Artykuł metodologiczny

Identyfikacja mikrogleju i makrofagów naciekających obwodowo w uszkodzonym rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67967

⸱

24 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Laboratory Medicine, Bengbu Medical University, 3Anhui Province Key Laboratory of Immunology in Chronic Diseases, Bengbu Medical University, 4The Second Affiliated Hospital of South China University, 5Anhui Province Key Laboratory of Basic and Translational Research of Inflammation-related Diseases, Bengbu Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Identyfikacja mikrogleju (MG) i obwodowych naciekających makrofagów (Mø) w uszkodzonym rdzeniu kręgowym jest trudna. W tym protokole zastosowano cytometrię przepływową (FCM) do identyfikacji odpowiednio MG podobnego do M1, MG podobnego do M2, M1-podobnego Mø i M2-podobnego Mø. Technologia ta może być również stosowana w innych chorobach ośrodkowego układu nerwowego, aby zrozumieć rolę MG i Mø.

Streszczenie

W zdrowym rdzeniu kręgowym makrofagi naciekające obwodowo są prawie niewykrywalne, a mikroglej (MG) uczestniczy w utrzymaniu stabilności mikrośrodowiska rdzenia kręgowego poprzez fagocytozę, usuwanie resztek komórkowych i wytwarzanie czynników neurotroficznych. Po urazie rdzenia kręgowego (SCI) MG są aktywowane, a obwodowe komórki odpornościowe infiltrują do uszkodzonego rdzenia kręgowego. Wśród tych komórek odpornościowych aktywowane MG i makrofagi naciekające obwodowo (Mø) odgrywają kluczową rolę w patologicznym procesie SCI. Komórki te można podzielić na fenotypy prozapalne (podobne do M1) i przeciwzapalne (podobne do M2); Jednak ich rozróżnienie jest trudne ze względu na podobieństwo morfologii i wiele markerów komórkowych. Cytometria przepływowa (FCM), szeroko stosowana technika w dziedzinie biomedycyny, może jednocześnie wykrywać wiele parametrów komórkowych, takich jak rozmiar komórki, rozmiar cząstek, powierzchnia komórki i markery wewnątrzkomórkowe w jednym eksperymencie. Przez lata badań FCM próbowano zidentyfikować MG i Mø w rdzeniu kręgowym i stale optymalizowano, aby ostatecznie opracować stabilną metodę wykrywania. Metoda ta pozwala na identyfikację M1/M2-podobnego MG i M1/M2-podobnego Mø po SCI poprzez wykrycie profili ekspresji CD45, CD11b, CD68, CCR7 i innych markerów. W tym protokole CD11b+CD45−/niskiCD68+CCR7+, CD11b+CD45−/niskiCD68+CCR7-, CD11b+CD45wysokiCD68+CCR7+ i CD11b+CD45wysokiCD68+CCR7- można zidentyfikować odpowiednio jako M1-podobne MG, M2-podobne MG, M1-podobne Mø i M2-podobne Mø.

Wprowadzenie

Uraz rdzenia kręgowego (SCI) jest wynikiem uszkodzenia rdzenia kręgowego spowodowanego różnymi przyczynami. SCI ma wysoki wskaźnik niepełnosprawności, a obecnie nie ma skutecznych opcji leczenia, co czyni ją jednym z najpoważniejszych problemów zdrowia publicznego na świecie 1,2. Patofizjologiczny proces SCI jest złożony, podzielony na dwa etapy. Początkowo uraz mechaniczny spowodowany urazem natychmiast powoduje ostrą dysfunkcję komórkową i śmierć komórki. Następnie wtórne uszkodzenie prowadzi do dalszej dysfunkcji komórkowej i śmierci komórki w ciągu dni, tygodni, a nawet miesięcy. Udowodniono, że w ramach wtórnych mechanizmów uszkodzeń stan zapalny jest kluczowym wyznacznikiem ciężkości wtórnego uszkodzenia, ostatecznie decydując o śmierci komórki i jej funkcjonalności3. Cechą charakterystyczną reakcji zapalnych jest naciekanie i aktywacja komórek zapalnych w uszkodzonym rdzeniu kręgowym, co prowadzi do wzrostu liczby komórek zapalnych i czynników zapalnych, tworząc mikrośrodowisko zapalne i ostatecznie powodując dysfunkcję rdzenia kręgowego4.

