Artykuł metodologiczny

Model pęcherza moczowego in vitro infekcji dróg moczowych związanej z cewnikiem

DOI:

10.3791/67966

⸱

24 czerwca 2025

 ,  , 
1The Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, The University of Liverpool, 2Department of Life Sciences, The University of Bath

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje model in vitro cewnikowanego układu moczowego, który może być wykorzystany do badania zarówno planktonowych, jak i związanych z biofilmem populacji komórek bakteryjnych w symulowanych infekcjach dróg moczowych związanych z cewnikiem. Model ten może być dalej wykorzystywany do badania skuteczności produktów przeciwdrobnoustrojowych mających na celu kontrolowanie infekcji dróg moczowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infekcje dróg moczowych związane z cewnikiem (CAUTIs) należą do najczęstszych infekcji związanych z opieką zdrowotną. Tworzenie się biofilmu na cewnikach moczowych jest kluczowym aspektem patogenezy tych zakażeń i często prowadzi do zablokowania cewników i poważnych powikłań, takich jak odmiedniczkowe zapalenie nerek i posocznica. Podejścia do modelowania i badania powstawania biofilmu w tym otoczeniu są niezbędne zarówno dla podstawowego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw patogenezy CAUTI, jak i dla opracowania i solidnej oceny przedklinicznej skutecznych strategii terapeutycznych w celu kontrolowania CAUTI i zablokowania cewnika. Protokół ten opisuje model in vitro cewnikowanych dróg moczowych, który replikuje system zamkniętego drenażu cewnika stosowany w praktyce klinicznej, ułatwiając badanie CAUTI i tworzenia biofilmu cewnika w reprezentatywnych warunkach. Ponadto protokół ten szczegółowo opisuje zastosowanie modelu pęcherza moczowego in vitro do oceny skuteczności produktów do konserwacji cewnika przeciwdrobnoustrojowego, w tym produktów dostępnych obecnie w łańcuchu dostaw NHS.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cewniki moczowe są jednymi z najczęściej stosowanych urządzeń medycznych, z szacowanym rozpowszechnieniem 19% w placówkach intensywnej terapii1,2,3. Cewniki są stosowane przede wszystkim w celu pomocy w zarządzaniu wydalaniem moczu w przypadku dysfunkcji pęcherza moczowego i są wprowadzane bezpośrednio do pęcherza, umożliwiając oddawanie moczu z pęcherza przez centralny lumen2,3. Cewniki moczowe mogą być używane z przerwami, gdzie są okresowo wprowadzane do pęcherza moczowego w celu odprowadzenia moczu, lub można stosować cewniki na stałe, w których cewniki są pozostawiane na miejscu w pęcherzu moczowym w celu ciągłego odprowadzania moczu3,4. Pomimo ich powszechnego stosowania, cewniki moczowe są największym czynnikiem ryzyka rozwoju zakażeń dróg moczowych (ZUM), które stanowią około jednej piątej zakażeń związanych z opieką zdrowotną5,6. Rzeczywiście, sam cewnik często działa jako początkowe miejsce kolonizacji drobnoustrojów, zapewniając powierzchnię dla uropatogenów, do których mogą przylegać i dalej kolonizować drogi moczowe1,6,7,8. Praktycznie wszyscy pacjenci poddawani długotrwałemu ciągłemu cewnikowaniu (gdzie cewnik pozostaje na miejscu przez ≥28 dni) doświadczą bakteriurii, przy czym ryzyko wzrasta o ~5% na każdy dzień, w którym cewnik znajduje się na miejscu2,9,10,11. Proporcjonalnie, około 80% infekcji dróg moczowych jest związanych z użyciem cewnika moczowego6.

Zakażenia dróg moczowych związane z cewnikiem (CAUTIs) stanowią znaczne obciążenie dla służby zdrowia i często wiążą się z poważniejszymi objawami górnego odcinka przewodu moczowego (takimi jak zapalenie moczowodu i odmiedniczkowe zapalenie nerek) niż niepowikłane ZUM, a także zwiększonym ryzykiem wtórnych infekcji krwi1,7,12,13,14. Standardowe leczenie CAUTI obejmuje antybiotykoterapię, jednak infekcje te są często oporne na leczenie przeciwbakteryjne w wyniku rozwoju złożonych zbiorowisk biofilmu na powierzchni cewnika15,16,17,18,19,20. Rzeczywiście, szacuje się, że ~80% CAUTI wynika z patogenów dróg moczowych tworzących biofilm19. Tworzenie biofilmu charakteryzuje się przyłączaniem komórek bakteryjnych do powierzchni cewnika i rozwojem zbiorowisk osadzonych w rozległej matrycy zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS)21,22,23,24. Produkcja EPS jest cechą charakterystyczną społeczności biofilmu i jest odpowiedzialna za wiele wyłaniających się właściwości wykazywanych przez komórki związane z biofilmem, takich jak podwyższona odporność na środki przeciwdrobnoustrojowe i klirens immunologiczny21,22,24. EPS może odgrywać bezpośrednią rolę w tych fenotypach, fizycznie osłaniając komórki i chroniąc je przed środkami przeciwdrobnoustrojowymi lub efektorami immunologicznymi, a także pośrednio ułatwiając rozwój szerszych aspektów zbiorowisk biofilmu, takich jak fizykochemiczne mikrośrodowisko biofilmu i tworzenie trwałych komórek23,24,25,26. Co więcej, niektóre uropatogeny, w tym Proteus spp., które stanowią ~11% CAUTI, posiadają silne enzymy ureazy, umożliwiające im hydrolizę mocznika obecnego w moczu i powodujące ogólny wzrost pH moczu 2,27,28,29,30. Wzrostowi pH towarzyszy wytrącanie się kryształów fosforanu wapnia i magnezu, które mogą zostać włączone do rosnącego biofilmu, co powoduje biomineralizację i tworzenie gęstych krystalicznych struktur biofilmu, które mogą blokować cewniki. Te krystaliczne biofilmy nie tylko sprawiają, że leczenie jest problematyczne, ale mogą również inicjować poważne powikłania, takie jak odmiedniczkowe zapalenie nerek i posocznica2,28,31,32,33,34.

Złożona nisza środowiskowa w cewnikowanych drogach moczowych i ważna rola tworzenia biofilmu w tych infekcjach, stanowią szczególne wyzwanie w badaniu patogenezy CAUTI. Proste i szeroko stosowane modele laboratoryjne do badania i ilościowego określania powstawania biofilmu, takie jak testy na 96-dołkowych płytkach, są nieodpowiednie do badania tworzenia biofilmu w CATUI, w szczególności biofilmów krystalicznych. Na przykład takie modele nie uwzględniają kluczowych aspektów niszy CAUTI, takich jak złożone środowisko odżywcze dostarczane przez mocz, sposób, w jaki powierzchnia cewnika wpływa na adhezję i późniejszą produkcję biofilmu oraz ciągły przepływ pożywki moczu35,36,37,38,39,40. Ponadto standardowe testy stosowane do określania wrażliwości uropatogenów na środki przeciwdrobnoustrojowe często nie odzwierciedlają rzeczywistej podatności klinicznej. Testy minimalnego stężenia hamującego i testy zawiesiny mikrobiologicznej są często stosowane do wnioskowania o podatności patogenów CAUTI na środki przeciwdrobnoustrojowe, ale zazwyczaj nie symulują ważnych zmiennych środowiska CAUTI, takich jak wpływ, jaki obecność cewnika moczowego i późniejsze tworzenie biofilmu może mieć na wrażliwość na środki przeciwdrobnoustrojowe41,42,43.

To badanie szczegółowo opisuje konfigurację i działanie modelu pęcherza in vitro, który symuluje środowisko cewnikowanego układu moczowego i replikuje standardowy system zamkniętego drenażu cewnika, stosowany w praktyce klinicznej, po raz pierwszy opisany przez Stickler et al.44 w 1999 roku (Rysunek 1). Model ten wykorzystuje cewniki Foleya o standardowych rozmiarach (które są obecnie dostępne w łańcuchu dostaw NHS) oraz sztuczne podłoża moczowe (AUM), jak wcześniej opisano przez Nzakizwanayo i wsp.45do symulacji CAUTI i tworzenia biofilmu. Model pęcherza in vitro składa się z dwuściennej szklanej komory, która działa jak "pęcherz" i ma wylot, przez który można wprowadzić cewnik Foleya do centralnej szklanej komory. W górnej części centralnej szklanej komory znajduje się wlot, przez który AUM może być dostarczane do "pęcherza" z biologicznie odpowiednim natężeniem przepływu za pomocą pompy perystaltycznej, która przepływa przez cewnik przez otwory drenażowe do worka na odpady. Dodatkowo komora zewnętrzna podłączona jest do obwodu łaźni wodnej, co pozwala na utrzymanie modeli w stałej temperaturze. Model pęcherza moczowego in vitro może być inokulowany przez centralną komorę, co pozwala na badanie patogenów CAUTI w biologicznie reprezentatywnej niszy. Ponadto, ponieważ modele są cewnikowane i stale zaopatrywane w świeże AUM, można badać wzrost i dynamikę populacji zarówno komórek planktonowych, jak i komórek związanych z biofilmem.

Poprzednie badania wykorzystywały modele pęcherza in vitro do kilku zastosowań, w tym do fundamentalnego badania tworzenia biofilmu u głównych patogenów CAUTI, w tym Proteus mirabilis i Escherichia coli 43,45,46,47,48,49. Dodatkowo, model in vitro został wykorzystany do oceny skuteczności produktów przeznaczonych do kontroli CAUTI lub zapobiegania blokadom50,51,52. Ostatnio modele zostały wykorzystane do określenia, czy adaptacje i mutacje związane z opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe wpływają na tworzenie biofilmu i patogenezę CAUTI u P. mirabilis43,46. Model pęcherza moczowego in vitro został również wykorzystany do badania nowych terapii przeciwdrobnoustrojowych mających na celu leczenie CAUTI, w tym nowo opracowanych powłok cewników teranotycznych i terapii fagowej47,48. Protokół ten obejmuje przygotowanie i przeprowadzenie modeli pęcherza moczowego in vitro, zliczenie żywotnych komórek planktonowych i związanych z biofilmem odpowiednio z powierzchni modelu i cewnika moczowego oraz pomiar pH moczu w celu monitorowania produkcji ureazy. Szczegółowo opisano również protokoły oceny produktów przeciwdrobnoustrojowych mających na celu leczenie lub zapobieganie CAUTI, w tym roztworów do irygacji pęcherza moczowego i przeciwdrobnoustrojowych żeli nawilżających, które są obecnie dostępne w łańcuchu dostaw NHS.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczne przedstawienie konfiguracji modelu pęcherza in vitro jest pokazane w Rysunek 1. Modele pęcherzy in vitro są zaprojektowane tak, aby były kompatybilne ze standardowymi cewnikami Foleya (wymiary pokazane w Rysunek 1 jest kompatybilny ze standardowymi cewnikami francuskimi w rozmiarze 14). Wysterylizuj cały sprzęt do modeli pęcherza in vitro i zaciśnij wszelkie silikonowe rurki używane w obwodzie mediów przed użyciem. Ścisłe przestrzeganie techniki aseptycznej jest wymagane podczas ustawiania modeli in vitro i zaleca się, aby model był montowany w sterylnych warunkach (tj. w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego kategorii II lub okapie z przepływem laminarnym). Zaleca się co najmniej n = 5 powtórzeń w celu określenia istotności statystycznej dla eksperymentów in vitro na modelu pęcherza moczowego. Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego sprzętu są wymienione w tabeli materiałów.

