Artykuł metodologiczny

Bezkomórkowa plama punktowa jako praktyczna i elastyczna platforma testów immunologicznych do wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych

DOI:

10.3791/67973

⸱

23 maja 2025

 ,  ,  , 
1Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto, 2Department of Mechanical and Industrial Engineering, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy niedawno opracowaną platformę testów immunologicznych opartą na zasadach bezkomórkowej biologii syntetycznej i technice dot-blot do konfigurowalnego wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seria globalnych epidemii patogenów w ciągu ostatnich dwóch dekad uwypukliła znaczenie strategii nadzoru serologicznego. Platformy testów immunologicznych, które służą do wykrywania przeciwciał specyficznych dla choroby w surowicach pacjentów, są podstawą nadzoru serologicznego. Typowe przykłady obejmują testy immunoenzymatyczne i testy przepływu bocznego; Jednak, chociaż są to złote standardy, wymagają one materiałów eksploatacyjnych specyficznych dla patogenów i specjalistycznego sprzętu, co ogranicza ich zastosowanie poza dobrze wyposażonymi laboratoriami.

Niedawno opracowaliśmy nową platformę testów immunologicznych o nazwie Cell-Free Dot-Blot (CFDB) i przetestowaliśmy ją za pomocą surowic ludzkich i zwierzęcych przeciwko SARS-CoV-2. W przeciwieństwie do konwencjonalnych testów immunologicznych, próbki surowicy pacjenta CFDB są unieruchamiane do fazy stałej (błony nitrocelulozowej), podczas gdy docelowy antygen jest zawieszony w fazie ruchomej testu. Aby poprawić dostęp do możliwości nadzoru serologicznego, antygeny CFDB są produkowane na żądanie i przy użyciu infrastruktury o niskim obciążeniu, wykorzystującej ekspresję białek in vitro. W tym przypadku antygen jest łączony ze znacznikiem peptydowym, który można wykryć za pomocą pojedynczego uniwersalnego białka reporterowego dla dowolnego testu CFDB. W rezultacie CFDB nie wymaga dostępu do czytnika płytek wielodołkowych ani oczyszczonych komercyjnych komponentów do testów molekularnych. Biorąc pod uwagę te rozważania projektowe, CFDB rozwiązuje problemy z istniejącymi platformami testów immunologicznych, zapewniając dostęp do niescentralizowanych laboratoriów, zdolność adaptacji do pojawiających się patogenów oraz przystępność cenową dla społeczności o niższych dochodach.

W obecnym artykule przedstawimy krok po kroku protokół przygotowania i przeprowadzenia testu immunologicznego CFDB. Korzystając z naszych ostatnich prac nad SARS-CoV-2 CFDB jako przykładu, omówimy projektowanie antygenowego DNA do produkcji bezkomórkowej na żądanie, a następnie przygotowanie białka reporterowego CFDB, immobilizację próbek surowicy w fazie stałej, a na koniec etapy wiązania antygenu i wykrywania testu. Przewidujemy, że postępując zgodnie z tymi instrukcjami, naukowcy będą w stanie dostosować test CFDB do wykrywania odpowiedzi immunologicznych w surowicach ludzkich i zwierzęcych na dowolny patogen.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pandemia COVID-19 ujawniła krytyczne zapotrzebowanie na niedrogie, skalowalne narzędzia diagnostyczne, szczególnie dla ustawień o niskich zasobach1. Konwencjonalne testy immunologiczne, takie jak testy immunoenzymatyczne (ELISA), okazały się niezbędne do wykrywania odpowiedzi immunologicznych2,3. Jednak ich wysoki koszt, uzależnienie od złożonych odczynników i uzależnienie od specjalistycznego sprzętu ograniczają ich dostępność, zwłaszcza podczas globalnych kryzysów zdrowotnych. W odpowiedzi na te wyzwania opracowaliśmy Cell-Free Dot Blot (CFDB), tanią, adaptowalną platformę testów immunologicznych przeznaczoną do wykrywania przeciwciał anty-SARS-CoV-2 w surowicach ludzkich i zwierzęcych.

CFDB wykorzystuje bezkomórkową biologię syntetyczną do szybkiej, na żądanie produkcji antygenów wirusowych przy użyciu liniowych szablonów DNA4,5. Eliminuje to potrzebę tradycyjnych procesów klonowania, ekspresji i oczyszczania opartych na komórkach, znacznie przyspieszając produkcję antygenu przy jednoczesnym obniżeniu kosztów. Metoda CFDB upraszcza wykrywanie przeciwciał dzięki zastosowaniu formatu kropkowego, w którym surowice są bezpośrednio nakrapiane na błony nitrocelulozowe. System ten eliminuje potrzebę stosowania drogich płytek wielodołkowych i specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego, umożliwiając prosty przepływ pracy "zanurzania" w etapach inkubacji i mycia. Platforma wykorzystuje również system SpyCatcher-SpyTag, w którym chimera peroksydazy SpyCatcher2-Apex2 działa jako uniwersalny wtórny odczynnik wykrywający5,6. Jest on wytwarzany przy użyciu standardowej ekspresji opartej na Escherichia coli, co eliminuje zależność od kosztownych komercyjnych koniugatów przeciwciał. W rezultacie, system CFDB może wykonywać testy serologiczne z wydajnością porównywalną do testów ELISA przy znacznie niższych kosztach - około 3 USD za test 96 próbek w porównaniu do ponad 300 USD za komercyjny zestaw ELISA5.

