, H. L., Warren, J. W. Urease-positive bacteriuria and obstruction of long-term urinary catheters. J Clin Microbiol. 25 (11), 2216-2217 (1987).
  32. Wasfi, R., Hamed, S. M., Amer, M. A., Fahmy, L. I. Proteus mirabilis biofilm: Development and therapeutic strategies. Front Cell Infect Microbiol. 10 (414), (2020).
  33. Broomfield, R. J., Morgan, S. D., Khan, A., Stickler, D. J. Crystalline bacterial biofilm formation on urinary catheters by urease-producing urinary tract pathogens: A simple method of control. J Med Microbiol. 58 (10), 1367-1375 (2009).
  34. Stickler, D. J. Clinical complications of urinary catheters caused by crystalline biofilms: Something needs to be done. J Intern Med. 276 (2), 120-129 (2014).
  35. Coffey, B. M., Anderson, G. G. Biofilm formation in the 96-well microtiter plate. Pseudomonas methods and protocols. , 631-641 (2014).
  36. Ceri, H., et al. The Calgary biofilm device: New technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clin Microbiol. 37 (6), 1771-1776 (1999).
  37. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J Microbiol Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  38. Bouatra, S., et al. The human urine metabolome. PloS one. 8 (9), e73076(2013).
  39. Holling, N., et al. Elucidating the genetic basis of crystalline biofilm formation in Proteus mirabilis. Infect Immun. 82 (4), 1616-1626 (2014).
  40. Lawrence, E., Turner, I. Materials for urinary catheters: A review of their history and development in the UK. Med Eng Phys. 27 (6), 443-453 (2005).
  41. Stickler, D. J. Chlorhexidine resistance in Proteus mirabilis. J Clin Pathol. 27 (4), 284-287 (1974).
  42. Fraise, A. P. Biocide abuse and antimicrobial resistance-a cause for concern. J Antimicrob Chemother. 49 (1), 11-12 (2002).
  43. Pelling, H., et al. Derepression of the smvA efflux system arises in clinical isolates of proteus mirabilis and reduces susceptibility to chlorhexidine and other biocides. Antimicrob Agents Chemother. 63 (12), e01535(2019).
  44. Stickler, D. J., Morris, N. S., Winters, C. Simple physical model to study formation and physiology of biofilms on urethral catheters. MethodsEnzymol. 310, 494-501 (1999).
  45. Nzakizwanayo, J., Pelling, H., Milo, S., Jones, B. V. An in vitro bladder model for studying catheter-associated urinary tract infection and associated analysis of biofilms. Proteus mirabilis: Methods and Protocols. , 139-158 (2019).
  46. Clarke, O. E., et al. Lipopolysaccharide structure modulates cationic biocide susceptibility and crystalline biofilm formation in Proteus mirabilis. Front Microbiol. 14, 1150625(2023).
  47. Nzakizwanayo, J., et al. Bacteriophage can prevent encrustation and blockage of urinary catheters by proteus mirabilis. Antimicrob Agents Chemother. 60 (3), 1530-1536 (2015).
  48. Slate, A. J., et al. Infection-responsive coatings to reduce biofilm formation and encrustation of urinary catheters. J Appl Microbiol. 134 (6), lxad121(2023).
  49. Maierl, M., Jörger, M., Rosker, P., Reisner, A. In vitro dynamic model of a catheterized bladder and biofilm assay. Bio Protoc. 5 (2), e1381(2015).
  50. Stickler, D., Clayton, C., Chawla, J. The resistance of urinary tract pathogens to chlorhexidine bladder washouts. J Hosp Infect. 10 (1), 28-39 (1987).
  51. King, J., Stickler, D. An assessment of antiseptic bladder washout solutions using a physical model of the catheterized bladder. J Hosp Infect. 18 (3), 179-190 (1991).
  52. King, J., Stickler, D. The effect of repeated instillations of antiseptics on catheter-associated urinary tract infections: A study in a physical model of the catheterized bladder. Urol Res. 20, 403-407 (1992).
  53. Morris, N., Stickler, D. Encrustation of indwelling urethral catheters by Proteus mirabilis biofilms growing in human urine. J Hosp Infect. 39 (3), 227-234 (1998).
  54. Stickler, D., Morgan, S. Observations on the development of the crystalline bacterial biofilms that encrust and block foley catheters. J Hosp Infect. 69 (4), 350-360 (2008).
  55. Stamm, W. E. Catheter-associated urinary tract infections: Epidemiology, pathogenesis, and prevention. Am J Med. 91 (3, Supplement 2), S65-S71 (1991).
  56. Sarigul, N., Korkmaz, F., Kurultak, I. A new artificial urine protocol to better imitate human urine. Sci Rep. 9 (1), 20159(2019).
  57. Brooks, T., Keevil, C. A simple artificial urine for the growth of urinary pathogens. Lett Appl Microbiol. 24 (3), 203-206 (1997).
  58. Ipe, D. S., Horton, E., Ulett, G. C. The basics of bacteriuria: Strategies of microbes for persistence in urine. Front CellI Infect Microbiol. 6 (14), 3389(2016).
  59. Ipe, D. S., Ulett, G. C. Evaluation of the in vitro growth of urinary tract infection-causing gram-negative and gram-positive bacteria in a proposed synthetic human urine (SHU) medium. J Microbioll Methods. 127, 164-171 (2016).
  60. Chutipongtanate, S., Thongboonkerd, V. Systematic comparisons of artificial urine formulas for in vitro cellular study. Anal Biochem. 402 (1), 110-112 (2010).
  61. Saude, E. J., Adamko, D., Rowe, B. H., Marrie, T., Sykes, B. D. Variation of metabolites in normal human urine. Metabolomics. 3, 439-451 (2007).