Mikroglej w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i makrofagi naciekające obwodowo odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi zapalnej po urazie rdzenia kręgowego (SCI)5,6. Jako makrofagi rezydujące w OUN, mikroglej stanowi 5%-10% komórek OUN i jest niezbędny do odzyskiwania SCI 7,8. Mikroglej może pochłaniać i usuwać zanieczyszczenia komórkowe po SCI, pośrednicząc w tworzeniu gojących się blizn 9,10. Jednak nadmierna aktywacja mikrogleju może prowadzić do trwałej odpowiedzi zapalnej i sprzyjać powstawaniu blizn glejowych, które utrudniają regenerację aksonów11. Po SCI aktywowany mikroglej wykazuje głównie dwa fenotypy: podobny do M1 i podobny do M212,13. Fenotyp podobny do M1 jest prozapalny, promując syntezę czynników zapalnych przyczyniających się do apoptozy komórek i wtórnego uszkodzenia. Mikroglej podobny do M1 ma również działanie neurotoksyczne, zaostrzając urazy i apoptozę neuronów14,15. W przeciwieństwie do tego, fenotyp podobny do M2 ma właściwości przeciwzapalne i promuje angiogenezę, remielinę, wzrost aksonów i naprawę tkanek16,17. Mikroglej podobny do M2 odgrywa kluczową rolę w modulowaniu stanu zapalnego i procesach naprawczych.

Makrofagi obwodowe infiltrują do miejsca zmiany chorobowej po SCI przez uszkodzone bariery krew-rdzeń kręgowy i naczynia krwionośne17,18, dodatkowo regulując odpowiedź zapalną, fagocytozę, tworzenie blizn i regenerację tkanki nerwowej19,20. Makrofagi naciekające obwodowo mogą zmniejszać odpowiedź zapalną po SCI, resztki tkanki fagocytozy21, promować regenerację neuronów i przebudowę macierzy. Jednak utrzymująca się reakcja zapalna, w której pośredniczą makrofagi naciekające obwodowo, może prowadzić do wtórnego urazu, co jest szkodliwe dla długotrwałego powrotu do zdrowia22,23. Makrofagi naciekające obwodowo podobne do M1 mają silne zdolności fagocytarne i antygenowe, zdolne do usuwania komórek nekrotycznych24. Jednak ich nadmierne wydzielanie cytokin prozapalnych, reaktywnych form tlenu (ROS) i reaktywnych form azotu (RNS) może uszkadzać neurony i komórki glejowe, prowadząc do poważniejszej apoptozy neuronów25. I odwrotnie, makrofagi naciekające obwodowo podobne do M2 mogą hamować apoptozę neuronów i łagodzić odpowiedź zapalną po SCI, promując w ten sposób naprawę tkanki nerwowej26.

Aktywowany mikroglej i obwodowo naciekające makrofagi po SCI wykazują podobieństwa morfologiczne i ekspresji molekularnej, które utrudniają ich różnicowanie. Cytometria przepływowa (FCM), szeroko stosowana technika, jest stosowana do analizy ekspresji powierzchni komórki i cząsteczek wewnątrzkomórkowych, identyfikacji różnych subpopulacji komórek i jednoczesnej oceny wielu parametrów poszczególnych komórek. Prowadzono stabilny test FCM w celu odróżnienia aktywowanego mikrogleju od makrofagów naciekających obwodowo, co ułatwia badanie ich roli w SCI. W tym artykule opisano opracowaną metodę stabilnego wykrywania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Medycznego Bengbu (nr 2020-050). Opieka nad zwierzętami była zgodna z przepisami dostarczonymi przez Ministerstwo Nauki i Technologii Chin. W sumie 18 ośmiotygodniowych samic myszy C57/BL6 zostało pozyskanych i wykorzystanych komercyjnie. Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie doświadczalne i zwierzęce

  1. Trzymaj myszy w wentylowanych klatkach przed operacją. Utrzymuj 12-godzinny cykl światła/ciemności i zapewnij swobodny dostęp do jedzenia i wody. Utrzymuj temperaturę otoczenia w pomieszczeniu na poziomie 20-22 °C, a wilgotność na poziomie 30%-70% przez tydzień aklimatyzacji.
  2. Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne dla myszy przez autoklawowanie i wysusz je przed użyciem. Poddaj narzędzia i salę operacyjną zwierząt sterylizacji ultrafioletem na pół godziny przed zabiegiem. Pogrupuj i oznacz myszy zgodnie z zasadą losowego grupowania. Rejestruj i rejestruj ich wagę do późniejszego wykorzystania.
  3. Znieczulić myszy koktajlem ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Ogol włosy z tyłu od kręgów T8 do T10.

