Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mysi model chirurgicznego uszkodzenia macicy i późniejszych wyników ciąży

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67977

⸱

27 czerwca 2025

 , 
1Department of Physiology and Membrane Biology, University of California, Davis, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of California, Davis

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje procedurę wywoływania uszkodzenia macicy w modelu mysim, po której następują dalsze analizy podczas kolejnej ciąży.

Streszczenie

Uszkodzenie macicy spowodowane cesarskim cięciem (cesarskim cięciem) i innymi zabiegami (rozszerzanie i łyżeczkowanie, miomektomia itp.) może prowadzić do kilku chorób w kolejnych ciążach, w tym łożyska przodującego, spektrum przylegania łożyska (PAS), ciąży z blizną po cesarskim cięciu i pęknięcia macicy. Cesarskie cięcia stanowią około 30% porodów w USA, przy czym przewiduje się, że stawki wzrosną. W związku z tym niezbędne jest głębsze zrozumienie mechanizmów, w wyniku których powstają zaburzenia ciążowe związane z urazami, oraz platforma do testowania możliwych interwencji. Aby osiągnąć te cele, istnieje pilne zapotrzebowanie na zwierzęce modele uszkodzenia macicy, w szczególności te, które dotyczą wpływu urazu na późniejsze wyniki w życiu płodowym. Protokół ten opisuje nowatorską procedurę chirurgiczną dla modelu mechanicznie indukowanego uszkodzenia macicy u myszy laboratoryjnej (Mus musculus). Przedstawiono kroki podjęte w ramach przygotowań do operacji, indukcji samego urazu macicy oraz procedur rekonwalescencji pooperacyjnej. Podano dodatkowe informacje dotyczące dalszej sekcji myszy zarówno niebędących w ciąży, jak i ciężarnych. Ogólnie rzecz biorąc, poprzez wyszczególnienie zestawu procedur wywoływania uszkodzenia macicy w modelu in vivo , protokół ten przedstawia wykonalną metodę wyjaśniania molekularnych i komórkowych zdarzeń gojenia się ran macicy i ich wpływu na późniejszą ciążę.

Wprowadzenie

Chociaż 1 na 3 porody w USA odbywa się przez cesarskie cięcie (cesarskie cięcie), niewiele wiadomo o tym, jak goi się macica i jak uszkodzona macica prowadzi do komplikacji w kolejnych ciążach 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12, Rozdział 13. Powikłania te obejmują pęknięcie macicy, łożysko przodujące, PAS i ciążę z blizną po cesarskim cięciu, które razem dotykają ~ 2,5% pacjentek, które miały jedno lub więcej cesarskich cięć 1,2,6,8,12,14,15,16,17. Łożysko przodujące charakteryzuje się nieprawidłowym umieszczeniem łożyska w dolnej części macicy 4,16. Powoduje to nie tylko fizyczną niedrożność szyjki macicy i zwiększone ryzyko krwawienia w czasie ciąży, ale jest również istotnym czynnikiem ryzyka cięższego, inwazyjnego stanu PAS 8,12. PAS definiuje się jako nadmierną inwazję łożyska zbyt głęboko w tkanki matki, nawet do pęcherza moczowego lub odbytnicy, i często wymaga histerektomii przez cesarskie cięcie, aby wykluczyć zagrażający życiu krwotok matki12,17. Ciąże z bliznami po cesarskim cięciu, choć rzadkie, niosą ze sobą wysoki odsetek powiązanych chorób, w tym poronienia, obumarcia płodu i przedwczesnego porodu18,19. Oprócz powikłań związanych z historią wcześniejszych cesarskich cięć, inne zabiegi macicy, takie jak miomektomia lub dylatacja i łyżeczkowanie (D&C), również prowadzą do chorób chorobowych pacjentki. Na przykład, ~ 30% pacjentek poddawanych D&C po późnym samoistnym poronieniu i do 46% pacjentek poddawanych drugiej histeroskopowej resekcji mięśniaka gładkokomórkowego rozwija zrosty wewnątrzmaciczne charakterystyczne dla zespołu Ashermana (AS)20,21. AS dotyka ~ 2% kobiet, powodując brak miesiączki, bolesne miesiączkowanie, niepowodzenie implantacji zarodka, nawracające utrata ciąży, przedwczesny poród i/lub PAS21,22. W związku z tym, biorąc pod uwagę znaczną liczbę poważnych zachorowań i śmiertelności związanych z wcześniejszymi urazami macicy, eksperymentalny model zwierzęcy ma kluczowe znaczenie nie tylko dla wyjaśnienia mechanizmów, za pomocą których rany macicy goją się i jak uszkodzenie macicy wpływa na późniejsze wyniki ciąży, ale także jako platforma do rozwoju nowatorskiej diagnostyki i terapii23,24.

W związku z tym w kilku badaniach opracowano mysie modele uszkodzenia macicy. Jednak wczesne badania albo nie badały konsekwencji uszkodzenia macicy na kolejne ciąże25, albo ograniczały uszkodzenia powierzchni światła macicy w celu zbadania implantacji zarodka poza oknem receptywności endometrium u myszy poddanych owariektomii26. Aby wypełnić te luki w wiedzy, model opisany w tym protokole, wraz z innymi niedawnymi badaniami, przedstawia nowatorską metodologię chirurgiczną wprowadzania uszkodzenia macicy u myszy27,28. Protokół ten wykorzystuje zwykłą mysz laboratoryjną jako organizm modelowy ze względu na jej szeroką dostępność, podatność genetyczną, krótką ciążę, szybki czas od urodzenia do dojrzewania, duże rozmiary miotu i opłacalność. Ponadto cecha anatomiczna dwóch rogów macicy u myszy pozwala na wewnętrzną kontrolę z nieuszkodzonym rogiem u każdego zwierzęcia doświadczalnego, a także na możliwość oddzielenia miejscowych wad bezpośrednio przy bliźnie vs. globalne wady w całym środowisku macicy. Podejście opisane w tym protokole obejmuje prostą laparotomię grzbietową, po której następuje użycie zadziornej igły w celu wykonania nacięcia zarówno przez warstwę endometrium, jak i mięśniówkę macicy pojedynczego rogu macicy. Metodologia ta najwierniej naśladuje urazy obserwowane podczas cesarskich cięć i miomektomii, chociaż można ją łatwo zmodyfikować w celu zbadania urazów bez nacięcia, takich jak D&C, które poprzedzają AS29,30. Po urazie zwierzętom pozwala się na powrót do zdrowia, a następnie kryje się je z samcami reproduktora w czasie ciąży w celu zbadania konsekwencji urazu dla późniejszych wyników w macicy27,28.

