Izolacja, utrwalenie i charakterystyka młodocianych leukocytów nerkowych dorady za pomocą cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje izolację i utrwalanie leukocytów pobranych z nerki głowy dorady oraz ocenę ich żywotności za pomocą cytometrii przepływowej. Prace te przyczyniają się do standaryzacji protokołów i wykorzystują przetwarzanie większej liczby próbek bez uszczerbku dla jakości próbek, promując postęp w wiedzy na temat immunologii ryb.

Streszczenie

Odporność jest kluczowa dla fizjologicznej regulacji organizmów, służąc jako podstawowa obrona przed patogenami i stresorami środowiskowymi. Izolacja i analiza komórek odpornościowych dostarcza kluczowych informacji na temat odpowiedzi immunologicznych na naciski zewnętrzne. Jednak brak zharmonizowanych protokołów dla mniej badanych gatunków, takich jak ryby morskie, często prowadzi do wyzwań technicznych i analitycznych, które utrudniają interpretację danych i dokładne zrozumienie specyficznych dla danego gatunku odpowiedzi immunologicznych. Badanie to miało na celu opracowanie zoptymalizowanej procedury analitycznej opartej na cytometrii przepływowej w celu scharakteryzowania i określenia żywotności leukocytów z nerki głowy (głównego narządu krwiotwórczego u ryb teleostowych) młododoła (Sparus aurata). Procedura rozpoczęła się od izolacji leukocytów w procesie homogenizacji przy użyciu zbilansowanego roztworu soli Hanksa, a następnie zoptymalizowanej metody wirowania w gradiencie gęstości Percoll w celu zapewnienia wysokich wskaźników odzysku leukocytów przy minimalnym zanieczyszczeniu erytrocytów wymaganym do wydajnej późniejszej analizy cytometrii przepływowej. Ponadto zastosowano nowatorską technikę wykorzystującą barwnik reagujący z komórkami (LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit) w celu odróżnienia komórek żywych od martwych na podstawie ich fluorescencyjnych wzorów barwienia. Utrwalenie osiągnięto przy użyciu 3,7% formaldehydu, zachowując morfologię komórek, żywotność i skuteczność barwienia. Analiza cytometrii przepływowej z powodzeniem zidentyfikowała trzy dominujące populacje leukocytów: limfocyty, monocyty i granulocyty. Metoda ta pozwoliła nie tylko na przeprowadzenie testów żywotności, ale także na dokładne różnicowanie typów komórek. Ulepszenie protokołów cytometrii przepływowej stanowi krok naprzód w immunologii ryb poprzez zwiększenie dokładności i wydajności analizy komórek odpornościowych. Ponadto, umożliwiając utrwalanie komórek do późniejszej analizy, protokół ten znacznie skraca czas i wysiłek wymagany do oceny odporności, co czyni go cennym narzędziem zarówno do badań, jak i praktycznych zastosowań w różnych dziedzinach badań.

Wprowadzenie

Odporność odgrywa kluczową rolę w fizjologicznej regulacji organizmów, działając jako podstawowa obrona przed szerokim zakresem patogenów i stresorów środowiskowych¹. Podobnie jak inne kręgowce, ryby mają złożony, dynamiczny i skoordynowany układ odpornościowy niezbędny dla ich ogólnego stanu zdrowia i dobrego samopoczucia¹.

Ryby teleost posiadają zarówno wrodzony, jak i adaptacyjny układ odpornościowy, który działa jednocześnie w celu wykrywania, reagowania i neutralizowania szkodliwych najeźdźców². Wrodzony układ odpornościowy działa jako pierwsza linia obrony, zapewniając natychmiastowe i niespecyficzne odpowiedzi na patogeny², podczas gdy adaptacyjny układ odpornościowy rozwija się z czasem, oferując bardziej wyspecjalizowaną odpowiedź, która umożliwia rybom rozpoznawanie określonych patogenów i ustanowienie pamięci immunologicznej³. Układ odpornościowy ryb opiera się na wyspecjalizowanych pierwotnych narządach limfatycznych (tj. grasicy i nerce głowy) oraz wtórnych narządach limfatycznych (np. śledzionie i tkankach limfatycznych związanych z błoną śluzową (MALT)) w celu wspierania obrony immunologicznej i utrzymania ogólnego stanu zdrowia⁴. Nerka głowy jest głównym narządem krwiotwórczym u ryb teleost i odgrywa kluczową rolę w rozwoju i dojrzewaniu komórek odpornościowych, w tym leukocytów⁵.

W ostatnich latach poczyniono znaczne postępy w badaniu odpowiedzi immunologicznych kilku gatunków ryb². Jednym z kluczowych obszarów zainteresowania było zrozumienie populacji leukocytów i ich aktywności. Leukocyty, znane również jako białe krwinki, są ogólnie klasyfikowane jako monocyty, limfocyty i granulocyty i odgrywają kluczową rolę w obronie immunologicznej ryb. Mają komórki fagocytarne, które są odpowiedzialne za pochłanianie i niszczenie patogenów oraz uwalniają bakteriobójcze reaktywne formy tlenu, przyczyniając się do eliminacji inwazyjnych mikroorganizmów⁶. Leukocyty są również zaangażowane w proces zapalny, pomagając w izolowaniu i eliminowaniu infekcji, jednocześnie wspomagając naprawę tkanek⁶. Liczebność i aktywność populacji leukocytów są ważnymi wskaźnikami stanu odporności w zdrowiu i chorobie zwierząt^7,8.

Niektóre badania wykazały, że czynniki stresowe, takie jak niekorzystne warunki środowiskowe, mogą zmieniać liczbę i morfologię erytrocytów oraz skład krążących leukocytów^9,10. Na przykład, jak dokonali recenzenci Franke i in. (2024), kluczowe znaczenie ma badanie układu odpornościowego ryb w scenariuszach zmian klimatu, ponieważ stresory środowiskowe mogą zagrozić odporności ryb, zwiększyć podatność na choroby i zwiększyć zakaźność niektórych patogenów, ostatecznie przyspieszając postęp choroby¹¹. Co więcej, zrozumienie odporności ryb ma zasadnicze znaczenie nie tylko dla postępu w podstawowych badaniach biologicznych, ale także dla wspierania różnych sektorów społeczeństwa, takich jak przemysł akwakultury. Wraz z rozwojem akwakultury na całym świecie coraz ważniejsze staje się zapewnienie zdrowia i dobrostanu gatunków ryb hodowlanych. Jednak dobrostan ryb pozostaje stosunkowo nowym obszarem badań, a odpowiedzi immunologiczne ryb hodowlanych nadal wymagają dokładnych i ustandaryzowanych ocen. Priorytetowe traktowanie badań nad odpowiedzią immunologiczną ma ogromne znaczenie, ponieważ uzyskane informacje mogą zwiększyć zrównoważony rozwój i produktywność akwakultury dzięki skutecznym i dostosowanym do potrzeb podejściom, które poprawiają dobrostan i odporność zwierząt gospodarskich.