2. Przygotowanie modelu myszy SCI

  1. Zdezynfekuj obszar operacyjny za pomocą wacika jodowego od głowy do ogona, centrując na T9, a następnie zdezynfekuj wacikiem nasączonym 75% alkoholem. Wykonaj 1 cm nacięcie w skórze wyśrodkowanej w T9. Wypreparuj powięź, mięśnie i więzadła otaczające T9 na 1 cm.
    1. Odłącz mięsień przylegający do wyrostka kolczystego T9, aby odsłonić T9. Użyj nożyczek okulistycznych, aby odsłonić i usunąć blaszkę między T9 a T10, całkowicie odsłaniając rdzeń kręgowy znajdujący się w T9, który ma średnicę około 2 mm.
      UWAGA: Podczas podnoszenia blaszki T9 upewnij się, że nożyczki nie dotykają rdzenia kręgowego.
  2. Ustabilizuj kręgosłup, zaciskając wyrostki kolczyste T7 i T11. Stwórz umiarkowany model SCI za pomocą pręta o średnicy 1,3 mm i sile 0,5 N. Obserwuj, jak ogon zwija się do góry, a tylna kończyna drga po SCI. W przypadku myszy operowanych pozorowanych należy wykonywać tylko laminektomię bez kontuzji.
  3. Osiągnij hemostazę w miejscu nacięcia. Wykonaj warstwowe zamknięcie za pomocą sterylnych szwów chirurgicznych 5-0. W celu przybliżenia mięśniowego chwyć głęboką powięź za pomocą kleszczyków Adson z zębami i zszyj warstwę panniculus carnosus za pomocą wchłanialnej żyłki 5-0, wprowadzając igłę prostopadle 2 mm od krawędzi rany, aby uzyskać symetryczne zgryzy o pełnej grubości (głębokość 2-3 mm) oddalone od siebie o 3 mm.
    1. Zawiąż kwadratowe węzły z kontrolowanym napięciem, aby anatomicznie wyrównać płaszczyzny powięzi. Zmień położenie krawędzi skóry za pomocą nożyczek z mikro tęczówką, aby uzyskać wywinięcie naskórka o 1 mm. Precyzyjnie wyrównaj skórę właściwą za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich i zabezpiecz prostymi, przerywanymi, niewchłanialnymi szwami 5-0 oddalonymi od siebie o 2 mm, zapewniając jednolitą koaptację bez podskórnej martwej przestrzeni.
    2. Zdezynfekuj linię szwów za pomocą wacików jodowych, wykonując jednokierunkowe ruchy od środka rany na zewnątrz. Delikatnie przetrzyj resztki krwi gazą zwilżoną solą fizjologiczną i nałóż cienką warstwę maści z potrójnym antybiotykiem wzdłuż nacięcia.
  4. Po operacji umieść myszy w klatce utrzymywanej w odpowiedniej temperaturze i wilgotności. Zapewnij pielęgnację oddawania moczu dwa razy dziennie (rano i wieczorem), aby pomóc myszom, dopóki nie odzyskają niezależnego oddawania moczu.
  5. Wstrzykuj każdej myszy podskórnie 0,5 ml soli fizjologicznej i antybiotyków (gentamycyna, 2000-2500 j./mysz) dziennie, aby zapobiec infekcji.

3. Izolacja tkanki rdzenia kręgowego od myszy C57 / BL6

  1. Znieczulij myszy przed zabiegiem (krok 1.3). Po całkowitym znieczuleniu zamocuj je na stole operacyjnym w pozycji leżącej. Myszy pozorowane są traktowane podobnie.
  2. Wykonaj poprzeczne nacięcie w jamie klatki piersiowej, poniżej mostka i wzdłuż przepony, aby odsłonić serce. Delikatnie ustabilizuj serce za pomocą hemostatyków i włóż kaniulę perfuzyjną do wierzchołkowej lewej komory, przesuwając ją do aorty.
    1. Natychmiast przeciąć prawą małżowinę uszną i rozpocząć perfuzję z szybkością 250 ml / h z 10 ml roztworu PBS. Perfuzję uważa się za udaną, gdy płyn spływający z prawej małżowiny usznej zmienia kolor z krwistoczerwonego na przezroczysty i bezbarwny lub gdy wątroba przechodzi z czerwonego na biały27.
  3. Przeciąć kręgosłup na końcu ogona myszy, aby odsłonić otwór kręgowy. Za pomocą nożyczek okulistycznych ostrożnie wypreparuj tkankę rdzenia kręgowego 0,5 cm powyżej i poniżej miejsca urazu. Umieść izolowaną tkankę rdzenia kręgowego w sterylnym, bezenzymatycznym naczyniu hodowlanym zawierającym 5% bufor barwiący i przechowuj ją na lodzie w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania w wirowaniu gradientu gęstości poliwinylopirolidonu (PVP) pokrytego krzemionką koloidalną.
    UWAGA: Podczas preparowania rdzenia kręgowego w pobliżu centrum urazu należy upewnić się, że tkanka jest integralna, aby uniknąć rozerwania lub uszkodzenia rdzenia kręgowego w miejscu urazu. 5% bufor barwiący (SB) składa się z 2,5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 47,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).