Aby zademonstrować skuteczność CFDB, przetestowaliśmy jego zdolność do wykrywania przeciwciał w wstępnie scharakteryzowanych surowicach ludzkich i zwierzęcych. Nasze wyniki ściśle korelowały z testem ELISA w identyfikacji próbek dodatnich i ujemnych pod względem COVID-19. Oprócz diagnostyki u ludzi oceniliśmy przydatność CFDB w modelach zwierzęcych, testując surowice chomików zakażonych SARS-CoV-2 i tych zaszczepionych rekombinowanym białkiem nukleokapsydu. Testy te potwierdziły potencjał CFDB do wykorzystania zarówno w diagnostyce ludzi, jak i weterynarzy, co czyni go wszechstronnym narzędziem do monitorowania odpowiedzi immunologicznych u różnych gatunków. Jedną z kluczowych zalet kontraktów CFDB jest ich elastyczność. Poprzez prostą modyfikację matrycy DNA kodującej antygen będący przedmiotem zainteresowania, platforma może być szybko przystosowana do wykrywania przeciwciał przeciwko różnym patogenom, co czyni ją cenną dla przyszłej gotowości na wypadek pandemii. Niski koszt, prosty przepływ pracy i minimalne wymagania infrastrukturalne sprawiają, że jest szczególnie przydatny w zdecentralizowanych laboratoriach i środowiskach o niskich zasobach, w których dostęp do komercyjnej diagnostyki jest ograniczony.

W tej pracy przedstawimy instrukcje krok po kroku, jak przygotować i przeprowadzić test CFDB. Po pierwsze, zajmiemy się projektowaniem i syntezą liniowych matryc DNA do bezkomórkowej produkcji antygenów, które są podstawowymi odczynnikami wykrywającymi w teście. Następnie opisujemy etapy przygotowania wtórnego odczynnika wykrywającego test SpyCatcher2-Apex2. Następnie dostarczamy instrukcje dotyczące produkcji bezkomórkowej i kontroli jakości samych antygenów. Na koniec szczegółowo opisujemy proces przeprowadzania testu CFDB na próbkach surowicy ludzkiej lub zwierzęcej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty z chomikami zostały przeprowadzone w Narodowym Laboratorium Mikrobiologicznym (NML) w Agencji Zdrowia Publicznego Kanady, zatwierdzonym przez Kanadyjskie Centrum Nauki o Zdrowiu Ludzi i Zwierząt oraz zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami. Wszystkie próbki ludzkiej surowicy/osocza zostały uzyskane komercyjnie do testów wewnętrznych lub dostarczone przez współpracowników klinicznych do NML w celu przeprowadzenia niezależnych testów w NML.