1. Przygotowanie sztucznych pożywek moczu

UWAGA: Sztuczne media moczowe (AUM) są zalecane do stosowania w modelach pęcherza in vitro ze względu na duże ilości pożywki wymagane do eksperymentów i zmienność związaną z próbkami ludzkiego moczu. Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie AUM zgodnie z wcześniejszym opisem i optymalizacją do stosowania w modelu pęcherza in vitro przez Nzakizwanayo i wsp. (5 L objętość końcowa)43,45,46,48,53,54.

  1. Przygotuj rozwiązanie AUM 1
    1. Odważyć następujące związki i dodać do 1 litrowej butelki borokrzemianowej wypełnionej 850 ml wody dejonizowanej: 3,25 g sześciowodnego chlorku magnezu (MgCl 2,6H2O), 23 g chlorku sodu(NaCl), 11,5 g bezwodnego siarczanu sodu (Na2SO4), 3,25 g cytrynianu trisodowego (Na3C6H5O7), 0,1 g szczawianu sodu (Na2C2O4), 14 g fosforanu monopotasowego (KH2PO4), 8 g chlorku potasu (KCl), 5 g chlorku amonu (NH4Cl), 25 g żelatyny i 5 g bulionu sojowego tryptonu.
  2. Mieszając roztwór AUM, zmierzyć pH za pomocą pH-metru i dostosować do 5,75 (± 0,02), dodając odpowiednio 3 M NaOH lub HCl.
    UWAGA: NaOH/HCl do regulacji pH należy dodawać kroplami do AUM, aby zapobiec wytrącaniu się soli z roztworu.
  3. Po dostosowaniu AUM do pH uzupełnić roztwór do końcowej objętości 1 l wodą dejonizowaną i sterylizować w autoklawie.
    UWAGA: Po sterylizacji roztwór można przechowywać do trzech miesięcy w temperaturze pokojowej (roztwór AUM 1 należy wyrzucić, jeśli zaobserwuje się opady lub zmętnienie).
  4. Oddzielnie przygotować roztwór AUM 2, dodając 125 g mocznika (CH4N2O) i 2,45 g chlorku wapnia (CaCl2) do 400 ml sterylnej, dejonizowanej wody w sterylnej zlewce o pojemności 500 ml.
    UWAGA: Przygotowanie roztworu mocznika wapniowego 2 powoduje reakcję endotermiczną, dlatego zaleca się wymieszanie roztworu AUM 2 i podgrzanie go do ~ 50 °C na płycie grzejnej/mieszadle magnetycznym, podczas gdy związki rozpuszczają się, aby zapobiec zamarzaniu.
  5. Po rozpuszczeniu mocznika i chlorku wapnia przefiltruj roztwór sterylizacyjny 2 za pomocą pompy próżniowej i jednostek filtrujących nitrocelulozę 0,45 μM do sterylnej szklanej butelki o pojemności 500 ml. Po wysterylizowaniu roztwór 2 jest stabilny przez trzy miesiące w temperaturze 4 °C lub jeden miesiąc w temperaturze pokojowej
    UWAGA: Roztwór AUM 2 należy wyrzucić, jeśli obserwuje się opady lub zmętnienie.
  6. W okapie z przepływem laminarnym lub komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego kategorii II należy aseptycznie połączyć roztwory AUM 1 i 2 z 3,6 l sterylnej wody dejonizowanej w sterylnej szklanej butelce aspiracyjnej o pojemności 5 l. AUM powinien być bladożółty i przezroczysty.
  7. Za pomocą pipety serologicznej usunąć 50 ml z całkowitej objętości AUM i podwielokrotność porcji do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i odłożyć do późniejszego użycia.
  8. Uszczelnij butelkę aspiratora za pomocą gumowej zatyczki lub folii aluminiowej i pozostaw w temperaturze pokojowej do czasu złożenia modeli in vitro.
  9. Aseptycznie usunąć 10 ml AUM z 50 ml podwielokrotności i zachować resztę roztworu do przygotowania inokulum. Za pomocą pH-metru zmierz pH 10 ml podwielokrotności AUM, która powinna wynosić ~pH 6,1 (±0,2). Przygotowany AUM jest stabilny w temperaturze pokojowej przez około miesiąc i należy go wyrzucić w przypadku wystąpienia opadów lub zmętnienia.

2. Konfiguracja modelu pęcherza in vitro

  1. Wprowadzić cewnik Foleya do centralnej szklanej komory modelu pęcherza in vitro (schemat szczegółowo opisany w Rysunek 1). Zamocuj cewnik na miejscu, napompowując balon dostrzykawką z dostarczoną sterylną wodą i przymocuj worek na odpady do portu cewnika.
  2. Podłącz model pęcherza in vitro device45 do zbiornika AUM za pomocą rurki łączącej. Podłącz rurkę obwodu mediów do pompy perystaltycznej zgodnie z instrukcjami producenta, upewniając się, że rurka ma odpowiednie napięcie bez rozciągania.
  3. Przymocuj modele pęcherza in vitro do stojaków zaciskowych i zabezpiecz worki na odpady w stojakach poniżej modeli, aby zapewnić przepływ przez modele grawitacyjnie.
  4. Podłącz zewnętrzną komorę modelu pęcherza moczowego do krążącej łaźni wodnej za pomocą silikonowej rurki ( Rysunek 1B). Nagrzać łaźnię wodną do temperatury 37 °C i włączyć pompy cyrkulacyjne zbiornika.
    1. Uruchomić łaźnie wodne na 30 minut przed zaszczepieniem modeli pęcherza in vitro, aby upewnić się, że temperatura jest stabilna na poziomie 37 °C, i upewnić się, że kąpiel wodna pozostaje uzupełniona do odpowiedniego poziomu wody na czas trwania eksperymentu.
  5. Usuń wszelkie zaciski z przewodów mediów i ustaw pompy perystaltyczne tak, aby pracowały z prędkością około 0,75 ml / min, aby odtworzyć produkcję moczu u ludzi (~ 1080 ml / dzień). Rzeczywiste natężenia przepływu zostaną obliczone podczas eksperymentowania.
  6. Przeprowadź AUM przez modele pęcherza in vitro za pomocą pompy perystaltycznej przez 30 minut przed inokulacją, aby potwierdzić, że przepływ pożywki jest stały i że sterylny system drenażowy jest nienaruszony.
  7. Odcedź nagromadzone media z worka na odpady przed eksperymentem. Objętość mediów można zmierzyć, aby obliczyć dokładne natężenie przepływu (szczegółowe informacje w kroku 4).

3. Inokulacja modeli pęcherza in vitro

  1. Przygotuj nocne kultury dla modeli pęcherza in vitro, zawieszając pętlę kolonii bakteryjnych wyhodowanych na stałym agarze w 10 ml bulionu LB. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z mieszaniem.
    UWAGA: Model pęcherza moczowego in vitro może być wykorzystany do badania różnych patogenów CAUTI, w tym szczepów ureazo-dodatnich, takich jak Proteus mirabilis, a stosowane pożywki wzrostowe można odpowiednio zmodyfikować.
  2. Odwirować całą objętość nocnej kultury o stężeniu 4 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w 10 ml AUM i zmierzyć absorbancję przy średnicy zewnętrznej595 nm za pomocą spektrometru.
  3. Znormalizować zawieszone kultury do OD595 nm 1,0 i końcowej objętości 10 ml w AUM, stosując następujące równanie:
    figure-protocol-1
    gdzie, A1 jest absorbancją przy OD600 nm hodowli nocnej, A2 jest pożądaną absorbancją inokulum przy OD600 nm (1.0), V2 jest pożądaną objętością inokulum (10 ml), a V1 jest wymaganą objętością nocnej hodowli do normalizacji.
    UWAGA: 10 ml zawiesiny OD595 nm 1.0 zapewni, że modele zostaną zaszczepione około 1010 CFU większości szczepów bakteryjnych (zwalidowanych dla Proteus mirabilis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus), replikujących ustaloną infekcję. Inokulum wyjściowe może być modyfikowane w zależności od użytego gatunku lub stadium infekcji, które jest modelowane (tj. mniejsza gęstość inokulum może być użyta do symulacji infekcji we wczesnym stadium)47.
  4. Wysterylizuj modele pęcherza in vitro przy użyciu 70% etanolu i usuń korek (wlot pożywki), aby uzyskać dostęp do wewnętrznej komory. Usunąć 10 ml AUM z objętości wewnątrz modelu pęcherza moczowego za pomocą pipety serologicznej.
    UWAGA: Podczas zaszczepiania i pobierania próbek z modeli in vitro z komory centralnej należy upewnić się, że praca jest szybka i aseptyczna, zawsze nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i regularnie odkażać rękawice i powierzchnie 70% etanolem.
  5. Zaszczepić modele pęcherza in vitro przez komorę centralną, używając całej znormalizowanej zawiesiny o pojemności 10 ml i dokładnie wymieszać pipetą serologiczną. Pobrać 10 ml z centralnej komory modeli pęcherza in vitro za pomocą pipety serologicznej i podwielokrotności do uniwersalnej o pojemności 15 ml w celu późniejszych obliczeń CFU/ml i pomiaru pH.
  6. Dokładnie odkaż zewnętrzne powierzchnie modelu pęcherza moczowego i korka 70% etanolem i wymień korek. Wznów na chwilę przepływ mediów, aby upewnić się, że poziom AUM w komorze centralnej dotrze do otworu na oczko, zanim zatrzyma przepływ.
  7. Pozwól hodowlom ustabilizować się w modelu pęcherza moczowego przez 1 godzinę przed włączeniem przepływu pożywki przez pompę perystaltyczną z prędkością ~0,75 ml / min.
  8. Podczas gdy inokulum się zastyga, należy przygotować rozcieńczenia z próbki pobranej z centralnej komory.
    1. Seryjnie rozcieńczyć 100 μl próbki w 900 μl sterylnego PBS, aż próbka zostanie rozcieńczona do 10-7. Rozmieścić 10 μl plamek rozcieńczonych roztworów w trzech egzemplarzach na odpowiednich pożywkach stałych i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
    2. Po inkubacji policzyć kolonie na każdej płytce rozcieńczającej i obliczyć dokładną jtk/ml początkowego inokulum.
      UWAGA: W przypadku stosowania gatunków, które się roją, np. Proteus mirabilis, należy użyć agaru MacConkey bez soli (pepton 20,0 g/L, laktoza 10,0 g/L, sole żółciowe 5,0 g/L, neutralna czerwień 0,075 g/L i agar 12,0 g/L), aby upewnić się, że pojedyncze kolonie są nadal widoczne dla ułatwienia liczenia.
  9. Po 1 godzinie inkubacji włącz przepływ pożywki przez pompę perystaltyczną, aby rozpocząć pracę z modelami pęcherza in vitro, zwracając uwagę na czas, w którym modele są włączone.