4. Wirowanie w gradiencie gęstości przy użyciu krzemionki koloidalnej pokrytej poliwinylopirolidonem

  1. Umieść tkankę rdzenia kręgowego w sitku do komórek o oczkach 300 i zmiel ją za pomocą tłoka jednorazowej strzykawki o pojemności 5 ml/10 ml. Po zmieleniu przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko o oczkach 300 do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml w celu odwirowania (5 min, 110 x g, temperatura pokojowa).
    1. Po odwirowaniu dodać 1 ml roztworu do wytrawiania komórek trypsyny do osadu komórkowego i inkubować go w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Zatrzymaj trawienie, dodając 1,5 ml płodowej surowicy bydlęcej, a następnie ponownie odwiruj (110 x g, 5 min, temperatura pokojowa). Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml 5% buforu barwiącego (SB).
  2. Kolejno dodać 4 ml 70% roztworu poliwinylopirolidonu pokrytego krzemionką koloidalną, 4 ml 30% roztworu poliwinylopirolidonu pokrytego krzemionką koloidalną i 1 ml 5% roztworu komórek zawieszonych w SB do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować mieszaninę (300 x g, 30 min, 20 °C).
    UWAGA: Przygotować odczynnik do separacji poliwinylopirolidonu pokrytego krzemionką koloidalną jako mieszaninę 9:1 poliwinylopirolidonu pokrytego krzemionką koloidalną i 10× PBS. Rozcieńczyć 70% roztwór poliwinylopirolidonu pokrytego krzemionką koloidalną 1× PBS, a 30% roztwór poliwinylopirolidonu pokryty krzemionką koloidalną pożywką do hodowli komórkowych DMEM lub RPMI 1640.
  3. Po odwirowaniu komórki utworzą warstwy w probówce wirówkowej (rysunek 1). Wyrzuć resztki komórek i warstwy płytek krwi powyżej znacznika kalibracji 8 ml. Ostrożnie odessać pozostały roztwór (do znaku kalibracyjnego 1,5 ml) i wyrzucić osad poniżej znaku.
    1. Przenieść pozostały roztwór do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodać 1× PBS, aby uzyskać całkowitą objętość do 15 ml do odwirowania (400 x g, 5 min, 4 °C).
  4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5% SB. Przenieść roztwór do probówki do cytometrii przepływowej (FCM) w celu przepłukania i odwirowania (110 x g, 5 min, 4 °C). Ponownie zawiesić osad komórkowy w probówce FCM za pomocą 200 μl 5% SB.

5. Barwienie FCM

  1. Podzielić 200 μl zawiesiny komórek równo na dwie nowe probówki do cytometrii przepływowej. Oznacz jedną probówkę jako "Kontrola izotypu", a drugą jako "Barwienie specyficzne".
  2. Procedura barwienia
    1. Do probówki "Isotype Control" dodaj następujące przeciwciała dopasowane do izotypu: Kappa IgG2b znakowana PE, kappa IgG2b znakowana FITC, kappa IgG2b znakowana APC, kappa IgG2b znakowana APC i kappa IgG2b znakowana APC-eFluor 780.
    2. Do probówki "Specyficzne barwienie" dodać następujący panel przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie zgodnie z zalecanymi proporcjami rozcieńczenia: Szczur anty-mysz CD45 APC, Szczur anty-mysz CD11b PE, Szczur anty-mysz CD68 FITC i Szczur anty-mysz CCR7 APC-eFluor 780.
    3. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, przez 30 minut.
  3. Umyj poplamione komórki dwukrotnie, dodając za każdym razem 1 ml SB. Odwirować komórki (110 x g, 5 min, 4 °C). Na koniec utrwal komórki za pomocą 2% paraformaldehydu (PFA) do analizy cytometrii przepływowej.

6. Wykrywanie FCM

UWAGA: Szczegółowe informacje na temat procedury znajdują się w poprzednich raportach 27,28.

