Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja, utrwalenie i charakterystyka młodocianych leukocytów nerkowych dorady za pomocą cytometrii przepływowej

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67978

⸱

9 maja 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UCIBIO - Applied Molecular Biosciences Unit, Department of Chemistry, NOVA School of Science and Technology, NOVA University of Lisbon, 2IPMA DivAV - Division of Aquaculture, Upgrading and Bioprospection, Portuguese Institute for the Sea and Atmosphere, 3CIIMAR - Interdisciplinary Centre of Marine and Environmental Research, University of Porto, 4UCIBIO - Applied Molecular Biosciences Unit, Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, NOVA University of Lisbon, 5Associate Laboratory i4HB - Institute for Health and Bioeconomy, NOVA School of Science and Technology, NOVA University of Lisbon, 6Bioscience Core Lab, King Abdullah University of Science and Technology, 7CDG & Allies - Professionals and Patient Associations International Network (CDG & Allies - PPAIN), Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, NOVA University of Lisbon

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje izolację i utrwalanie leukocytów pobranych z nerki głowy dorady oraz ocenę ich żywotności za pomocą cytometrii przepływowej. Prace te przyczyniają się do standaryzacji protokołów i wykorzystują przetwarzanie większej liczby próbek bez uszczerbku dla jakości próbek, promując postęp w wiedzy na temat immunologii ryb.

Streszczenie

Odporność jest kluczowa dla fizjologicznej regulacji organizmów, służąc jako podstawowa obrona przed patogenami i stresorami środowiskowymi. Izolacja i analiza komórek odpornościowych dostarcza kluczowych informacji na temat odpowiedzi immunologicznych na naciski zewnętrzne. Jednak brak zharmonizowanych protokołów dla mniej badanych gatunków, takich jak ryby morskie, często prowadzi do wyzwań technicznych i analitycznych, które utrudniają interpretację danych i dokładne zrozumienie specyficznych dla danego gatunku odpowiedzi immunologicznych. Badanie to miało na celu opracowanie zoptymalizowanej procedury analitycznej opartej na cytometrii przepływowej w celu scharakteryzowania i określenia żywotności leukocytów z nerki głowy (głównego narządu krwiotwórczego u ryb teleostowych) młododoła (Sparus aurata). Procedura rozpoczęła się od izolacji leukocytów w procesie homogenizacji przy użyciu zbilansowanego roztworu soli Hanksa, a następnie zoptymalizowanej metody wirowania w gradiencie gęstości Percoll w celu zapewnienia wysokich wskaźników odzysku leukocytów przy minimalnym zanieczyszczeniu erytrocytów wymaganym do wydajnej późniejszej analizy cytometrii przepływowej. Ponadto zastosowano nowatorską technikę wykorzystującą barwnik reagujący z komórkami (LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit) w celu odróżnienia komórek żywych od martwych na podstawie ich fluorescencyjnych wzorów barwienia. Utrwalenie osiągnięto przy użyciu 3,7% formaldehydu, zachowując morfologię komórek, żywotność i skuteczność barwienia. Analiza cytometrii przepływowej z powodzeniem zidentyfikowała trzy dominujące populacje leukocytów: limfocyty, monocyty i granulocyty. Metoda ta pozwoliła nie tylko na przeprowadzenie testów żywotności, ale także na dokładne różnicowanie typów komórek. Ulepszenie protokołów cytometrii przepływowej stanowi krok naprzód w immunologii ryb poprzez zwiększenie dokładności i wydajności analizy komórek odpornościowych. Ponadto, umożliwiając utrwalanie komórek do późniejszej analizy, protokół ten znacznie skraca czas i wysiłek wymagany do oceny odporności, co czyni go cennym narzędziem zarówno do badań, jak i praktycznych zastosowań w różnych dziedzinach badań.

Wprowadzenie

Odporność odgrywa kluczową rolę w fizjologicznej regulacji organizmów, działając jako podstawowa obrona przed szerokim zakresem patogenów i stresorów środowiskowych1. Podobnie jak inne kręgowce, ryby mają złożony, dynamiczny i skoordynowany układ odpornościowy niezbędny dla ich ogólnego stanu zdrowia i dobrego samopoczucia1.

Ryby teleost posiadają zarówno wrodzony, jak i adaptacyjny układ odpornościowy, który działa jednocześnie w celu wykrywania, reagowania i neutralizowania szkodliwych najeźdźców2. Wrodzony układ odpornościowy działa jako pierwsza linia obrony, zapewniając natychmiastowe i niespecyficzne odpowiedzi na patogeny2, podczas gdy adaptacyjny układ odpornościowy rozwija się z czasem, oferując bardziej wyspecjalizowaną odpowiedź, która umożliwia rybom rozpoznawanie określonych patogenów i ustanowienie pamięci immunologicznej3. Układ odpornościowy ryb opiera się na wyspecjalizowanych pierwotnych narządach limfatycznych (tj. grasicy i nerce głowy) oraz wtórnych narządach limfatycznych (np. śledzionie i tkankach limfatycznych związanych z błoną śluzową (MALT)) w celu wspierania obrony immunologicznej i utrzymania ogólnego stanu zdrowia4. Nerka głowy jest głównym narządem krwiotwórczym u ryb teleost i odgrywa kluczową rolę w rozwoju i dojrzewaniu komórek odpornościowych, w tym leukocytów5.

W ostatnich latach poczyniono znaczne postępy w badaniu odpowiedzi immunologicznych kilku gatunków ryb2. Jednym z kluczowych obszarów zainteresowania było zrozumienie populacji leukocytów i ich aktywności. Leukocyty, znane również jako białe krwinki, są ogólnie klasyfikowane jako monocyty, limfocyty i granulocyty i odgrywają kluczową rolę w obronie immunologicznej ryb. Mają komórki fagocytarne, które są odpowiedzialne za pochłanianie i niszczenie patogenów oraz uwalniają bakteriobójcze reaktywne formy tlenu, przyczyniając się do eliminacji inwazyjnych mikroorganizmów6. Leukocyty są również zaangażowane w proces zapalny, pomagając w izolowaniu i eliminowaniu infekcji, jednocześnie wspomagając naprawę tkanek6. Liczebność i aktywność populacji leukocytów są ważnymi wskaźnikami stanu odporności w zdrowiu i chorobie zwierząt7,8.