Chociaż ogólna strategia jest podobna do innych ostatnich badań, istnieją aspekty tego protokołu, które zapewniają wyraźne korzyści. Na przykład zarówno Li i wsp., jak i Burke i wsp. uzyskali dostęp do macicy brzusznie, a nie grzbietowo, jak opisano tutaj 31,32. Podejście grzbietowe jest zarówno prostsze do wykonania, jak i bardziej sprzyja szybkiej rekonwalescencji pooperacyjnej zwierzęcia. W przypadku myszy niebędących w ciąży w badaniu Burke i wsp., do zeskrobywania endometrium użyto wygiętych igieł lub kiret, naśladując w ten sposób D&C, w przeciwieństwie do urazów nacięć o pełnej grubości w tym protokole, które dokładniej modelują cesarskie cięcia i miomektomie32. U myszy okołoporodowych Burke i in. wprowadzili nacięcia na mezometrium, w przeciwieństwie do powierzchni antymesometrialnej, na której zagnieżdżają się zarodki, jak opisano tutaj. Używając igły z zadziorami, w przeciwieństwie do nożyczek używanych przez Li i wsp.31, podejście to można łatwiej zmodyfikować od urazów o pełnej grubości do urazów ograniczonych endometrium, aby modelować zarówno D&C, jak i cesarskie cięcia i miomektomię. Zarówno Li i wsp., jak i Burke i wsp. zamknęli rany macicy szwami, które, choć bardziej wierne wydarzeniom podczas cesarskiego cięcia, wprowadzają dodatkową zmienność w procesie gojenia, a także potencjalne skutki dla ciał obcych 31,32,33,34,35,36. W podobnych badaniach na szczurach wykorzystano drogi brzuszne w celu wygenerowania ran macicy o pełnej grubości37,38 lub39 nacięć, które są zamykane za pomocą szwów 37,38,39 zarówno u kobiet niebędących w ciąży38,39, jak i w ciąży37 zwierzęta. W związku z tym przedstawiony tutaj protokół jest szczególnie odpowiedni dla badaczy zainteresowanych łatwym i powtarzalnym podejściem, które wymaga minimalnego doświadczenia chirurgicznego, odnosi się do zdarzeń związanych z implantacją zarodka i łożyskiem po urazie macicy o pełnej grubości i można go łatwo dostosować do szerokiej gamy pytań, w tym podobnych do D&C urazów endometrium27,28.

Krok 1 tego protokołu określa kroki przedoperacyjne. Krok 2 opisuje procedurę chirurgiczną mającą na celu wywołanie uszkodzenia rogu macicy. Wreszcie, Krok 3 szczegółowo opisuje sekcję ciężarnej matki w celu zbadania wpływu operacji macicy na kolejną ciążę. Podsumowując, badanie to przedstawia unikalny model chirurgiczny gojenia się ran macicy u gryzoni i związanych z tym wyników ciąży, który jest szybki do wykonania i łatwy do przyjęcia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury przedstawione w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis (Protokół IACUC #23985). Procedury opisane w tym protokole są zwykle wykonywane na samicach C3H w wieku 7-10 tygodni i wadze 19-25 g, chociaż protokół ten jest odpowiedni dla samic myszy wszystkich szczepów, wieku i wagi, w zależności od pytania badacza. Monitoruj zwierzęta przed operacją, aby upewnić się, że do badań wykorzystywane są tylko zdrowe zwierzęta bez oznak urazu lub stresu. Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie pola operacyjnego