Kwantyfikacja i identyfikacja leukocytów są zwykle wykonywane przy użyciu metod hematologicznych, takich jak ręczne liczenie za pomocą hemocytometrów Bürkera, Neubauera lub Thoma, a także barwione rozmazy krwi7^,10. Aby pomóc w wizualizacji i różnicowaniu komórek krwi, często stosuje się zestawy do barwienia, takie jak Wright, May-Grünwald-Giemsa i Hemacolor^7,12. Jednak te techniki ręcznego liczenia komórek są żmudne, czasochłonne i podatne na błędy ludzkie^8,10. Częstymi źródłami błędów są nieodpowiednie mieszanie lub rozcieńczanie krwi, problemy z barwieniem i nieprawidłowe ładowanie komory hemocytometru, co może prowadzić do niedokładnej liczby komórek¹². Ponadto ręczna analiza hematologiczna wymaga wysokiego poziomu wiedzy i doświadczenia, aby zapewnić wiarygodność i odtwarzalność wyników⁷. Wraz ze wzrostem zapotrzebowania na precyzyjne i skuteczne narzędzia diagnostyczne, opracowanie innowacyjnych metod, które zapewniają dogłębne zrozumienie stanu odporności populacji ryb, staje się coraz ważniejszym krokiem w rozwoju tej dziedziny.

Cytometria przepływowa stała się potężnym narzędziem w tym kontekście, oferując wysokoprzepustowe, ilościowe podejście do analizy populacji leukocytów i żywotności komórek⁸. Ta nowoczesna technologia diagnostyczna pozwala na szybkie wykrywanie, liczenie i charakteryzowanie pojedynczych komórek w mieszanych populacjach z niezwykłą precyzją¹³. Co więcej, cytometria przepływowa umożliwia jednoczesne pomiary wieloparametryczne zarówno w charakterystyce fenotypowej, jak i funkcjonalnej. Chociaż jest szeroko stosowany w warunkach klinicznych u ludzi i w medycynie weterynaryjnej, jego zastosowanie w badaniu leukocytów ryb pozostaje bardzo ograniczone⁸. Chociaż przeprowadzono pewne badania na różnych gatunkach ryb^1,6,8^{,13,14,15,16,17}, nadal należy stawić czoła kilku krytycznym wyzwaniom. Jednym z głównych wyzwań w tych analizach jest konieczność uzyskania zawiesin żywych leukocytów wyekstrahowanych z krwi obwodowej lub tkanek limfatycznych, takich jak głowa nerki¹. Izolacja leukocytów jest często trudna ze względu na unikalną cechę ryb teleostowych: obecność jądrzastych erytrocytów. Niezamierzone zanieczyszczenie erytrocytami może zakłócać analizę leukocytów ze względu na ich wielkość, jajowaty kształt i obecność jądra¹. Dlatego konieczne jest wyeliminowanie erytrocytów z zawiesin leukocytów w celu uzyskania wysokiej czystości leukocytów oraz zbadania cech fenotypowych i funkcjonalnych leukocytów za pomocą analizy cytometrii przepływowej. U ssaków izolacja leukocytów zazwyczaj obejmuje lizę osmotyczną erytrocytów lub separację gradientu gęstości za pomocą Ficoll lub Percoll¹. Jednak liza osmotyczna jest nieskuteczna zarówno w przypadku ryb morskich, jak i słodkowodnych ze względu na ich jądrzaste erytrocyty, które nie mogą być prawidłowo zrandomizowane¹. Zamiast tego separacja gradientu gęstości jest preferowana dla ryb, ponieważ skutecznie zachowuje stabilność komórek w czasie¹. Chociaż niektóre badania z powodzeniem wyizolowały leukocyty od młodych ryb, wiele badań nadal koncentruje się głównie na populacjach dorosłych¹⁷. Niemniej jednak wczesne stadia życia są nie tylko bardziej podatne na wybuchy choroby, ale także mają mniejsze rozmiary, co sprawia, że proces pobierania próbek jest bardziej złożony i wymagający. Innym ograniczeniem jest to, że obecne metody są często ograniczone do ograniczonej liczby próbek lub powtórzeń jednocześnie, ponieważ ocena żywotności leukocytów wymaga natychmiastowego przetwarzania. Opóźnienia w przetwarzaniu próbek mogą niekorzystnie wpłynąć na żywotność komórek, wprowadzając w ten sposób dalsze komplikacje do procesu pobierania próbek i potencjalnie zagrażając całej pracy.

Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, żadna z opublikowanych metod nie zdołała skutecznie ustalić komórek leukocytów do późniejszej analizy żywotności za pomocą cytometrii przepływowej. Niniejsze badanie jest pionierskie, ponieważ ustanawia skuteczną metodę izolowania leukocytów z nerki głowy młodego dorady (Sparus aurata), głównego gatunku ryb hodowanych w krajach Europy Południowej, przy użyciu metodologii separacji gradientu gęstości Percoll. Przedstawiamy również ulepszoną technikę opartą na barwieniu, która odróżnia żywe komórki od martwych, jednocześnie identyfikując główne populacje leukocytów (limfocyty, monocyty i granulocyty) za pomocą cytometrii przepływowej. Ulepszony protokół wiąże się z utrwaleniem komórek, co umożliwia realną analizę komórek do 1 miesiąca po zabiegu. Wdrożenie tego protokołu cytometrii przepływowej może znacznie skrócić czas i wysiłek zwykle wymagany do oceny odporności, co czyni ją cenną techniką zarówno dla badań, jak i bardziej praktycznych zastosowań w sektorze akwakultury. Zastosowanie tej metodologii zapewnia korzyści w zakresie analizy dużej liczby próbek, konserwacji komórek i umożliwienia opóźnionej analizy za pomocą cytometrii przepływowej. W związku z tym bardzo pomocne może być uzyskanie cennych informacji na temat mechanizmów odpornościowych ryb i tego, jak na żywotność komórek wpływają różne warunki środowiskowe lub eksperymentalne. Co więcej, ten test żywotności można zintegrować z wieloparametryczną charakterystyką fenotypową i funkcjonalną określonych populacji komórek odpornościowych. Takie podejście umożliwia bardziej kompleksową analizę kilku parametrów immunologicznych, łącząc je bezpośrednio z odpowiadającymi im typami komórek i zapewniając lepsze zrozumienie odpowiedzi immunologicznej. Odkrycia te mogą przyczynić się do opracowania skuteczniejszych strategii, w tym ulepszonych podejść do zarządzania chorobami w akwakulturze.