Niektóre badania wykazały, że czynniki stresowe, takie jak niekorzystne warunki środowiskowe, mogą zmieniać liczbę i morfologię erytrocytów oraz skład krążących leukocytów9,10. Na przykład, jak dokonali recenzenci Franke i in. (2024), kluczowe znaczenie ma badanie układu odpornościowego ryb w scenariuszach zmian klimatu, ponieważ stresory środowiskowe mogą zagrozić odporności ryb, zwiększyć podatność na choroby i zwiększyć zakaźność niektórych patogenów, ostatecznie przyspieszając postęp choroby11. Co więcej, zrozumienie odporności ryb ma zasadnicze znaczenie nie tylko dla postępu w podstawowych badaniach biologicznych, ale także dla wspierania różnych sektorów społeczeństwa, takich jak przemysł akwakultury. Wraz z rozwojem akwakultury na całym świecie coraz ważniejsze staje się zapewnienie zdrowia i dobrostanu gatunków ryb hodowlanych. Jednak dobrostan ryb pozostaje stosunkowo nowym obszarem badań, a odpowiedzi immunologiczne ryb hodowlanych nadal wymagają dokładnych i ustandaryzowanych ocen. Priorytetowe traktowanie badań nad odpowiedzią immunologiczną ma ogromne znaczenie, ponieważ uzyskane informacje mogą zwiększyć zrównoważony rozwój i produktywność akwakultury dzięki skutecznym i dostosowanym do potrzeb podejściom, które poprawiają dobrostan i odporność zwierząt gospodarskich.

Kwantyfikacja i identyfikacja leukocytów są zwykle wykonywane przy użyciu metod hematologicznych, takich jak ręczne liczenie za pomocą hemocytometrów Bürkera, Neubauera lub Thoma, a także barwione rozmazy krwi7,10. Aby pomóc w wizualizacji i różnicowaniu komórek krwi, często stosuje się zestawy do barwienia, takie jak Wright, May-Grünwald-Giemsa i Hemacolor7,12. Jednak te techniki ręcznego liczenia komórek są żmudne, czasochłonne i podatne na błędy ludzkie8,10. Częstymi źródłami błędów są nieodpowiednie mieszanie lub rozcieńczanie krwi, problemy z barwieniem i nieprawidłowe ładowanie komory hemocytometru, co może prowadzić do niedokładnej liczby komórek12. Ponadto ręczna analiza hematologiczna wymaga wysokiego poziomu wiedzy i doświadczenia, aby zapewnić wiarygodność i odtwarzalność wyników7. Wraz ze wzrostem zapotrzebowania na precyzyjne i skuteczne narzędzia diagnostyczne, opracowanie innowacyjnych metod, które zapewniają dogłębne zrozumienie stanu odporności populacji ryb, staje się coraz ważniejszym krokiem w rozwoju tej dziedziny.

Cytometria przepływowa stała się potężnym narzędziem w tym kontekście, oferując wysokoprzepustowe, ilościowe podejście do analizy populacji leukocytów i żywotności komórek8. Ta nowoczesna technologia diagnostyczna pozwala na szybkie wykrywanie, liczenie i charakteryzowanie pojedynczych komórek w mieszanych populacjach z niezwykłą precyzją13. Co więcej, cytometria przepływowa umożliwia jednoczesne pomiary wieloparametryczne zarówno w charakterystyce fenotypowej, jak i funkcjonalnej. Chociaż jest szeroko stosowany w warunkach klinicznych u ludzi i w medycynie weterynaryjnej, jego zastosowanie w badaniu leukocytów ryb pozostaje bardzo ograniczone8. Chociaż przeprowadzono pewne badania na różnych gatunkach ryb1,6,8,13,14,15,16,17, nadal należy stawić czoła kilku krytycznym wyzwaniom. Jednym z głównych wyzwań w tych analizach jest konieczność uzyskania zawiesin żywych leukocytów wyekstrahowanych z krwi obwodowej lub tkanek limfatycznych, takich jak głowa nerki1. Izolacja leukocytów jest często trudna ze względu na unikalną cechę ryb teleostowych: obecność jądrzastych erytrocytów. Niezamierzone zanieczyszczenie erytrocytami może zakłócać analizę leukocytów ze względu na ich wielkość, jajowaty kształt i obecność jądra1. Dlatego konieczne jest wyeliminowanie erytrocytów z zawiesin leukocytów w celu uzyskania wysokiej czystości leukocytów oraz zbadania cech fenotypowych i funkcjonalnych leukocytów za pomocą analizy cytometrii przepływowej. U ssaków izolacja leukocytów zazwyczaj obejmuje lizę osmotyczną erytrocytów lub separację gradientu gęstości za pomocą Ficoll lub Percoll1. Jednak liza osmotyczna jest nieskuteczna zarówno w przypadku ryb morskich, jak i słodkowodnych ze względu na ich jądrzaste erytrocyty, które nie mogą być prawidłowo zrandomizowane1. Zamiast tego separacja gradientu gęstości jest preferowana dla ryb, ponieważ skutecznie zachowuje stabilność komórek w czasie1. Chociaż niektóre badania z powodzeniem wyizolowały leukocyty od młodych ryb, wiele badań nadal koncentruje się głównie na populacjach dorosłych17. Niemniej jednak wczesne stadia życia są nie tylko bardziej podatne na wybuchy choroby, ale także mają mniejsze rozmiary, co sprawia, że proces pobierania próbek jest bardziej złożony i wymagający. Innym ograniczeniem jest to, że obecne metody są często ograniczone do ograniczonej liczby próbek lub powtórzeń jednocześnie, ponieważ ocena żywotności leukocytów wymaga natychmiastowego przetwarzania. Opóźnienia w przetwarzaniu próbek mogą niekorzystnie wpłynąć na żywotność komórek, wprowadzając w ten sposób dalsze komplikacje do procesu pobierania próbek i potencjalnie zagrażając całej pracy.

Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, żadna z opublikowanych metod nie zdołała skutecznie ustalić komórek leukocytów do późniejszej analizy żywotności za pomocą cytometrii przepływowej. Niniejsze badanie jest pionierskie, ponieważ ustanawia skuteczną metodę izolowania leukocytów z nerki głowy młodego dorady (Sparus aurata), głównego gatunku ryb hodowanych w krajach Europy Południowej, przy użyciu metodologii separacji gradientu gęstości Percoll. Przedstawiamy również ulepszoną technikę opartą na barwieniu, która odróżnia żywe komórki od martwych, jednocześnie identyfikując główne populacje leukocytów (limfocyty, monocyty i granulocyty) za pomocą cytometrii przepływowej. Ulepszony protokół wiąże się z utrwaleniem komórek, co umożliwia realną analizę komórek do 1 miesiąca po zabiegu. Wdrożenie tego protokołu cytometrii przepływowej może znacznie skrócić czas i wysiłek zwykle wymagany do oceny odporności, co czyni ją cenną techniką zarówno dla badań, jak i bardziej praktycznych zastosowań w sektorze akwakultury. Zastosowanie tej metodologii zapewnia korzyści w zakresie analizy dużej liczby próbek, konserwacji komórek i umożliwienia opóźnionej analizy za pomocą cytometrii przepływowej. W związku z tym bardzo pomocne może być uzyskanie cennych informacji na temat mechanizmów odpornościowych ryb i tego, jak na żywotność komórek wpływają różne warunki środowiskowe lub eksperymentalne. Co więcej, ten test żywotności można zintegrować z wieloparametryczną charakterystyką fenotypową i funkcjonalną określonych populacji komórek odpornościowych. Takie podejście umożliwia bardziej kompleksową analizę kilku parametrów immunologicznych, łącząc je bezpośrednio z odpowiadającymi im typami komórek i zapewniając lepsze zrozumienie odpowiedzi immunologicznej. Odkrycia te mogą przyczynić się do opracowania skuteczniejszych strategii, w tym ulepszonych podejść do zarządzania chorobami w akwakulturze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejszy protokół musi być wykonywany przez badaczy posiadających certyfikat w zakresie eksperymentów na zwierzętach (funkcje A i B według UE). Wszystkie procedury związane z obchodzeniem się ze zwierzętami i pobieraniem próbek muszą być zgodne z wytycznymi ARRIVE (Animal Research: Reporting of in vivo Experiments) oraz przestrzegać standardów etycznych dotyczących opieki i wykorzystania zwierząt zgodnie z rekomendacjami Federacji Europejskich Stowarzyszeń Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (FELASA). Niniejsze badanie zostało przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi tymi standardami, a także z portugalskim ustawodawstwem dotyczącym nauki o zwierzętach laboratoryjnych (dyrektywa UE 2010/63; dekret-prawo nr 113/2013). Badanie zostało zatwierdzone przez Organ ds. Dobrostanu i Etyki Zwierząt IPMA (ORBEA, LABVIVOS-002-AquaClimAdapt) pod nadzorem krajowego organu ds. wykorzystania żywych zwierząt, znanego jako Dyrekcja Generalna ds. Żywności i Weterynarii (DGAV), pod numerem zgody etycznej 20596/25-S.

1. Model badania i utrzymanie organizmów

UWAGA: Niniejsze badanie zostało zaprojektowane specjalnie dla młodzieńczych osobników dorady (Sparus aurata) o średniej masie 30,0 ± 5,0 g i całkowitej długości 12,0 ± 2,0 cm. Metoda ta może nie mieć bezpośredniego zastosowania do innych gatunków ryb, ponieważ różne gatunki posiadają unikalne cechy fizjologiczne i immunologiczne, które mogą wpływać na izolację leukocytów, utrwalanie komórek oraz ocenę żywotności. W przypadku innych gatunków może być wymagana adaptacja protokołu, a w celu optymalizacji warunków dla każdego gatunku docelowego zaleca się przeprowadzenie badań wstępnych.

  1. Aklimatyzacja ryb (okres kwarantanny)
    1. Rozdziel ryby równomiernie do zbiorników o dużej pojemności (np. dwa zbiorniki o całkowitej pojemności 660 L każdy – patrz Supplementary Figure 1).
      UWAGA: Stosowane zbiorniki mogą być częścią recyrkulacyjnego systemu akwakultury (RAS), który umożliwia efektywne wykorzystanie wody i lepszą kontrolę nad jej jakością. W systemie RAS woda jest stale recyrkulowana i oczyszczana wewnątrz układu, co zapewnia stabilne i kontrolowane środowisko dla ryb. Taka konfiguracja pomaga w utrzymaniu optymalnych warunków dla zdrowia i wzrostu ryb, zapewniając jednorodne rozprzestrzenienie i minimalizując stres podczas badania.
    2. Utrzymywanie optymalnych warunków abiotycznych.
      1. Utrzymuj ryby w kwarantannie przez 3 tygodnie w warunkach naśladujących ich naturalne środowisko:
        temperatura: 20,0 ± 0,5 °C;
        tlen rozpuszczony: 7,2 ± 0,2 mg/L;
        zasolenie: 35,0 ± 0,5 ‰;
        pH: 8,0 ± 0,1 jednostek;
        fotoperiod: 14 h światła/10 h ciemności.
        ​UWAGA: Idealne warunki utrzymania mogą różnić się w zależności od gatunku ryb. Inne gatunki mogą mieć odmienne wymagania, dlatego ważne jest dostosowanie tych warunków do specyficznych potrzeb docelowego gatunku, aby zapewnić zdrowie i dobrostan organizmów. Ponadto temperatura wody morskiej i fotoperiod mogą zmieniać się wraz z porami roku, dlatego przy odtwarzaniu naturalnych warunków w laboratorium należy uwzględnić zmienność sezonową.
  2. Rozpoczęcie badania eksperymentalnego.
    1. Określ liczbę zbiorników i ryb niezbędnych na podstawie projektu układu eksperymentalnego dla każdego przypadku badania.
    2. Po okresie kwarantanny przenieś ryby do niezależnych systemów RAS (patrz Supplementary Figure 2).
      1. Wyposaż każdy system w odpieniacze białkowe w celu usunięcia nadmiaru związków organicznych z wody; filtrację mechaniczną (worek filtrujący [400 µm], gąbka filtrująca i wata szklana); filtrację biologiczną (biopierścienie [1,5"], sterylizator wody UV oraz zatopione kamienie napowietrzające); automatyczne systemy chłodzenia wody morskiej i zatopione grzałki cyfrowe, oba podłączone do komputerowego systemu sterowania (ProfiLux) z czujnikami temperatury w celu regulacji temperatury w każdym zbiorniku; zatopione kamienie napowietrzające w każdym zbiorniku do kontroli poziomu tlenu rozpuszczonego.
    3. Aklimatyzuj ryby przez 2 tygodnie w nowych systemach przed przystąpieniem do eksperymentu.
    4. Wykonywanie codziennej konserwacji
      1. Usuwaj odchody ryb z każdego zbiornika inkubacyjnego i przeprowadzaj 25% wymianę wody morskiej.
      2. Mierz temperaturę za pomocą przenośnego termometru precyzyjnego.
      3. Monitoruj pozostałe abiotyczne parametry wody morskiej (zasolenie, tlen rozpuszczony i pH) za pomocą miernika wieloparametrowego.
      4. Koryguj abiotyczne parametry wody morskiej w razie potrzeby, aby zapewnić stabilność w trakcie całego eksperymentu.
        UWAGA: Warunki abiotyczne w systemach eksperymentalnych mogą się różnić w zależności od specyficznych wymagań każdego przypadku badania. Na przykład, jeśli badanie ma na celu symulację zmian sezonowych lub morskich fal upałów, temperaturę i fotoperiod należy odpowiednio dostosować, aby naśladować naturalne wahania sezonowe. Podobnie, jeśli badanie koncentruje się na symulacji warunków hipoksyjnych lub zakwaszenia oceanów, należy wprowadzić korekty poziomu tlenu i pH wody morskiej. Zapewnia to, że warunki eksperymentalne są jak najbardziej realistyczne i relewantne, co zwiększa ważność i stosowalność wyników badania.
      5. Oceniaj stan zdrowia i dobrostan ryb, identyfikując i zarządzając oznakami stresu lub chorób zgodnie z opisem w krokach 1.2.4.6-1.2.4.8.
      6. Zwracaj uwagę na nieprawidłowe zachowania, takie jak chaotyczne pływanie, utrata apetytu, letarg, agresja lub izolacja.
      7. Sprawdzaj oznaki chorób, w tym zmiany skórne, owrzodzenia, odbarwienia, przykurczone płetwy, nadmiar śluzu lub gwałtowne ruchy skrzeli.
      8. Zapisuj wszystkie obserwacje, odnotowując datę i podjęte działania.
    5. Przeprowadzaj cotygodniowe testy jakości wody.
      1. Mierz poziomy amoniaku (NH3/NH4), azotynów (NO2-) i azotanów (NO3-) za pomocą testów kolorymetrycznych.
        UWAGA: Upewnij się, że wszystkie te parametry znajdują się poniżej poziomów wykrywalnych. Jeśli poziomy przekroczą limity, przeprowadź dodatkową wymianę wody, zwiększ napowietrzanie lub dostosuj filtrację.
    6. Karmienie i monitorowanie żywienia ryb.
      1. Zastosuj wysokiej jakości dietę spełniającą specyficzne wymagania żywieniowe młodzieży ryb (patrz Supplementary Table 1 w celu zapoznania się z przykładem szczegółowego składu diety).
        UWAGA: Upewnij się, że rozmiar granul paszy (2-3 mm) jest odpowiedni dla młodzieży, co ułatwi pobieranie i trawienie pokarmu.
      2. Dostosuj ilość paszy tak, aby odpowiadała 2% średniej masy ciała ryb na dobę.
      3. Karm ryby ręcznie dwa razy dziennie – raz rano i raz po południu (wyznacz konkretne godziny, aby utrzymać stabilną rutynę karmienia).