  1. Przed dniem operacji umieść wszystkie narzędzia chirurgiczne (cienkie kleszcze (#5 lub #55), uchwyt na igłę, zakrzywione nożyczki do tęczówki i aplikator do przycinania skóry (załadowany klipsami)) w woreczkach sterylizacyjnych i autoklawie.
  2. W przypadku stosowania środka znieczulającego do wstrzykiwań, należy przygotować robocze rozcieńczenie 10 mg/ml ketaminy i 1 mg/ml ksylazyny w 0,9% roztworze soli fizjologicznej chlorku sodu.
    UWAGA: Alternatywnie, izofluran podawany przez noznos jest dopuszczalną formą znieczulenia40.
  3. Bezpośrednio przed zabiegiem należy założyć środki ochrony osobistej (PPE): fartuch laboratoryjny, chirurgiczną czepkę do włosów, chirurgiczną maskę na twarz i rękawiczki.
  4. Przygotuj obszar przedoperacyjny.
    UWAGA: Może składać się z jednej chłonnej podkładki wyłożonej ręcznikami papierowymi oraz klatki, w której zwierzę może odpocząć po otrzymaniu znieczulenia przed operacją. Wyłóż klatkę dla zwierząt ręcznikami papierowymi i umieść ją obok podkładki na ławkę przed operacją.
  5. Zważyć zwierzę przeznaczone do operacji w wytarowanej plastikowej zlewce lub podobnym pojemniku na wadze (ryc. 1A). Zapisz wagę, aby obliczyć odpowiednie ilości środka znieczulającego, przeciwbólowego i soli fizjologicznej.
  6. Podaj zwierzęciu znieczulenie iniekcyjne, wykonując następujące czynności:
    1. Napełnić strzykawkę insulinową odpowiednią objętością roboczego rozcieńczenia ketaminy/ksylazyny (patrz krok 1.1), aby uzyskać dawkę 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny (Rysunek 1B).
      UWAGA: Na przykład zwierzę ważące 22 g wymagałoby 0,22 ml 10 mg/ml ketaminy i 1 mg/ml ksylazynowego roztworu znieczulającego.
    2. Odpowiednią dawkę ketaminy/ksylazyny wstrzyknąć dootrzewnowo (I.P.) po bezpiecznym otarciu i odwróceniu zwierzęcia do pozycji leżącejna plecach 41 (Rysunek 1C).
      UWAGA: W razie potrzeby można zastosować osłonę przeciwzadrapaniową.
  7. Monitoruj zwierzę przez około 3 minuty. Wstrzyknąć dodatkowe 0,02 ml roztworu ketaminy/ksylazyny I.P.41 , jeśli w tym oknie czasowym zaobserwowany jest ruch.
  8. Sprawdź, czy sedacja jest odpowiednia, wykonując szczypanie przedniego palca u nogi ~10 min po podaniu znieczulenia40,42.
    UWAGA: Zwierzęta zazwyczaj osiągają chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia w ciągu 10-15 minut. Myszy C3H zazwyczaj wymagają ~ 20% więcej środka znieczulającego niż zwierzęta C57BL/6 lub BALB/c (np. 0,24 ml roztworu ketaminy/ksylazyny na zwierzę o wadze 20 g). Może być konieczne empiryczne określenie dawkowania na podstawie każdego szczepu.
  9. Po ustaniu ruchu, podskórnie (S.C.) wstrzyknąć zwierzęciu41 0,5 mg/kg buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu (ryc. 1D).
    UWAGA: Biorąc pod uwagę małą objętość i lepki charakter buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu, zaleca się wstrzykiwanie jej w pobliżu łopatki, jednocześnie napinając skórę drugą ręką.
  10. Aby chronić oczy zwierzęcia, nałóż maść okulistyczną za pomocą sterylnego bawełnianego wacika (ryc. 2A).
  11. Znieczulone zwierzę należy umieścić na przedoperacyjnym podkładzie chłonnym wyłożonym ręcznikami papierowymi.
  12. Ostrożnie ogolić miejsce nacięcia w dolnej i środkowej części pleców za pomocą trymera do futra (Rysunek 2B). Usuń nadmiar sierści za pomocą ręczników papierowych, a następnie wałka do kłaczków (Rysunek 2C).1.12
    UWAGA: Krem do depilacji można nakładać za pomocą sterylnego wacika w celu całkowitego usunięcia sierści.
  13. Zdezynfekuj miejsce nacięcia za pomocą wacików nasączonych alkoholem i wacików powidonowo-jodowych w następujący sposób:
    1. Zaczynając od środka zamierzonego miejsca nacięcia, wytrzyj na zewnątrz wacikiem nasączonym alkoholem okrężnymi ruchami (Rysunek 2D).
    2. Następnie przetrzyj miejsce nacięcia wacikiem jodowo-powidonowym w podobny sposób (ryc. 2E).
    3. Na przemian z wacikami do przygotowywania świeżego alkoholu i wacikami z widonem i jodem, w sumie 3 rundy.
  14. Przygotować obszar operacyjny w następujący sposób (patrz rysunek 3A):
    1. Umieść drugi wkład chłonny pod oświetlaczem, a następnie sterylną serwetę chirurgiczną na wkładce chłonnej.
    2. Zdezynfekuj iluminator 70% etanolem. Zmień rękawice na sterylne przed kontaktem ze wysterylizowanymi narzędziami i wykonaniem nacięcia.
    3. Umieść sterylne narzędzia chirurgiczne na krawędziach serwety chirurgicznej i umieść zwierzę na środku pola operacyjnego.
  15. Stwórz sterylne pole, umieszczając sterylną serwetę (np. Glad Press 'n Seal) nad zwierzęciem, pozostawiając odsłonięty tylko pysk (ryc. 3B).
    UWAGA: Podczas użytkowania czyste narzędzia chirurgiczne można umieszczać na sterylnych powierzchniach, takich jak sterylna serweta w obrębie obszaru operacyjnego.
  16. Wytnij mały kwadrat nad ogolonym obszarem, przygotowując się do wykonania nacięcia w tym miejscu (ryc. 3C,D). Patrz UWAGA dla kroku 2.1 (poniżej), aby zapoznać się z konkretną lokalizacją miejsca nacięcia.

2. Chirurgiczna indukcja uszkodzenia macicy

UWAGA: W tej sekcji opisano operację i procedurę wprowadzania urazu do pojedynczego rogu macicy samicy myszy, która nie jest w ciąży. Najpierw wykonuje się laparotomię grzbietową w celu odsłonięcia górnej części rogu macicy. Następnie do światła macicy wprowadza się zadziorną igłę o wadze 25 G, aby uszkodzić błonę śluzową macicy i, w razie potrzeby, przeciąć mięśniówkę macicy. W ten sposób powstaje podłużna rana w uszkodzonym rogu macicy, co umożliwia dalsze eksperymenty w celu odpowiedzi na takie pytania, jak gojenie się macicy i jak uraz wpływa na późniejszą ciążę. Ważne jest, aby zwierzę zostało odpowiednio uspokojone przed wykonaniem zabiegu. Jak opisano w kroku 1, kilka parametrów wskazuje, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone. Należą do nich ustanie ruchu, zmniejszenie częstości oddechów i brak odruchu kończyn przednich. Ponadto odruch kończyn tylnych przy lekkim dotyku powinien być nieobecny, chociaż odruch ten czasami pozostaje obecny pomimo odpowiedniego znieczulenia, jeśli zostanie przyłożony wystarczający nacisk40,42.