Protokół

Ten protokół musi być wykonany przez badaczy certyfikowanych w eksperymentach na zwierzętach (funkcje UE A i B). Wszystkie procedury związane z obchodzeniem się ze zwierzętami i pobieraniem próbek muszą być zgodne z wytycznymi ARRIVE (Animal Research: Reporting of in vivo Experiments) i przestrzegać norm etycznych dotyczących opieki i wykorzystywania zwierząt zgodnie z zaleceniami Federacji Europejskich Stowarzyszeń Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (FELASA). Niniejsze badanie było zgodne ze wszystkimi tymi standardami, a także z portugalskim ustawodawstwem dotyczącym nauk o zwierzętach laboratoryjnych (dyrektywa UE 2010/63; Dekret z mocą ustawy nr 113/2013). Badania zostały zatwierdzone przez Organ ds. Dobrostanu Zwierząt i Etyki IPMA (ORBEA, LABVIVOS-002-AquaClimAdapt), nadzorowany przez Krajowy Urząd ds. Wykorzystania Żywych Zwierząt, znany jako Dyrekcja Generalna ds. Żywności i Weterynarii (DGAV), pod numerem poświadczenia etycznego 20596/25-S.

1. Model badawczy i utrzymanie organizmów

UWAGA: To badanie zostało specjalnie zaprojektowane dla młodych dorad (Sparus aurata), o średniej wadze 30,0 ± 5,0 g i całkowitej długości 12,0 ± 2,0 cm. Metoda ta może nie mieć bezpośredniego zastosowania do innych gatunków ryb, ponieważ różne gatunki mają unikalne cechy fizjologiczne i immunologiczne, które mogą wpływać na izolację leukocytów, utrwalanie komórek i ocenę żywotności. W przypadku innych gatunków mogą być wymagane dostosowania do protokołu, a wstępne badania są zalecane w celu optymalizacji warunków dla każdego gatunku docelowego.

1. Zaaklimatyzować ryby (okres kwarantanny)
   1. Rozmieścić ryby równomiernie w zbiornikach o dużej pojemności (np. dwa zbiorniki o łącznej pojemności 660 l każdy - patrz rysunek uzupełniający 1).
      UWAGA: Zbiorniki, które mają być używane, mogą być częścią recyrkulacyjnego systemu akwakultury (RAS), który pozwala na efektywne wykorzystanie wody i lepszą kontrolę jakości wody. W RAS woda jest stale zawracana i uzdatniana w systemie, zapewniając rybom stabilne i kontrolowane środowisko. Taka konfiguracja pomaga w utrzymaniu optymalnych warunków dla zdrowia i wzrostu ryb, zapewniając równomierne rozprowadzenie i minimalizując stres podczas badania.
   2. Utrzymuj optymalne warunki abiotyczne.
      1. Trzymaj ryby w kwarantannie przez 3 tygodnie w warunkach naśladujących ich naturalne środowisko:
         temperatura: 20,0 ± 0,5 °C;
         tlen rozpuszczony: 7,2 ± 0,2 mg/L;
         Zasolenie: 35,0 ± 0,5 ‰;
         pH: 8,0 ± 0,1 jednostki;
         Okres zdjęciowy: 14 h światła/10 h ciemności.
         UWAGA: Idealne warunki konserwacji mogą się różnić w zależności od gatunku ryb. Inne gatunki mogą mieć różne wymagania, dlatego ważne jest, aby dostosować te warunki do szczególnych potrzeb gatunków docelowych, aby zapewnić zdrowie i dobrostan organizmów. Ponadto temperatura wody morskiej i fotoperiod mogą zmieniać się wraz z porami roku, dlatego podczas odtwarzania warunków naturalnych w laboratorium należy wziąć pod uwagę wahania sezonowe.
2. Rozpocznij badanie eksperymentalne.
   1. Zdefiniuj wymaganą liczbę zbiorników i ryb w oparciu o projekt konfiguracji eksperymentalnej każdego studium przypadku.
   2. Po okresie kwarantanny przenieść ryby do niezależnego systemu wczesnego ostrzegania (zob. rysunek uzupełniający 2).
      1. Wyposaż każdy system w odpieniacze białek w celu usunięcia nadmiaru związków organicznych z wody; filtracja fizyczna (worek filtracyjny [400 μm], gąbka filtracyjna i wata szklana); filtracja biologiczna (kulki biologiczne [1,5"], sterylizator wody ultrafioletowej i zanurzone kamienie napowietrzające); automatyczne systemy chłodzenia wodą morską i zanurzone grzałki cyfrowe, oba połączone ze skomputeryzowanym systemem sterowania (ProfiLux) z czujnikami temperatury do regulacji temperatury w każdym zbiorniku; zanurzone kamienie napowietrzające w każdym zbiorniku do kontroli rozpuszczonego tlenu.
   3. Przed przystąpieniem do eksperymentu należy zaaklimatyzować ryby przez 2 tygodnie w nowych systemach.
   4. Wykonuj codzienną konserwację
      1. Usuń odchody ryb z każdego zbiornika inkubacyjnego i wykonaj 25% odnowę wody morskiej.
      2. Zmierz temperaturę za pomocą przenośnego termometru precyzyjnego.
      3. Monitoruj inne parametry abiotyczne wody morskiej (zasolenie, tlen rozpuszczony i pH) za pomocą wieloparametrowego przyrządu pomiarowego.
      4. Dostosuj parametry abiotyczne wody morskiej w razie potrzeby, aby zapewnić stabilność podczas całego eksperymentu.
         UWAGA: Warunki abiotyczne w systemach eksperymentalnych mogą się różnić w zależności od specyficznych wymagań każdego studium przypadku. Na przykład, jeśli badanie ma na celu symulację zmian sezonowych lub morskich fal upałów, temperatura i fotoperiod powinny być odpowiednio dostosowane, aby naśladować naturalne wahania sezonowe. Podobnie, jeśli badanie koncentruje się na symulacji warunków niedotlenienia lub zakwaszenia oceanów, należy wprowadzić korekty poziomu tlenu i pH wody morskiej. Gwarantuje to, że warunki eksperymentalne są tak realistyczne i istotne, jak to tylko możliwe, zwiększając ważność i możliwość zastosowania wyników badania.
      5. Oceń zdrowie i dobrostan ryb, identyfikując oznaki stresu lub choroby i radząc sobie z nimi, jak opisano w krokach 1.2.4.6-1.2.4.8.
      6. Szukaj nieprawidłowych zachowań, takich jak nieregularne pływanie, utrata apetytu, letarg, agresja lub izolacja.
      7. Sprawdź, czy nie ma oznak choroby, w tym zmian chorobowych, wrzodów, przebarwień, zaciśniętych płetw, nadmiernego śluzu lub szybkich ruchów skrzeli.
      8. Zapisuj wszystkie obserwacje, odnotowując datę i podjęte działania.
   5. Przeprowadzaj cotygodniowe testy jakości wody.
      1. Zmierz poziom amoniaku (NH₃/NH₄), azotynów (NO₂^-) i azotanów (NO₃^-) za pomocą testów kolorymetrycznych.
         UWAGA: Upewnij się, że wszystkie te parametry są poniżej wykrywalnych poziomów. Jeśli poziomy przekraczają limity, wykonaj dodatkową wymianę wody, zwiększ napowietrzanie lub wyreguluj filtrację.
   6. Karm i monitoruj żywienie ryb.
      1. Zapewnić wysokiej jakości dietę, która spełnia specyficzne wymagania żywieniowe młodych ryb (przykład szczegółowego składu diety znajduje się w tabeli uzupełniającej 1).
         UWAGA: Upewnij się, że rozmiar granulek aquafeed (2-3 mm) jest odpowiedni dla młodych osobników, ułatwiając spożycie i trawienie.
      2. Dostosuj ilość paszy tak, aby odpowiadała 2% średniej masy ciała ryby dziennie.
      3. Karm ryby ręcznie dwa razy dziennie - raz rano i raz po południu (ustaw określoną godzinę, aby utrzymać stabilną rutynę karmienia).