2. Pobieranie próbek ryb, eutanazja, sekcja i pobieranie nerek głównych

  1. Pobranie ryb z akwariów.
    1. Wybierz ryby z akwariów w sposób losowy, aby uniknąć błędu próbkowania.
    2. Używając siatki, ostrożnie przenieś ryby do tymczasowego pojemnika przechowawczego wypełnionego wodą z akwarium.
      UWAGA: Ogranicz czas manipulacji do minimum, aby zredukować stres.
  2. Przygotowanie roztworu do eutanazji.
    1. Użyj odpowiedniego pojemnika (np. wiadra o pojemności 3 L) nadającego się do przetrzymywania ryb.
    2. Rozpuść odpowiednią ilość Tricaine (MS-222) w wodzie morskiej, aby uzyskać stężenie końcowe 200-300 mg/L18 (OSTRZEŻENIE zobacz Tabelę uzupełniającą 2 oraz Plik uzupełniający 1)).
    3. Zbuforuj roztwór wodorowęglanem sodu do pH 7,2-7,5.
  3. Podanie roztworu do eutanazji.
    1. Umieść ryby w roztworze do eutanazji na co najmniej 10 min lub do momentu zaobserwowania ustania ruchów opercularnych i utraty odruchów (potwierdź eutanazję, sprawdzając brak reakcji na bodźce zewnętrzne).
    2. Zapisz masę ciała (g) i długość całkowitą (cm) ryby.
  4. Wykonanie sekcji ryby.
    UWAGA: Aby zapewnić optymalną jakość próbki i żywotność komórek, proces sekcji należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe, idealnie w ciągu 5 min po eutanazji.
    1. Upewnij się, że temperatura w laboratorium jest utrzymywana na poziomie 19 °C przy użyciu klimatyzacji, aby zminimalizować wahania podczas pobierania i przetwarzania próbek.
    2. Zesterylizuj narzędzia do sekcji (w miarę możliwości autoklawuj instrumenty metalowe) i przygotuj czyste miejsce pracy, używając 70% etanolu (OSTRZEŻENIE, zobacz Tabelę uzupełniającą 2).
    3. Połóż uśpioną rybę na boku na sterylnej tacy sekcyjnej, kierując głowę w stronę ręki niedominującej.
    4. Za pomocą skalpela wykonaj ostrożne cięcie wzdłuż brzusznej linii środkowej ryby, od otworu odbytniczego w kierunku skrzeli.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność, aby nie ciąć zbyt głęboko i nie uszkodzić organów wewnętrznych.
    5. Uważnie użyj nożyczek sekcyjnych, aby poszerzyć nacięcie i odsłonić organy wewnętrzne. Delikatnie unieś płaty ściany ciała, aby uzyskać jasny widok na anatomię wewnętrzną.
    6. Zlokalizuj nerkę głowową: Nerka głowowa znajduje się tuż za skrzelami, w przedniej grzbietowej części jamy ciała i rozciąga się wzdłuż górnej strony jamy ciała, pod kręgosłupem.
      UWAGA: Nerka głowowa ma zazwyczaj ciemniejszy kolor w porównaniu do otaczających ją tkanek (Rysunek 1).
    7. Ostrożnie usuń wszelkie otaczające tkanki, takie jak tłuszcz i tkanka łączna, aby lepiej zwizualizować nerkę głowową.
      UWAGA: Krok ten wymaga delikatnego obchodzenia się z tkanką, aby uniknąć uszkodzenia nerki głowowej.
    8. Używając pęsety z cienkim końcem i nożyczek, ostrożnie unieś nerkę głowową i wykonaj precyzyjne cięcia wokół niej, aby uwolnić ją z otaczających tkanek.
      UWAGA: Traktuj tkankę delikatnie, aby zapobiec uszkodzeniom. W przypadku ryby o masie około 30 g oczekiwana masa nerki głowowej wynosi około 20-30 mg.
    9. Niezwłocznie umieść wycięty organ w sicie komórkowym (siatka nylonowa 100 µm) w sterylnej płytce Petriego, aby zapewnić sterylność i ułatwić kolejne etapy przetwarzania.
      UWAGA: Od tego momentu wszystkie czynności powinny być wykonywane tak szybko, jak to możliwe (w ciągu 5 min), aby utrzymać żywotność komórek. Aby utrzymać próbkę w niskiej temperaturze, wykonuj następne kroki z płytką Petriego umieszczoną na pojemniku wypełnionym lodem i przykrytym folią aluminiową.

