Opisujemy niedawno opracowaną platformę testów immunologicznych opartą na zasadach bezkomórkowej biologii syntetycznej i technice dot-blot do konfigurowalnego wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Bezkomórkowa plama punktowa jako praktyczna i elastyczna platforma testów immunologicznych do wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Seria globalnych epidemii patogenów w ciągu ostatnich dwóch dekad uwypukliła znaczenie strategii nadzoru serologicznego. Platformy testów immunologicznych, które służą do wykrywania przeciwciał specyficznych dla choroby w surowicach pacjentów, są podstawą nadzoru serologicznego. Typowe przykłady obejmują testy immunoenzymatyczne i testy przepływu bocznego; Jednak, chociaż są to złote standardy, wymagają one materiałów eksploatacyjnych specyficznych dla patogenów i specjalistycznego sprzętu, co ogranicza ich zastosowanie poza dobrze wyposażonymi laboratoriami.
Niedawno opracowaliśmy nową platformę testów immunologicznych o nazwie Cell-Free Dot-Blot (CFDB) i przetestowaliśmy ją za pomocą surowic ludzkich i zwierzęcych przeciwko SARS-CoV-2. W przeciwieństwie do konwencjonalnych testów immunologicznych, próbki surowicy pacjenta CFDB są unieruchamiane do fazy stałej (błony nitrocelulozowej), podczas gdy docelowy antygen jest zawieszony w fazie ruchomej testu. Aby poprawić dostęp do możliwości nadzoru serologicznego, antygeny CFDB są produkowane na żądanie i przy użyciu infrastruktury o niskim obciążeniu, wykorzystującej ekspresję białek in vitro. W tym przypadku antygen jest łączony ze znacznikiem peptydowym, który można wykryć za pomocą pojedynczego uniwersalnego białka reporterowego dla dowolnego testu CFDB. W rezultacie CFDB nie wymaga dostępu do czytnika płytek wielodołkowych ani oczyszczonych komercyjnych komponentów do testów molekularnych. Biorąc pod uwagę te rozważania projektowe, CFDB rozwiązuje problemy z istniejącymi platformami testów immunologicznych, zapewniając dostęp do niescentralizowanych laboratoriów, zdolność adaptacji do pojawiających się patogenów oraz przystępność cenową dla społeczności o niższych dochodach.
W obecnym artykule przedstawimy krok po kroku protokół przygotowania i przeprowadzenia testu immunologicznego CFDB. Korzystając z naszych ostatnich prac nad SARS-CoV-2 CFDB jako przykładu, omówimy projektowanie antygenowego DNA do produkcji bezkomórkowej na żądanie, a następnie przygotowanie białka reporterowego CFDB, immobilizację próbek surowicy w fazie stałej, a na koniec etapy wiązania antygenu i wykrywania testu. Przewidujemy, że postępując zgodnie z tymi instrukcjami, naukowcy będą w stanie dostosować test CFDB do wykrywania odpowiedzi immunologicznych w surowicach ludzkich i zwierzęcych na dowolny patogen.
Wprowadzenie
Pandemia COVID-19 ujawniła krytyczne zapotrzebowanie na niedrogie, skalowalne narzędzia diagnostyczne, szczególnie dla ustawień o niskich zasobach1. Konwencjonalne testy immunologiczne, takie jak testy immunoenzymatyczne (ELISA), okazały się niezbędne do wykrywania odpowiedzi immunologicznych2,3. Jednak ich wysoki koszt, uzależnienie od złożonych odczynników i uzależnienie od specjalistycznego sprzętu ograniczają ich dostępność, zwłaszcza podczas globalnych kryzysów zdrowotnych. W odpowiedzi na te wyzwania opracowaliśmy Cell-Free Dot Blot (CFDB), tanią, adaptowalną platformę testów immunologicznych przeznaczoną do wykrywania przeciwciał anty-SARS-CoV-2 w surowicach ludzkich i zwierzęcych.
CFDB wykorzystuje bezkomórkową biologię syntetyczną do szybkiej, na żądanie produkcji antygenów wirusowych przy użyciu liniowych szablonów DNA4,5. Eliminuje to potrzebę tradycyjnych procesów klonowania, ekspresji i oczyszczania opartych na komórkach, znacznie przyspieszając produkcję antygenu przy jednoczesnym obniżeniu kosztów. Metoda CFDB upraszcza wykrywanie przeciwciał dzięki zastosowaniu formatu kropkowego, w którym surowice są bezpośrednio nakrapiane na błony nitrocelulozowe. System ten eliminuje potrzebę stosowania drogich płytek wielodołkowych i specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego, umożliwiając prosty przepływ pracy "zanurzania" w etapach inkubacji i mycia. Platforma wykorzystuje również system SpyCatcher-SpyTag, w którym chimera peroksydazy SpyCatcher2-Apex2 działa jako uniwersalny wtórny odczynnik wykrywający5,6. Jest on wytwarzany przy użyciu standardowej ekspresji opartej na Escherichia coli, co eliminuje zależność od kosztownych komercyjnych koniugatów przeciwciał. W rezultacie, system CFDB może wykonywać testy serologiczne z wydajnością porównywalną do testów ELISA przy znacznie niższych kosztach - około 3 USD za test 96 próbek w porównaniu do ponad 300 USD za komercyjny zestaw ELISA5.