2. Pobieranie próbek ryb, eutanazja, sekcja i pobieranie nerki głowy

1. Spróbuj ryb ze zbiorników.
   1. Wybieraj ryby losowo ze zbiorników, aby uniknąć stronniczości w pobieraniu próbek.
   2. Użyj siatki, aby delikatnie przenieść rybę do tymczasowego pojemnika wypełnionego wodą ze zbiornika.
      UWAGA: Zminimalizuj czas obsługi, aby zmniejszyć stres.
2. Przygotuj roztwór do eutanazji.
   1. Użyj odpowiedniego pojemnika (np. wiadra o pojemności 3 l) odpowiedniego do przechowywania ryby.
   2. Rozpuść odpowiednią ilość Trikainy (MS-222) w wodzie morskiej, aby osiągnąć końcowe stężenie 200-300 mg/L¹⁸ (UWAGA Patrz Tabela Uzupełniająca 2 i Plik Uzupełniający 1).
   3. Roztwór z wodorowęglanem sodu zbuforować do pH 7,2-7,5.
3. Podaj roztwór do eutanazji.
   1. Umieść rybę w roztworze do eutanazji na co najmniej 10 minut lub do momentu, gdy zaobserwuje się ustanie ruchu operkularnego i utratę odruchów (potwierdź eutanazję, sprawdzając, czy nie reaguje na bodźce zewnętrzne).
   2. Zapisać masę ciała ryby (g) i jej całkowitą długość (cm).
4. Przeprowadzić sekcję ryb.
   UWAGA: Aby zapewnić optymalną jakość próbki i żywotność komórek, proces preparacji powinien zostać zakończony tak szybko, jak to możliwe, najlepiej w ciągu 5 minut po eutanazji.
   1. Zapewnić, że temperatura w laboratorium jest utrzymywana na poziomie 19 °C za pomocą klimatyzacji w celu zminimalizowania wahań podczas pobierania próbek i przetwarzania.
   2. Wysterylizuj narzędzia do preparowania (najlepiej w autoklawie metalowe narzędzia, jeśli to możliwe) i ustaw czyste miejsce pracy z 70% etanolem (UWAGA, patrz Tabela uzupełniająca 2).
   3. Umieść uśpioną rybę na boku na sterylnej tacce rozbiorowej z głową skierowaną w stronę ręki niedominującej.
   4. Za pomocą skalpela wykonaj ostrożne nacięcie wzdłuż brzusznej linii środkowej ryby od otworu wentylacyjnego (odbytu) w kierunku skrzeli.
      UWAGA: Uważaj, aby nie ciąć zbyt głęboko, aby uniknąć uszkodzenia narządów wewnętrznych.
   5. Ostrożnie użyj nożyczek preparacyjnych, aby przedłużyć nacięcie i odsłonić narządy wewnętrzne. Delikatnie unieś klapy ściany ciała, aby zapewnić wyraźny widok anatomii wewnętrznej.
   6. Zlokalizuj nerkę głowy: Nerka głowy znajduje się tuż za skrzelami, w pobliżu przedniego obszaru grzbietowego jamy ciała i rozciąga się wzdłuż górnej strony jamy ciała, poniżej kręgosłupa.
      UWAGA: Nerka głowy ma zazwyczaj ciemniejszy kolor w porównaniu z otaczającymi ją tkankami (Ryc. 1).
   7. Ostrożnie usuń wszelkie otaczające tkanki, takie jak tłuszcz i tkanka łączna, aby lepiej uwidocznić nerkę głowy.
      UWAGA: Ten krok wymaga delikatnego obchodzenia się, aby uniknąć uszkodzenia nerki głowy.
   8. Za pomocą kleszczyków i nożyczek z cienką końcówką ostrożnie podnieś nerkę głowy i wykonaj precyzyjne nacięcia wokół niej, aby uwolnić ją od otaczających tkanek.
      UWAGA: Z chusteczką należy obchodzić się delikatnie, aby zapobiec uszkodzeniu. U ryb o masie około 30 g oczekuje się, że nerka głowy będzie ważyć około 20-30 mg.
   9. Natychmiast umieścić wycięty narząd w sitku do komórek (siatka nylonowa 100 μm) na sterylnej szalce Petriego, aby zapewnić sterylność i ułatwić kolejne etapy przetwarzania.
      UWAGA: Od tego momentu wszystkie kroki należy wykonywać tak szybko, jak to możliwe (w ciągu 5 minut), aby utrzymać żywotność komórek. Aby próbka była chłodna, należy wykonać następujące czynności z szalką Petriego umieszczoną na pojemniku wypełnionym lodem i pokrytą folią aluminiową.