Schemat anatomii ryby; proces wycinania nerki głównej; ilustracja edukacyjna z zakresu biologii.
Rycina 1: Położenie nerki głównej: (A) Ilustracja przedstawiająca typową lokalizację nerki głównej za skrzelami, wzdłuż przedniego grzbietowego regionu jamy ciała; (B) Reprezentatywny obraz nerki głównej u dorady, podkreślający jej ciemniejszą barwę w porównaniu do otaczających tkanek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Izolacja leukocytów z nerki głównej (Rycina 2)

Proces izolacji leukocytów z głowowej nerki ryby; schemat wirowania metodą gradientu gęstości.
Rysunek 2: Ilustracyjny opis izolacji leukocytów z głowowej nerki. Protokół obejmuje kilka etapów: rozpoczyna się od homogenizacji tkanki, po której następuje wirowanie w gradiencie gęstości, pobranie pierścienia leukocytów, przemycie pierścienia leukocytów, a kończy się resuspensją i dostosowaniem stężenia komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

  1. Unhomogenizuj tkankę.
    1. Do sterylnej szalki Petriego wlej 2 mL zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS).
    2. Upewnij się, że siatka sitka do komórek (siatka nylonowa 100 µm) styka się z HBSS, ale nie jest całkowicie zanurzona.
    3. Rozdrobnij nerkę głowową na sitku do komórek, używając tłoka strzykawki. Wywieraj delikatny nacisk, aby przepchnąć fragmenty narządu przez nylonową siatkę, tworząc zawiesinę komórkową.
      UWAGA: W przypadku przetwarzania wielu próbek, szalkę Petriego zawierającą zawiesinę komórkową można przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C przez kilka minut do momentu wykonania następnego kroku. Ta zawiesina komórkowa zostanie wykorzystana do izolacji leukocytów.
  2. Przeprowadź wirowanie w gradiencie gęstości.
    1. Przygotuj roztwór medium do gradientu gęstości o gęstości 1,077 g/mL, osmolarności 353 mOsm/kg i pH 7,4 (patrz Supplementary File 1).
      UWAGA: Osmolarność może różnić się w zależności od gatunku ryb, dlatego kluczowe jest dostosowanie osmolarności roztworu medium do gradientu gęstości do specyficznych wymagań każdego gatunku.
    2. Do polistyrenowych probówek o okrągłym dnie o pojemności 5 mL ostrożnie dodaj 600 µL roztworu medium do gradientu gęstości.
    3. Pobierz zawiesinę komórkową (2 mL) i powoli dodaj ją do probówki zawierającej medium do gradientu gęstości. Pierwsza kropla jest kluczowa – dodaj ją bardzo delikatnie, aby nie zdestabilizować fazy medium do gradientu gęstości.
      UWAGA: Należy to wykonać w stosunku 3:10 (medium do gradientu gęstości:zawiesina komórkowa). Do precyzyjnego i delikatnego dodawania użyj sterylnej pipety Pasteura 1 mL. Upewnij się, że końcówka pipety dotyka ścianki probówki, aby nie zaburzyć warstwy medium do gradientu gęstości. Unikaj mieszania próbki z medium do gradientu gęstości.
    4. Wiruj probówki przy 400 x g przez 45 min w temperaturze 4 °C z wyłączonym hamulcem. Zapewnia to zachowanie nienaruszonych warstw podczas procesu.
      UWAGA: Po wirowaniu powinny być widoczne wyraźne warstwy. Leukocyty utworzą pierścień na styku medium do gradientu gęstości i osadu z debris komórkowego (Figure 3).

Próbka do chromatografii w probówce, trzymana w ręku, do rozdziału i analizy w eksperymencie laboratoryjnym.
Rycina 3: Pierścień leukocytów na granicy między medium do gradientu gęstości a osadem z debris komórkowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Zbiór pierścienia leukocytowego.
    1. Za pomocą sterylnej pipety Pasteura delikatnie odessać pierścień leukocytowy (~100 µL) i przenieść go do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL.
      UWAGA: Należy uważać, aby nie zakłócić znacząco warstw, aby uniknąć zanieczyszczenia. Jeśli wydaje się, że pierścień leukocytowy zawiera zanieczyszczenia lub ciemne zawiesiny, zaleca się przefiltrowanie zebranej zawiesiny leukocytów przez nowy mini sitko do komórek (100 µm) w celu zapewnienia czystości. Umieścić mini sitko do komórek nad probówką do mikrocentryfugi 2 mL i delikatnie przenieść zawiesinę leukocytową przez sitko.
  2. Przemycie pierścienia leukocytowego.
    1. Dodać HBSS do probówek do mikrocentryfugi zawierających pierścień leukocytowy, aż objętość osiągnie 2 mL, a następnie delikatnie resuspendować komórki.
      UWAGA: Probówki należy przechowywać w pojemniku wypełnionym lodem i przykrytym folią aluminiową, aby utrzymać próbkę w niskiej temperaturze. Należy upewnić się, że probówki nie mają bezpośredniego kontaktu z lodem. Taki układ chłodzenia należy utrzymać przez cały proces przemywania.
    2. Odwirować próbki przy 400 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C (hamulec może być włączony).
    3. Po wirowaniu ostrożnie odlać nadsącz, pozostawiając osad na dnie (który może być niemal niewidoczny).
    4. Powtórzyć etapy przemywania (dodawanie HBSS, resuspendowanie, wirowanie i usuwanie nadsączu), aż osad będzie wolny od zanieczyszczeń.
  3. Resuspendowanie i dostosowanie stężenia komórek.
    1. Resuspendować komórki w 1 mL HBSS w tych samych probówkach do mikrocentryfugi 2 mL, które były używane do przemywań.
    2. Osiągnąć stężenie komórek między 1 × 104 a 1 × 106 komórek na mL. Jeśli początkowy osad jest duży, może być konieczne dodanie dodatkowego HBSS w celu rozcieńczenia stężenia komórek do pożądanego zakresu. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki 15 mL i dodać więcej HBSS w zależności od uzyskanych wyników zliczania komórek.
      UWAGA: W celu usprawnienia procesu zaleca się użycie automatycznego licznika komórek.