  1. Analizować próbki za pomocą cytometru przepływowego z kompatybilnym oprogramowaniem (patrz tabela materiałów).
    1. Najpierw przeanalizuj rurkę kontrolną izotypu, aby ustalić wykres pierwotny (FSC na osi x i SSC na osi y). Dostosuj napięcia rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC), aby ustawić populację komórek w odpowiednim zakresie.
    2. Ustaw dwa dodatkowe wykresy: jeden z IgG-APC na osi x i IgG-PE na osi y. Inny z IgG-FITC na osi x i IgG APC-Cy7 (uwaga: APC-eFluor 780 został wykryty w tym kanale) na osi y.
    3. Dostosuj napięcia kanału fluorescencji dla IgG-APC, IgG-PE, IgG-FITC i IgG APC-Cy7, aby umieścić populację komórek w 103 regionu podwójnie ujemnego.
  2. Po dostosowaniu i zoptymalizowaniu napięć FSC i SSC, a także napięć kanału fluorescencji za pomocą rurki kontrolnej izotypu, ustawienia te powinny pozostać niezmienione. Przystąp do analizy probówek eksperymentalnych wybarwionych przeciwciałami.
    1. Ustal wykres podstawowy z CD11b-PE na osi x i SSC na osi y. Skonfiguruj kolejny wykres z CD68-FITC na osi x i CCR7 APC-Cy7 na osi y. Używając rurki kontrolnej izotypu jako odniesienia, ustaw wartości podstawowe i wyznacz "region" dla komórek CD11b+ . Na wykresie podstawowym bramkuj region komórki CD11b+ i zdefiniuj go jako "bramkę P1 ".
    2. Następnie wybierz wykres z CD68-FITC na osi x i CCR7 APC-Cy7 na osi y. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Pokaż populację, a następnie wybierz pozycję P1. Spowoduje to wyświetlenie populacji komórek w grupie CD11b+ , które wyrażają CD68+/CCR7+ lub CD68+/CCR7-. Zbierz 50 000 zdarzeń na próbkę.
    3. Po uzyskaniu danych dostosuj kompensację fluorescencji w razie potrzeby. Przeanalizuj i określ procent komórek CD11b+ , CD68+ CCR7+ (M1-podobnych) i CD11b+ CD68+ CCR7- (M2-podobnych). Średni odsetek dodatnio oznaczonych komórek jest wyrażony jako procent całej populacji próbki.
  3. Korzystając z dobrze wyregulowanych parametrów napięcia z rurki kontrolnej izotypu, przystąp do analizy probówek doświadczalnych.
    1. Najpierw ustal wykres z CD45-APC i CD11b-PE, a następnie dwa wykresy z CD68-FITC i CCR7 APC-Cy7. Zbierz 50 000 zdarzeń na próbkę, a po uzyskaniu danych dostosuj kompensację fluorescencji.
    2. Na wykresach pseudokolorowych CD45/CD11b przeanalizuj "regiony" dla komórek CD11b+ CD45−/low i CD11b+ CD45high dla każdej próbki. Następnie przeanalizuj komórki CD68 + CCR7 + i CD68 + CCR7 - w tych dwóch regionach.
    3. Zintegrować analizy w celu określenia procentowej zawartości procentowej następujących populacji komórek: CD11b+ CD45−/niski CD68+ CCR7+ (mikroglej podobny do M1), CD11b+ CD45−/niski CD68+ CCR7- (mikroglej podobny do M2), CD11b+ CD45wysoki CD68+ CCR7+ (makrofagi podobne do M1), CD11b+ CD45wysoki CD68+ CCR7- (makrofagi podobne do M2)).
      UWAGA: Średni procent dodatnio oznaczonych komórek jest wyrażony jako procent całej populacji próbki.