  1. Wytnij 2-3 mm nacięcie w skórze grzbietowej myszy za pomocą nożyczek (prostych lub zakrzywionych nożyczek tęczówki), przytrzymując skórę cienkimi kleszczami (#5 lub #55).
    UWAGA: Odetnij ~1/3 odległości między podstawą ogona a szyją i ~0,5 cm od linii środkowej. Zobacz rysunek 4A.
  2. Wyciąć 2-3 mm nacięcie w powięzi bezpośrednio nakładające się na poduszeczkę tłuszczową jajnika (ryc. 4B).
  3. Delikatnie chwyć poduszeczkę tłuszczową jajnika za pomocą kleszczy i wyjmij ją z nacięć w powięzi i skórze (ryc. 4C).
    UWAGA: Może być konieczne przecięcie części poduszeczki tłuszczowej, aby można było usunąć jajnik i macicę z jamy ciała. Unikaj uszkodzenia jakiejkolwiek części samego żeńskiego układu rozrodczego, a także śledziony i wszelkich dużych naczyń krwionośnych w pobliżu poduszeczki tłuszczowej.
  4. Po odsłonięciu górnej jednej trzeciej macicy wykonaj następujące czynności (ryc. 4D):
    1. Delikatnie zabezpiecz podwiązanie macicy za pomocą kleszczyków (ryc. 5A,B).
    2. Użyj ostrego końca zadziornej igły, aby utworzyć mały otwór w górnej części macicy (ryc. 5A,B).
    3. Ostrożnie włóż igłę i zacznij zeskrobywać powierzchnię antymesometrialną rogu macicy (ryc. 5C).
    4. Kontynuuj skrobanie, aż zostanie osiągnięta całkowita perforacja zarówno warstwy endometrium, jak i mięśniówki macicy (ryc. 5D).
      UWAGA: Nadmierny nacisk za pomocą kleszczy i/lub wkłucia igły może rozerwać macicę przy podwiązaniu macicy, co powoduje oddzielenie rogu macicy od jajowodu i jajnika. Jeśli trudno jest wykonać otwór wejściowy do macicy za pomocą igły z zadziorami bez uszkodzenia podwiązania macicy, alternatywą może być użycie niezadziorowanej igły 25 G lub 27 G. Zadziorowaną igłę można następnie włożyć do tego otworu, aby wygenerować nacięcie, jak opisano powyżej. W opisanym tutaj podejściu w rogu macicy wprowadza się nacięcia o pełnej grubości. Jeśli jednak pożądane jest mniej rozległe uszkodzenie macicy, igła z zadziorami 25 G może być użyta do zeskrobania tylko najbardziej wewnętrznych warstw macicy, takich jak endometrium. Ponadto procedura ta nie wykorzystuje szwów do zamykania macicy, aby uniknąć wprowadzania reakcji ciała obcego jako dodatkowej zmiennej; Jednak szycie macicy jest akceptowalną alternatywą dla tej procedury.
  5. Delikatnie przywróć uszkodzony róg macicy do jamy ciała za pomocą kleszczy (ryc. 6A,B).
  6. Zszyj43 powięź zamknij szwem w rozmiarze 4-0 i usuń nadmiar szwu (ryc. 6C-E).
    UWAGA: Pojedynczy szew jest zazwyczaj wystarczający do zamknięcia nacięcia w powięzi.
  7. Zamknij nacięcie skóry klipsami za pomocą aplikatora do klipsów do skóry (Rysunek 6F).
    UWAGA: Do zamknięcia nacięcia niezbędny jest jeden lub dwa klipsy.
  8. Wstrzyknąćpodskórnie 41 10 mg/kg karprofenu jako środek przeciwbólowy i 0,5 ml soli fizjologicznej (0,9% NaCl) do pooperacyjnej opieki podtrzymującej. Zobacz rysunek 7A.
  9. Użyj dziurkacza do uszu lub numerowanych metalowych kolczyków, aby zidentyfikować zwierzę44.
  10. Umieść zwierzę w ogrzewanej klatce w celu rekonwalescencji pooperacyjnej (ryc. 7B).
    UWAGA: Gdy zwierzę będzie w stanie podnieść głowę, umieść je z powrotem w zwykłej klatce z pościelą. Zobacz krok 2.12 poniżej.
  11. Jeśli wykonujesz dodatkowe operacje przy użyciu tych samych narzędzi chirurgicznych, wykonaj następujące czynności:
    1. Najpierw wyczyść 70% etanolem i ręcznikami papierowymi.
    2. Następnie ponownie wysterylizuj narzędzia, umieszczając je w suchym sterylizatorze szklanym na 30 sekund.
    3. Przed dalszym użyciem poczekaj, aż narzędzia ostygną do temperatury pokojowej.
  12. Zwrócić zwierzę (zwierzęta) do umieszczenia w obiekcie dla zwierząt po wznowieniu przemieszczania, ~ 1-2 godziny po rekonwalescencji po operacji, jeśli zastosowano ketaminę/ksylazynę lub ~ 5 minut po znieczuleniu izofluranem.
  13. Należy codziennie monitorować zwierzę (zwierzęta) pod kątem objawów bólu i niepokoju oraz w razie potrzeby wstrzykiwać 10 mg/kg karprofenu przez okres do 3 dni po operacji.
    UWAGA: Skala grymasu45 i ocena kondycji ciała46 są standardowymi weterynaryjnymi ocenami dobrostanu zwierząt.