Rysunek 1: Pozycja nerki głowy: (A) Ilustracja przedstawiająca typowe położenie nerki głowy za skrzelami i wzdłuż przedniej części grzbietowej jamy ciała; (B) Reprezentatywny obraz nerki głowy u dorady, podkreślający jej ciemniejsze zabarwienie w porównaniu z otaczającymi tkankami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Izolacja leukocytów nerki głowy (Rysunek 2)

Rysunek 2: Ilustracyjny opis izolacji leukocytów z nerki głowy. Protokół obejmuje kilka etapów: począwszy od homogenizacji tkanki, następnie wirowania w gradifikacji gęstości, pobierania pierścienia leukocytów, mycia pierścienia leukocytów, a kończąc na ponownym zawieszeniu i dostosowaniu stężenia komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Homogenizuj tkankę.
   1. Umieść 2 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) na sterylnej szalce Petriego.
   2. Upewnij się, że siatka sitka komórkowego (siatka nylonowa 100 μm) styka się z HBSS, ale nie jest całkowicie zanurzona.
   3. Macerować nerkę głowy na sitku do komórek za pomocą tłoka strzykawki. Zastosuj delikatny nacisk, aby przepchnąć fragmenty narządu przez nylonową siatkę, tworząc zawiesinę komórkową.
      UWAGA: W przypadku przetwarzania wielu próbek, szalka Petriego zawierająca zawiesinę komórek może być przechowywana w lodówce w temperaturze 4 °C przez kilka minut do następnego etapu. Ta zawiesina komórkowa zostanie wykorzystana do izolacji leukocytów.
2. Przeprowadzić wirowanie w gradiencie gęstości.
   1. Przygotować roztwór pożywki o gradiencie gęstości o gęstości 1,077 g/ml, osmolarności 353 mOsm/kg i pH 7,4 (patrz plik uzupełniający 1).
      UWAGA: Osmolarność może się różnić w zależności od gatunku ryb, dlatego ważne jest, aby dostosować osmolarność roztworu pożywki o gradiencie gęstości, aby spełnić specyficzne wymagania każdego gatunku.
   2. W probówkach okrągłodennych z polistyrenu o pojemności 5 ml ostrożnie dodać 600 μl roztworu pożywki o gradiencie gęstości.
   3. Pobrać zawiesinę komórkową (2 ml) i powoli dodawać ją do probówki zawierającej podłoże o gradiencie gęstości. Pierwsza kropla jest kluczowa - dodaj ją bardzo delikatnie, aby uniknąć destabilizacji gradientu gęstości średniej fazy.
      UWAGA: Należy to zrobić w stosunku 3:10 (medium gradientu gęstości: zawiesina komórek). Użyj sterylnej pipety Pasteura o pojemności 1 ml do precyzyjnego i delikatnego dodawania. Upewnij się, że końcówka pipety dotyka boku probówki, aby zapobiec naruszeniu warstwy medium o gradiencie gęstości. Unikać mieszania próbki z podłożem o gradiencie gęstości.
   4. Odwirować probówki o sile 400 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C przy wyłączonym hamulcu. Gwarantuje to, że warstwy pozostają nienaruszone podczas procesu.
      UWAGA: Po odwirowaniu powinny być widoczne wyraźne warstwy. Leukocyty utworzą pierścień na granicy między ośrodkiem gradientu gęstości a osadem szczątków komórkowych (Rysunek 3).

Rysunek 3: Leukocyty dzwonią na granicy między medium gradientu gęstości a osadem z resztek komórkowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Zbierz pierścień leukocytów.
   1. Za pomocą sterylnej pipety Pasteura delikatnie odessać pierścień leukocytarny (~100 μL) i przenieść go do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml.
      UWAGA: Uważaj, aby nie naruszyć znacząco warstw, aby uniknąć zanieczyszczenia. Jeśli wydaje się, że pierścień leukocytów zawiera zanieczyszczenia lub ciemne zawiesiny, zaleca się przepuszczenie zebranej zawiesiny leukocytów przez nowe mini sitko do komórek (100 μm), aby zapewnić czystość. Umieść mini sitko do komórek na probówce mikrowirówki o pojemności 2 ml i delikatnie przenieś zawiesinę leukocytów przez sitko.
4. Umyj pierścień leukocytów.
   1. Dodać HBSS do probówek mikrowirówkowych zawierających pierścień leukocytów, aż objętość osiągnie 2 ml i delikatnie zawiesić komórki.
      UWAGA: Probówki należy przechowywać w pojemniku wypełnionym lodem i przykrytym folią aluminiową, aby utrzymać próbkę w niskiej temperaturze. Upewnij się, że rurki nie mają bezpośredniego kontaktu z lodem. Utrzymuj tę konfigurację chłodzenia przez cały proces prania.
   2. Odwirować próbki o masie 400 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C (hamulec może być włączony).
   3. Po odwirowaniu ostrożnie wyrzuć supernatant, pozostawiając osad na dnie (który może być prawie niewidoczny).
   4. Powtórz etapy mycia (dodanie HBSS, ponowne zawieszenie, odwirowanie i odrzucenie supernatantu), aż osad będzie wolny od zanieczyszczeń.
5. Ponownie zawiesić i dostosować stężenie komórek.
   1. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml HBSS w tych samych probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml, które są używane do płukania.
   2. Osiągnij stężenie komórek między 1 × 10⁴ i 1 × 10⁶ komórek na ml. Jeśli początkowa osadka jest duża, może być wymagany dodatkowy HBSS w celu rozcieńczenia stężenia komórek do pożądanego zakresu. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i dodać więcej HBSS w razie potrzeby w oparciu o uzyskaną liczbę komórek.
      UWAGA: W celu ułatwienia procesu zaleca się stosowanie automatycznego licznika komórek.