4. Obliczanie natężenia przepływu w modelu pęcherza in vitro

  1. Po zaszczepieniu modeli in vitro i zainicjowaniu przepływu pożywki, należy pozwolić modelom działać przez 4 godziny. Na krótko wstrzymać przepływ pożywki i zebrać całą objętość pozostałego AUM z worka na odpady w kolbie miarowej przez otwór drenażowy. Zanotuj zebrany wolumin.
    UWAGA: Natężenie przepływu można obliczyć na podstawie objętości mediów zebranych w kroku 2.7, jednak dokładniejsze natężenia przepływu można uzyskać, uruchamiając modele przez dłuższy czas (tj. zalecane 4 godziny), ponieważ zmniejsza to prawdopodobieństwo, że powietrze resztkowe w rurze obiegu mediów wpłynie na obliczone natężenie przepływu.
  2. Wznów przepływ mediów przez pompę perystaltyczną, upewniając się, że otwór odpływowy worka na odpady jest zamknięty, aby utrzymać sterylny system drenażowy.
  3. Aby obliczyć rzeczywiste natężenie przepływu modeli in vitro, należy użyć następującego równania:
    figure-protocol-2
    UWAGA: Zaleca się natężenia przepływu w zakresie 0,55-1,0 ml/min, aby odtworzyć produkcję moczu u ludzi.
  4. Jeżeli natężenie przepływu medium jest obliczane poza dopuszczalnym zakresem, należy odrzucić powtórzoną próbę i dostosować prędkość obrotową pompy perystaltycznej tak, aby mieściła się w dopuszczalnym zakresie.

5. Pobieranie próbek komórek planktonowych z modelu pęcherza in vitro

UWAGA: Modele pęcherza in vitro powinny być rutynowo próbkowane podczas eksperymentów, aby monitorować dynamikę populacji. Próbki ze wszystkich modeli należy pobrać natychmiast po inokulacji, w punkcie aktywacji przepływu AUM, 4 godziny po inokulacji (gdy oblicza się natężenie przepływu) i w tym punkcie modele są poddawane terminacji (albo blokada, albo z góry określony punkt końcowy). W przypadku uruchamiania modeli przez >24 godziny zaleca się, aby próbki były pobierane co 24 godziny w celu monitorowania CFU/ml, a dodatkowe próbki można pobrać zgodnie z wymaganiami użytkowników.

  1. Odkaż korek modelu pęcherza za pomocą 70% etanolu i wyjmij go, aby uzyskać dostęp do centralnej komory.
  2. Omijając końcówkę cewnika i balon, delikatnie wymieszaj zawartość komory centralnej za pomocą pipety serologicznej.
  3. Za pomocą pipety serologicznej wyjąć z komory próbkę o objętości 10 ml i przenieść ją do sterylnej probówki. Natychmiast odkazić korek 70% etanolem i wymienić, kończąc sterylny, zamknięty obieg drenażowy.
  4. Usunąć 1 ml z próbki za pomocą pipety i przelać do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml w celu seryjnych rozcieńczeń.
  5. Zmierz pH pozostałej próbki za pomocą pH-metru, upewniając się, że próbka jest dokładnie wymieszana, a pH-metr jest skalibrowany przed użyciem.
  6. Seryjnie rozcieńczyć zarezerwowaną 1 ml porcji z próbki i rozlać na odpowiednie podłoże stałe, jak opisano poprzednio w kroku 3.8., usuwając wszystkie rozcieńczenia.
    UWAGA: Próbki planktonu pobrane z modelu pęcherza moczowego są odpowiednie do innych analiz, w tym do zastosowań genomicznych lub biologii molekularnej (opcjonalnie).

6. Pobieranie próbek komórek związanych z biofilmem z modelu pęcherza in vitro

  1. Usunięcie i przygotowanie cewnika
    UWAGA: Pobieranie próbek biofilmu z modeli pęcherza moczowego in vitro jest analizą końcową, wymagającą dezaktywacji modeli i usunięcia cewników w celu przetworzenia.
    1. Odłącz worek na odpady od cewnika i spuść resztki moczu z modelu, opróżniając balon. Usuń cewnik z dolnej części modelu za pomocą sterylnych kleszczy.
    2. Umieść usunięty cewnik na sterylnej desce i za pomocą sterylnego skalpela przetnij cewnik w wymaganych punktach do przekroju (opisanych w Rysunek 2).
    3. Upewnij się, że odcinki cewnika są przecięte wzdłuż, aby odsłonić światło; następnie, za pomocą sterylnych kleszczy, zanurz odcinek cewnika 3 razy w sterylnym PBS, aby usunąć nieprzylegające komórki.
      UWAGA: W przypadku obrazowania odcinków cewnika poniżej, tj. za pomocą SEM, pozostaw 1 cm odcinki nienaruszone (nie przecinaj wzdłuż) i zamiast tego usuń nadmiar wilgoci ze światła sterylnym ręcznikiem papierowym przed utrwaleniem.
  2. Przerwanie biofilmu w celu oznaczania liczby CFU/ml
    UWAGA: Protokoły szczegółowo opisujące rozerwanie komórek związanych z biofilmem mogą wymagać dalszej optymalizacji, jeśli biofilmy są w dużym stopniu krystaliczne lub śluzowate.
    1. Przygotowany fragment cewnika inkubować w 0,25% trypsyny w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Objętość użytej trypsyny powinna być minimalna wymagana do pokrycia cewnika; Na przykład w przypadku 1-centymetrowego odcinka cewnika przeciętego prostopadle wystarczy 1 ml 0,25% trypsyny.
    2. Po inkubacji sonikować roztwór zawierający cewnik przez 10 minut. Odcinek cewnika można następnie usunąć i wyrzucić. Aby dezaktywować trypsynę, roztwór komórek należy natychmiast rozcieńczyć w sterylnym PBS i wysiać w celu uzyskania liczby CFU na odpowiednich pożywkach stałych, jak opisano wcześniej w kroku 3.8.
  3. Kwantyfikacja biofilmu cewnika za pomocą barwienia fioletem krystalicznym
    1. Dodaj przygotowane skrawki cewnika do studzienek na płytce studzienkowej o płaskim dnie o odpowiedniej wielkości. Użyj odpowiedniej objętości 0,1% roztworu fioletu krystalicznego, aby całkowicie zanurzyć sekcję cewnika i inkubować statycznie w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Upewnij się, że sterylny odcinek cewnika jest również dołączony jako kontrola tła.
    2. Usuń fragmenty cewnika z płytki i przenieś na nową płytkę. Umyj każdy odcinek cewnika dwukrotnie w wodzie destylowanej.
    3. Po wypłukaniu przenieś skrawki cewnika na nową płytkę i przykryj 33% kwasem octowym. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Wyjąć fragment cewnika z płytki, a następnie, za pomocą czytnika płytek, zmierzyć OD595 nm dla każdej kontrpróby, używając studzienek, które zawierały sterylne odcinki cewnika jako kontrolne tło.

7. Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe w modelu pęcherza in vitro

UWAGA: Większość terapii mających na celu kontrolowanie infekcji dróg moczowych związanych z cewnikiem jest kompatybilna ze standardowymi cewnikami Foleya, sprawdź kompatybilność przed rozpoczęciem eksperymentów in vitro z modelami pęcherza.