4. Barwienie i utrwalanie leukocytów (Rysunek 4)

UWAGA: Zestawy do barwienia martwych komórek LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kits zapewniają ulepszoną metodę oceny żywotności komórek utrwalonych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. Testy te wykorzystują fluorescencyjny barwnik reaktywny, który oddziałuje z aminami komórkowymi. Jeśli błony komórkowe są uszkodzone, barwnik może przeniknąć do wnętrza komórek, reagując z wolnymi aminami zarówno wewnątrz, jak i na powierzchni komórki, co skutkuje intensywnym barwieniem fluorescencyjnym. I odwrotnie, w komórkach żywych dostępne do reakcji z barwnikiem są jedynie aminy powierzchniowe, co prowadzi do stosunkowo słabego barwienia. Intensywność barwienia zostaje zachowana po utrwaleniu formaldehydem, który dodatkowo konserwuje próbkę, zapobiegając wzrostowi mikroorganizmów. Zestawy LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kits są identyczne, z wyjątkiem zastosowanego barwnika fluorescencyjnego – dostępnego w kolorach niebieskim, fioletowym, aqua, żółtym, zielonym, czerwonym, dalekim czerwonym lub bliskiej podczerwieni (near-IR). W niniejszym badaniu zastosowano reaktywny barwnik fluorescencyjny Near-IR. Ponadto ten jednobarwny test umożliwia równoległe badanie innych parametrów w eksperymencie wielobarwnym.

  1. Przygotuj barwnik.
    1. Doprowadzić odczynniki do temperatury pokojowej (RT): Pozostawić jedną fiolkę z fluorescencyjnym barwnikiem reaktywnym oraz fiolkę z bezwodnym dimetylosulfotlenkiem (DMSO) do momentu osiągnięcia temperatury pokojowej przed zdjęciem zakrętek.
    2. Przygotuj barwnik: Dodaj 50 µL DMSO do fiolki zawierającej barwnik reaktywny. Wymieszać dokładnie i upewnić się, że barwnik został całkowicie rozpuszczony.
    3. Zrekonstytuowany roztwór barwnika należy zużyć jak najszybciej, najlepiej w ciągu kilku godzin.
      UWAGA: Każdy zestaw zawiera pięć oddzielnych fiolek z barwnikiem reaktywnym, co zapewnia materiał wystarczający do zabarwienia co najmniej 40 próbek komórek. Należy jednak pamiętać, że po rekonstytucji roztwór barwnika w DMSO jest stosunkowo niestabilny, zwłaszcza w kontakcie z wilgocią. Niewykorzystane części można przechowywać do 2 tygodni w temperaturze ≤-20 °Cchroniąc przed światłem i wilgocią.
  2. Przebarwić i utrwalić komórki.
    UWAGA: Bufory odpowiednie do barwienia komórek obejmują zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS), roztwór soli fosforanowej (PBS) oraz PBS Dulbecco (D-PBS), pod warunkiem, że nie zawierają one obcych białek, takich jak albumina surowicy bydlęcej lub surowica. Podczas stosowania barwnika reaktywnego względem grup aminowych należy unikać buforów Tris oraz roztworów z azydkiem sodu lub obcymi białkami do resuspensji i przemywania komórek. W niniejszym badaniu zastosowano HBSS ze względu na jego zbilansowany skład jonowy, który pomaga utrzymać równowagę osmotyczną oraz dostarcza niezbędnych jonów i glukozy wspomagających metabolizm i żywotność komórek podczas procesu barwienia. HBSS jest również wolny od obcych białek, co zapobiega interferencji z barwnikiem reaktywnym i zapewnia dokładną ocenę żywotności.
    1. Po policzeniu komórek i dostosowaniu ich gęstości do poziomu 1 x 106 komórek na ml w HBSS, przenieść 1 ml tej zawiesiny komórkowej do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml.
      1. Dla każdego dnia badania należy wywołać śmierć komórek w co najmniej jednej próbce, która posłuży jako kontrola do ustalenia progu intensywności fluorescencji między komórkami żywymi a martwymi. Próbki należy przygotować w probówkach do mikrocentryfugi w następujący sposób:
        Probówka 1: Żywe komórki – niebarwione
        Probetka 2: Żywe komórki – barwione
        Probówka 3: Martwe komórki – niebarwione
        Probówka 4: Martwe komórki – zabarwione
        UWAGA: Te cztery probówki należy przygotować tylko dla jednej próbki w każdym doświadczeniu w celu zastosowania kontroli. Dla pozostałych próbek niezbędne są tylko dwie probówki (probówka 1: próbka – niebarwiona oraz probówka 2: próbka – barwiona), co pozwoli na uzyskanie informacji o komórkach żywych i martwych.
    2. Kontrola pozytywna śmierci komórkowej: Umieścić oznakowane probówki Martwe niebarwione (Probówka 3) oraz Martwe barwione (Probówka 4) w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C przez 7 min w celu wywołania śmierci komórek poprzez obróbkę termiczną.
    3. Barwienie komórek: Dodaj 1 µL zrekonstytuowanego fluorescencyjnego barwnika reaktywnego (z kroku 4.1.2) do 1 ml zawiesiny komórkowej w probówkach 2 i 4 (probówkach przeznaczonych do barwienia) i dokładnie wymieszać.
    4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min, chroniąc przed światłem.
      UWAGA: Jeśli utrwalenie nie jest wymagane, można pominąć poniższe kroki 4.2.5–4.2.7. Zamiast tego należy dwukrotnie przemyć komórki 1 ml roztworu HBSS z 1% albuminą surowicy bydlęcej (patrz Plik uzupełniający 1) i resuspender w 1 ml buforu HBSS z 1% albuminą surowiczą bydlęcą. Analizę na cytometrze przepływowym należy przeprowadzić jak najszybciej; w przeciwnym razie żywotność komórek może zostać obniżona, ponieważ komórki nie zostały utrwalone.
    5. Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml HBSS, a następnie zawiesić je ponownie w 900 µL roztworu HBSS.
    6. Dodaj 100 µL z 37% formaldehydu (UWAGA, patrz Tabela uzupełniająca 2).
    7. Inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    8. Przemyć dwukrotnie 1 ml roztworu HBSS z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA), a następnie resuspenderować komórki w 1 ml roztworu HBSS z 1% BSA.
    9. Przechowywać próbki w lodówce w temperaturze 4 °CPrzeprowadź analizę komórek w ciągu 1 miesiąca po utrwaleniu.
    10. Przeanalizuj zawiesinę utrwalonych komórek metodą cytometrii przepływowej, stosując odpowiedni kanał wzbudzenia i detekcji.
      UWAGA: Prawidłowe kanały wzbudzenia i detekcji mogą się różnić w zależności od używanego urządzenia (patrz Tabela uzupełniająca 3).