4. Barwienie i utrwalanie leukocytów (Rysunek 4)

UWAGA: Zestawy do naprawy martwych komórek ALIVE/DEAD zapewniają ulepszoną metodę oceny żywotności komórek w stałych komórkach za pomocą cytometrii przepływowej. Testy te wykorzystują fluorescencyjny barwnik reaktywny, który oddziałuje z aminami komórkowymi. Jeśli błony komórkowe zostaną naruszone, barwnik może wniknąć do komórek, reagując z wolnymi aminami zarówno wewnątrz, jak i na powierzchni komórki, powodując intensywne barwienie fluorescencyjne. I odwrotnie, w żywotnych komórkach tylko aminy na powierzchni komórki są dostępne do reakcji z barwnikiem, co prowadzi do stosunkowo słabego zabarwienia. Intensywność barwienia utrzymuje się po utrwaleniu formaldehydem, który również zachowuje próbkę, zapobiegając rozwojowi mikroorganizmów. Zestawy do barwienia martwych komórek LIVE/DEAD są identyczne, z wyjątkiem barwnika fluorescencyjnego - dostępnego w kolorze niebieskim, fioletowym, morskim, żółtym, zielonym, czerwonym, dalekiej czerwieni lub bliskiej podczerwieni (podczerwień). W tym badaniu użyliśmy fluorescencyjnego barwnika reaktywnego w bliskiej podczerwieni. Dodatkowo ten jednokolorowy test pozwala na równoległe testowanie innych parametrów w eksperymencie wielokolorowym.

1. Przygotuj barwnik.
   1. Doprowadź odczynniki do temperatury pokojowej (RT): Przed zdjęciem nakrętek pozwól, aby jedna fiolka fluorescencyjnego barwnika reaktywnego i fiolka z bezwodnym dimetylosulfotlenkiem (DMSO) osiągnęły temperaturę rzeczywistą.
   2. Rozpuść barwnik: Dodać 50 μl DMSO do fiolki zawierającej barwnik reaktywny. Dokładnie wymieszaj i upewnij się, że barwnik całkowicie się rozpuścił.
   3. Zużyć odtworzony roztwór barwnika tak szybko, jak to możliwe, najlepiej w ciągu kilku godzin.
      UWAGA: Każdy zestaw zawiera pięć oddzielnych fiolek z barwnikiem reaktywnym, zapewniających wystarczającą ilość materiału do barwienia co najmniej 40 próbek komórek. Jednak po rozpuszczeniu roztwór DMSO barwnika jest stosunkowo niestabilny, szczególnie pod wpływem wilgoci. Niewykorzystane porcje można przechowywać do 2 tygodni w temperaturze ≤-20 °C, chroniąc przed światłem i wilgocią.
2. Plamić i naprawić komórki.
   UWAGA: odpowiednie do barwienia komórek obejmują zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS), sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i PBS FIRMY DULBECCO (D-PBS), o ile nie zawierają obcych białek, takich jak albumina surowicy bydlęcej lub surowica. Stosując barwnik aminoreaktywny, należy unikać Tris i roztworów z azydkiem sodu lub obcym białkiem do ponownego zawieszania i przemywania komórek. W tym badaniu zastosowaliśmy HBSS ze względu na jego zrównoważony skład jonowy, który pomaga utrzymać równowagę osmotyczną i dostarcza niezbędnych jonów i glukozy do wspierania metabolizmu komórkowego i żywotności podczas procesu barwienia. HBSS jest również wolny od obcych białek, co zapobiega interferencji z barwnikiem reaktywnym i zapewnia dokładną ocenę żywotności.
   1. Po zliczeniu komórek i dostosowaniu gęstości do 1 x 10⁶ komórek na ml za pomocą HBSS, przenieś 1 ml tej zawiesiny komórek do probówek mikrowirówkowych o pojemności 2 ml.
      1. Każdego dnia indukuj śmierć komórki w co najmniej jednej próbce, która zostanie wykorzystana jako kontrola w celu ustawienia progu intensywności fluorescencji między żywymi i martwymi komórkami. Przygotować próbki w probówkach do mikrowirówek w następujący sposób:
         Rurka 1: Żywe komórki - niebarwione
         Rurka 2: Żywe komórki - barwione
         Rurka 3: Martwe komórki - niebarwione
         Rurka 4: Martwe komórki - barwione
         UWAGA: Te cztery probówki muszą być przygotowane tylko dla jednej próbki w każdym eksperymencie jako kontrole. W przypadku pozostałych próbek potrzebne są tylko dwie probówki (Probówka 1: próbka - niebarwiona i Probówka 2: próbka - barwiona), ponieważ dostarczy ona informacji o komórkach, które były żywe i tych, które były martwe.
   2. Kontrola pozytywna w kierunku śmierci komórki: Umieścić oznakowaną probówkę Martwa niebarwiona (Probówka 3) i Śmiertelnie Barwioną (Probówka 4) w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C na 7 minut w celu wywołania śmierci komórki poprzez obróbkę cieplną.
   3. Barwienie komórek: Dodać 1 μl odtworzonego barwnika fluorescencyjnego reaktywnego (z kroku 4.1.2) do 1 ml zawiesiny komórek w probówkach 2 i 4 (probówki, które będą barwione) i dobrze wymieszać.
   4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, chronić przed światłem.
      UWAGA: Jeśli fiksacja nie jest wymagana, możesz pominąć kroki 4.2.5-4.2.7 poniżej. Zamiast tego należy przemyć komórki dwukrotnie 1 ml HBSS z 1% albuminą surowicy bydlęcej (patrz plik uzupełniający 1) i ponownie zawiesić w 1 ml HBSS z 1% albuminą surowicy bydlęcej. Przeprowadzić analizę na cytometrze przepływowym tak szybko, jak to możliwe; W przeciwnym razie żywotność komórek może być zagrożona, ponieważ komórki nie są unieruchomione.
   5. Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml HBSS i ponownie zawiesić komórki w 900 μl HBSS.
   6. Dodać 100 μl 37% formaldehydu (UWAGA, patrz Tabela Uzupełniająca 2).
   7. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
   8. Przemyć dwukrotnie 1 ml HBSS 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA), a następnie ponownie zawiesić komórki w 1 ml HBSS z 1% BSA.
   9. Próbki należy przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C. Przeanalizować komórki w ciągu 1 miesiąca po utrwaleniu.
   10. Analizować utrwaloną zawiesinę komórek za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu odpowiedniego kanału wzbudzenia i detekcji.
       UWAGA: Prawidłowe kanały wzbudzenia i detekcji mogą się różnić w zależności od używanego przyrządu (patrz Tabela uzupełniająca 3).