  1. Przeciwbakteryjne żele smarne
    UWAGA: Aby zasymulować użycie środków smarujących podczas wprowadzania cewnika, krok ten należy wykonać w kroku 2.1, bezpośrednio przed wprowadzeniem cewnika Foleya. Po wprowadzeniu cewnika model należy natychmiast podłączyć i krok 2.6. należy pominąć, aby żel nie został rozcieńczony i odsączony przed inokulacją. Inokulacja powinna odbyć się tego samego dnia, w którym wprowadzono cewnik. Środki smarne przeznaczone do stosowania z cewnikami są pakowane jako pojedyncze, sterylne, jednorazowe strzykawki o pojemności 6 ml lub 11 ml. Około 5 ml lubrykantu jest wystarczające do wypełnienia zarówno szyjki modelu pęcherza, jak i pokrycia podstawy modelu.
    1. Stosując technikę aseptyczną, włóż koniec strzykawki zawierającej środek smarujący do szyjki modelu pęcherza moczowego i włóż 5 ml żelu, aby wypełnić szyjkę i wejść do podstawy komory.
    2. Obróć model tak, aby podstawa była równomiernie pokryta żelem, a następnie włóż cewnik Foleya do modelu, przepychając końcówkę cewnika przez żel i zabezpiecz, wypełniając balon jak zwykle.
    3. Podłącz model do reszty konfiguracji, a następnie napełnij światło modelu moczem, aż zacznie odpływać. Gdy tylko mocz zacznie spływać przez otwór oczkowy cewnika, należy zatrzymać pompę, aby zapobiec utracie żelu przed inokulacją.
      1. Inkubować modele przez 30 minut, aby mocz osiągnął temperaturę 37 °C, a następnie zaszczepić modele zgodnie z wcześniejszym opisem, aby zapewnić równomierność czasu dyfuzji składników żelu do objętości moczu.
    4. Zaszczepić model zgodnie z opisem w kroku 3.5 i pozostawić go do inkubacji na 1 godzinę przed włączeniem pomp perystaltycznych. W momencie włączania pompy pobrać próbkę planktonu o objętości 1 ml i rozcieńczyć ją w celu zliczenia jtk, jak opisano w kroku 3.8.
  2. Roztwory nawadniające
    UWAGA: Roztwory do irygacji są często dostępne luzem lub jako indywidualne, sterylne, jednorazowe "torebki". W przypadku stosowania indywidualnych roztworów należy upewnić się, że są one kompatybilne z portami drenażowymi cewników, które mają być używane, przed eksperymentowaniem. W przypadku stosowania roztworów do irygacji zbiorczej należy upewnić się, że używane są cewniki o potrójnym prześwicie i postępować zgodnie z instrukcjami producenta w celu określenia objętości/ram czasowych podawania produktu.
    1. Przed leczeniem należy przeprowadzić badania in vitro przez co najmniej 4 godziny, aby upewnić się, że społeczności związane z biofilmem miały wystarczająco dużo czasu na ustabilizowanie się. Po 4 godzinach pracy modeli należy wstrzymać przepływ pożywki i pobrać próbkę do obróbki wstępnej z wewnętrznej komory modeli in vitro, jak opisano w kroku 5.
      UWAGA: W przypadku korzystania z roztworów do nawadniania zbiorczego przejdź do kroku 7.2.5.
    2. W przypadku korzystania z indywidualnej "torebki" do irygacji odłącz worek na odpady od cewnika i użyj nakrętki dostarczonej z woreczkiem, aby uszczelnić worek na odpady. Natychmiast przymocuj woreczek z roztworem do irygacji do cewnika i lekko uciskając wyciśnij produkt do środkowego światła. Stosować zgodnie z zaleceniami producenta (tj. 15 minut aplikacji).
    3. Po zakończeniu zalecanego leczenia pozwól, aby pozostały roztwór spłynął z komory wewnętrznej przez otwór na oczko cewnika do woreczka irygacyjnego, a następnie odłącz woreczek. Pozostałą zawartość torebki można wyrzucić lub wykorzystać do dalszych zastosowań.
    4. Wysterylizuj port drenażowy cewnika i port przyłączeniowy worka na odpady 70% etanolem i podłącz je ponownie, tworząc sterylny, zamknięty system drenażowy.
      UWAGA: Przejdź do kroku 7.2.7, jeśli używasz woreczków do nawadniania.
    5. W przypadku korzystania z cewnika o potrójnym przeźrnicy należy zdezynfekować port świetlny irygacji 70% etanolem i natychmiast rozpocząć irygację za pomocą sterylnej strzykawki zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Zmierz objętość zalegającego moczu w worku na odpady przed nawadnianiem, aby można było to uwzględnić w obliczeniach czasu zatoru lub natężenia przepływu.
    6. Po zakończeniu irygacji należy wyrzucić strzykawkę i wszelkie pozostałości roztworu do irygacji pozostawione w worku na odpady.
    7. Pobrać próbkę po leczeniu z centralnej komory modelu pęcherza in vitro, jak opisano w kroku 5, i wznowić przepływ AUM przez pompę perystaltyczną, aby kontynuować eksperymenty.

8. Zakończenie eksperymentów z modelem pęcherza in vitro

UWAGA: Organizmy ureazo-dodatnie, takie jak P. mirabilis, mogą powodować zablokowanie cewników moczowych poprzez tworzenie krystalicznego biofilmu. Niedrożność może być zatem wykorzystana jako biologicznie istotny punkt końcowy dla modeli pęcherza moczowego in vitro i jest identyfikowana w sposób widoczny przez całkowite zamknięcie otworów ocznych cewnika z krystalicznymi biofilmami i zwiększenie objętości AUM w centralnej komorze szklanego "pęcherza" (Ryc. 3).

  1. Po tym, jak modele pęcherza moczowego in vitro doprowadzą do wcześniej ustalonego punktu końcowego, którym może być zator lub określony czas działania, należy wyłączyć przepływ AUM za pomocą pompy perystaltycznej i pobrać próbkę punktu końcowego z komory centralnej, jak opisano w kroku 5.
  2. Wyłącz przepływ łaźni wodnej i odłącz obieg mediów i rurki obwodu łaźni wodnej od modeli pęcherzy in vitro.
  3. Usunąć korki z modeli pęcherza moczowego in vitro i usunąć całą objętość resztek moczu za pomocą pipety serologicznej. Wszelkie zanieczyszczone media należy odpowiednio wyrzucić (tj. sterylizować w autoklawie).
  4. Opróżnij worki na odpady i wyrzuć wszelkie resztki mediów. Odłącz worki na odpady cewnika od portu cewnika i wyrzuć je.
  5. Za pomocą strzykawki powoli opróżnij balony cewnika przed wyjęciem cewników z modeli.
    UWAGA: W przypadku stosowania ureazo-dodatnich form bakteryjnych cewniki mogą "przykleić się" do szklanych ścianek modeli in vitro. Unikaj przykładania dużej siły do cewników, a zamiast tego przejdź do kroku 8.6.
  6. Namocz modele in vitro w 5% przeciwbakteryjnym roztworze czyszczącym (patrz tabela materiałów) przez noc, a następnie dokładnie umyj wodą, aby upewnić się, że wszelkie pozostałości środka dezynfekującego zostały usunięte. Autoklaw do sterylizacji.
    UWAGA: W przypadku stosowania gatunków ureazo-dodatnich dodaj 5% w/v kwasu cytrynowego do roztworu dezynfekującego, aby pomóc rozpuścić biomineralizację w komorze centralnej. Ten kwaśny roztwór pomoże również uwolnić wszelkie cewniki, które przykleiły się do modeli, rozbijając krystaliczne osady biofilmu.
  7. Odłącz rurkę obwodu mediów od zbiornika AUM i wyrzuć wszelkie pozostałe media. Przepłukać rurki wodą, aby usunąć wszelkie pozostałości AUM i autoklawu.
  8. Aby obliczyć dokładny czas zatoru, zanotuj końcową objętość w worku na odpady i użyj równania w kroku 4.4 oraz wcześniej obliczonego natężenia przepływu, aby określić czas zablokowania.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomyślne działanie modelu pęcherza in vitro zależy od praktykowania dobrej techniki aseptycznej i uważnej obserwacji zmętnienia podłoża podczas eksperymentów (Rysunek 3). Przed inokulacją sterylne AUM miało bladożółty kolor i było przezroczyste w centralnej komorze modelu pęcherza in vitro (Ryc. 3A). AUM w zbiorniku pożywki powinno pozostać czyste przez cały czas trwania eksperymentów, ponieważ wszelkie zmiany zmętnienia, które wystąpią, mogą wskazywać na wytrącanie się soli z roztworu lub zanieczyszczenie pożywki. Jeśli AUM w zbiorniku pożywki lub rurkach obwodu mediów stanie się mętne lub wykaże drastyczną zmianę koloru, powtórzone próby należy odrzucić i powtórzyć. Po inokulacji wyraźnie widoczny jest wzrost zmętnienia AUM w centralnej komorze modelu pęcherza in vitro (Ryc. 3B). Zmiany w zmętnieniu są często bardziej wyraźne u organizmów ureazo-dodatnich, takich jak P. mirabilis, ale powinny być nadal widoczne po inokulacji u organizmów ureazowo-ujemnych. Po zainicjowaniu przepływu AUM często obserwuje się zmniejszenie zmętnienia AUM, ponieważ komórki planktonowe są wypłukiwane i nie wskazuje to na brak żywotnych komórek w modelu. Obserwacja poziomu pożywki w komorze centralnej może być również wykorzystana do określenia czasu blokady w przypadku wykorzystania organizmów ureazo-dodatnich (Rysunek 3C). Podczas pracy modeli otwór na oczko i końcówka cewnika powinny być całkowicie widoczne, aby wskazać prawidłowy drenaż do worków na odpady. Po zablokowaniu poziom AUM w komorze centralnej wzrośnie ponad otwory oczne i końcówkę cewnika, co wskazuje, że eksperyment jest gotowy do wszelkich odczytów końcowych i zakończenia. Podczas eksperymentów efekty ciśnienia w obwodzie pożywki dla modelu pęcherza in vitro mogą sprawić, że modele będą wyglądać na zablokowane. Jeśli podejrzewa się zablokowanie, przed zakończeniem testu sprawdź, czy obwód AUM, cewnik i rurka worka na odpady są napięte, ponieważ wszelkie potencjalne pęcherzyki powietrza lub załamania w przewodzie mogą powodować "śluzy powietrzne" i uniemożliwiać opróżnianie cewnika.

Podczas eksperymentów in vitro na modelu pęcherza moczowego, pobieranie próbek planktonu może dostarczyć cennych informacji na temat dynamiki wzrostu w modelu, jak również progresji CAUTI. Wzrost komórek, pH i tworzenie biofilmu mogą być monitorowane podczas eksperymentów bez konieczności przerywania modeli (Rysunek 4). W przypadku stosowania organizmów ureazo-dodatnich, obliczenia czasu blokady mogą być wykorzystane jako miara szybkości tworzenia się biofilmu i wykorzystane do porównania właściwości różnych szczepów bakteryjnych (Rysunek 4). Porównanie dzikiego szczepu P. mirabilis i mutanta LPS (insercja mini-tn5 do waaC) wykazało wydłużenie czasu do zablokowania, a tym samym zmniejszenie tworzenia się biofilmu u mutanta (Figura 4). Organizmy ureazowo-ujemne zazwyczaj nie blokują modeli pęcherza moczowego in vitro, dlatego zaleca się określenie ustalonego punktu końcowego przed rozpoczęciem eksperymentów. W niektórych przypadkach organizmy ureazowo-ujemne mogą powodować zablokowanie cewnika. Na przykład szczepy Klebsiella pneumoniae mogą wytwarzać rozległe, śluzowate biofilmy, jednak zwykle blokują one drenaż znacznie dłużej niż biofilmy ureazy-dodatnie, więc nadal zaleca się ustalony punkt końcowy.

Pomiar pH podczas eksperymentów z modelami pęcherza moczowego może również dostarczyć informacji na temat różnic między szczepami, jak również postępu CAUTI. Jeśli wykorzystuje się organizmy ureazowo-ujemne, pH w centralnej komorze modelu pęcherza in vitro powinno w dużej mierze pozostać stabilne przez cały czas trwania eksperymentu, chociaż oczekuje się niewielkich wahań pH wraz ze zmianą dynamiki populacji w trakcie eksperymentu. Inokulacja modeli in vitro organizmami dodatnimi pod względem ureazy powoduje znaczny wzrost pH w czasie, przy czym najwyższe pH zwykle obserwuje się w momencie blokady, gdzie można zaobserwować odczyty pH tak wysokie, jak ~8-9 (Rysunek 4B).