Aby zademonstrować skuteczność CFDB, przetestowaliśmy jego zdolność do wykrywania przeciwciał w wstępnie scharakteryzowanych surowicach ludzkich i zwierzęcych. Nasze wyniki ściśle korelowały z testem ELISA w identyfikacji próbek dodatnich i ujemnych pod względem COVID-19. Oprócz diagnostyki u ludzi oceniliśmy przydatność CFDB w modelach zwierzęcych, testując surowice chomików zakażonych SARS-CoV-2 i tych zaszczepionych rekombinowanym białkiem nukleokapsydu. Testy te potwierdziły potencjał CFDB do wykorzystania zarówno w diagnostyce ludzi, jak i weterynarzy, co czyni go wszechstronnym narzędziem do monitorowania odpowiedzi immunologicznych u różnych gatunków. Jedną z kluczowych zalet kontraktów CFDB jest ich elastyczność. Poprzez prostą modyfikację matrycy DNA kodującej antygen będący przedmiotem zainteresowania, platforma może być szybko przystosowana do wykrywania przeciwciał przeciwko różnym patogenom, co czyni ją cenną dla przyszłej gotowości na wypadek pandemii. Niski koszt, prosty przepływ pracy i minimalne wymagania infrastrukturalne sprawiają, że jest szczególnie przydatny w zdecentralizowanych laboratoriach i środowiskach o niskich zasobach, w których dostęp do komercyjnej diagnostyki jest ograniczony.
W tej pracy przedstawimy instrukcje krok po kroku, jak przygotować i przeprowadzić test CFDB. Po pierwsze, zajmiemy się projektowaniem i syntezą liniowych matryc DNA do bezkomórkowej produkcji antygenów, które są podstawowymi odczynnikami wykrywającymi w teście. Następnie opisujemy etapy przygotowania wtórnego odczynnika wykrywającego test SpyCatcher2-Apex2. Następnie dostarczamy instrukcje dotyczące produkcji bezkomórkowej i kontroli jakości samych antygenów. Na koniec szczegółowo opisujemy proces przeprowadzania testu CFDB na próbkach surowicy ludzkiej lub zwierzęcej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na chomikach przeprowadzono w National Microbiology Laboratory (NML) w Public Health Agency of Canada, po uzyskaniu zgody Canadian Science Centre for Human and Animal Health oraz zgodnie z wytycznymi Canadian Council on Animal Care. Wszystkie próbki ludzkiego surowicy/osocza zostały zakupione komercyjnie do testów wewnętrznych lub przekazane przez współpracowników klinicznych do NML w celu niezależnego badania w NML.
1. Projektowanie i przygotowanie liniowych matryc ekspresji (LET) antygenu
- Zaprojektuj bezklejące systemy ekspresyjne LET dla antygenu docelowego zgodnie z instrukcjami zawartymi w pracy Norouzi i wsp.7 i zawierający SpyTag na N- lub C-końcu, zgodnie z opisem Norouzi i wsp.5.
UWAGA: W tej sekcji przedstawiamy szczegółowe informacje dotyczące preparatyki białka nukleokapsydu SARS-CoV-2 (NP, aminokwasy 2-419).- Upewnij się, że LET dla NP SARS-CoV-2 (Rysunek 1 i Plik uzupełniający 1) zawiera miejsca Ter 5' i 3' z 50-parowym buforem sekwencyjnym przed promotorem T7 i po kodonie stop.
- Oznacz białko NP na N-końcu za pomocą His6-SpyTag-TEV.
- Pobierz sekwencję białka z bazy danych UniProt (kod dostępu P0DTC9) i przeprowadź optymalizację kodonów dla E. coliekspresja oparta na narzędziu do optymalizacji kodonów firmy IDT8Zamów tę sekwencję do syntezy komercyjnej jako jednoniciowy fragment DNA resuspendowany w wodzie w stężeniu 10 ng/µl.μL.
UWAGA: Miejsce cięcia proteazy TEV oraz His6 znaczniki nie są istotnymi elementami konstrukcji LET.
- Przeprowadź amplifikację fragmentu DNA metodą PCR z wykorzystaniem uniwersalnego prawego primeru Ter FW (GGCTCCGAATAAGTATGTTGTAACTAAAGTGCGGCC)
ACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCG) i Ter RV (CCGAGGCAATAAGTATGTTGTAACTAAAGTGCTCAG
CTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCC) startery, wykorzystując zestaw z polimerazą DNA o wysokiej wierności (patrz) Tabela materiałów)- Przygotuj 100 µL reakcja przebiega następująco: 75 µL wody wolnej od nukleaz, 20 µL buforu do polimerazy DNA 5x, 2 µL 10 mM dNTP (stężenie końcowe 200 µM), 0.5 µL z 100 µM starter Ter-FW, 0.5 µL z 100 µM starter Ter-RV, 1 µL 10 ng/µL jednoniciowy LET, 1 µL(2U) polimerazy DNA.