Rysunek 4: Ilustracyjny opis barwienia i utrwalania leukocytów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Cytometria przepływowa

1. Pobieranie danych.
   UWAGA: Procedury, których należy przestrzegać na cytometrze przepływowym, mogą się różnić w zależności od używanego cytometru. W tym badaniu dane uzyskano za pomocą cytometru przepływowego Attune NTx.
   1. Uruchom przykłady.
   2. Umieść probówkę z próbką w porcie próbki.
   3. Rozpocznij akwizycję, naciskając start, a następnie kliknij rekord, gdy częstotliwość zdarzeń (zdarzenia/sekunda) ustabilizuje się.
   4. Rejestruj co najmniej 10 000 zdarzeń dla każdej próbki w bramce podwójnej, aby uzyskać wiarygodną analizę.
   5. Zapisz wszystkie dane dla każdej próbki i utwórz ich kopię zapasową na dyskach zewnętrznych lub w chmurze.
2. Analizowanie danych.
   UWAGA: Do analizy cytometrii przepływowej dostępnych jest kilka opcji oprogramowania. W tym badaniu analiza danych została przeprowadzona przy użyciu FlowJo v10.8.1¹⁹.
   1. Załaduj pliki danych: Uruchom oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej i prześlij pliki .fcs uzyskane z eksperymentu.
   2. Wizualizacja danych (Rysunek 5A): Wykreśl rozproszenie do przodu (FSC-A) (XX) w porównaniu z rozproszeniem bocznym (SSC-A) (YY), aby ocenić rozmiar i stopień szczegółowości komórki.
      UWAGA: Ten wykres jest powszechnie używany do identyfikowania populacji komórek i wykluczania szczątków na podstawie ich właściwości rozpraszania.
   3. Bramkowanie pojedynczych komórek i wykluczenie mnożników (Rysunek 5B): Użyj wykresu obszaru rozproszenia do przodu (FSC-A) w stosunku do wysokości rozproszenia do przodu (FSC-H), aby wykluczyć wielokrotności. Narysuj bramkę, aby uwzględnić wszystkie zdarzenia wyrównane na wykresie (pojedyncze komórki) i wykluczyć niewyrównane (wielokrotności). Jeśli próbka ma zdarzenia o bardzo niskim FSC, należy je wykluczyć, nie uwzględniając ich na bramce pojedynczej komórki, pozostawiając tylko komórki singletowe.
   4. Identyfikacja populacji leukocytów (Rysunek 5C): Rozróżnij 3 populacje leukocytów na podstawie profilu FSC-A/SSC-A:^{FSC-A wysokie}/SSC-A^wysokie to granulocyty,^pożywka FSC-A/^pożywka SSC-A to monocyty, a FSC-A^niskie/SSC-A^niskie to limfocyty.
   5. Bramkowanie żywotności (Rysunek 5D): Ustaw próg barwienia barwnikiem żywotności na odpowiednim kanale fluorescencyjnym (NIR, RL3-A). Żywe i martwe komórki są definiowane na podstawie intensywności barwienia za pomocą LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain: słabo wybarwione komórki są definiowane jako żywe komórki, a silnie zabarwione komórki są definiowane jako martwe komórki.
   6. Statystyki populacji: Spójrz na statystyki dostarczone przez oprogramowanie, w tym łączną liczbę zdarzeń (komórek) w każdej bramce oraz procenty komórek całkowitych i bramkowanych.
   7. Eksport danych: Eksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego i użyj odpowiedniego oprogramowania statystycznego (GraphPad Prism lub R) do dalszej analizy statystycznej.
      UWAGA: Wybór metod analizy będzie zależał od celów badań.

Rysunek 5: Strategia bramkowania cytometrii przepływowej do oceny żywotności komórek nerki głowy: (A) Przedstawia profil FSC-A/SSC-A wszystkich zebranych zdarzeń. (B) Reprezentuje wykluczenie multipletów w oparciu o definicję regionu singletów opartą na liniowości na wykresie rozproszenia do przodu (FSC-A)/rozproszenia do przodu (FSC-H). (C) Reprezentuje 3 główne populacje, które zostały zdefiniowane na podstawie FSC-A/SSC-A, po wykluczeniu mnożników. (D) Reprezentuje histogram przedstawiający barwienie barwnikiem żywej/martwej żywotności. Aby ustalić próg, który pozwala na odróżnienie komórek żywych i martwych, leukocyty poddano łagodnemu szokowi cieplnemu (50 °C, 7 min), a następnie wybarwiono barwnikiem żywotności. Komórki o wysokiej intensywności barwienia dodatnie (++) to martwe komórki, a komórki dodatnie o niskiej intensywności barwienia (+-) to żywe komórki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Rysunek 6 przedstawia reprezentatywne dane cytometryczne z cytometrii przepływowej pokazujące populacje leukocytów wyizolowane z nerki głowy młodocianego dorada (Sparus aurata) i ich żywotność komórek przy użyciu protokołu opisanego w tym badaniu. Rysunek porównuje dwie próbki: jedną o wysokiej żywotności komórkowej, w której ryby były wystawione na optymalne warunki (Rysunek 6A), a drugą o niskiej żywotności komórkowej, gdzie kom...