  62. Andersen, S., et al. Proteomes of uropathogenic Escherichia coli growing in human urine and in j82 urinary bladder cells. Proteomes. 10 (2), 15(2022).
  63. Uppuluri, P., Dinakaran, H., Thomas, D. P., Chaturvedi, A. K., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of Candida albicans biofilms grown in a synthetic urine medium. J Clin Microbiol. 47 (12), 4078-4083 (2009).
  64. Gaston, J. R., et al. Enterococcus faecalis polymicrobial interactions facilitate biofilm formation, antibiotic recalcitrance, and persistent colonization of the catheterized urinary tract. Pathogens. 9 (10), 835(2020).
  65. Warren, J. W., Tenney, J. H., Hoopes, J. M., Muncie, H. L., Anthony, W. C. A prospective microbiologic study of bacteriuria in patients with chronic indwelling urethral catheters. The JI Infect Dis. 146 (6), 719-723 (1982).
  66. Armbruster, C. E., et al. Genome-wide transposon mutagenesis of Proteus mirabilis: Essential genes, fitness factors for catheter-associated urinary tract infection, and the impact of polymicrobial infection on fitness requirements. PLoS Pathog. 13 (6), e1006434(2017).
  67. Armbruster, C. E., et al. The pathogenic potential of Proteus mirabilis is enhanced by other uropathogens during polymicrobial urinary tract infection. Infect Immun. 85 (2), e00808(2017).
  68. Siegman-Igra, Y., Kulka, T., Schwartz, D., Konforti, N. Polymicrobial and monomicrobial bacteraemic urinary tract infection. J Hosp Infect. 28 (1), 49-56 (1994).
  69. Nye, T. M., et al. Microbial co-occurrences on catheters from long-term catheterized patients. Nat Commun. 15 (1), 61(2024).
  70. Hunt, B. C., et al. Metabolic interplay between Proteus mirabilis and Enterococcus faecalis facilitates polymicrobial biofilm formation and invasive disease. mBio. 15, e02164(2024).
  71. Stickler, D., Ganderton, L., King, J., Nettleton, J., Winters, C. Proteus mirabilis biofilms and the encrustation of urethral catheters. Urol Res. 21, 407-411 (1993).
  72. Donlan, R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  73. Habash, M., Reid, G. Microbial biofilms: Their development and significance for medical device-related infections. J Clin Pharmacol. 39 (9), 887-898 (1999).
  74. Ommen, P., Zobek, N., Meyer, R. L. Quantification of biofilm biomass by staining: Non-toxic safranin can replace the popular crystal violet. J Microbiol Methods. 141, 87-89 (2017).
  75. Wilson, C., et al. Quantitative and qualitative assessment methods for biofilm growth: A mini-review. Research and Reviews: J Eng Technol. 6 (4), 30214915(2017).
  76. Niebergall, A. K., et al. Influence of polymerized siloxane coating on growth and biofilm formation of aerobic grown nosocomial bacteria. J Cell Biotechnol. 3 (2), 107-115 (2018).
  77. Ionescu, A., Brambilla, E., Sighinolfi, M. C., Mattina, R. A new urinary catheter design reduces in vitro biofilm formation by influencing hydrodynamics. J Hosp Infect. 114, 153-162 (2021).
  78. Pelling, H., et al. Bacterial biofilm formation on indwelling urethral catheters. Lett Appl Microbiol. 68 (4), 277-293 (2019).
  79. Schaffer, J. N., Pearson, M. M. Proteus mirabilis and urinary tract infections. Microbiol Spectr. 3 (5), 1128(2015).
  80. Konieczna, I., et al. Bacterial urease and its role in long-lasting human diseases. Curr Protein Pept Sci. 13 (8), 789-806 (2012).
  81. Nzakizwanayo, J., et al. Fluoxetine and thioridazine inhibit efflux and attenuate crystalline biofilm formation by Proteus mirabilis. Sci Rep. 7 (1), 12222(2017).
  82. Strathmann, M., Wingender, J., Flemming, H. C. Application of fluorescently labeled lectins for the visualization and biochemical characterization of polysaccharides in biofilms of Pseudomonas aeruginosa. J Microbiol Methods. 50 (3), 237-248 (2002).
  83. Van Den Driessche, F., Rigole, P., Brackman, G., Coenye, T. Optimization of resazurin-based viability staining for quantification of microbial biofilms. J Microbiol Methods. 98, 31-34 (2014).
  84. Trafny, E. A., Lewandowski, R., Zawistowska-Marciniak, I., Stępińska, M. Use of MTT assay for determination of the biofilm formation capacity of microorganisms in metalworking fluids. World J Microbiol Biotechnol. 29, 1635-1643 (2013).
  85. Chapman, J. S. Biocide resistance mechanisms. Int Biodeterior Biodegrad. 51 (2), 133-138 (2003).
  86. Cloete, T. E. Resistance mechanisms of bacteria to antimicrobial compounds. Int Biodeterior Biodegrad. 51 (4), 277-282 (2003).
  87. Maillard, J. Y. Resistance of bacteria to biocides. Microbiol Spectr. 6 (2), 1128(2018).
  88. Maillard, J. Y. Bacterial resistance to biocides in the healthcare environment: Should it be of genuine concern. J Hosp Infect. 65, 60-72 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tworzenie biofilmucewniki moczoweoporność na środki przeciwdrobnoustrojowecewnik Foleyaniedrożność cewnikajednostki tworzące koloniebarwienie fioletem krystalicznympłukanie chlorheksydyną
Model pęcherza moczowego in vitro infekcji dróg moczowych związanej z cewnikiem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.