7. Analiza danych FCM

  1. Uruchom oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej i przeciągnij pliki eksperymentu cytometrii przepływowej do sekcji "Wszystkie próbki" w interfejsie. Eksperymenty cytometrii przepływowej zostaną wyświetlone poniżej "Wszystkie próbki" w interfejsie. Rozpocznij od analizy probówki kontrolnej izotypu, aby określić próg między dodatnimi i ujemnymi sygnałami fluorescencji.
    1. Kliknij dwukrotnie próbkę probówki kontrolnej izotypu , aby wyświetlić graficzne okno wyświetlające dwuwymiarowy wykres punktowy. Wybierz FSC-A dla osi x i SSC-A dla osi y. Kliknij przycisk Brama prostokątna u góry interfejsu i użyj prostokąta, aby wybrać obszar po usunięciu zanieczyszczeń komórkowych (Rysunek 2A).
    2. Kliknij dwukrotnie na wybrany obszar, aby wygenerować nowe okno graficzne. Wybierz FITC dla osi x i histogram dla osi y. Kliknij przycisk Bramka regionu u góry interfejsu, aby ustawić bramkę w histogramie jednoparametrowym w celu określenia progu między ujemnymi i dodatnimi sygnałami fluorescencji. Bramka regionu zdefiniuje obszar dodatni (rysunek 2A).
      UWAGA: Obszar o mniejszych wartościach FSC reprezentuje szczątki komórkowe.
    3. Dla każdego z czterech przeciwciał fluorescencyjnych użytych w eksperymencie należy określić próg między sygnałami ujemnymi i dodatnimi, używając próbki z probówki kontrolnej izotypu. Na osi x kolejno zmień fluorochromy na PE, APC i APC-Cy7, zachowując oś y jako histogram.
    4. Użyj narzędzia bramki regionu w histogramie jednoparametrowym, aby ustawić bramki i określić próg między sygnałami ujemnymi i dodatnimi dla każdego z czterech przeciwciał fluorescencyjnych (rysunek 2A).
  2. Aby przeanalizować proporcje komórek podobnych do M1 i M2:
    1. Kliknij dwukrotnie próbkę eksperymentalnej probówki , aby wyświetlić dwuwymiarowy wykres punktowy. Wybierz FSC-A dla osi x i SSC-A dla osi y. Kliknij przycisk Bramka prostokątna u góry interfejsu i użyj prostokąta, aby wybrać obszar po usunięciu zanieczyszczeń komórkowych (Rysunek 2B).
    2. Kliknij dwukrotnie na wybrany obszar, aby wygenerować nowe okno graficzne. Wybierz CD11b-PE dla osi x i SSC-A dla osi y. Kliknij przycisk Bramka prostokątna w górnej części interfejsu i używając dodatniego/ujemnego progu PE ustawionego przez kontrolkę izotypu jako odniesienia, zdefiniuj bramkę CD11b+ (Rysunek 2B).
    3. Kliknij dwukrotnie obszar bramki CD11b+ , aby wygenerować nowe okno graficzne. Wybierz CD68-FITC dla osi x i CCR7 APC-Cy7 dla osi y. Kliknij przycisk Cross Gate . Używając progów dodatnich / ujemnych FITC i APC-Cy7 ustawionych przez kontrolę izotypu jako odniesienia, użyj bramki krzyżowej do kategoryzacji komórek, określając proporcje komórek CD11b + CD68 + CCR7 + (M1-podobnych) i komórek CD11b + CD68 + CCR7- (M2-podobnych) (Figura 2B).
      UWAGA: Zasady bramkowania do analizy proporcji makrofagów podobnych do M1 (M1-podobne Mø), makrofagów podobnych do M2 (M2-podobne Mø), mikrogleju podobnego do M1 (MG podobnego do M1) i mikrogleju podobnego do M2 (MG podobnego do M2) są zgodne z tymi stosowanymi do analizy komórek podobnych do M1 i M2. Progi rozróżniania dodatnich i ujemnych sygnałów fluorescencyjnych są oparte na rurce kontrolnej izotypu, która służy jako odniesienie do ustawiania bramek. Proces działania oprogramowania przedstawiono na rysunku 2B, a profile ekspresji markerów używane do określania proporcji komórek są szczegółowo opisane w sekcji dotyczącej wyników reprezentatywnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Komórki odpornościowe z tkanki rdzenia kręgowego są rozdzielane przy użyciu wirowania w gradiencie gęstości z wykorzystaniem krzemionki koloidalnej powlekanej poliwinylopirolidonem. Podczas procesu wirowania komórki rozkładają się w różnych warstwach zgodnie z ich gęstością wypornościową, co pozwala na rozdzielenie komórek (Rycina 1). Od góry do dołu rozkład przedstawia się następująco: debris komórkowy, warstwa bogata w komórki mononuklearne, warstwa bogata w limfocyty, a na samym dnie wars...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pomyślne stworzenie modelu zwierzęcego SCI ma zasadnicze znaczenie. Model SCI został ustalony poprzez wystawienie rdzenia kręgowego w segmencie T9 na działanie siły 0,5 N. Sukces modelu zwierzęcego został zademonstrowany przez zwijanie się ogona myszy, przy czym obie tylne kończyny doświadczały skurczów, a tylne kończyny były sparaliżowane, co uniemożliwiało myszowi chodzenie po SCI (patrz krok 2.3). Opieka pooperacyjna ma kluczowe znaczenie dla przeżycia myszy. Opieka nad moczem jest zapewniona do momentu, gdy mysz będz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Prace te były wspierane przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (nr 82072416); oraz fundusz zespołu ds. innowacji naukowych i technologicznych wysokiego szczebla Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Kolegium Medycznego Bengbu (BYYFY2022TD001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 i razy; PBS  Solarbio (Słoneczna Biologia)Zobacz materiał P1020
10 i razy; PBS  Solarbio (Słoneczna Biologia)Zobacz materiał P1022
18 ośmiotygodniowych samic myszy C57/BL6 Cavens Laboratory Animal Ltd, Chang Zhou, Chiny
APC-eFluor 780 znakowany szczurzym anty-mysim CCR7 (IgG2b kappa)Invitrogen47-1971-820,25μ g/test
APC-eFluor 780 oznaczony IgG2b Szczur kappa  Kontrola izotypuInvitrogen47-4321-820,25μ g/test
CD45 przeciw myszom oznaczony APC (IgG2b kappa)Invitrogen17-0451-820,125μ g/test
Szczur IgG2b oznaczony APC  Kontrola izotypuInvitrogen17-4031-820,125μ g/test
DMEM (DMEM)Gibco (firma Gibco)11965092
Surowica bydlęca płoduLonsera (Lonsera)S711-001
Szczurzy CD68 z oznaczeniem FITC (IgG2b kappa)Invitrogen  MA5-16676 powiedział:0,25μ g/test
Szczur IgG2b oznaczony znakiem FITC kappa  Kontrola izotypuInvitrogen11-4031-820,25μ g/test
ParaformaldehydOstrze biologiczne23319084
CD11b z oznaczeniem PE anty-mysi (IgG2b kappa)Invitrogen12-0112-810,25μ g/test
Szczur IgG2b z oznaczeniem PE kappa  Kontrola izotypuInvitrogen12-4031-820,25μ g/test
Percoll powiedział:  Solarbio (Słoneczna Biologia)Zobacz materiał P8370
Roztwór trypsynyOstrze biologiczneBL526A