- Stosuj następujące parametry PCR: wstępna denaturacja w 98 °C przez 30 s; 35 cykli: 98 °C przez 6 s, 60 °C przez 15 s, 72 °C przez 90 s; utrzymać w 4 °C.
- Produkt PCR należy oczyścić za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania PCR, sprawdzić jego jakość poprzez przeprowadzenie elektroforezy próbki na 1% żelu agarozowym oraz zmierzyć jego stężenie za pomocą spektrofotometru UV-Vis.
UWAGA: Surowe produkty PCR mogą być również stosowane bezpośrednio do ekspresji bezkomórkowej. Jednakże oczyszczanie pozwala na przeprowadzenie bardziej zestandaryzowanej procedury.
Rysunek 1Liniowy szablon ekspresyjny dla SARS-CoV-2-NP. Schemat przedstawiający cechy liniowego matrycy DNA His-SpyTag-SARS-CoV-2 NP. Oznaczono kluczowe elementy matrycy DNA. Sekwencja kodująca interesujące białko, w tym przypadku NP, znajduje się pod kontrolą transkrypcyjną promotora T7 w celu zapewnienia wydajnej ekspresji. Na N-końcu do białka NP dołączono SpyTag w celu specyficznej detekcji przy użyciu odczynnika detekcyjnego SpyCatcher2-Apex2. Znak x6His oraz miejsca cięcia proteazy TEV, mimo że zostały uwzględnione w ramach ogólnego projektu LET, są zbędne w zastosowaniach CFDB. Na końcach liniowej matrycy DNA umieszczono miejsca Ter „upstream” i „downstream”, z których każde jest poprzedzone odpowiednią sekwencją buforową o długości 50 par zasad, co zapewnia ochronę przed egzonukleolityczną degradacją DNA w lizacie bezkomórkowym za pośrednictwem białka Tus. Skróty: NP = białko nukleokapsydu; LET = liniowa matryca ekspresyjna; TEV = wirus trawienia tytoniu; CFDB = bezkomórkowy dot-blot. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
2. Oczyszczanie białka reporterowego SpyCatcher2-Apex2
- Należy użyć plazmidu pET24b-SpyCatcher2-Apex2, pierwotnie skonstruowanego przez Norouzi i współpracowników.5 (pełna sekwencja w Plik uzupełniający 2 oraz mapa plazmidu w Rycina dodatkowa S1) w celu przygotowania białka reporterowego SpyCatcher2-Apex-2.
- Przygotować płytki agarowe oraz pożywkę LB (lysogeny broth) zawierającą 50 μg/mL kanamycyna. Transformacja E. coli komórki BL21 (DE3) z plazmidem pET24b-SpyCatcher2-Apex2. Zaszczepić pojedynczą kolonię do 15 ml kultury startowej w pożywce LB i inkubować przez noc w 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 250 obr./min.
- Następnego dnia dodać 10 mL kultury startowej do 500 mL świeżej pożywki LB zawierającej 50 μg/mL kanamycyna. Inkubować w 37 °C z wstrząsaniem przy 250 obr./min, aż do momentu, gdy kultura osiągnie gęstość optyczną przy 600 nm wynoszącą 0,6-0,8 (~3 h).
- Indukować ekspresję SpyCatcher2-Apex2 poprzez uzupełnienie hodowli o 0,5 mM izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozydu oraz 1 mM chlorowodorku kwasu 5-aminolewulinowego. Obniżyć temperaturę hodowli do 30 °C i inkubować kulturę przez kolejne 4 h.
- Oddzielić bakterie poprzez wirowanie przy 8 000 × g przez 15 min. Następnie przystąp do lizy komórek lub alternatywnie przechowuj osad w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
- Osad resuspender w 20 ml buforu do lizy zawierającego 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 300 mM NaCl, 1 mg/ml lizozymu, tabletkę inhibitora proteaz bez EDTA oraz 1 mM ditiotreolu (DTT). Komórki poddać lizie poprzez sonikację przy amplitudzie 50%, stosując interwały 5 s włączenia (ON) i 10 s wyłączenia (OFF), aż do osiągnięcia łącznego czasu włączenia wynoszącego 3 min.
- Oczyścić lizat poprzez wirowanie przy 20 000 × g przez 1 h w temperaturze 4 °CPrzenieść nadfiltr przez 0.2 μm filtr strzykawkowy
- Dodać chlorek heminy do stężenia końcowego wynoszącego 250 μM do oczyszczonego lizatu i inkubować przez noc w temperaturze 4 °CPrzejdź do oczyszczania białka.