1. Projektowanie i przygotowanie szablonów liniowego wyrażania antygenu (LETs)

  1. Zaprojektuj bezkomórkowe wyrażenie LETs dla docelowego antygenu na podstawie instrukcji w Norouzi et al.7 i zawierających N/C-końcowy SpyTag zgodnie z opisem w Norouzi et al.5.
    UWAGA: Tutaj podajemy szczegóły dotyczące przygotowania białka nukleokapsydu SARS-CoV-2 (NP, aminokwasy 2-419).
    1. Upewnij się, że LET dla SARS-CoV-2 NP (Rysunek 1 i plik uzupełniający 1) zawiera miejsca 5' i 3' Ter z sekwencją buforową 50 par zasad przed promotorem T7 i po kodonie stop.
    2. Oznacz białko NP na N-końcu za pomocą His 6-SpyTag-TEV.
    3. Uzyskaj sekwencję białka z bazy danych UniProt (kod akcesyjny P0DTC9) i zoptymalizuj ją kodonem pod kątem ekspresji opartej na E. coli za pomocą narzędzia do optymalizacji kodonów IDT8. Zamów tę sekwencję do syntezy komercyjnej jako jednoniciowy fragment DNA zawieszony w wodzie w stężeniu 10 ng / μL.
      UWAGA: Miejsce rozszczepienia proteazy TEV i znacznik His6 nie są istotnymi cechami w projekcie LET.
  2. PCR amplifikuje fragment DNA za pomocą uniwersalnego Ter FW (GGCTCCGAATAAGTATGTTGTAACTAAAGTGCGGCC
    ACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCG) i ter RV (CCGAGGCAATAAGTATGTTGTAACTAAAGTGCTCAG
    CTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCC) przy użyciu zestawu polimerazy DNA o wysokiej wierności (patrz Tabela materiałów)
    1. Ustaw reakcję 100 μL w następujący sposób: 75 μL wody wolnej od nukleaz, 20 μL 5x buforu polimerazy DNA, 2 μL 10 mM dNTP (stężenie końcowe 200 μM), 0,5 μL 100 μM startera Ter-FW, 0,5 μL 100 μM startera Ter-RV, 1 μL 10 ng/μL jednoniciowego LET, 1 μL(2U) polimerazy DNA.
    2. Stosować następujące ustawienia PCR: początkowa denaturacja w temperaturze 98 °C przez 30 s; 35 cykli: 98 °C przez 6 s, 60 °C przez 15 s, 72 °C przez 90 s; utrzymanie w temperaturze 4 °C.
  3. Oczyść produkt PCR za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania PCR, sprawdź jego jakość, przeprowadzając próbkę na 1% żelu agarozowym i zmierz jego stężenie na spektrofotometrze UV-Vis.
    UWAGA: Surowe produkty PCR mogą być również używane bezpośrednio do odciągania pokarmu bez komórek. Jednak oczyszczanie pozwala na bardziej ustandaryzowaną procedurę.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Szablon wyrażenia liniowego dla SARS-CoV-2-NP. Schemat przedstawiający cechy liniowej matrycy DNA His-SpyTag-SARS-CoV-2 NP. Kluczowe elementy matrycy DNA są oznakowane. Sekwencja kodująca białko będące przedmiotem zainteresowania, w tym przypadku NP, jest umieszczana pod kontrolą transkrypcyjną promotora T7 w celu efektywnej ekspresji. Na N-końcu białko NP jest dołączane do SpyTag w celu specyficznego wykrywania za pomocą odczynnika detekcyjnego SpyCatcher2-Apex2. Miejsca proteazy x6His-tag i TEV, chociaż są częścią ogólnego projektu LET, są zbędne do celów CFDB. Na końcach liniowej matrycy DNA włącza się miejsca Ter "upstream" i "downstream", z których każde poprzedzone jest odpowiednimi sekwencjami buforowymi 50 par zasad, w celu ochrony za pośrednictwem Tus przed degradacją egzonukleolitycznego DNA w lizacie bezkomórkowym. Skróty: NP = białko nukleokapsydu; LET = szablon wyrażenia liniowego; TEV = wirus wytrawienia tytoniu; CFDB = bezkomórkowa plama punktowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Oczyszczanie białka reporterowego SpyCatcher2-Apex2