Bibliografia

  1. Rubiano, A. M., Carney, N., Chesnut, R., Puyana, J. C. Global neurotrauma research challenges and opportunities. Nature. 527 (7578), S193-S197 (2015).
  2. Fehlings, M., Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clin Epidemiol. 6, 309-331 (2014).
  3. Sterner, R. C., Sterner, R. M. Immune response following traumatic spinal cord injury: Pathophysiology and therapies. Front Immunol. 13, 1084101(2023).
  4. Sun, X., et al. Multiple organ dysfunction and systemic inflammation after spinal cord injury: A complex relationship. J Neuroinflammation. 13 (1), 260(2016).
  5. Brockie, S., Zhou, C., Fehlings, M. G. Resident immune responses to spinal cord injury: Role of astrocytes and microglia. Neural Regen Res. 19 (8), 1678-1685 (2024).
  6. Wang, Z., Zhou, W., Zhang, Z., Zhang, L., Li, M. Metformin alleviates spinal cord injury by inhibiting nerve cell ferroptosis through upregulation of heme oxygenase-1 expression. Neural Regen Res. 19 (9), 2041-2049 (2024).
  7. Li, F., et al. Lupenone improves motor dysfunction in spinal cord injury mice through inhibiting the inflammasome activation and pyroptosis in microglia via the nuclear factor kappa B pathway. Neural Regen Res. 19 (8), 1802-1811 (2024).
  8. Zhou, H. -Y., et al. Dynamic development of microglia and macrophages after spinal cord injury. Neural Regen Res. 20 (12), 3606-3619 (2024).
  9. Hakim, R., et al. Spinal cord injury induces permanent reprogramming of microglia into a disease-associated state which contributes to functional recovery. J Neurosci. 41 (40), 8441-8459 (2021).
  10. Brennan, F. H., et al. Microglia coordinate cellular interactions during spinal cord repair in mice. Nat Commun. 13 (1), 4096(2022).
  11. Zeng, F., et al. Microglia overexpressing brain-derived neurotrophic factor promote vascular repair and functional recovery in mice after spinal cord injury. Neural Regen Res. , (2024).
  12. Tang, Y., Le, W. Differential roles of M1 and M2 microglia in neurodegenerative diseases. Mol Neurobiol. 53 (2), 1181-1194 (2015).
  13. Butovsky, O., Weiner, H. L. Microglial signatures and their role in health and disease. Nat Rev Neurosci. 19 (10), 622-635 (2018).
  14. Wang, J., He, W., Zhang, J. A richer and more diverse future for microglia phenotypes. Heliyon. 9 (4), e14713(2023).
  15. Zeng, F., et al. Knockout of TNF-α in microglia decreases ferroptosis and convert microglia phenotype after spinal cord injury. Heliyon. 10 (17), e36488(2024).
  16. Prinz, M., Jung, S., Priller, J. Microglia biology: One century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
  17. Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
  18. Hao, D., et al. Trends of epidemiological characteristics of traumatic spinal cord injury in China, 2009-2018. Eur Spine J. 30 (10), 3115-3127 (2021).
  19. Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell Mol Life Sci. 72 (21), 4111-4126 (2015).
  20. Kong, X., Gao, J. Macrophage polarization: A key event in the secondary phase of acute spinal cord injury. J Cell Mol Med. 21 (5), 941-954 (2016).
  21. Lech, M., Anders, H. -J. Macrophages and fibrosis: How resident and infiltrating mononuclear phagocytes orchestrate all phases of tissue injury and repair. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1832 (7), 989-997 (2013).
  22. Mosley, R. L., et al. The glial scar-monocyte interplay: A pivotal resolution phase in spinal cord repair. PLoS One. 6 (12), e27969(2011).
  23. Zhu, Y., et al. Hematogenous macrophage depletion reduces the fibrotic scar and increases axonal growth after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 74, 114-125 (2015).