3. Krycie i sekcja ciężarnych myszy w celu oceny konsekwencji uszkodzenia macicy

UWAGA: W zależności od konkretnego pytania badawczego można przeprowadzić różne analizy punktów końcowych po urazie macicy. Na przykład zwierzęta, które nie są w ciąży, mogą być poddawane sekcji w różnych punktach czasowych po urazie w celu zbadania kinetyki gojenia się ran27. Ponadto zranione zwierzęta mogą zostać zapłodnione poprzez naturalne krycie lub transfer zarodków w celu zbadania wpływu urazu na kolejne ciąże27. Ten Krok opisuje ocenę rozwoju embrionalnego i łożyskowego w uszkodzonym środowisku macicy. W szczególności krok ten zawiera szczegółowe informacje na temat ustalania krycia w określonym czasie i sekcji zwierząt w 12,5 dniu ciąży w embrionalnym dniu ciąży (E12,5, z porannym czopem dopochwowym zdefiniowanym jako E0,5; więcej informacji na temat identyfikacji czopów dopochwowych w kroku 3.2 poniżej). Ogólnie rzecz biorąc, krok 3 stanowi przykład dalszych analiz, które można przeprowadzić po urazie w celu zbadania określonego zestawu pytań eksperymentalnych.

  1. Po rekonwalescencji pooperacyjnej należy przeprowadzić krycia czasowe47 poprzez wspólne trzymanie rannej samicy z reproduktorem w wieku 11 tygodni lub starszym.
    UWAGA: Czas rekonwalescencji po urazie zostanie określony przez konkretne pytanie badawcze. Badania z wykorzystaniem tego protokołu zazwyczaj pozwalają na 30 dni rekonwalescencji (z testowanym zakresem 5-105 dni) przed rozpoczęciem krycia w czasie. Kojarzenie trio lub harem obniża koszty utrzymania i zwiększa efektywność tego eksperymentalnego podejścia. Należy jednak pamiętać, że takie konfiguracje krycia wymagają zatwierdzenia instytucjonalnego i są przeznaczone wyłącznie do celów sekcji w czasie ciąży; Żywe urodzenia z krzyżowania trio lub haremu powodują stres u zwierząt i nie są ogólnie zalecane ani dozwolone.
  2. Wykonuj kontrole zatyczki dopochwowej każdego ranka, aż zostanie zidentyfikowany czop (patrz ryc. 8), w którym to momencie samica może być trzymana oddzielnie od samca ćwieka.
    UWAGA: Zatyczki pojawią się jako biała masa w kanale pochwy (ryc. 8A) lub jako wybrzuszenie całego obszaru pochwy. Jeśli na zewnątrz nie widać śladu zatyczki, sondę naprowadzającą można powoli wprowadzić do kanału pochwy (ryc. 8C,D). Jakikolwiek opór przed pełnym włożeniem końcówki aż do zagięcia w głowicy naprowadzającej sondy wskazuje na zatyczkę. Kontrole wtyczek należy przeprowadzać o ~7 rano lub tak wcześnie, jak to możliwe rano, ponieważ wtyczki wypadają w ciągu dnia. Aby uzyskać więcej informacji na temat sprawdzania zatyczek dopochwowych, patrz Behringer i wsp.48. W celu dodatkowego i bardziej wiarygodnego potwierdzenia ciąży można zastosować ultrasonografię o wysokiej częstotliwości49,50. Jeśli ultradźwięki są niedostępne lub niepożądane, wykazano, że przyrost masy ciała pozwala przewidzieć ciążę z rozsądną dokładnością przez E7.7551.
  3. Zwierzę należy złożyć w ofierze (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami) w pożądanym wieku ciążowym. Zobacz NOTATKĘ poniżej, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tego, jak przeprowadzić eutanazję zwierząt i jak wybrać wiek ciążowy do sekcji.
    UWAGA: Data wtyczki jest oznaczona jako E0.5. Wybierz wiek ciążowy w momencie składania ofiary na podstawie pytania eksperymentalnego, na które odpowiadasz. Na przykład E4.5-E5.5 jest odpowiedni do badania biologii okołoimplantacyjnej. E11.5-E14.5 jest wskazany do badania wad łożyska w połowie ciąży, w tym obecności zrośniętych łożysk. Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi eutanazji zwierząt. Dopuszczalną procedurą jest 8-minutowy okres inkubacjiCO2 , po którym następuje 2-minutowy okres oczekiwania i obserwacji, a na końcu wtórne potwierdzenie eutanazji poprzez zwichnięcie szyjki macicy.
  4. Po eutanazji przygotuj się do sekcji w następujący sposób (patrz ryc. 9A):
    1. Umieść zwierzę w pozycji leżącej na powierzchni sekcyjnej.
    2. Zaopatrz się w niezbędne narzędzia preparacyjne (kleszcze, nożyczki) wraz z szalkami Petriego wypełnionymi 1× PBS.
    3. Aby zapobiec przywieraniu luźnych pasm futra do miejsca sekcji, przed rozcięciem należy najpierw zwilżyć sierść na brzuchu 70% etanolem, wodą lub 1× PBS.
  5. Wykonaj nacięcie w dolnej części brzucha, przytrzymując skórę brzucha kleszczami i przecinając nożyczkami kształt litery V wzdłuż brzucha, aż dojdziesz do dna klatki piersiowej (~ 2 cm nacięcie na każde pociągnięcie litery "V"). Patrz rysunek 9B-D.
  6. Wykonaj nacięcie w kształcie litery V w leżącej poniżej ścianie mięśnia brzucha (nacięcie ~2 cm na każde pociągnięcie litery "V"), trzymając je kleszczami i tnąc w kształcie litery V, aż jama brzuszna będzie widoczna. Patrz rysunek 9E,F.
  7. Odsłoń macicę, delikatnie odsuwając na bok jelita i inną zawartość jamy brzusznej. Wyciągnij macicę zawierającą zarodki z jamy brzusznej i umieść ją w polu widzenia. Zobacz rysunek 9G.
  8. Usuń macicę wraz z zamkniętymi zarodkami z jamy brzusznej. Umieść macicę na szalce Petriego wypełnionej 1× PBS. Zobacz rysunek 9H.