Liczenie planktonowego CFU/ml jest ważnym elementem modelowania pęcherza in vitro, pozwalając operatorom ocenić, czy inokulacja się powiodła i monitorować postęp eksperymentów. Pomiar CFU/ml pod koniec eksperymentów może uwidocznić wszelkie różnice w kolonizacji pęcherza moczowego między różnymi szczepami bakterii. Porównując zmutowany szczep mini-Tn5 P. mirabilis z typem dzikim, zaobserwowano znaczne zmniejszenie CFU/ml w momencie blokady (Figura 4C). Co więcej, wyliczenie CFU z biofilmów na powierzchni cewnika i kwantyfikacja biomasy biofilmu może dostarczyć informacji na temat zdolności różnych patogenów do kolonizacji cewnikowanych dróg moczowych. Barwienie fioletu krystalicznego wykorzystano do określenia różnic w tworzeniu biofilmu między szczepem P. mirabilis typu dzikiego HI4320 a izolatami pasażowanymi w chlorheksydynie (Rysunek 5). Pomiary gęstości optycznej przy długości fali 595 nm wykazały, że izolaty pasażowane w chlorheksydynie wykazywały zmniejszenie tworzenia biofilmu w porównaniu z izolatami typu dzikiego i kontrolnymi pasażowanymi przy braku chlorheksydyny.

Ponieważ celem modelu pęcherza in vitro jest dokładne odtworzenie niszy CAUTI, modele mogą być również wykorzystywane do badania efektów terapii przeciwbakteryjnych mających na celu leczenie CAUTI w klinicznie istotnym środowisku. W przypadku organizmów ureazo-dodatnich porównanie czasów blokady modeli poddanych działaniu ureazy z modelami nieleczonymi może dostarczyć użytecznych informacji na temat skuteczności leczenia. Leczenie in vitro modeli pęcherza moczowego zaszczepionych P. mirabilis 0,02% roztworem do irygacji pęcherza chlorheksydyny znacznie wydłużyło czas do zablokowania w porównaniu z modelami, które nie były leczone lub traktowane 0,9% solą fizjologiczną (Figura 6A). Ponadto model pęcherza moczowego in vitro może być wykorzystany do badania bakteriobójczego działania leków przeciwdrobnoustrojowych. Monitorowanie zmian w jtk/ml komórek planktonowych i związanych z biofilmem po leczeniu przeciwbakteryjnym może wskazać, czy leczenie jest skuteczne. Leczenie modelami pęcherza moczowego in vitro inokulowanymi P. mirabilis wykazało zmniejszenie planktonowej CFU/ml o >7 log bezpośrednio po leczeniu, w porównaniu z nieleczonymi i 0,9% modelami nawadnianymi solą fizjologiczną, gdy były stosowane zgodnie z instrukcjami producenta (Rycina 6B).

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat głównych elementów modelu pęcherza in vitro. (A) Model pęcherza moczowego (zamknięty system drenażowy): (1) dwuścienna szklana komora symulująca pęcherz (2) wlot mediów, AU jest dostarczany przez pompę perystaltyczną do wewnętrznej komory modelu pęcherza (3) wlot wody dostarczany przez łaźnię cyrkulacyjną do komory zewnętrznej (4) wylot wody (5) cewnik Foleya, wprowadzony do komory wewnętrznej (6) punkt podłączenia światła drenażu; Punkt podłączenia worka na odpady/woreczka irygacyjnego (7) Worek drenażowy zbierający odpływ moczu. (B) Schemat przedstawiający konfigurację modelu pęcherza moczowego in vitro oraz kierunek przepływu pożywki i wody przez model. Sztuczny mocz jest przechowywany w zbiorniku pożywki (1) w temperaturze pokojowej i dostarczany do modelu za pośrednictwem pompy perystaltycznej (2) przy stałym natężeniu przepływu ~ 0,75 ml min-1 przez czas trwania eksperymentu. Media przepływają do centralnej komory dwuściennego szklanego naczynia reprezentującego pęcherz moczowy (3) i spływają przez otwór oczny cewnika Foleya (4) do worka drenażowego (5), kończąc sterylny zamknięty system drenażowy. Model pęcherza moczowego in vitro utrzymuje się w stałej temperaturze 37 °C za pomocą cyrkulacyjnej łaźni wodnej (6), która przepływa przez zewnętrzną komorę szklanego naczynia o podwójnych ściankach. Linie przerywane reprezentują rurki silikonowe, a strzałki reprezentują kierunek przepływu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Sekcja cewników moczowych w celu przetwarzania komórek związanych z biofilmem. Przykładowe punkty na cewniku moczowym do rozwarstwienia w celu ilościowej oceny biofilmu. (A) Cewniki są najpierw cięte równoleżnikowo w obszarze 8 cm proksymalnie do końcówki/otworów ocznych (gdzie obserwuje się tworzenie większości biofilmu). Odcinki o długości 1 cm usuwa się skalpelem, zazwyczaj unikając obszaru, w którym znajduje się opróżniony balon cewnika ze względu na trudności w odtwarzalności przetwarzania (1-3). (B) Po początkowym pocięciu cewników na kawałki o długości 1 cm, wykonuje się kolejne podłużne cięcie w dół środkowego światła, aby odsłonić obecny biofilm w celu dalszej kwantyfikacji biofilmu, tj. wyliczenia CFU/ml barwienia fioletem krystalicznym. Linie przerywane reprezentują punkty rozcięcia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Etapy eksperymentu z modelem pęcherza in vitro. Obrazy pęcherza moczowego w modelu centralnej komory in vitro, na różnych etapach eksperymentu. (A) AUM w centralnej komorze modelu pęcherza in vitro przed inokulacją. Pożywka w komorze centralnej jest całkowicie przezroczysta, co wskazuje na pomyślną sterylizację, a końcówka cewnika i otwory oczne są widoczne powyżej linii pożywki, co wskazuje, że cewnik pomyślnie opróżnia. (B) Pożywka w centralnej komorze modelu pęcherza moczowego in vitro po inokulacji P. mirabilis (4 godziny po inokulacji). Na udaną inokulację wskazuje zwiększona mętność pożywki. Widoczność końcówki cewnika i otworów ocznych wskazuje, że AUM pomyślnie przepływa przez cewnik i nie doszło do zatkania. (C) Przykład modelu pęcherza moczowego z zatkanym powietrzem in vitro. Inokulacja P. mirabilis, a następnie tworzenie i mineralizacja biofilmu spowodowały zablokowanie otworów ocznych cewnika, uniemożliwiając drenaż i powodując wzrost poziomu pożywki w komorze centralnej powyżej końcówki cewnika. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Pomiary końcowe dla modelu pęcherza in vitro trwają aż do momentu zablokowania. Przykładowe pomiary punktu końcowego w momencie zablokowania z modelu pęcherza moczowego in vitro inokulowanego klinicznym szczepem P. mirabilis, RS47 (WT) i zmutowanym szczepem z osłabionym tworzeniem biofilmu, RS47-2 (Mutant). (A) Czas blokady (h) WT i zmutowanych szczepów P. mirabilis. (B) pH modeli pęcherza moczowego in vitro w momencie zatoru. (C) jtk/ml komórek planktonowych w komorze modelowej pęcherza moczowego in vitro w momencie zatoru. Wszystkie dane reprezentują średnią z pięciu kontrprób biologicznych. Słupki błędów pokazują błąd standardowy średniej (SEM). *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01. Ten rysunek został zmodyfikowany z Clarke et al.46. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Pomiary komórek związanych z biofilmem z modelu pęcherza in vitro. Kwantyfikacja tworzenia biofilmu P. mirabilis, porównanie szczepu typu dzikiego HI4320 z przystosowanymi populacjami pasażowanymi z chlorheksydyną lub bez niej (CHD) poprzez barwienie fioletem krystalicznym i pomiar gęstości optycznej (OD) przy 595 nm. WT: P. mirabilis HI4320; 1, 3, 5: kontrola pasażu bez ekspozycji na CHD; 2, 4, 6: HI4320 pasażowany w 4 μg / ml CHD. Wszystkie dane reprezentują średnią z pięciu kontrprób biologicznych. Słupki błędów pokazują SEM. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Pomiary z modeli pęcherza in vitro po leczeniu przeciwbakteryjnym. Próbki planktonu pobrano z modelu pęcherza moczowego in vitro zaszczepionego P. mirabilis, po przepłukaniu 0,02% roztworem przeciwbakteryjnym chlorheksydyny (100 ml) lub kontrolną 0,9% solą fizjologiczną. (A) Czas zatoru modeli pęcherza moczowego in vitro po irygacji. (B) Planktonowa jtk/ml bezpośrednio po zabiegu nawadniania. Wszystkie dane reprezentują średnią z pięciu kontrprób biologicznych. Słupki błędów pokazują SEM. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; *p ≤ 0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cewnikowane drogi moczowe stanowią złożoną niszę biologiczną, która może być trudna do odtworzenia w środowisku laboratoryjnym. Model pęcherza moczowego in vitro został zaprojektowany w celu symulacji CAUTI i wykorzystuje standardowe cewniki moczowe do odtworzenia sterylnego, zamkniętego systemu drenażu stosowanego w praktyce klinicznej. Cewnikowane drogi moczowe są bardzo podatne na infekcje, o czym świadczą cewniki moczowe będące największym pojedynczym czynnikiem ryzyka rozwoju CAUTI 6,55. Proporcjonalnie, staranna technika aseptyczna ma kluczowe znaczenie dla powodzenia badania modeli pęcherza in vitro. Zmętnienie AUM jest wyraźnym wskaźnikiem sterylności, ponieważ zanieczyszczone lub przeterminowane pożywki z czasem staną się mętne, co będzie wymagało wyrzucenia wszystkich powtórzeń. Podczas zaszczepiania i pobierania próbek z modelu pęcherza moczowego in vitro należy również stosować staranną technikę aseptyczną, ponieważ otwarcie centralnej komory w celu dodania przygotowanego inokulum przerywa sterylny, zamknięty system drenażowy, co sprawia, że model pęcherza in vitro jest podatny na zanieczyszczenie. Aby uniknąć zanieczyszczenia komory centralnej, cewniki o potrójnym prześwicie mogą być używane do pobierania próbek populacji komórek planktonowych (poprzez zaciśnięcie światła odpadowego i opróżnienie przez dodatkowe światło). Oczekuje się, że w ciągu 4 godzin nastąpi pewne wypłukanie, ale może być konieczne rozwiązywanie problemów, jeśli w tym momencie nie zostaną wyliczone żadne żywotne komórki planktonowe. Jeśli po 4 godzinach nie zostaną zliczone żadne żywe komórki, może być konieczne zoptymalizowanie gęstości inokulum lub preparatu AUM, aby lepiej wspierać kolonizację bakteryjną. Dodatkowo, wypłukiwanie inokulum może wskazywać na problem z obwodem pożywki; Załamania w rurkach mogą uniemożliwić odpowiedni drenaż, powodując gromadzenie się toksycznych metabolitów, które mogą utrudniać rozwój bakterii, podczas gdy wszelkie resztki środka dezynfekującego używane do przepłukiwania przewodów mediów mogą mieć działanie bakteriobójcze.

Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie AUM, jak wcześniej opisali Nzakizwanayo i wsp., ponieważ został on wcześniej zatwierdzony do stosowania w modelu pęcherza in vitro z widocznymi patogenami CAUTI, w tym Proteus mirabilis i Escherichia coli 43,45,46,48 . Istnieje jednak możliwość modyfikacji preparatu AUM zastosowanego w protokole w celu selekcji pod kątem wzrostu innych patogenów. Opublikowano wiele różnych formuł AUM, które mogą być stosowane w obiegu medialnym 28,56,57,58,59,60. Dodatkowo AUM w zbiorniku pożywki może być uzupełniany składnikami odżywczymi lub antybiotykami w celu selekcji do wzrostu określonych patogenów. Historycznie rzecz biorąc, modele pęcherza moczowego in vitro były również dostarczane z kałużą ludzkiego moczu, jednak duże ilości pożywki wymagane do przeprowadzenia replikacji modelu pęcherza in vitro mogą sprawić, że pobieranie próbek ludzkich będzie niepraktyczne53,54. Co więcej, skład ludzkiego moczu może się znacznie różnić między próbkami pobranymi od pacjentów, wpływając na odtwarzalność eksperymentu, ponieważ wykazano, że różnice w stężeniu hormonów, soli i białek, a także stan nawodnienia, wpływają na wzrost bakterii i tworzenie biofilmu 38,39,61,62.

Powyższy protokół szczegółowo opisuje inokulację modelu pęcherza in vitro za pomocą ~1010 CFU/ml replikujących CAUTI w późnym stadium. Jednak miejsce inokulacji modelu pęcherza moczowego in vitro może zostać zmodyfikowane w przyszłych testach, aby lepiej odtworzyć wcześniejsze etapy CAUTI, tj. początkową kolonizację cewnika moczowego i wzniesienie do pęcherza moczowego. Ręczne zanieczyszczenie cewników Foleya znanym inokulum bakteryjnym przed skonfigurowaniem modeli in vitro może dostarczyć informacji na temat wczesnych stadiów CAUTI. Rzeczywiście, gęstość inokulum została zmodyfikowana w poprzednich pracach w celu odtworzenia infekcji we wcześniejszym stadium; na przykład Nzakizwanayo i wsp. inokulowane modele pęcherza moczowego in vitro z niższym wyjściowym CFU/ml (ok. 103 CFU/ml) w celu replikacji infekcji we wcześniejszym stadium47. Warto jednak zauważyć, że zmiana gęstości inokulum może spowodować wydłużenie czasu do zablokowania i wymaga dodatkowej walidacji przed eksperymentami.

Ponadto, podczas gdy protokół szczegółowo opisuje inokulację modelu in vitro monokulturą bakteryjną, istnieje możliwość inokulacji modeli patogenami grzybowymi. Wcześniejsze badania sugerowały, że do 8% CAUTI wynika z zakażenia Candida spp., który jest zdolny do wytwarzania biofilmów, które często są oporne na leczenie przeciwgrzybicze27,63. Co więcej, model pęcherza moczowego in vitro może być modyfikowany w celu uwzględnienia badania wielodrobnoustrojowego CAUTI. Rzeczywiście, zasugerowano, że do 86% CAUTI to infekcje wielodrobnoustrojowe, a infekcje te często wiążą się z poważniejszymi objawami i wyższą śmiertelnością niż infekcje jednogatunkowe 27,64,65,69. Modele in vitro mogą być inokulowane wieloma gatunkami w celu zbadania powstawania biofilmów polimikrobiologicznych i progresji CAUTI, ale przed inokulacją należy przeprowadzić staranną walidację społeczności polimikrobiologicznych i modyfikację gęstości inokulum. W poprzednich badaniach wykorzystano model pęcherza in vitro do monitorowania różnic w tworzeniu biofilmu u pojedynczych gatunków P. mirabilis CAUTI w porównaniu z dwugatunkowymi CAUTI z E. faecalis, podkreślając wzajemne oddziaływanie metaboliczne między szczepami, co skutkowało zwiększonym tworzeniem biofilmu w porównaniu z infekcją pojedynczym gatunkiem70.

Główną zaletą wykorzystania modelu pęcherza moczowego in vitro do badania CAUTI, jest możliwość obserwacji powstawania biofilmu na powierzchni standardowego cewnika moczowego. Tworzenie biofilmów w CAUTI jest często inicjowane przez tworzenie się filmów kondycjonujących na świetle cewnika, składających się z organicznych składników moczu, do których mogą przylegać uropatogeny, przed proliferacją i utworzeniem dojrzałych biofilmów 2,18,71,72,73 . Standardowe testy stosowane do badania tworzenia biofilmu często wykorzystują standardowe pożywki bakteryjne zamiast AUM i często opierają się na przyleganiu do mikropłytek lub kołków polistyrenowych, tj. urządzenia z Calgary; jednak wcześniejsze prace sugerowały, że środowisko odżywcze, pH i poziom tlenu w systemie, a także właściwości fizyczne, takie jak przepływ i różnica w strukturze powierzchni (silikon kontra tworzywa sztuczne), mogą wpływać na tworzenie biofilmu 36,37,74,75,76,77,78. Dodatkowo, hodowla bakterii o dużej aktywności ureazy, takich jak P. mirabilis w systemie zamkniętym w AUM, może powodować gromadzenie się toksycznych metabolitów, co może prowadzić do śmierci komórki78,79. Jest to złagodzone w modelu pęcherza in vitro, ponieważ AUM w komorze centralnej jest stale zastępowane świeżymi pożywkami za pośrednictwem obwodu pożywki, co pozwala na badanie biofilmów CAUTI w bardziej istotnych klinicznie warunkach45. Codzienny przebieg modelu pęcherza moczowego in vitro i punkt końcowy wybrany dla modeli w dużej mierze zależy od tego, czy modele są inokulowane organizmami ureazowo-dodatnimi czy ujemnymi. Teoretycznie modele in vitro mogą działać w nieskończoność, jeśli są dostarczane z odpowiednią ilością AUM i jeśli zachowana jest sterylność modelu; Zaleca się jednak, aby przed eksperymentowaniem wybrać punkt końcowy, niezależnie od tego, czy jest to blokada, czy dowolna liczba dni. Ogólnie zaleca się, aby modele in vitro zaszczepione organizmami ureazowo-ujemnymi były uruchamiane przez ≤7 dni w celu symulacji środowiska klinicznego, ponieważ jest to zazwyczaj wystarczające do zaobserwowania tworzenia się biofilmu w większości organizmów, przy jednoczesnym zachowaniu zgodności z interwencjami klinicznymi, ponieważ standardowa najlepsza praktyka wskazuje, że cewniki należy wymienić po widocznym zakażeniu1, 2,3,47,48. Chociaż organizmy ureazowo-dodatnie mogą wytwarzać krystaliczne biofilmy, istnieje duża zmienność wśród szczepów ureazo-dodatnich w czasie do zablokowania modelu pęcherza in vitro, przy czym niektóre szczepy Proteus mirabilis powodują zablokowanie cewnika w czasie krótszym niż 10 godzin, a inne potrzebują ponad 30 godzin na zablokowanie39,46. Standardowy test ureazy może być stosowany przed eksperymentami z modelami pęcherza in vitro w celu określenia, czy należy uruchomić modele do zatkania, czy też do wstępnie zdefiniowanego punktu końcowego80.

Być może głównym ograniczeniem stosowania modelu pęcherza moczowego in vitro do badania tworzenia biofilmu jest to, że pomiary biofilmu są odczytem końcowym, ponieważ wymagają usunięcia i wypreparowania cewnika moczowego. I odwrotnie, próbki planktonu można pobrać z modelu pęcherza in vitro w dowolnym momencie podczas eksperymentów. Dodatkowo, po pobraniu próbek biofilmu z modeli pęcherza moczowego in vitro, można zastosować wiele dodatkowych technik dalszych w celu lepszego ilościowego określenia produkcji biofilmu. W poprzednich badaniach wykorzystano fotometrię płomieniową do ilościowego określenia ilości wapnia i magnezu obecnych w krystalicznych biofilmach, a bardziej złożone barwienia można wykorzystać do dokładnej identyfikacji składników matrycy EPS biofilmów ureazowo-ujemnych 45,73,81,82,83,84.