Dyskusja

Metoda opracowana w tym badaniu stanowi znaczący postęp w badaniach nad immunologią ryb i daje nadzieję na lepsze zrozumienie odpowiedzi immunologicznych ryb i zrównoważenia zasobów morskich. S. aurata jest cennym gatunkiem ryb morskich z rodziny sparidae, służącym jako idealny organizm modelowy z kilku powodów, w tym ze względu na swoje znaczenie ekologiczne i ekonomiczne, a także wszechstronność w badaniach laboratoryjnych w kilku dziedzinach nauki, takich jak fizjologia, immunologia, toksykologia i akwakultur...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kamienie napowietrzające	N/A	N/A
Aquafeed	SPAROS, Lda., Portugalia	N/A	Dieta wysokiej jakości
Automatyczny sprzęt do liczenia komórek	NanoEnteK, Korea	N/A	EVE automatyczny licznik komórek (NanoEnteK)
Automatyczne systemy chłodzenia wodą	Foshan Weinuo Refrigeration Equipment Co., Ltd, Chiny	Nie dotyczy
Bio kulki 1,5-calowy filtr do stawu akwariowego	TMC Iberia, Portugalia	Nie dotyczy
albuminy surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich, Niemcy	A7906
Wiadro (3 l)	N/A	N/A	Aby przygotować i przeprowadzić eutanazję
Wiadra (5 L)	N/A	N/A	Do transportu zwierząt
Sitka komórkowe	Jetbiofil, Chiny	CSS-013-100	Sitko komórkowe, 100 μ m nylonowa siatka, sterylna, żółta
Centrifugue	Fisher Scientific, Niemcy	Nie dotyczy Zestaw	kolorymetryczny accuSpin Micro 17 R
do amoniaku (NH4 + / NH3)	Tropic Marin, USA	Nie dotyczy
Zestaw testowy kolorymetryczny do azotanów (NO3-)	Tropic Marin, USA	Brak
Zestaw do testów kolorymetrycznych dla azotynów (NO2-)	Tropic Marin, USA	Nie dotyczy
komputera	N/A	N/A	Pozyskiwanie i analiza danych uzyskanych z cytometru przepływowego
Komputerowy system sterowania (Profilux)	GHL, Niemcy	Nie dotyczy	ProfiLux 3 Zewnętrzna
woda dejonizowana	N/A	N/A	Do czyszczenia cytometru przepływowego
Gradient gęstości Medium: Percoll	Cytiva, Sigma-Aldrich, Niemcy	17-0891-01
Waga cyfrowa	KERN & Sohn GmbH, Niemcy	N/A	KERN EMS 300-3
Etanol 70%	Millipore, Supelco, Portugalia	EX0281	Aby utrzymać miejsce pracy w czystości
Szkiełka do liczenia komórek EVE	NanoEnteK, Korea	N/A
Probówki Falcon (15 ml)	pluriSelect Life Science, Niemcy	05-00002-01	Sterylny
worek filtracyjny	TMC Iberia, Portugalia	/A	400 mikronów
Gąbka filtracyjna	Nie	N/A
	ThermoFisher Scientific, USA	N/A	Attune cytometr przepływowy
FlowJo v10.8.1 Oprogramowanie	BD Life Sciences	N/A
Formaldehyd 37%	Sigma-Aldrich, Niemcy	8.18708
Wełna szklana	N/A	N/A
Zrównoważony roztwór soli Hanksa	Merck Life Science S.L, Portugalia	H6648	Modyfikowany, z wodorowęglanem sodu, bez czerwieni fenolowej, chlorku wapnia i siarczanu magnezu, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych
ŻYWE/MARTWE Zestawy do naprawy barwników martwych komórek	Life Technologies Europe, Holandia	L10119	Barwnik fluorescencyjny w bliskiej podczerwieni +
główne pompy wodne	EHEIM, Niemcy
probówki do mikrowirówek 1200 (2 ml)	MARKA, Merck, Niemcy	Z628034	sterylne
końcówki do mikropipet	Sartorius, Niemcy	790010, 790200, 791000	Kompatybilny z Sartorius, 1-10 i mikro; L, 2-20 i mikro; L, 20-200 i mikro; L, 100-1000 i mikro; L
Mikropipety	Sartorius, Niemcy	728020, 728030, 728060, 728070	Sartorius ProlinePlus 1-10 µ L, 2-20 i mikro; L, 20-200 i mikro; L, 100-1000 i mikro; L
Mini sitka komórkowe	pluriSelect Globalna siedziba główna w dziedzinie nauk przyrodniczych, Niemcy	43-10100-50	PluriStrainer 100 µ m nylonowa siatka, sterylny
wieloparametrowy przyrząd pomiarowy	WTW, Niemcy		Multi 3420 SET G + cyfrowa cela konduktometryczna IDS (TetraCon 925) + Optyczny czujnik tlenu rozpuszczonego IDS (FDO 925) + elektroda pH IDS (SenTix 940)
Pipety Pasteura (1 mL, 5 mL)	Humeau Expert du laboratoire, Francja	248295	Sterylne
szalki Petriego	Sarstedt, Niemcy	82.1194.500	60 x 15 mm, Polistyren, Sterylny
pH-metr	Hanna Instruments Inc., Rumunia		HANNA HI2211
Polistyrenowe rurki Falcon z okrągłym dnem (5 ml)	Fisher Scientific, Niemcy	14-959-2A	Sterylny
przenośny termometr precyzyjny	Ebro Electronic,	Niemcy N/A	TFX 430
Odpieniacze białkowe	Mantis	N/A	Tornado 120
Koraliki kontroli jakości/Koraliki do testu wydajności	Thermofisher Scientific, USA	N/A
Zbiorniki kwarantannowe	Nie	dotyczy	Zbiorniki o całkowitej objętości 660 l
Prostokątne szklane zbiorniki/akwaria	Nie		Zbiorniki o całkowitej pojemności 200 l
Lodówka	Nie		przechowywania próbek w temperaturze 4 & stopni;
C Linijka 30 cm	N/A	N/A	Do pomiaru długości ryby
Wodorowęglan sodu	Honeywell Fluka, Niemcy	31437	Wodorowęglan sodu (NaHCO3)
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich, Niemcy	S9888
Sterylne narzędzia preparacyjne	NIE	DOTYCZY NIE DOTYCZY	(np. skalpel, nożyczki, kleszcze z cienką końcówką, taca/deska do sekcji)
Zanurzone grzejniki cyfrowe	TMC Iberia, Portugalia		300 W, Cyfrowe grzałki V2Therm
Strzykawki 1 mL	IVFSTORE, USA	8300014579-MEA	Sterylne, HSW Soft-Ject Strzykawki  do maceracji czujników temperatury głowy i nerki
	GHL, Niemcy		PT 1000
Tricaine (MS-222)	ThermoFisher Scientific, Niemcy	118000500	3-aminobenzoesan etylu, sól kwasu metanosulfonowego, 98% (C10H15NO5S)
Sterylizator wody ultrafioletowej	EHEIM, Niemcy	5305010	ClearUVC-36
	Fisher Scientific, Niemcy	N/A	Fisherbrand IsotempTM (P/N U01318)
Oprawy wodoodporne	N/A	N/A N/A