    UWAGA: Użyj kleszczy, aby najpierw chwycić poduszeczkę tłuszczową jajnika. Następnie użyj nożyczek, aby oddzielić macicę od reszty jamy ciała, najpierw przecinając tłuszcz jajnikowy, następnie tętnice mesometrialne, pochwę, tętnice mesometrialne wzdłuż drugiego rogu macicy, a na końcu drugą poduszeczkę tłuszczową jajnika. W razie potrzeby można przeprowadzić dalszą sekcję w celu uzyskania pożądanej dalszej analizy, takiej jak mikroskopia lub histologia. Na rysunku 10 przedstawiono przykładowe dane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po zabiegu chirurgicznym z zastosowaniem ketaminy/ksylazyny jako środka znieczulającego, zwierzęta zazwyczaj odzyskują częściową sprawność ruchową w ciągu ~1 h, a pełną sprawność w ciągu ~4-6 h. Wybudzanie z znieczulenia izofluranem następuje zazwyczaj w ciągu kilku minut. Wszelkie powikłania, które mogą wystąpić, takie jak rozszerzenie rany lub ból, są zazwyczaj widoczne w ciągu 1-3 dni po operacji. Należy przeprowadzać codzienne kontrole dobrostanu w celu monitorowania bólu lub powikłań, aż do czasu zagojenia się nacię...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Cesarskie cięcie stanowi ~33% porodów w USA i do 55%-65% porodów w krajach takich jak Brazylia i Egipt12,52, a jednak niewiele wiadomo o tym, jak macica goi się po urazie lub jak te urazy wpływają na kolejne ciąże. Chociaż wcześniejsze cesarskie cięcie jest głównym czynnikiem ryzyka zaburzeń ciąży, takich jak spektrum przylegania łożyska (PAS) i łożysko przodujące, mechanizmy, w wyniku których one powstają, są niejasne 3,6,14,17...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy UC Davis Teaching and Research Animal Care Services (TRACS) za ich ciągłe wsparcie hodowlane, proceduralne i logistyczne. Dziękujemy Animal Model Core UC Davis Cardiovascular Research Institute (CVRI) i głównemu dyrektorowi dr Yi-Je (Jay) Chen, D.V.M., Ph.D. za wskazówki techniczne i wsparcie, a także korzystanie z sali operacyjnej podczas filmowania. Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Zhang za ich wsparcie dla tej pracy. Rysunek 5A został utworzony za pomocą BioRender.com (https://BioRender.com/ig9sfon).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% NaCl do wstrzykiwań, sterylneFresenius Kabi63323-186-10
25 G x 5/8 cala BD PrecisionGlide&handel; IgłaBD305122
70% etanoluFisher NaukowyBP82031GAL
Wchłanialny szew vicryl 4-0EtykaZobacz materiał J214
Klatki dla zwierzątFirma VWR10712-110 oraz 10715-323Dopuszczalne są klatki dostarczone przez zakład dla zwierząt badacza
Zwierzęcy kolczyk w uchoFisher Naukowy13-812-201
System zamykania ran AutoClipNarzędzia naukowe12020-00
Strzykawka insulinowa U-100Fisher Naukowy14-826-79Marka BD
Waciki BetadineLinia medlineMDS093901
Buprenorfina o przedłużonym uwalnianiu, 1,3 mg/ml (Ethiqa XR)Fidelis Pharmaceuticals099114Dopuszczalne są alternatywne buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu lub chlorowodorku buprenorfiny
Karprofen (RIMADYL) 50 mg/ml Urządzenie ZoetisFELGA-00284R1
Zakrzywione nożyczki do tęczówkiŚwiatowe instrumenty precyzyjne501759G
Sterylizator narzędzi chirurgicznych z suchymi szklanymi kulkamiVWR MIĘDZYNARODOWA75999-324
Wkład do suchych kulek szklanychVWR MIĘDZYNARODOWA75999-332
Samice myszy, zwykle w wieku od 8 do 12 tygodni, np. szczep C3HRzeka Karola025
Cienkie nożyczki - zakrzywione 10,5 cmNarzędzia naukowe14370-23
Trymer do futraFisher Naukowy50-195-4544
Zadowolona prasa ' n PieczęćFisher NaukowyNC1089054
Rękawice nitryloweFisher Naukowy19-130-1597C
H2O, sterylnie destylowanyNarzędzia naukowe15230170
Oświetlacz do operacjiAmScopeHL150-AY
Ketamina, 100 mg/ml (zetamina)Dechra (Głuch)501072
Fartuch laboratoryjnyUline powiedział:S-15376W-50
Mikroskop świetlnyFisher NaukowyZobacz materiał S13039
Wałek do kłaczkówFisher Naukowy17-018-329
Krem do depilacji NairCel049-06-3304
Uchwyt na igłęNarzędzia naukowe12500-12
Ręczniki papieroweScott1804
szalka PetriegoFisher Naukowy08-757-100
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Naukowy10010023
Plastikowa zlewkaThermo Fisher Naukowy12010250
Głowica nasadcza z wygiętym końcemFisher Naukowy08-995
Marka rybaków&handel; Woreczki do sterylizacji z natychmiastowym uszczelnieniem 9 cm (szer.) x 13,3 cm (wys.)Fisher Naukowy181250
Marka rybaków&handel; Woreczki do sterylizacji z natychmiastowym uszczelnieniem 9 cm (szer.) x 23 cm (wys.)Fisher Naukowy181251
Kleszcze, w porządku, #5Narzędzia naukowe11254-20
Kleszcze, w porządku, #55 Narzędzia naukowe11295-51
SkalaFisher NaukowyNumer katalogowy S93805 powiedział:
Nożyczki chirurgiczneNarzędzia naukowe14060-09
Butelka z rozpylaczemFisher NaukowyS413505P
Sterylne waciki nasączone alkoholemFisher Naukowy22-363-750
Sterylna okulistyczna maść weterynaryjnaPuralube (Purałub)PH-PURALUBE-VET
Sterylne waciki do aplikacji maści do oczuFisher Naukowy18-366-472
Woreczki do sterylizacjiFisher Naukowy19-910-673
Serweta chirurgicznaFisher Naukowy50-209-1792
Chirurgiczny czepek do włosówUline powiedział:S-10480BLU
Maski chirurgiczneFisher Naukowy18-048-010
Thomas Scientific Chłonny podkład pod ławkę, podkładki pod ławki, 16,5 x 23 cale / 42 x 58 cmFisher NaukowyNC1588452
Komora grzewcza/indukcyjna z pełnym ociepleniem podłogiFisher Naukowy14-370-302
Wkłady do klipsów do ranNarzędzia naukowe12022-09
100 mg / ml ksylazynyDechra (Głuch)Rompun 100 mg/ml ksylazyna