  1. Użyj plazmidu pET24b-SpyCatcher2-Apex2, pierwotnie skonstruowanego w Norouzi et al.5 (pełna sekwencja w pliku uzupełniającym 2 i mapa plazmidu na rysunku uzupełniającym S1), aby przygotować białko reporterowe SpyCatcher2-Apex-2.
  2. Przygotuj płytki agarowe i bulion lizogeniczny (LB) zawierający 50 μg/ml kanamycyny. Przekształć komórki E. coli BL21 (DE3) za pomocą plazmidu pET24b-SpyCatcher2-Apex2. Zaszczepić pojedynczą kolonię w 15 ml starterowej kultury LB i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min.
  3. Następnego dnia dodaj 10 ml kultury starterowej do 500 ml świeżej pożywki LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min, aż kultura osiągnie gęstość optyczną 0,6-0,8 (~3 h) przy długości fali 600 nm.
  4. Indukować ekspresję SpyCatcher2-Apex2 poprzez uzupełnienie kultury 0,5 mM izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozydu i 1 mM chlorowodorku kwasu 5-aminolewulinowego. Zmniejszyć temperaturę wzrostu do 30 °C i pozostawić kulturę do inkubacji przez kolejne 4 godziny.
  5. Zebrać bakterie przez odwirowanie w temperaturze 8 000 × g przez 15 minut. Przystąpić do lizy komórek lub alternatywnie przechowywać granulki w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
  6. Zawiesić osad w 20 ml buforu do lizy zawierającego 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 300 mM NaCl, 1 mg / ml lizozymu, tabletkę inhibitora proteazy wolną od EDTA i 1 mM ditiotreitol (DTT). Poddać komórki lizie przez sonikację przy amplitudzie 50 % z odstępami 5 s ON i 10 s OFF, aby uzyskać całkowity czas włączenia wynoszący 3 min.
  7. Klarować lizat przez odwirowanie w stężeniu 20 000 × g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Przepuścić supernatant przez filtr strzykawkowy 0,2 μm.
  8. Dodać chlorek heminy do końcowego stężenia 250 μM do oczyszczonego lizatu i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Przystąpić do oczyszczania białka.
    UWAGA: Inkubacja z chlorkiem heminy maksymalizuje włączenie hemu do peroksydazy Apex-2 w celu uzyskania optymalnej aktywności enzymu.
  9. Dodać 2,5 ml żywicy Ni do oczyszczonego lizatu i inkubować w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając przez 45 minut. Nałożyć mieszaninę na grawitacyjną kolumnę przepływową i przemyć żywicę 50 ml buforu Tris (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 300 mM NaCl i 1 mM DTT).
  10. Eluować białko SpyCatcher2-Apex2 w 25 ml buforu Tris zawierającego 400 mM imidazolu. Koncentrat i bufor wymieniają eluat na bufor Tris za pomocą odśrodkowej jednostki filtrującej, dążąc do końcowej objętości 0,5-1,0 ml.
  11. Użyj współczynnika ekstynkcji molowej SpyCatcher2-Apex2 (27 390 M-1 cm-1), aby określić stężenie białka na spektrofotometrze UV-Vis. Dodać glicerol do końcowego stężenia 40% i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Oczekuje się, że ten protokół dostarczy około 40 mg wysoce czystego i aktywnego SpyCatcher2-Apex2, co wystarczy na 400 serii CFDB na standardowej wielkości 96 próbek.
  12. W celu wykrycia białek SpyTagged przy użyciu konwencjonalnego western blot9 oraz w eksperymentach CFDB, zawsze blokuj błony w 5% beztłuszczowym mleku w proszku w 1x soli fizjologicznej buforowanej Tris zawierającej 0,05% Tween-20 (TBST). Stosować białko SpyCatcher2-Apex2 w końcowym stężeniu 10 μg/ml w roztworze blokującym.
    UWAGA: Reporter SpyCatcher2-Apex2 wymaga rozwiązania o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) do tworzenia sygnału. Rozwiązanie ECL można uzyskać komercyjnie lub przygotować we własnym zakresie zgodnie z instrukcjami zawartymi w Mruk et al.10. Końcowy roztwór ECL składa się z 0,4 mM kwasu p-kumarowego, 2,5 mM luminolu i 0,015% H2O2 w 100 mM Tris-HCl (pH 8,6).

3. Produkcja bezkomórkowa i kontrola jakości antygenów

  1. Przygotuj i złóż bezkomórkowy lizat ekspresyjny E. coli BL21 i składniki reakcji, postępując zgodnie z instrukcjami w Levine et al.11 i Norouzi et al.5. Uzupełnić końcową mieszaninę reakcyjną 5 μM białka Tus i 1,2 μM polimerazy T7 RNA w następujący sposób, aby uzyskać reprezentatywną reakcję 100 μL: 14,6 μl roztworu A, 14 μl roztworu B, 33,3 μl lizatu E. coli BL21, 2,5 μL 200 mM białka Tus, 1,2 μL 100 mM polimerazy RNA T7, 1 μl liniowej matrycy DNA 1,5 μM, 33,4 μl wody wolnej od nukleaz.
    UWAGA: Patrz Plik Uzupełniający 3 w celu uzyskania kluczowych instrukcji dotyczących przygotowania lizatu bezkomórkowego E. coli BL21 oraz Tabela Uzupełniająca S1 w celu uzyskania szczegółowej receptury roztworów A i B. Bezkomórkowy system ekspresji E. coli może być również przygotowany przy użyciu alternatywnych protokołów lub uzyskany komercyjnie, o ile reakcja jest uzupełniona polimerazą RNA Tus i T7.
  2. Wykonaj wstępny test ekspresji w skali 5 μl, dodając 10% (v/v) surowego produktu PCR do reakcji bezkomórkowej w probówce PCR. Inkubować bez wytrząsania w temperaturze 30 °C przez 15 godzin.
  3. Sprawdzić jakość ekspresji antygenu NP, ładując 1 μl reakcji bezkomórkowej do 12% żelu poliakryloamidowego z dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), a następnie przenosząc go do membrany nitrocelulozowej w celu uzyskania western blot, jak opisano w kroku 2.12. Użyj białka reporterowego SpyCatcher2-Apex2 do znakowania blot za pomocą SpyTag i opcjonalnie specyficznego komercyjnego przeciwciała (w tym przypadku anty-SARS-CoV-2-NP) przeciwko docelowemu antygenowi.
  4. Złóż bezkomórkową reakcję w skali 1 ml z oczyszczonym produktem LET o stężeniu 15 nM, który ma być użyty do testu CFDB. Inkubować mieszaninę ekspresji w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, wytrząsając przy 80 obr./min przez 15 godzin w temperaturze 30 °C. Sprawdzić jakość wyrażania przy użyciu western blot i przechowywać 50 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C.