UWAGA: Inkubacja z chlorkiem heminy maksymalizuje wbudowywanie hemu do peroksydazy Apex-2 w celu zapewnienia optymalnej aktywności enzymatycznej. - Do klarownego lizatu dodać 2,5 ml żywicy Ni i inkubować w 4 °C przy delikatnym wstrząsaniu przez 45 min. Przenieść mieszaninę do kolumny grawitacyjnej i przemyć żywicę 50 mL buforu Tris (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 300 mM NaCl i 1 mM DTT).
- Eluuj białko SpyCatcher2-Apex2 w 25 ml buforu Tris zawierającego 400 mM imidazolu. Skoncentruj eluat i przeprowadź wymianę buforu na bufor Tris, używając odwirku filtracyjnego, tak aby uzyskać objętość końcową od 0,5 do 1,0 ml.
- Należy użyć molowego współczynnika ekstynkcji SpyCatcher2-Apex2 (27 390 M-1 cm-1) w celu oznaczenia stężenia białka za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Dodać glicerol do stężenia końcowego 40% i przechowywać alikwoty w temperaturze -20 °C.
UWAGA: Oczekuje się, że protokół ten pozwoli na uzyskanie około 40 mg wysokiej czystości i aktywności białka SpyCatcher2-Apex2, co jest ilością wystarczającą do przeprowadzenia 400 analiz CFDB przy standardowej wielkości blotu dla 96 próbek. - Do detekcji białek SpyTagged przy użyciu konwencjonalnego westernu (western blot)9 a w przypadku eksperymentów CFDB zawsze blokować membrany w 5% odtłuszczonym suchym mleku w 1x buforze soli w TRIS-ie zawierającym 0,05% Tween-20 (TBST). Użyć białka SpyCatcher2-Apex2 w stężeniu końcowym wynoszącym 10 μg/mL w roztworze blokującym.
UWAGA: Reporter SpyCatcher2-Apex2 wymaga zastosowania roztworu do wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) w celu wywołania sygnału. Roztwór ECL można nabyć w drodze komercyjnej lub przygotować we własnym zakresie zgodnie z instrukcjami zawartymi w pracy Mruk i wsp.10Końcowy roztwór do ECL składa się tutaj z 0,4 mM p-kwas kumarynowy, 2,5 mM luminolu i 0,015% H2O2 w 100 mM Tris-HCl (pH 8,6).
3. Bezkomórkowa produkcja i kontrola jakości antygenów
- Przygotować i złożyć bezkomórkowy lizat ekspresyjny E. coli BL21 oraz komponenty reakcji, postępując zgodnie z instrukcjami w pracy Levine et al.11 oraz Norouzi et al.5. Uzupełnić końcową mieszaninę reakcyjną o 5 μM białka Tus i 1,2 μM polimerazy RNA T7 w następujący sposób dla reprezentatywnej reakcji o objętości 100 μL: 14,6 µL roztworu A, 14 µL roztworu B, 33,3 µL lizatu E. coli BL21, 2,5 µL białka Tus o stężeniu 200 mM, 1,2 µL polimerazy RNA T7 o stężeniu 100 mM, 1 µL liniowego matrycowego DNA o stężeniu 1,5 µM oraz 33,4 µL wody wolnej od nukleaz.
UWAGA: Kluczowe instrukcje dotyczące przygotowania bezkomórkowego lizatu E. coli BL21 znajdują się w Pliku uzupełniającym 3, a szczegółowy przepis na roztwory A i B w Tabeli uzupełniającej S1. Bezkomórkowy system ekspresyjny E. coli może być również przygotowany zgodnie z alternatywnymi protokołami lub zakupiony komercyjnie, pod warunkiem, że reakcja zostanie uzupełniona o białko Tus i polimerazę RNA T7. - Przeprowadzić wstępny test ekspresji w skali 5 μL, dodając 10% (v/v) surowego produktu PCR do reakcji bezkomórkowej w probówce PCR. Inkubować bez wstrząsania w temperaturze 30 °C przez 15 h.
- Sprawdzić jakość ekspresji antygenu NP, nakładając 1 μL reakcji bezkomórkowej na 12% żel poliakrylamidowy z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), a następnie przenosząc go na membranę nitrocelulozową w celu wykonania western blotu, zgodnie z opisem w kroku 2.12. Do znakowania blotu poprzez SpyTag użyć białka reporterowego SpyCatcher2-Apex2 oraz opcjonalnie specyficznego przeciwciała komercyjnego (w tym przypadku anty-SARS-CoV-2-NP) przeciwko docelowemu antygenowi.
- Złożyć bezkomórkową reakcję w skali 1 mL z 15 nM oczyszczonego produktu LET do wykorzystania w teście CFDB. Inkubować mieszaninę ekspresyjną w 15 mL probówce stożkowej z wstrząsaniem przy 80 RPM przez 15 h w temperaturze 30 °C. Sprawdzić jakość ekspresji za pomocą western blotu i przechowywać alikwoty 50 μL w temperaturze -20 °C.