Bibliografia

  1. Bowman, Z. S., et al. Risk factors for placenta accreta: A large prospective cohort. Am J Perinatol. 31 (9), 799-804 (2014).
  2. Miller, D. A., Chollet, J. A., Goodwin, T. M. Clinical risk factors for placenta previa-placenta accreta. Am J Obstet Gynecol. 177 (1), 210-214 (1997).
  3. Solheim, K. N., et al. The effect of cesarean delivery rates on the future incidence of placenta previa, placenta accreta, and maternal mortality. J Matern Fetal Neonatal Med. 24 (11), 1341-1346 (2011).
  4. Biswas, R., Sawhney, H., Dass, R., Saran, R. K., Vasishta, K. Histopathological study of placental bed biopsy in placenta previa. Acta Obstet Gynecol Scand. 78 (3), 173-179 (1999).
  5. Cramer, S. F., Heller, D. s Placenta accreta and placenta increta: An approach to pathogenesis based on the trophoblastic differentiation pathway. Pediatr Dev Pathol. 19 (4), 320-333 (2016).
  6. Khong, T. Y., Robertson, W. B. Placenta creta and placenta praevia creta. Placenta. 8 (4), 399-409 (1987).
  7. Khong, T. Y., Cramer, S. F., Heller, D. S. Chorion laeve accreta - Another manifestation of morbid adherence. Placenta. 74, 32-35 (2018).
  8. Silver, R. M., Barbour, K. D. Placenta accreta spectrum: Accreta, increta, and percreta. Obstet Gynecol Clin North Am. 42 (2), 381-402 (2015).
  9. Stanek, J., Drummond, Z. Occult placenta accreta: The missing link in the diagnosis of abnormal placentation. Pediatr Dev Pathol. 10 (4), 266-273 (2007).
  10. Tantbirojn, P., Crum, C. P., Parast, M. M. Pathophysiology of placenta creta: The role of decidua and extravillous trophoblast. Placenta. 29 (7), 639-645 (2008).
  11. Zhang, E. T., et al. PRG2 and AQPEP are misexpressed in fetal membranes in placenta previa and percretadagger. Biol Reprod. 105 (1), 244-257 (2021).
  12. Wortman, A. C., Alexander, J. M. Placenta accreta, increta, and percreta. Obstet Gynecol Clin North Am. 40 (1), 137-154 (2013).
  13. Wu, S., Kocherginsky, M., Hibbard, J. U. Abnormal placentation: Twenty-year analysis. Am J Obstet Gynecol. 192 (5), 1458-1461 (2005).
  14. Chazotte, C., Cohen, W. R. Catastrophic complications of previous cesarean section. Am J Obstet Gynecol. 163 (3), 738-742 (1990).
  15. Jurkovic, D., et al. First-trimester diagnosis and management of pregnancies implanted into the lower uterine segment cesarean section scar. Ultrasound Obstet Gynecol. 21 (3), 220-227 (2003).
  16. Fitzpatrick, K. E., et al. Incidence and risk factors for placenta accreta/increta/percreta in the UK: A national case-control study. PLoS One. 7 (12), e52893(2012).
  17. Jauniaux, E., Gronbeck, L., Bunce, C., Langhoff-Roos, J., Collins, S. L. Epidemiology of placenta previa accreta: A systematic review and meta-analysis. BMJ Open. 9 (11), e031193(2019).
  18. Silva, B., Viana Pinto, P., Costa, M. A. Cesarean scar pregnancy: A systematic review on expectant management. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 288, 36-43 (2023).
  19. Kaelin Agten, A., et al. First-trimester cesarean scar pregnancy: A comparative analysis of treatment options from the international registry. Am J Obstet Gynecol. 230 (6), 669.e1-669.e9 (2024).
  20. Gilman, A. R., Dewar, K. M., Rhone, S. A., Fluker, M. R. Intrauterine adhesions following miscarriage: Look and learn. J Obstet Gynaecol Can. 38 (5), 453-457 (2016).
  21. Smikle, C., Yarrarapu, S. N. S., Khetarpal, S. Statpearls. , Treasure Island (FL). (2024).
  22. Dreisler, E., Kjer, J. J. Asherman's syndrome: Current perspectives on diagnosis and management. Int J Womens Health. 11, 191-198 (2019).
  23. Hanuman, S., Pande, G., Nune, M. Current status and challenges in uterine myometrial tissue engineering. Bioengineered. 14 (1), 2251847(2023).
  24. Hanuman, S., B, H. K., Pai, K. S. R., Nune, M. Surface-conjugated galactose on electrospun polycaprolactone nanofibers: An innovative scaffold for uterine tissue engineering. ACS Omega. 9 (32), 34314-34328 (2024).
  25. Buhimschi, C. S., Zhao, G., Sora, N., Madri, J. A., Buhimschi, I. A. Myometrial wound healing post-cesarean delivery in the MRL/MPJ mouse model of uterine scarring. Am J Pathol. 177 (1), 197-207 (2010).
  26. Cowell, T. P. Implantation and development of mouse eggs transferred to the uteri of non-progestational mice. J Reprod Fertil. 19 (2), 239-245 (1969).
  27. Zhang, E. T., et al. Uterine injury during diestrus leads to placental and embryonic defects in future pregnancies in mice. Biol Reprod. , (2024).
  28. Zhang, E. T. Mouse surgical model of mechanical uterine injury and subsequent embryo defects. Curr Protoc. 4 (4), e1044(2024).
  29. Freedman, M. F., Schlaff, W. D. Avoiding Asherman's syndrome: Refining our approach to uterine evacuation. Fertil Steril. 116 (4), 961-962 (2021).