4. Próbki surowicy

  1. Próbki surowicy (lub osocza) ludzkiej/zwierzęcej należy pobierać ze źródeł komercyjnych lub od współpracowników klinicznych lub we własnym zakresie, stosując standardowe procedury i postępując zgodnie z wytycznymi instytucjonalnej komisji etycznej ds. badań klinicznych na ludziach lub komisji ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania. Upewnij się, że podjęto odpowiednie środki obróbki wstępnej próbki w celu zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia.
    UWAGA: Środki obróbki wstępnej mogą obejmować obróbkę rozpuszczalnikiem i detergentem, inaktywację termiczną i badanie na obecność markerów wirusa przenoszonego przez krew. Dostępny jest przydatny protokół izolacji surowicy i osocza z krwi pełnej12. Podobnie jak w przypadku innych platform testów immunologicznych, oczekuje się, że próbki surowicy pobrane wcześnie (<3 tygodnie) po początkowym zakażeniu lub wystąpieniu choroby nie będą zawierały odpowiedniego poziomu odpowiedzi przeciwciał, a ich wyniki należy traktować z ostrożnością.
  2. Do weryfikacji jakości odczynników CFDB SARS-CoV-2 NP należy użyć międzynarodowego panelu referencyjnego Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) Narodowego Instytutu Standardów Biologicznych i Kontroli (NIBSC) dla immunoglobuliny anty-SARS-CoV-2, która zawiera x1 pre-COVID-19 i x4 SARS-CoV-2-dodatnie próbki o różnych poziomach immunoglobulin anty-NP13. Alternatywnie, użyj wstępnie scharakteryzowanych zdrowych i dodatnich próbek surowicy z innych źródeł.
  3. W przypadku eksperymentów CFDB należy uzyskać lub przygotować próbkę kontroli ujemnej poprzez zebranie wielu (>3) zdrowych próbek surowicy w celu zwiększenia dokładności oraz ułatwienia analizy i interpretacji wyników.