Schemat testu żywotności komórek z traktowaniem formaldehydem i procesem analizy cytometrią przepływową.
Rycina 4: Ilustracyjny opis barwienia i fiksacji leukocytów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

5. Cytometria przepływowa

  1. Nabycie danych.
    UWAGA: Procedury wykonywane na cytometrze przepływowym mogą się różnić w zależności od zastosowanego urządzenia. W niniejszym badaniu dane pozyskano przy użyciu cytometru przepływowego Attune NTx.
    1. Przeprowadź analizę próbek.
    2. Umieść probówkę z próbką w porcie pomiarowym.
    3. Rozpocznij nabywanie danych, naciskając start, a następnie kliknij record, gdy częstotliwość zdarzeń (events/second) się ustabilizuje.
    4. Zarejestruj minimum 10 000 zdarzeń dla każdej próbki w bramce singletów, aby zapewnić wiarygodność analizy.
    5. Zapisz wszystkie dane dla każdej próbki i utwórz kopię zapasową na zewnętrznych dyskach lub w chmurze.
  2. Analiza danych.
    UWAGA: Do analizy cytometrii przepływowej dostępnych jest kilka opcji oprogramowania. W niniejszym badaniu analiza danych została przeprowadzona przy użyciu programu FlowJo v10.8.119.
    1. Wczytanie plików danych: Uruchom oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej i prześlij pozyskane z eksperymentu pliki .fcs.
    2. Wizualizacja danych (Rycina 5A): Przedstaw rozproszenie przednie (FSC-A) (XX) względem rozproszenia bocznego (SSC-A) (YY), aby ocenić wielkość i ziarnistość komórek.
      UWAGA: Wykres ten jest powszechnie stosowany do identyfikacji populacji komórek i wykluczania debris na podstawie ich właściwości rozproszeniowych.
    3. Bramkowanie singletów i wykluczanie multipletów (Rycina 5B): Użyj wykresu pola rozproszenia przedniego (FSC-A) względem wysokości rozproszenia przedniego (FSC-H), aby wykluczyć multiplety. Wyznacz bramkę obejmującą wszystkie zdarzenia ułożone w linii na wykresie (pojedyncze komórki) i wyklucz zdarzenia nieułożone (multiplety). Jeśli próbka zawiera zdarzenia o bardzo niskim FSC, wyklucz je, nie włączając ich do bramki pojedynczych komórek, tak aby pozostały jedynie singlety.
    4. Identyfikacja populacji leukocytów (Rycina 5C): Rozróżnij 3 populacje leukocytów na podstawie profilu FSC-A/SSC-A: FSC-Ahigh/SSC-Ahigh to granulocyty, FSC-Amedium/SSC-Amedium to monocyty, a FSC-Alow/SSC-Alow to limfocyty.
    5. Bramkowanie żywotności (Rycina 5D): Ustaw próg dla barwienia barwnikiem żywotności na odpowiadającym mu kanale fluorescencji (NIR, RL3-A). Komórki żywe i martwe definiuje się na podstawie intensywności barwienia barwnikiem LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain: komórki słabo zabarwione definiuje się jako żywe, a komórki silnie zabarwione jako martwe.
    6. Statystyka populacji: Przeanalizuj statystyki dostarczone przez oprogramowanie, w tym całkowitą liczbę zdarzeń (komórek) w każdej bramce oraz procenty komórek całkowitych i bramkowanych.
    7. Eksport danych: Wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego i użyj odpowiedniego oprogramowania statystycznego (GraphPad Prism lub R) do dalszej analizy statystycznej.
      UWAGA: Wybór metod analizy zależy od celów badawczych.