4. Próbki surowicy
- Pozyskać próbki surowicy (lub osocza) ludzkiej/zwierzęcej z komercyjnych źródeł, od współpracowników klinicznych lub wewnętrznie, stosując standardowe procedury i zgodnie z wytycznymi instytucjonalnej komisji etyki badań z udziałem ludzi lub komisji ds. opieki i użytkowania zwierząt. Upewnić się, że podjęto odpowiednie środki wstępnego przygotowania próbek w celu zminimalizowania ryzyka kontaminacji.
UWAGA: Środki wstępnego przygotowania mogą obejmować traktowanie rozpuszczalnikami-detergentami, inaktywację termiczną oraz testowanie pod kątem markerów wirusów przenoszonych przez krew. Przydatny protokół izolacji surowicy i osocza z krwi pełnej jest dostępny12. Podobnie jak w przypadku innych platform testów immunologicznych, nie oczekuje się, aby próbki surowicy pobrane wcześnie (<3 tygodnie) po początkowym zakażeniu lub wystąpieniu choroby zawierały odpowiednie poziomy odpowiedzi przeciwciał, a ich wyniki należy traktować z ostrożnością. - W celu weryfikacji jakości odczynników SARS-CoV-2 NP CFDB należy użyć międzynarodowego panelu referencyjnego dla immunoglobulin przeciwko SARS-CoV-2 opracowanego przez National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) i Światową Organizację Zdrowia (WHO), który zawiera 1 próbkę sprzed COVID-19 oraz 4 próbki dodatnie pod kątem SARS-CoV-2 z różnymi poziomami immunoglobulin przeciwko NP13. Alternatywnie można zastosować uprzednio scharakteryzowane próbki surowicy zdrowej i dodatniej z innych źródeł.
- Do eksperymentów CFDB należy pozyskać lub przygotować próbkę kontrolną ujemną poprzez połączenie kilku (>3) próbek surowicy zdrowej, aby zwiększyć dokładność oraz ułatwić analizę i interpretację wyników.
5. Procedura bezkomórkowego dot-blotu (CFDB)
- Pobierz i wydrukuj plik obrazu siatki głównej (Rycina dodatkowa S2). Siatka główna stanowi wzór o wymiarach 6 x 6 cm zawierający 12 x 12 kółek o średnicy 2 mm każde i zapewnia pojemność nanoszenia próbek zbliżoną do płytki 96-dołkowej.
- Mocno zaklemuj siatkę między dwiema warstwami klejącej folii uszczelniającej do płytek PCR i dotnij do odpowiedniego rozmiaru wzdłuż zewnętrznych krawędzi siatki. Użyj bioptera o średnicy 2 mm, aby wyciąć otwory w każdym zaznaczonym okręgu.
UWAGA: Niniejszą siatkę główną można wykorzystać wielokrotnie po przetarciu 70% etanolem. - Wytnij fragment membrany nitrocelulozowej o wymiarach 6,5 x 6,5 cm i umieść go pod siatką wzorczą na czystej powierzchni, mocując całość za pomocą taśmy klejącej, jak pokazano w Rysunek 2 oraz rysunek uzupełniający S3Użyj pisaka, aby zaznaczyć pozycje zewnętrznego okręgu na membranie nitrocelulozowej; posłużą one jako pomoc przy wycinaniu membrany po naniesieniu próbek.
- Rozcieńczyć próbki surowicy w stosunku 1:10 w 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (pH 7,4). Za pomocą mikropipety nanieść próbki w trzech powtórzeniach. 0.4 μL objętości każdej próbki na membranę nitrocelulozową w wyznaczonych pozycjach siatki. Nanoszenie każdej plamki zajmie około 15 s.
UWAGA: Należy pamiętać o uwzględnieniu próbek kontrolnych negatywnych i pozytywnych w każdym teście, ponieważ będą one niezbędne do analizy wyników. - Pozostaw naniesione próbki na 10 minut w temperaturze pokojowej w celu związania i wyschnięcia. Za pomocą pincety ostrożnie wyjmij membranę nitrocelulozową i wytnij ją wzdłuż zaznaczonych zewnętrznych okręgów.
- Blokować membranę w 10 ml roztworu blokującego (5% beztłustego mleka w proszku w TBST) w 10-centymetrowej płytce Petriego przez 30 min w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając z prędkością 100 obr./min.
- Rozmrozić i dodać 50 μL przenieść alikwot mieszaniny ekspresyjnej antygenu bezkomórkowego do 5 ml roztworu blokującego w szalce Petriego o średnicy 10 cm. Przenieść membranę bezpośrednio do tego roztworu zawierającego antygen i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h, wytrząsając z prędkością 100 obr./min.
UWAGA: Będzie to główny etap detekcji, podczas którego antygen SpyTagged zwiąże się z pozycjami plamek zawierającymi przeciwciała, jeśli takie występują. - Opłukać membranę, inkubować w celu przemycia przez 5 min, a następnie ponownie opłukać w TBST przed przejściem do etapu detekcji wtórnej.