5. Procedura bezkomórkowej kropki (CFDB)

  1. Pobierz i wydrukuj plik obrazu master-grid (rysunek uzupełniający S2). Siatka główna to wzór o wymiarach 6 x 6 cm, zawierający 12 x 12 okręgów o średnicy 2 mm każdy i zapewnia zdolność punktowania podobną do płytki 96-dołkowej.
  2. Umieść siatkę mocno między dwiema warstwami samoprzylepnej folii uszczelniającej do płytek PCR i przyciąć na wymiar wzdłuż zewnętrznych granic siatki. Użyj dziurkacza do biopsji o średnicy 2 mm, aby wydrążyć każde zaznaczone kółko.
    UWAGA: Ta główna siatka może być wielokrotnie używana po przetarciu 70% etanolem.
  3. Wytnij kawałek membrany nitrocelulozowej o wymiarach 6,5 x 6,5 cm i umieść go pod siatką główną na czystej powierzchni, zabezpieczając zestaw za pomocą taśmy klejącej, jak pokazano na Rysunek 2 i Rysunek uzupełniający S3. Za pomocą markera zaznacz najbardziej zewnętrzne pozycje okręgów na membranie nitrocelulozowej, które mają służyć jako prowadnica do cięcia membrany po plamieniu próbki.
  4. Rozcieńczyć próbki surowicy w stosunku 1/10 w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (pH 7,4). Za pomocą mikropipety dozować trzykrotnie 0,4 μl objętości każdej próbki na membranę nitrocelulozową w określonych pozycjach siatki. Dozowanie zajmie około 15 s na miejsce.
    UWAGA: Należy pamiętać, aby do każdego testu dołączyć zarówno ujemne, jak i dodatnie próbki kontrolne, ponieważ będzie to wymagane do analizy wyników.
  5. Odczekać 10 minut w temperaturze otoczenia, aby nakrapiane próbki związały się i wyschły. Za pomocą pęsety ostrożnie wyjmij membranę nitrocelulozową i przetnij wzdłuż zaznaczonych zewnętrznych okręgów.
  6. Zablokować membranę w 10 ml roztworu blokującego (5% odtłuszczonego mleka w proszku w TBST) na 10 cm szalce Petriego na 30 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając przy 100 obr./min.
  7. Rozmrozić i dodać 50 μl podwielokrotności bezkomórkowej mieszaniny ekspresji antygenu do 5 ml roztworu blokującego na 10-centymetrowej szalce Petriego. Przenieść membranę bezpośrednio do roztworu zawierającego antygen i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, wytrząsając z prędkością 100 obr./min.
    UWAGA: Będzie to główny etap wykrywania, w którym antygen SpyTagged zwiąże się z pozycjami punktowymi zawierającymi przeciwciała, jeśli jest obecny.
  8. Wypłucz membranę, myj przez 5 minut i ponownie spłucz w TBST przed przejściem do etapu wtórnego wykrywania.
  9. Inkubować błonę w 10 ml buforu blokującego zawierającego 10 μg/ml oczyszczonego białka SpyCatcher2-Apex2 przez 1 godzinę, wytrząsając z prędkością 100 obr./min.
  10. Wypłukać membranę i umyć 2 x 5 min w TBST, z końcowym płukaniem w TBS.
  11. Przyklej i zabezpiecz kawałek parafilmu na czystym obszarze roboczym w pobliżu przyrządu do obrazowania plam. Usuń nadmiar płynu, stukając w membranę za pomocą pęsety i umieść membranę na wierzchu parafilmu.
  12. Natychmiast dodać 3 ml (100 μl/cm2) roztworu ECL na wierzch membrany i inkubować w temperaturze pokojowej dokładnie przez 90 sekund.
  13. Natychmiast osusz membranę i przenieś do przyrządu do obrazowania zgodnego z chemiluminescencją w celu wizualizacji wyników.
    UWAGA: Optymalny czas obrazowania może się różnić w zależności od instrumentu. Zaleca się korzystanie z domyślnych ustawień czasu automatycznej akwizycji urządzenia, a jeśli nie ma takiego braku, użycie wstępnie scharakteryzowanych próbek surowicy w celu optymalizacji czasu akwizycji obrazu.
  14. Użyj funkcji analizy obrazu przyrządu, aby uzyskać intensywność plamki, w tym dla trzech ślepych punktów (tła) na membranie nitrocelulozowej; utrzymuj stałą objętość pomiarową dla każdego punktu. Eksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, pamiętając o prawidłowym oznaczeniu każdej pozycji spotu.
  15. Obliczyć średnią i odchylenie standardowe (SD) potrójnej intensywności plamki. Następnie odejmij tło membrany nitrocelulozowej od wszystkich próbek.
  16. Użyj poniższego równania, aby uzyskać wartość odcięcia dla interpretacji wyników -/+:
    (średnia z kontroli ujemnych) + (3 x SD z kontroli ujemnych). Próbki uznaje się za dodatnie, jeśli ich średnia intensywność spada powyżej wartości odcięcia, a ujemne, jeśli ich średnia intensywność spada poniżej wartości odcięcia.
    UWAGA: Schemat procedury CFDB znajduje się w Rysunek 3.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Montaż CFDB. Schemat konfiguracji zespołu siatki głównej CFDB i membrany NC. Siatka główna jest nałożona na membranę NC, aby zapewnić regularny, adresowalny wzór do wykrywania i unieruchamiania próbek surowicy. Skróty: CFDB = cell-free dot blot; NC = nitroceluloza. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Schematyczne przedstawienie przepływu pracy CFDB. W teście CFDB niewielka ilość (<0,4 μl) 10 rozcieńczonych próbek surowicy jest ręcznie dozowana na wstępnie przyciętą membranę nitrocelulozową (lewy panel) w dyskretnych, adresowalnych lokalizacjach (panel środkowy). Umieszczenie jednej próbki surowicy na plamkę w trzech miejscach i unieruchomienie zawartości białka, w tym całkowitego rezerwuaru przeciwciał surowicy, na stałym podłożu NC (beżowe plamki w środkowym panelu). W tym przykładzie przeciwciała anty-NP zawarte w próbkach surowicy mogą być najpierw związane przez odczynnik do wykrywania pierwotnego CFDB SpyTag-NP, a na końcu wykryte przez odczynnik do wykrywania wtórnego CFDB SpyCatcher2-Apex2 (bańka w powiększeniu prawego panelu). Ten rysunek został zaczerpnięty z Norouzi et al.5. Skróty: CFDB = cell-free dot blot; NP = białko nukleokapsydu; LET = szablon wyrażenia liniowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amplifikacja PCR szablonu wyrażenia liniowego dla docelowego antygenu
Do amplifikacji SARS-CoV-2 NP LET metodą PCR zastosowano uniwersalne startery Ter do przodu i do tyłu, jak opisano w sekcji protokołu 1.2, a 1 μl produktu sprawdzono na żelu agarozowym (Rysunek 4) przed przystąpieniem do oczyszczania produktu PCR.

figure-results-1
<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pandemia COVID-19 uwypukliła znaczenie dostępnej i solidnej diagnostyki dla kontrolowania ognisk zakażeń i optymalizacji globalnych strategii zdrowotnych. Testy serologiczne wykrywające przeciwciała ochronne okazały się niezbędne do śledzenia wzorców przenoszenia się nowych wariantów, identyfikowania gorących punktów, kierowania opracowywaniem szczepionek, klasyfikowania podejrzanych przypadków i ochrony wrażliwych populacji14. Pandemia obnażyła również nierówności w zakresie dostępności testów, p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.N. i K.P. są współtwórcami metody bezkomórkowej kropkowej plamy. Złożono tymczasowy wniosek patentowy związany z tą pracą (PCT/CA2024/050097, złożony w styczniu 2024 r.).