  30. Jensen, P. A., Stromme, W. B. Amenorrhea secondary to puerperal curettage (Asherman's syndrome). Am J Obstet Gynecol. 113 (2), 150-157 (1972).
  31. Li, Z., et al. Uterine scarring leads to adverse pregnant consequences by impairing the endometrium response to steroids. Endocrinology. 161 (11), bqaa174(2020).
  32. Burke, S. D., Zsengeller, Z. K., Karumanchi, S. A., Shainker, S. A. A mouse model of placenta accreta spectrum. Placenta. 99, 8-15 (2020).
  33. Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
  34. Carnicer-Lombarte, A., Chen, S. T., Malliaras, G. G., Barone, D. G. Foreign body reaction to implanted biomaterials and its impact in nerve neuroprosthetics. Front Bioeng Biotechnol. 9, 622524(2021).
  35. Klopfleisch, R., Jung, F. The pathology of the foreign body reaction against biomaterials. J Biomed Mater Res A. 105 (3), 927-940 (2017).
  36. Itoga, R., et al. Delayed onset of infectious foreign body granuloma for nonabsorbable sutures after open Achilles tendon repair: A case report. J Foot Ankle Surg. 60 (6), 1297-1300 (2021).
  37. Bowers, D., Mckenzie, D., Dutta, D., Wheeless, C. R., Cohen, W. R. Growth hormone treatment after cesarean delivery in rats increases the strength of the uterine scar. Am J Obstet Gynecol. 185 (3), 614-617 (2001).
  38. Kuramoto, G., et al. Human mesenchymal stem cell sheets improve uterine incision repair in a rodent hysterotomy model. Am J Perinatol. 39 (11), 1212-1222 (2022).
  39. Lin, N., et al. The effect of collagen-binding vascular endothelial growth factor on the remodeling of scarred rat uterus following full-thickness injury. Biomaterials. 33 (6), 1801-1807 (2012).
  40. Oh, S. S., Narver, H. L. Mouse and rat anesthesia and analgesia. Curr Protoc. 4 (2), e995(2024).
  41. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  42. Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. Ilar Journal. 62 (1-2), 238-273 (2021).
  43. Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in aseptic rodent surgery. Curr Protoc Immunol. Chapter 1 (Unit 1), 12-14 (2008).
  44. Stewart, K., Schroeder, V. A. Rodent identification I. J Vis Exp. , e10189(2023).
  45. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  46. Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: A rapid and accurate method for assessing health status in mice. Lab Anim Sci. 49 (3), 319-323 (1999).
  47. Stewart, K., Schroeder, V. A. Fundamentals of breeding and weaning. J Vis Exp. , e10293(2023).
  48. Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Selecting female mice in estrus and checking plugs. Cold Spring Harb Protoc. 2016 (8), prot092387(2016).
  49. Phoon, C. K. L., Ren, M. Is my mouse pregnant? High-frequency ultrasound assessment. J Vis Exp. (169), e61893(2021).
  50. Greco, A., et al. High-frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PLoS One. 8 (10), e77205(2013).
  51. Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (4), 368-371 (2015).
  52. Boerma, T., Ronsmans, C. Global epidemiology of use of and disparities in cesarean sections - Authors' reply. Lancet. 394 (10192), 25(2019).
  53. Alawadhi, F., Du, H., Cakmak, H., Taylor, H. S. Bone marrow-derived stem cell (BMDSC) transplantation improves fertility in a murine model of Asherman's syndrome. PLoS One. 9 (5), e96662(2014).
  54. Park, M., et al. Perivascular stem cell-derived cyclophilin A improves uterine environment with Asherman's syndrome via hif1alpha-dependent angiogenesis. Mol Ther. 28 (8), 1818-1832 (2020).
  55. Kim, J. H., et al. Intrauterine infusion of human platelet-rich plasma improves endometrial regeneration and pregnancy outcomes in a murine model of Asherman's syndrome. Front Physiol. 11, 105(2020).
  56. Feng, Q., et al. Establishment of an animal model of intrauterine adhesions after surgical abortion and curettage in pregnant rats. Ann Transl Med. 8 (4), 56(2020).
  57. Mansouri-Kivaj, N., et al. Homogenous subpopulation of human mesenchymal stem cells and their extracellular vesicles restore function of endometrium in an experimental rat model of Asherman syndrome. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 61(2023).
  58. Gan, L., et al. Human amniotic mesenchymal stromal cell transplantation improves endometrial regeneration in rodent models of intrauterine adhesions. Cytotherapy. 19 (5), 603-616 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cięcie cesarskieplacenta accretałożysko przodojcowegojenie ran macicyimplantacja zarodkaprocedura chirurgicznabliznowacenie macicy
Mysi model chirurgicznego uszkodzenia macicy i późniejszych wyników ciąży
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.