- Inkubować membranę w 10 ml buforu blokującego zawierającego 10 μg/mL oczyszczonego białka SpyCatcher2-Apex2 przez 1 h przy wytrząsaniu z prędkością 100 RPM.
- Opłucz membranę, a następnie przemyj ją dwukrotnie przez 5 min w TBST, kończąc ostatnim płukaniem w TBS.
- Przykleić i przymocować fragment parafilmu do czystego obszaru roboczego w pobliżu urządzenia do obrazowania blotów. Usunąć nadmiar cieczy, delikatnie uderzając pęsetą w membranę, a następnie umieścić membranę na parafilmie.
- Natychmiast dodać 3 ml (100 μL/cm2) roztwór ECL na wierzch membrany i inkubować w temperaturze pokojowej przez dokładnie 90 s.
- Należy niezwłocznie osuszyć membranę poprzez dotykanie jej papierem absorpcyjnym, a następnie przenieść ją do urządzenia obrazującego kompatybilnego z chemiluminescencją w celu wizualizacji wyników.
UWAGA: Optymalny czas obrazowania może różnić się w zależności od urządzenia. Zaleca się korzystanie z domyślnych ustawień automatycznego czasu akwizycji instrumentu, a w przypadku ich braku – wykorzystanie wcześniej scharakteryzowanych próbek surowicy w celu optymalizacji czasu akwizycji obrazu. - Użyj funkcji analizy obrazu urządzenia, aby uzyskać intensywność plamek, w tym dla trzech pozycji pustych (tła) na membranie nitrocelulozowej; zachowaj stałą objętość pomiaru dla każdej plamki. Eksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, pamiętając o poprawnym oznaczeniu każdej pozycji plamki.
- Oblicz średnią i odchylenie standardowe (SD) intensywności plamek z pomiarów wykonanych w trzech powtórzeniach. Następnie od wszystkich próbek odejmij tło membrany nitrocelulozowej.
- Użyj następującego równania, aby wyznaczyć wartość odcięcia (cut-off) dla interpretacji wyników dodatnich i ujemnych (-/+):
(Średnia z kontroli negatywnych) + (3 x odchylenie standardowe kontroli negatywnych). Próbki uznaje się za pozytywne, jeśli ich średnia intensywność przekracza wartość graniczną, oraz za negatywne, jeśli ich średnia intensywność jest niższa od wartości granicznej.
UWAGA: Schemat procedury CFDB znajduje się w Rycina 3.
Rycina 2Montaż CFDB. Schemat głównej siatki CFDB oraz konfiguracji zestawu z membraną NC. Główna siatka jest nakładana na membranę NC, aby zapewnić regularny, adresowalny wzór do nanoszenia i unieruchamiania próbek surowicy. Skróty: CFDB = cell-free dot blot; NC = nitroceluloza. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Schematyczny przebieg procedury CFDB. W teście CFDB niewielka ilość (<0,4 μL) 10-krotnie rozcieńczonych próbek surowicy jest nanoszona ręcznie na dociętą błonę nitrocelulozową (panel lewy) w oddzielnych, określonych punktach (panel środkowy). Jedna próbka surowicy jest nanoszona w trzech powtórzeniach, co prowadzi do unieruchomienia zawartości białek, w tym całej puli przeciwciał zawartych w surowicy, na stałym podłożu NC (beżowe plamki na panelu środkowym). W tym przykładzie przeciwciała anty-NP zawarte w próbkach surowicy mogą zostać najpierw związane przez pierwotny odczyn detekcyjny CFDB SpyTag-NP, a następnie wykryte przez wtórny odczyn detekcyjny CFDB SpyCatcher2-Apex2 (panel prawy – powiększona bańka). Rysunek pochodzi z pracy Norouzi et al.5. Skróty: CFDB = cell-free dot blot; NP = nucleocapsid protein; LET = linear expression template. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Amplifikacja PCR liniowej matrycy ekspresyjnej dla antygenu docelowego
W celu amplifikacji PCR LET białka NP SARS-CoV-2 zastosowano uniwersalne primery Ter forward i reverse, zgodnie z opisem w sekcji 1.2 protokołu, a następnie 1 μL produktu sprawdzono na żelu agarozowym (Rysunek 4>) przed przystąpieniem do oczyszczania produktu PCR.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pandemia COVID-19 uwypukliła znaczenie dostępnej i solidnej diagnostyki dla kontrolowania ognisk zakażeń i optymalizacji globalnych strategii zdrowotnych. Testy serologiczne wykrywające przeciwciała ochronne okazały się niezbędne do śledzenia wzorców przenoszenia się nowych wariantów, identyfikowania gorących punktów, kierowania opracowywaniem szczepionek, klasyfikowania podejrzanych przypadków i ochrony wrażliwych populacji14. Pandemia obnażyła również nierówności w zakresie dostępności testów, p...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
M.N. i K.P. są współtwórcami metody bezkomórkowej kropkowej plamy. Złożono tymczasowy wniosek patentowy związany z tą pracą (PCT/CA2024/050097, złożony w styczniu 2024 r.).