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.S. i R.Z. są wspierane przez fundusze z Agencji Zaawansowanych Projektów Badawczych w Obszarze Obronności (DARPA), numer umowy N66001-23-2-4042. Wyrażone poglądy, opinie i/lub ustalenia są poglądami autorów i nie powinny być interpretowane jako reprezentujące oficjalne poglądy lub politykę Departamentu Obrony lub rządu Stanów Zjednoczonych. Praca ta została wsparta funduszami dla K.P. z programu grantowego CIHR Foundation (201610FDN-375469), CIHR Canada Research Chair Program (950-231075 i 950-233107), University of Toronto's Medicine by Design Initiative, która otrzymuje finansowanie z Canada First Research Excellence Fund oraz fundusze dla K.P., z Defense Research and Development Canada's, Canadian Safety and Security Program (umowa 39903-200137). Rysunek 1 i rysunek uzupełniający S1 zostały utworzone przy użyciu przeglądarki SnapGene Viewer.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 kb drabinka DNANEBN3232Stosowany jako znacznik wielkości dla żeli agarozowych
20 AminokwasySigma-AldrichLAA21-1KTSkładnik reakcji bezkomórkowej Roztwór B
Dziurkacz do biopsji 2 mm Integra Miltex 33-31-P/25w siatce głównej CFDB
 Sigma-AldrichA3785Prekursor hemu do indukcji SpyCatcher2-Apex2
Agaroza w proszkuBioShopAGA002Do analizy elektroforetycznej DNA przeciwciała
anty-SARS-CoV2-nukleokapsyduSinobiological40588-T62Do wykrywania WB antygenu NP wytwarzanego bez komórek
Bio-Rad ChemiDoc  XRS+Bio-RadN/AŻelowy aparat do obrazowania
Koncentratory odśrodkoweCytiva28-9323-60Do zagęszczania i wymiany buforowej białek
WirówkaEppendorfEP022628257Do zbioru kultur bakteryjnych
Koenzym  Hydrat soli sodowej (CoA)Sigma-AldrichC3144Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór A
Wstępnie barwiony wzorzec białka barwiony kolorem (szeroki zakres)NEBP7719Stosowany jako znacznik wielkości dla żeli SDS-PAGE
Panel surowicy Covid-19RayBiotechCoV-PosSetWstępnie scharakteryzowane surowice do weryfikacji i optymalizacji odczynników/warunków
CFDBD-(−)-3-Fosfogliceryna kwas disodowy sól (3-PGA)Sigma-AldrichP8877Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór B
Ditiotreitol (DTT)Sigma-Aldrich10197777001Składnik
E. coli 5-alfaNEBC2987 do przygotowania plazmidu
E. coli BL21 NEBC2530 Do otrzymywania lizatów bezkomórkowych
E. coli BL21 (DE3)NEBC2527 Do wyrażania SpyCatcher2-Apex2
Tabletka z inhibitorem proteazy bez EDTASigma-Aldrich11836153001Składnik buforu do lizy E. coli
Eppendorf  Nowy Brunszwik  Inkubator Innova 43/43RShaker EppendorfEPM1320Inkubator do hodowli komórek E. coli do ekspresji białek i bezkomórkowego przygotowania lizatu
Kwas folinowySigma-Aldrich47612Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór A
GlicerolSigma-AldrichG9012Składnik buforu magazynującego SpyCatcher2-Apex2
Chlorek hemin Sigma-AldrichH9039 Do suplementacji hemem SpyCatcher2-Apex2
Nadtlenek wodoru 30%Sigma-AldrichH1009Do wytwarzania odczynnika ECL
Oprogramowanie Image LabOprogramowanie Bio-Rad1709690do żelu ChemiDoc  Przyrząd do obrazowania
Izopropylo-b-D-1-tiogalaktopiranozyd BioshopIPT001Do indukcji SpyCatcher2-Apex2 expressikon
Kanamycin SulfateSigma-Aldrich60615Do przygotowania kultury bakteryjnej SpyCatcher2-Apex2
Agar LBBioShopLBL406Do wzrostu E. coli
bulion LBBioShopLBL407Do wzrostu E. coli
luminol Sigma-AldrichA4685Do wytwarzania odczynnika ECL
LizozymSigma-AldrichL6876Do lizy komórek bakteryjnych
Octan magnezuSigma-AldrichM5661Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór B
Żywica NEBExpress Ni NEBS1428SDo oczyszczania SpyCatcher2-Apex2
Beztłuszczowe mleko w proszkuBioshopSKI400Do blokowania membran WB i CFDB
ParafilmBemis2099-1337410Do inkubacji ECL
kwas p-kumarowy CFDB blot Sigma-AldrichC9008Do wytwarzania odczynnika ECL
pET24b-SpyCatcher2-Apex2 plazmidPardee LaboratoryN/AUżywany do ekspresji białka SpyCatcher2-Apex2
szalka PetriegoFisherbrandFB0875712Pojemnik do inkubacji błon WB i CFDB 
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami 10%BioShopPBS405Składnik
Glutaminian potasuSigma-AldrichG1501Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór B
Szczawian potasu Monohydrat (kwas szczawiowy)Sigma-Aldrich223425Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór A
Prefabrykat SDS-PAGEżel BioRad4561036EDUDo analizy elektroforetycznej
polimerazy DNA o wysokiej wierności białka Q5 NEBM0491 Do amplifikacji PCR LET
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR Qiagen28106Do oczyszczania LETS
Zestaw roztworów rybonukleotydowychNEBN0450SSkładnik reakcji bezkomórkowej Roztwór A
Odtłuszczone mleko w proszkuBioShopSKI400Stosowany jako środek blokujący dla western blot i CFDB
Chlorek soduSigma-AldrichS9625Składnik do oczyszczania białek
SonicatorQsonicaQ500Do lizy komórek bakteryjnych
SpermidynaSigma-AldrichS2626Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór A
Filtr strzykawkowySigma-AldrichSLGSR33SSDo sterylizacji i roztworów
TermocyklerBioRadT100Przyrząd do inkubacji reakcji PCR
Transfer RNA (tRNA)Sigma-AldrichR8759Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór
A Tris buforowana sól fizjologicznaThermo ScientificJ60764. K2Składnik buforu płuczkowego WB i CFDB Baza
TrizmaSigma-AldrichT1503Do wytwarzania buforu tris
Tunair SS-5012 Kolba do wytrząsania z półprzegrodą, 2,5 lCole-ParmerRK-01835-39Naczynie do hodowli komórek E. coli do ekspresji białek i bezkomórkowego przygotowania lizatu
Tween-20BioShopTWN510Składnik bufora do płukania WB i CFDB
PęsetaAlmedic7728-A10-100z membraną CFB NC
Thermo Scientific13400518Służy do pomiaru stężenia kwasów nukleinowych i DNA oraz hodowli bakterii
OD WHO Międzynarodowy Panel Referencyjny dla immunoglubuliny anty-SARS-CoV-2NISBC20/268Wstępnie scharakteryzowane surowice do weryfikacji i optymalizacji odczynników/warunków
CFDBβ-Hydrat dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD)Sigma-Aldrich10127965001Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór A
Do przygotowania chlorowodorku kwasu 5-aminolewulinowego Do obsługi spektrofotometru UV-Vis