  24. Hou, C., et al. Mono-macrophage-derived MANF protects against lipopolysaccharide-induced acute kidney injury via inhibiting inflammation and renal M1 macrophages. Inflammation. 44 (2), 693-703 (2020).
  25. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. -S. Microglia-mediated neurotoxicity: Uncovering the molecular mechanisms. Nat Rev Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
  26. Zhang, J., et al. The effects of the M2a macrophage-induced axonal regeneration of neurons by arginase 1. Biosci Rep. 40 (2), BSR20193031(2020).
  27. Li, J. L., et al. The polarization of microglia and infiltrated macrophages in the injured mice spinal cords: A dynamic analysis. PeerJ. 11, e14929(2023).
  28. Gratama, J. W., et al. Analysis of variation in results of flow cytometric lymphocyte immunophenotyping in a multicenter study. Cytometry. 30 (4), 166-177 (1997).
  29. Delarasse, C., Fontaine, B., El-Behi, M., Martin, E. Analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry. J Vis Exp. (124), e55781(2017).
  30. Chen, Y. J., et al. Temporal kinetics of macrophage polarization in the injured rat spinal cord. J Neurosci Res. 93 (10), 1526-1533 (2015).
  31. Chen, Y. -Q., et al. CRID3, a blocker of apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ameliorates murine spinal cord injury by improving local immune microenvironment. J Neuroinflammation. 17 (1), 255(2020).
  32. Vijay, S., Nair, R. R., Sharan, D., Jakkala, K., Ajitkumar, P. Percoll discontinuous density gradient centrifugation method for the fractionation of the subpopulations of Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis from in vitro cultures. MethodsX. 11 (7), 102344(2023).
  33. Sharma, A., et al. Successful transplantation of transfected enriched buffalo spermatogonial stem cells to homologous recipients. Theriogenology. 142, 441-449 (2020).
  34. Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nat Protoc. 3 (7), 1228-1239 (2008).
  35. Maurer, F., et al. Continuous Percoll gradient centrifugation of erythrocytes: Explanation of cellular bands and compromised age separation. Cells. 11 (8), 1296(2022).
  36. Gamboa-Suárez, B. A., Lotta-Arévalo, I. A., Sarmiento-Salazar, F., Matta, N. E. Finding a needle in a haystack: DNA Haemoproteus columbae enrichment using percoll density gradient and flow cytometry. Vet Parasitol. 328, 110170(2024).
  37. Cao, Y., et al. Paeoniflorin suppresses kidney inflammation by regulating macrophage polarization via KLF4-mediated mitophagy. Phytomedicine. 116, 154901(2023).
  38. Nishihara, T., et al. Chronic constriction injury of the sciatic nerve in rats causes different activation modes of microglia between the anterior and posterior horns of the spinal cord. Neurochem Int. 134, 104672(2020).
  39. Durafourt, B. A., et al. Comparison of polarization properties of human adult microglia and blood-derived macrophages. Glia. 60 (5), 717-727 (2012).
  40. Wachholz, S., et al. Microglia activation is associated with IFN-alpha induced depressive-like behavior. Brain Behav Immun. 55, 105-113 (2016).
  41. Chen, X., et al. Correlations between macrophage polarization and osteoinduction of porous calcium phosphate ceramics. Acta Biomater. 103, 318-332 (2020).
  42. Guo, S. D., et al. Nasal delivery of Fasudil-modified immune cells exhibits therapeutic potential in experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurosci Ther. 25 (6), 783-795 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Identyfikacja mikroglejuuraz rdzenia kr gowegowirowanie w gradiencie g sto ciizolacja kom rek odporno ciowychmarker CD11bmarker CD68marker CCR7fenotypy M1 i M2

Powiązane artykuły