Podziękowania
S.S. i R.Z. są wspierane przez fundusze z Agencji Zaawansowanych Projektów Badawczych w Obszarze Obronności (DARPA), numer umowy N66001-23-2-4042. Wyrażone poglądy, opinie i/lub ustalenia są poglądami autorów i nie powinny być interpretowane jako reprezentujące oficjalne poglądy lub politykę Departamentu Obrony lub rządu Stanów Zjednoczonych. Praca ta została wsparta funduszami dla K.P. z programu grantowego CIHR Foundation (201610FDN-375469), CIHR Canada Research Chair Program (950-231075 i 950-233107), University of Toronto's Medicine by Design Initiative, która otrzymuje finansowanie z Canada First Research Excellence Fund oraz fundusze dla K.P., z Defense Research and Development Canada's, Canadian Safety and Security Program (umowa 39903-200137). Rysunek 1 i rysunek uzupełniający S1 zostały utworzone przy użyciu przeglądarki SnapGene Viewer.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 kb drabinka DNA | NEB | N3232 | Stosowany jako znacznik wielkości dla żeli agarozowych |
| 20 Aminokwasy | Sigma-Aldrich | LAA21-1KT | Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór B |
| Dziurkacz do biopsji 2 mm | Integra Miltex | 33-31-P/25 | w siatce głównej CFDB |
| Sigma-Aldrich | A3785 | Prekursor hemu do indukcji SpyCatcher2-Apex2 | |
| Agaroza w proszku | BioShop | AGA002 | Do analizy elektroforetycznej DNA przeciwciała |
| anty-SARS-CoV2-nukleokapsydu | Sinobiological | 40588-T62 | Do wykrywania WB antygenu NP wytwarzanego bez komórek |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | N/A | Żelowy aparat do obrazowania |
| Koncentratory odśrodkowe | Cytiva | 28-9323-60 | Do zagęszczania i wymiany buforowej białek |
| Wirówka | Eppendorf | EP022628257 | Do zbioru kultur bakteryjnych |
| Koenzym Hydrat soli sodowej (CoA) | Sigma-Aldrich | C3144 | Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór A |
| Wstępnie barwiony wzorzec białka barwiony kolorem (szeroki zakres) | NEB | P7719 | Stosowany jako znacznik wielkości dla żeli SDS-PAGE |
| Panel surowicy Covid-19 | RayBiotech | CoV-PosSet | Wstępnie scharakteryzowane surowice do weryfikacji i optymalizacji odczynników/warunków |
| CFDBD-(−)-3-Fosfogliceryna kwas disodowy sól (3-PGA) | Sigma-Aldrich | P8877 | Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór B |
| Ditiotreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Składnik |
| E. coli 5-alfa | NEB | C2987 | do przygotowania plazmidu |
| E. coli BL21 | NEB | C2530 | Do otrzymywania lizatów bezkomórkowych |
| E. coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | Do wyrażania SpyCatcher2-Apex2 |
| Tabletka z inhibitorem proteazy bez EDTA | Sigma-Aldrich | 11836153001 | Składnik buforu do lizy E. coli |
| Eppendorf Nowy Brunszwik Inkubator Innova 43/43R | Shaker Eppendorf | EPM1320 | Inkubator do hodowli komórek E. coli do ekspresji białek i bezkomórkowego przygotowania lizatu |
| Kwas folinowy | Sigma-Aldrich | 47612 | Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór A |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G9012 | Składnik buforu magazynującego SpyCatcher2-Apex2 |
| Chlorek hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | Do suplementacji hemem SpyCatcher2-Apex2 |
| Nadtlenek wodoru 30% | Sigma-Aldrich | H1009 | Do wytwarzania odczynnika ECL |
| Oprogramowanie Image Lab | Oprogramowanie Bio-Rad | 1709690 | do żelu ChemiDoc Przyrząd do obrazowania |
| Izopropylo-b-D-1-tiogalaktopiranozyd | Bioshop | IPT001 | Do indukcji SpyCatcher2-Apex2 expressikon |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Do przygotowania kultury bakteryjnej SpyCatcher2-Apex2 |
| Agar LB | BioShop | LBL406 | Do wzrostu E. coli |
| bulion LB | BioShop | LBL407 | Do wzrostu E. coli |
| luminol | Sigma-Aldrich | A4685 | Do wytwarzania odczynnika ECL |
| Lizozym | Sigma-Aldrich | L6876 | Do lizy komórek bakteryjnych |
| Octan magnezu | Sigma-Aldrich | M5661 | Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór B |
| Żywica NEBExpress Ni | NEB | S1428S | Do oczyszczania SpyCatcher2-Apex2 |
| Beztłuszczowe mleko w proszku | Bioshop | SKI400 | Do blokowania membran WB i CFDB |
| Parafilm | Bemis | 2099-1337410 | Do inkubacji ECL |
| kwas p-kumarowy CFDB blot | Sigma-Aldrich | C9008 | Do wytwarzania odczynnika ECL |
| pET24b-SpyCatcher2-Apex2 plazmid | Pardee Laboratory | N/A | Używany do ekspresji białka SpyCatcher2-Apex2 |
| szalka Petriego | Fisherbrand | FB0875712 | Pojemnik do inkubacji błon WB i CFDB |
| Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami 10% | BioShop | PBS405 | Składnik |
| Glutaminian potasu | Sigma-Aldrich | G1501 | Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór B |
| Szczawian potasu Monohydrat (kwas szczawiowy) | Sigma-Aldrich | 223425 | Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór A |
| Prefabrykat SDS-PAGE | żel BioRad | 4561036EDU | Do analizy elektroforetycznej |
| polimerazy DNA o wysokiej wierności białka Q5 | NEB | M0491 | Do amplifikacji PCR LET |
| Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR | Qiagen | 28106 | Do oczyszczania LETS |
| Zestaw roztworów rybonukleotydowych | NEB | N0450S | Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór A |
| Odtłuszczone mleko w proszku | BioShop | SKI400 | Stosowany jako środek blokujący dla western blot i CFDB |
| Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | S9625 | Składnik do oczyszczania białek |
| Sonicator | Qsonica | Q500 | Do lizy komórek bakteryjnych |
| Spermidyna | Sigma-Aldrich | S2626 | Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór A |
| Filtr strzykawkowy | Sigma-Aldrich | SLGSR33SS | Do sterylizacji i roztworów |
| Termocykler | BioRad | T100 | Przyrząd do inkubacji reakcji PCR |
| Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8759 | Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór |
| A Tris buforowana sól fizjologiczna | Thermo Scientific | J60764. K2 | Składnik buforu płuczkowego WB i CFDB Baza |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503 | Do wytwarzania buforu tris |
| Tunair SS-5012 Kolba do wytrząsania z półprzegrodą, 2,5 l | Cole-Parmer | RK-01835-39 | Naczynie do hodowli komórek E. coli do ekspresji białek i bezkomórkowego przygotowania lizatu |
| Tween-20 | BioShop | TWN510 | Składnik bufora do płukania WB i CFDB |
| Pęseta | Almedic | 7728-A10-100 | z membraną CFB NC |
| Thermo Scientific | 13400518 | Służy do pomiaru stężenia kwasów nukleinowych i DNA oraz hodowli bakterii | |
| OD WHO Międzynarodowy Panel Referencyjny dla immunoglubuliny anty-SARS-CoV-2 | NISBC | 20/268 | Wstępnie scharakteryzowane surowice do weryfikacji i optymalizacji odczynników/warunków |
| CFDBβ-Hydrat dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD) | Sigma-Aldrich | 10127965001 | Składnik reakcji bezkomórkowej Roztwór A |
Bibliografia
- Carter, L. J., et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Cent Sci. 6, 591-605 (2020).
- Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nat Med. 26 (7), 1033-1036 (2020).
- Stadlbauer, D., et al. SARS-CoV-2 seroconversion in humans: A detailed protocol for a serological assay, antigen production, and test setup. Curr Protoc Microbiol. 57 (1), e100(2020).
- Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259.e12 (2016).
- Norouzi, M., et al. Cell-free dot blot: an ultra-low-cost and practical immunoassay platform for detection of anti-SARS-CoV-2 antibodies in human and animal sera. Microbiol Spectr. 11 (2), e0245722(2023).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).
- Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synth Biol. 10 (7), 1615-1624 (2021).
- IDT codon optimization tool. , Integrated DNA Technologies. https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool (2025).
- General protocol for western blotting. , Bio-Rad. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2025).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Enhanced chemiluminescence (ECL) for routine immunoblotting. Spermatogenesis. 1, 121-122 (2011).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J Vis Exp. (144), (2019).
- Plasma and serum preparation. , ThermoFisher Scientific. https://www.thermofisher.com/ca/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/elisa-protocol/elisa-sample-preparation-protocols/plasma-and-serum-preparation.html (2025).
- Mattiuzzo, G., et al. WHO/BS.2020.2403 Establishment of the WHO International Standard and Reference Panel for anti-SARS-CoV-2 antibody. , (2020).
- Gong, F., Wei, H., Li, Q., Liu, L., Li, B. Evaluation and comparison of serological methods for COVID-19 diagnosis. Front Mol Biosci. 8, 682405(2021).
- Peeling, R. W., et al. Serology testing in the COVID-19 pandemic response. Lancet Infect Dis. 20 (9), e245-e249 (2020).
- Smith, M. T., Berkheimer, S. D., Werner, C. J., Bundy, B. C. Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage. Biotechniques. 56 (4), 186-193 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