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carter, L. J., et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Cent Sci. 6, 591-605 (2020).
  2. Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nat Med. 26 (7), 1033-1036 (2020).
  3. Stadlbauer, D., et al. SARS-CoV-2 seroconversion in humans: A detailed protocol for a serological assay, antigen production, and test setup. Curr Protoc Microbiol. 57 (1), e100(2020).
  4. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259.e12 (2016).
  5. Norouzi, M., et al. Cell-free dot blot: an ultra-low-cost and practical immunoassay platform for detection of anti-SARS-CoV-2 antibodies in human and animal sera. Microbiol Spectr. 11 (2), e0245722(2023).
  6. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).
  7. Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synth Biol. 10 (7), 1615-1624 (2021).
  8. IDT codon optimization tool. , Integrated DNA Technologies. https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool (2025).
  9. General protocol for western blotting. , Bio-Rad. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2025).
  10. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Enhanced chemiluminescence (ECL) for routine immunoblotting. Spermatogenesis. 1, 121-122 (2011).
  11. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J Vis Exp. (144), (2019).
  12. Plasma and serum preparation. , ThermoFisher Scientific. https://www.thermofisher.com/ca/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/elisa-protocol/elisa-sample-preparation-protocols/plasma-and-serum-preparation.html (2025).
  13. Mattiuzzo, G., et al. WHO/BS.2020.2403 Establishment of the WHO International Standard and Reference Panel for anti-SARS-CoV-2 antibody. , (2020).
  14. Gong, F., Wei, H., Li, Q., Liu, L., Li, B. Evaluation and comparison of serological methods for COVID-19 diagnosis. Front Mol Biosci. 8, 682405(2021).
  15. Peeling, R. W., et al. Serology testing in the COVID-19 pandemic response. Lancet Infect Dis. 20 (9), e245-e249 (2020).
  16. Smith, M. T., Berkheimer, S. D., Werner, C. J., Bundy, B. C. Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage. Biotechniques. 56 (4), 186-193 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wykrywanie przeciwciaStrategia nadzoru serologicznegoEkspresja bia ekMembrana nitrocelulozowaWestern blotObrazowanie chemiluminescencyjneAnaliza pr bek surowicyPrzeciwcia a przeciwko SARS CoV 2

Powiązane artykuły