W pracy opisano również zastosowanie modelu pęcherza moczowego in vitro do badania efektów terapii ukierunkowanych na leczenie CAUTI. Model pęcherza moczowego in vitro symuluje ważne aspekty niszy CAUTI, takie jak zastosowanie AUM, a także klinicznie istotne tworzenie biofilmu i zwiększone obciążenie organiczne obserwowane w CAUTI. Środki terapeutyczne, takie jak antybiotyki, mogą być dodawane bezpośrednio do zbiornika AUM, aby symulować klinicznie istotną biodostępność leku, a wcześniejsze badania wykorzystywały leki o zmienionym przeznaczeniu, takie jak tiorydazyna i fluoksetyna, aby wykazać działanie przeciwbiofilmowe81. Ponadto testy minimalnego stężenia hamującego i testy zawiesiny bakteryjnej są często stosowane w celu wywnioskowania aktywności przeciwdrobnoustrojowej biocydów, chociaż istnieje niewiele dowodów sugerujących, że testy korelują z wrażliwością biocydów w świecie rzeczywistym 41,85,86,87,88. Model pęcherza moczowego in vitro jest korzystny dla testowania produktów biobójczych mających na celu leczenie lub zapobieganie CAUTI, ponieważ obecność cewnika moczowego i bardziej reprezentatywna symulacja niszy CAUTI oznaczają, że produkty takie jak przeciwdrobnoustrojowe żele smarowe i roztwory do irygacji mogą być testowane zgodnie z instrukcjami producenta. W poprzednich badaniach wykorzystano również model pęcherza in vitro w celu określenia skuteczności terapii fagowej i wykazano, że leczenie fagami może wydłużyć czas blokowania modelu pęcherza in vitro o ponad 100 godzin47. Zastosowanie cewnika Foleya o standardowej wielkości w modelu pęcherza moczowego in vitro oznacza również, że nowatorskie, powlekane cewniki mogą być testowane pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Wcześniejsze prace Slate i wsp. wykazano, że cewniki pokryte teranotyczną powłoką cyprofloksacyny mogą wydłużyć czas do zablokowania P. mirabilis o ~60 godzin w pęcherzu in vitro model48. Podkreśla to potencjalne zastosowanie modelu pęcherza moczowego in vitro w badaniach nad nowymi terapiami mającymi na celu leczenie CAUTI, co pozwoli na dokładniejszą ocenę środków przeciwdrobnoustrojowych w biologicznie istotnej symulowanej niszy CAUTI.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Jonathanowi Nzakizwanayo i Dr. Anthony'emu J. Slate'owi za ich wspólną wiedzę w rozwijaniu tego protokołu. Praca na Uniwersytecie w Bath została sfinansowana przez Radę Badań Medycznych GW4 Biomed DTP jako stypendium dla V.B. (MR/N0137941/1). B. V. J. jest również wspierany przez fundusze z Dunhill Medical Trust (RPGF1906\171). Badania przeprowadzone przez O.E.C. zostały sfinansowane przez Kidney Research Northwest (RCN: 1144798). Rysunek 1 jest tworzony za pomocą Biorender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
313 Przedłużenie głowicy pompy Rapid-LoadPompa perystaltyczna Watson-Marlow313- dodatkowe przedłużenie głowicy 
323S/D Pompa o zmiennej prędkości sterowana ręcznieWatson-Marlow323S/DPompa perystaltyczna
3L Worki na łóżka, sterylne z kranami dźwigniowymi Opieka zdrowotna dla niedźwiedzi Great Bear GDW173
Rurka silikonowa utwardzana platyną o średnicy wewnętrznej 3 mmFisher10111801Rurka z małym obwodem AUM (podłącz rurkę pompy do modeli)
Rurka silikonowa utwardzana platyną o średnicy wewnętrznej 5 mmRurkaobwodu Fisher 10539201 Medium AUM (podłącz rurkę pompy do zbiornika AUM
) chlorek amonu (NH4Cl)Fisher11473713
bezwodny siarczan sodu (Na2SO4)Złącze
Azlon Fisher10712807Służy do łączenia różnych długości przewodów w obwodzie AUM
Wieszaki na torby na łóżko Opieka zdrowotna dla niedźwiedzi Great Bear 10705P
Zaciski rurki kurka Bochem, średnica 25 mmFisher11805101
chlorek wapnia (CaCl2)Fisher10021681
Monohydrat kwasu cytrynowego MerckC1909-500GSłuży do usuwania krystalicznego biofilmu z modeli po eksperymentach 
Marka rybacka  Pipety z podziałką szklaną klasy B typu 1Fisher11992168Służy do dostarczania modeli łopatek in vitro z AUM za pomocą zwierciadlanej
żelatynyVWR24360.233
Graphpad prism 10GraphPadV10.0Oprogramowanie analityczne służące do tworzenia wykresów wyników modeli pęcherza moczowego in vitro i analizy statystycznej. 
Miernik pH Hanna HI 2211-02Phillip Harris PP00057414
Model pęcherza moczowego < in vitro>-Sprzęt na zamówienie, jak wcześniej opisano przez Nzakizwanayo i in. (2019).
Instillagel 6 ml żel nawilżającymydoctorshop.co.uk40-006Żele smarujące stosowane w sekcji 7.1.; inni dostawcy są dostępni.
Kartell Plastilab Nierówny łącznik stożkowyFisher 11914289Służy do łączenia przewodów o różnych średnicach
Agar MacConkey bez soli (odwodniony)Fisher10472643Do oznaczania liczby pojedynczych kolonii bakterii rojowych, tj. Proteus mirabilis
chlorek magnezu sześciowodny (MgCl2.6H2O)Fisher10386743
fosforan monopotasowy (KH2PO4)Złącze Fisher10573181
Nalgene w kształcie litery YFisher10186070Służy do uruchamiania wielu obwodów AUM z jednego zbiornika AUM (1-4 modele na zbiornik) 
potasu (KCl)
Pyrex z bocznym gniazdem ze szkła szlifowanego, Pojemność: 5000 mlZbiornik Fisher11347884AUM
Korki gumowe z otworem, Średnica zewnętrzna: 37mm, Czerwona, Średnica: 37mmFisher11517612Stosowany w zbiorniku AUM oraz do zasilania modeli in vitro z AUM
Rozmiar 14 francuski 100% silikonowy cewnik Foleya ze sterylną strzykawką z wodą do pompowania Opieka zdrowotna dla niedźwiedzi Great Bear 4833-0514
chlorek sodu (NaCl)Fisher10735921
szczawian sodu (Na2C2O4)Fisher10442211
Teknon Biocleanse koncentrat biobójczy środek czyszczący 5L Fisher12447580Służy do sterylizacji modeli po eksperymentach
cytrynian trisodowy (Na3C6H5O7)Fisher11434993
bulion sojowy tryptonowyFisher10198002
mocznik (CH4N2O)Fisher10404185
Uro-Tainer M NaCl 0,9%B.BraunFB99833Worek do irygacji pęcherza soli fizjologicznej stosowany w sekcji 7.2. 
Watson-Marlow Pumpsil 1,6 mm rurka silikonowa utwardzana platyną o średnicy wewnętrznejFisher12406280Grube rurki obwodu AUM (do stosowania w pompie perstaltycznej)
stożkowe Fisher 11498717 chlorek Butelka z aspiratorem Fisher 10375810

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, D. R., et al. Epidemiology and health-economic burden of urinary-catheter-associated infection in English NHS hospitals: A probabilistic modelling study. J Hosp Infect. 103 (1), 44-54 (2019).
  2. Stickler, D. J. Bacterial biofilms in patients with indwelling urinary catheters. Nat Clin Pract Urol. 5 (11), 598-608 (2008).
  3. Feneley, R. C., Hopley, I. B., Wells, P. N. Urinary catheters: History, current status, adverse events and research agenda. J Med Eng Technol. 39 (8), 459-470 (2015).
  4. Lapides, J., Diokno, A. C., Silber, S. J., Lowe, B. S. Clean, intermittent self-catheterization in the treatment of urinary tract disease. J Urol. 107 (3), 458-461 (1972).
  5. Suetens, C., et al. Prevalence of healthcare-associated infections, estimated incidence and composite antimicrobial resistance index in acute care hospitals and long-term care facilities: Results from two European point prevalence surveys, 2016 to 2017. Euro Surveill. 23 (46), 1800516(2018).
  6. Nicolle, L. E. Catheter associated urinary tract infections. Antimicrob Resist Infect Control. 3, 23(2014).
  7. Jacobsen, S. M., Stickler, D. J., Mobley, H. L., Shirtliff, M. E. Complicated catheter-associated urinary tract infections due to Escherichia coli and Proteus mirabilis. Clinical Microbiol Rev. 21 (1), 26-59 (2008).
  8. Trautner, B. W., Darouiche, R. O. Role of biofilm in catheter-associated urinary tract infection. Am J Infect Control. 32 (3), 177-183 (2004).
  9. Garibaldi, R. A., Burke, J. P., Dickman, M. L., Smith, C. B. Factors predisposing to bacteriuria during indwelling urethral catheterization. N Engl J Med. 291 (5), 215-219 (1974).
  10. Warren, J. W., et al. Fever, bacteremia, and death as complications of bacteriuria in women with long-term urethral catheters. JInfect Dis. 155 (6), 1151-1158 (1987).
  11. Walker, J. N., et al. High-resolution imaging reveals microbial biofilms on patient urinary catheters despite antibiotic administration. World JUrol. 38 (9), 2237-2245 (2020).
  12. Chant, C., Smith, O. M., Marshall, J. C., Friedrich, J. O. Relationship of catheter-associated urinary tract infection to mortality and length of stay in critically ill patients: A systematic review and meta-analysis of observational studies. Crit Care Med. 39 (5), 1167-1173 (2011).
  13. Clarke, K., et al. Catheter-associated urinary tract infections in adults: Diagnosis, treatment, and prevention. J Hosp Med. 15 (9), 552-556 (2020).
  14. Tambyah, P. A., Maki, D. G. The relationship between pyuria and infection in patients with indwelling urinary catheters: A prospective study of 761 patients. Arch Intern Med. 160 (5), 673-677 (2000).
  15. Flemming, H. C., et al. Biofilms: An emergent form of bacterial life. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 563-575 (2016).
  16. Stewart, P. S., Costerton, J. W. Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. Lancet. 358 (9276), 135-138 (2001).
  17. Stewart, P. S. Mechanisms of antibiotic resistance in bacterial biofilms. Int J Med Microbiol. 292 (2), 107-113 (2002).
  18. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  19. Sabir, N., et al. Bacterial biofilm-based catheter-associated urinary tract infections: Causative pathogens and antibiotic resistance. Am JInfect Control. 45 (10), 1101-1105 (2017).
  20. Touzel, R., Sutton, J., Wand, M. Establishment of a multi-species biofilm model to evaluate chlorhexidine efficacy. JHosp Infect. 92 (2), 154-160 (2016).
  21. Luo, Y., Yang, Q., Zhang, D., Yan, W. Mechanisms and control strategies of antibiotic resistance in pathological biofilms. J Microbiol Biotechnol. 31 (1), 1-7 (2021).
  22. Dincer, S., Uslu, F. M., Delik, A. Antibiotic resistance in biofilm. Bacterial biofilms. , IntechOpen. (2020).
  23. Soto, S. M. Importance of biofilms in urinary tract infections: New therapeutic approaches. Adv Biol. 2014 (1), 543974(2014).
  24. Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends Microbiol. 13 (1), 34-40 (2005).
  25. Otto, S. B., et al. Privatization of biofilm matrix in structurally heterogeneous biofilms. MSystems. 5 (4), e00425-e00520 (2020).
  26. Wood, T. K., Knabel, S. J., Kwan, B. W. Bacterial persister cell formation and dormancy. Appl Environ Microbiol. 79 (23), 7116-7121 (2013).
  27. Gaston, J. R., Johnson, A. O., Bair, K. L., White, A. N., Armbruster, C. E. Polymicrobial interactions in the urinary tract: Is the enemy of my enemy my friend. InfectImmun. 89 (4), (2021).
  28. Griffith, D. P., Musher, D. Á, Itin, C. Urease. The primary cause of infection-induced urinary stones. Invest Urol. 13 (5), 346-350 (1976).
  29. Armbruster, C. E., Mobley, H. L. T., Pearson, M. M. Pathogenesis of Proteus mirabilis infection. EcoSal Plus. 8 (1), 1128(2018).
  30. Jacobsen, S. M., Shirtliff, M. E. Proteus mirabilis biofilms and catheter-associated urinary tract infections. Virulence. 2 (5), 460-465 (2011).
  31. Mobley, H. L., Warren, J. W. Urease-positive bacteriuria and obstruction of long-term urinary catheters. J Clin Microbiol. 25 (11), 2216-2217 (1987).
  32. Wasfi, R., Hamed, S. M., Amer, M. A., Fahmy, L. I. Proteus mirabilis biofilm: Development and therapeutic strategies. Front Cell Infect Microbiol. 10 (414), (2020).
  33. Broomfield, R. J., Morgan, S. D., Khan, A., Stickler, D. J. Crystalline bacterial biofilm formation on urinary catheters by urease-producing urinary tract pathogens: A simple method of control. J Med Microbiol. 58 (10), 1367-1375 (2009).
  34. Stickler, D. J. Clinical complications of urinary catheters caused by crystalline biofilms: Something needs to be done. J Intern Med. 276 (2), 120-129 (2014).
  35. Coffey, B. M., Anderson, G. G. Biofilm formation in the 96-well microtiter plate. Pseudomonas methods and protocols. , 631-641 (2014).
  36. Ceri, H., et al. The Calgary biofilm device: New technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clin Microbiol. 37 (6), 1771-1776 (1999).
  37. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J Microbiol Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  38. Bouatra, S., et al. The human urine metabolome. PloS one. 8 (9), e73076(2013).
  39. Holling, N., et al. Elucidating the genetic basis of crystalline biofilm formation in Proteus mirabilis. Infect Immun. 82 (4), 1616-1626 (2014).
  40. Lawrence, E., Turner, I. Materials for urinary catheters: A review of their history and development in the UK. Med Eng Phys. 27 (6), 443-453 (2005).
  41. Stickler, D. J. Chlorhexidine resistance in Proteus mirabilis. J Clin Pathol. 27 (4), 284-287 (1974).
  42. Fraise, A. P. Biocide abuse and antimicrobial resistance-a cause for concern. J Antimicrob Chemother. 49 (1), 11-12 (2002).
  43. Pelling, H., et al. Derepression of the smvA efflux system arises in clinical isolates of proteus mirabilis and reduces susceptibility to chlorhexidine and other biocides. Antimicrob Agents Chemother. 63 (12), e01535(2019).
  44. Stickler, D. J., Morris, N. S., Winters, C. Simple physical model to study formation and physiology of biofilms on urethral catheters. MethodsEnzymol. 310, 494-501 (1999).
  45. Nzakizwanayo, J., Pelling, H., Milo, S., Jones, B. V. An in vitro bladder model for studying catheter-associated urinary tract infection and associated analysis of biofilms. Proteus mirabilis: Methods and Protocols. , 139-158 (2019).
  46. Clarke, O. E., et al. Lipopolysaccharide structure modulates cationic biocide susceptibility and crystalline biofilm formation in Proteus mirabilis. Front Microbiol. 14, 1150625(2023).
  47. Nzakizwanayo, J., et al. Bacteriophage can prevent encrustation and blockage of urinary catheters by proteus mirabilis. Antimicrob Agents Chemother. 60 (3), 1530-1536 (2015).
  48. Slate, A. J., et al. Infection-responsive coatings to reduce biofilm formation and encrustation of urinary catheters. J Appl Microbiol. 134 (6), lxad121(2023).
  49. Maierl, M., Jörger, M., Rosker, P., Reisner, A. In vitro dynamic model of a catheterized bladder and biofilm assay. Bio Protoc. 5 (2), e1381(2015).
  50. Stickler, D., Clayton, C., Chawla, J. The resistance of urinary tract pathogens to chlorhexidine bladder washouts. J Hosp Infect. 10 (1), 28-39 (1987).
  51. King, J., Stickler, D. An assessment of antiseptic bladder washout solutions using a physical model of the catheterized bladder. J Hosp Infect. 18 (3), 179-190 (1991).
  52. King, J., Stickler, D. The effect of repeated instillations of antiseptics on catheter-associated urinary tract infections: A study in a physical model of the catheterized bladder. Urol Res. 20, 403-407 (1992).
  53. Morris, N., Stickler, D. Encrustation of indwelling urethral catheters by Proteus mirabilis biofilms growing in human urine. J Hosp Infect. 39 (3), 227-234 (1998).
  54. Stickler, D., Morgan, S. Observations on the development of the crystalline bacterial biofilms that encrust and block foley catheters. J Hosp Infect. 69 (4), 350-360 (2008).
  55. Stamm, W. E. Catheter-associated urinary tract infections: Epidemiology, pathogenesis, and prevention. Am J Med. 91 (3, Supplement 2), S65-S71 (1991).
  56. Sarigul, N., Korkmaz, F., Kurultak, I. A new artificial urine protocol to better imitate human urine. Sci Rep. 9 (1), 20159(2019).
  57. Brooks, T., Keevil, C. A simple artificial urine for the growth of urinary pathogens. Lett Appl Microbiol. 24 (3), 203-206 (1997).
  58. Ipe, D. S., Horton, E., Ulett, G. C. The basics of bacteriuria: Strategies of microbes for persistence in urine. Front CellI Infect Microbiol. 6 (14), 3389(2016).
  59. Ipe, D. S., Ulett, G. C. Evaluation of the in vitro growth of urinary tract infection-causing gram-negative and gram-positive bacteria in a proposed synthetic human urine (SHU) medium. J Microbioll Methods. 127, 164-171 (2016).
  60. Chutipongtanate, S., Thongboonkerd, V. Systematic comparisons of artificial urine formulas for in vitro cellular study. Anal Biochem. 402 (1), 110-112 (2010).
  61. Saude, E. J., Adamko, D., Rowe, B. H., Marrie, T., Sykes, B. D. Variation of metabolites in normal human urine. Metabolomics. 3, 439-451 (2007).
  62. Andersen, S., et al. Proteomes of uropathogenic Escherichia coli growing in human urine and in j82 urinary bladder cells. Proteomes. 10 (2), 15(2022).
  63. Uppuluri, P., Dinakaran, H., Thomas, D. P., Chaturvedi, A. K., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of Candida albicans biofilms grown in a synthetic urine medium. J Clin Microbiol. 47 (12), 4078-4083 (2009).
  64. Gaston, J. R., et al. Enterococcus faecalis polymicrobial interactions facilitate biofilm formation, antibiotic recalcitrance, and persistent colonization of the catheterized urinary tract. Pathogens. 9 (10), 835(2020).
  65. Warren, J. W., Tenney, J. H., Hoopes, J. M., Muncie, H. L., Anthony, W. C. A prospective microbiologic study of bacteriuria in patients with chronic indwelling urethral catheters. The JI Infect Dis. 146 (6), 719-723 (1982).
  66. Armbruster, C. E., et al. Genome-wide transposon mutagenesis of Proteus mirabilis: Essential genes, fitness factors for catheter-associated urinary tract infection, and the impact of polymicrobial infection on fitness requirements. PLoS Pathog. 13 (6), e1006434(2017).
  67. Armbruster, C. E., et al. The pathogenic potential of Proteus mirabilis is enhanced by other uropathogens during polymicrobial urinary tract infection. Infect Immun. 85 (2), e00808(2017).
  68. Siegman-Igra, Y., Kulka, T., Schwartz, D., Konforti, N. Polymicrobial and monomicrobial bacteraemic urinary tract infection. J Hosp Infect. 28 (1), 49-56 (1994).
  69. Nye, T. M., et al. Microbial co-occurrences on catheters from long-term catheterized patients. Nat Commun. 15 (1), 61(2024).
  70. Hunt, B. C., et al. Metabolic interplay between Proteus mirabilis and Enterococcus faecalis facilitates polymicrobial biofilm formation and invasive disease. mBio. 15, e02164(2024).
  71. Stickler, D., Ganderton, L., King, J., Nettleton, J., Winters, C. Proteus mirabilis biofilms and the encrustation of urethral catheters. Urol Res. 21, 407-411 (1993).
  72. Donlan, R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  73. Habash, M., Reid, G. Microbial biofilms: Their development and significance for medical device-related infections. J Clin Pharmacol. 39 (9), 887-898 (1999).
  74. Ommen, P., Zobek, N., Meyer, R. L. Quantification of biofilm biomass by staining: Non-toxic safranin can replace the popular crystal violet. J Microbiol Methods. 141, 87-89 (2017).
  75. Wilson, C., et al. Quantitative and qualitative assessment methods for biofilm growth: A mini-review. Research and Reviews: J Eng Technol. 6 (4), 30214915(2017).
  76. Niebergall, A. K., et al. Influence of polymerized siloxane coating on growth and biofilm formation of aerobic grown nosocomial bacteria. J Cell Biotechnol. 3 (2), 107-115 (2018).
  77. Ionescu, A., Brambilla, E., Sighinolfi, M. C., Mattina, R. A new urinary catheter design reduces in vitro biofilm formation by influencing hydrodynamics. J Hosp Infect. 114, 153-162 (2021).
  78. Pelling, H., et al. Bacterial biofilm formation on indwelling urethral catheters. Lett Appl Microbiol. 68 (4), 277-293 (2019).
  79. Schaffer, J. N., Pearson, M. M. Proteus mirabilis and urinary tract infections. Microbiol Spectr. 3 (5), 1128(2015).
  80. Konieczna, I., et al. Bacterial urease and its role in long-lasting human diseases. Curr Protein Pept Sci. 13 (8), 789-806 (2012).
  81. Nzakizwanayo, J., et al. Fluoxetine and thioridazine inhibit efflux and attenuate crystalline biofilm formation by Proteus mirabilis. Sci Rep. 7 (1), 12222(2017).
  82. Strathmann, M., Wingender, J., Flemming, H. C. Application of fluorescently labeled lectins for the visualization and biochemical characterization of polysaccharides in biofilms of Pseudomonas aeruginosa. J Microbiol Methods. 50 (3), 237-248 (2002).
  83. Van Den Driessche, F., Rigole, P., Brackman, G., Coenye, T. Optimization of resazurin-based viability staining for quantification of microbial biofilms. J Microbiol Methods. 98, 31-34 (2014).
  84. Trafny, E. A., Lewandowski, R., Zawistowska-Marciniak, I., Stępińska, M. Use of MTT assay for determination of the biofilm formation capacity of microorganisms in metalworking fluids. World J Microbiol Biotechnol. 29, 1635-1643 (2013).
  85. Chapman, J. S. Biocide resistance mechanisms. Int Biodeterior Biodegrad. 51 (2), 133-138 (2003).
  86. Cloete, T. E. Resistance mechanisms of bacteria to antimicrobial compounds. Int Biodeterior Biodegrad. 51 (4), 277-282 (2003).
  87. Maillard, J. Y. Resistance of bacteria to biocides. Microbiol Spectr. 6 (2), 1128(2018).
  88. Maillard, J. Y. Bacterial resistance to biocides in the healthcare environment: Should it be of genuine concern. J Hosp Infect. 65, 60-72 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tworzenie biofilmucewniki moczoweoporno na rodki przeciwdrobnoustrojowecewnik Foleyaniedro no cewnikajednostki tworz ce koloniebarwienie fioletem krystalicznymp ukanie chlorheksydyn

Powiązane artykuły