Wykresy rozrzutu cytometrii przepływowej przedstawiające analizę populacji komórek z wynikami barwienia barwnikiem żywotności.
Rycina 5: Strategia bramkowania w cytometrii przepływowej do oceny żywotności komórek nerki głównej: (A) Przedstawia profil FSC-A/SSC-A wszystkich zarejestrowanych zdarzeń. (B) Przedstawia wykluczenie multipletów na podstawie definicji regionu singletów wyznaczonego na podstawie liniowości na wykresie rozproszenia w przód (FSC-A)/rozproszenia w przód (FSC-H). (C) Przedstawia 3 główne populacje zdefiniowane na podstawie FSC-A/SSC-A po wykluczeniu multipletów. (D) Przedstawia histogram barwienia barwnikiem żywotności Live/Dead. Aby ustalić próg pozwalający na rozróżnienie komórek żywych i martwych, leukocyty poddano łagodnemu szokowi termicznemu (50 ˚C, 7 min), a następnie zabarwiono barwnikiem żywotności. Komórki o wysokiej intensywności barwienia dodatnie (++) to komórki martwe, a komórki o niskim stopniu barwienia dodatnie (+-) to komórki żywe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 6 przedstawia reprezentatywne dane z cytometrii przepływowej ukazujące populacje leukocytów wyizolowane z nerki głównej młodzieńczych dorad seabream (Sparus aurata) oraz ich żywotność komórkową z zastosowaniem protokołu opisanego w niniejszym badaniu. Rycina porównuje dwie próbki: jedną o wysokiej żywotności komórkowej, w której ryby poddano warunkom optymalnym (Rycina 6A), oraz drugą o niskiej żywotności komórkow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metoda opracowana w tym badaniu stanowi znaczący postęp w badaniach nad immunologią ryb i daje nadzieję na lepsze zrozumienie odpowiedzi immunologicznych ryb i zrównoważenia zasobów morskich. S. aurata jest cennym gatunkiem ryb morskich z rodziny sparidae, służącym jako idealny organizm modelowy z kilku powodów, w tym ze względu na swoje znaczenie ekologiczne i ekonomiczne, a także wszechstronność w badaniach laboratoryjnych w kilku dziedzinach nauki, takich jak fizjologia, immunologia, toksykologia i akwakultur...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak finansowych, osobistych lub zawodowych konfliktów interesów, które mogłyby mieć wpływ na badania, analizy, interpretację danych, pisanie lub decyzję o złożeniu manuskryptu do publikacji.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fundação Portuguesa para a Ciência e Tecnologia (FCT I.P.), w ramach projektu Aqua-CLIMADAPT (PTDC/CTA-AMB/0592/2021, https://doi.org/10.54499/PTDC/CTA-AMB/0592/2021). Wyrażamy uznanie dla BioLab wspieranego przez Zakład Stosowanych Nauk Biologicznych (UCIBIO) oraz Stowarzyszone Laboratorium Jednostki Badawczej Zielonej Chemii – LAQV, które są finansowane ze środków krajowych z FCT/MCTES (ODPOWIEDNIO UIDB/04378/2020 i UIDB/50006/2020), a także Associate Laboratory Institute for Health and Bioeconomy – i4HB (LA/P/0140/2020). Prace te były również wspierane przez Komisję Europejską w ramach projektu GLYCOTwinning (umowa o grant nr 101079417) oraz FCT za pośrednictwem InnoGlyco (2022.04607.PTDC). Isa Marmelo dziękuje również FCT I.P. za grant doktorski (2020.04413.BD, https://doi.org/10.54499/2020.04413.BD).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kamienie napowietrzająceN/AN/A
Aquafeed SPAROS, Lda., PortugaliaN/ADieta wysokiej jakości 
Automatyczny sprzęt do liczenia komórek NanoEnteK, KoreaN/AEVE automatyczny licznik komórek (NanoEnteK)
Automatyczne systemy chłodzenia wodą Foshan Weinuo Refrigeration Equipment Co., Ltd, ChinyNie dotyczy
Bio kulki 1,5-calowy filtr do stawu akwariowegoTMC Iberia, PortugaliaNie dotyczy
albuminy surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich, NiemcyA7906
Wiadro (3 l)N/AN/AAby przygotować i przeprowadzić eutanazję 
Wiadra (5 L)N/AN/ADo transportu zwierząt 
Sitka komórkoweJetbiofil, ChinyCSS-013-100Sitko komórkowe, 100 μ m nylonowa siatka, sterylna, żółta
CentrifugueFisher Scientific, NiemcyNie dotyczy Zestawkolorymetryczny accuSpin Micro 17 R
do amoniaku (NH4 + / NH3)Tropic Marin, USANie dotyczy
Zestaw testowy kolorymetryczny do azotanów (NO3-)Tropic Marin, USABrak
Zestaw do testów kolorymetrycznych dla azotynów (NO2-)Tropic Marin, USANie dotyczy
komputera N/AN/APozyskiwanie i analiza danych uzyskanych z cytometru przepływowego
Komputerowy system sterowania (Profilux)GHL, NiemcyNie dotyczyProfiLux 3 Zewnętrzna
woda dejonizowana N/AN/ADo czyszczenia cytometru przepływowego
Gradient gęstości Medium: PercollCytiva, Sigma-Aldrich, Niemcy17-0891-01
Waga cyfrowaKERN & Sohn GmbH, NiemcyN/AKERN EMS 300-3
Etanol 70%Millipore, Supelco, PortugaliaEX0281Aby utrzymać miejsce pracy w czystości
Szkiełka do liczenia komórek EVE NanoEnteK, KoreaN/A
Probówki Falcon (15 ml)pluriSelect Life Science, Niemcy05-00002-01Sterylny
worek filtracyjny TMC Iberia, Portugalia/A400 mikronów
Gąbka filtracyjnaNieN/A
 ThermoFisher Scientific, USAN/AAttune cytometr przepływowy
FlowJo v10.8.1 OprogramowanieBD Life SciencesN/A
Formaldehyd 37%Sigma-Aldrich, Niemcy8.18708
Wełna szklanaN/AN/A
Zrównoważony roztwór soli Hanksa Merck Life Science S.L, PortugaliaH6648Modyfikowany, z wodorowęglanem sodu, bez czerwieni fenolowej, chlorku wapnia i siarczanu magnezu, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych
ŻYWE/MARTWE Zestawy do naprawy barwników martwych komórek Life Technologies Europe, HolandiaL10119Barwnik fluorescencyjny w bliskiej podczerwieni +
główne pompy wodneEHEIM, Niemcy
probówki do mikrowirówek 1200 (2 ml)MARKA, Merck, NiemcyZ628034sterylne
końcówki do mikropipet Sartorius, Niemcy790010, 790200, 791000Kompatybilny z Sartorius, 1-10 i mikro; L, 2-20 i mikro; L, 20-200 i mikro; L, 100-1000 i mikro; L
MikropipetySartorius, Niemcy728020, 728030, 728060, 728070Sartorius ProlinePlus 1-10 µ L, 2-20 i mikro; L, 20-200 i mikro; L, 100-1000 i mikro; L
Mini sitka komórkowe pluriSelect Globalna siedziba główna w dziedzinie nauk przyrodniczych, Niemcy43-10100-50PluriStrainer 100 µ m nylonowa siatka, sterylny
wieloparametrowy przyrząd pomiarowy WTW, NiemcyMulti 3420 SET G + cyfrowa cela konduktometryczna IDS (TetraCon 925) + Optyczny czujnik tlenu rozpuszczonego IDS (FDO 925) + elektroda pH IDS (SenTix 940)
Pipety Pasteura (1 mL, 5 mL)Humeau Expert du laboratoire, Francja248295Sterylne
szalki PetriegoSarstedt, Niemcy82.1194.50060 x 15 mm, Polistyren, Sterylny
pH-metrHanna Instruments Inc., RumuniaHANNA HI2211
Polistyrenowe rurki Falcon z okrągłym dnem (5 ml)Fisher Scientific, Niemcy14-959-2ASterylny
przenośny termometr precyzyjny Ebro Electronic,Niemcy N/ATFX 430
Odpieniacze białkoweMantisN/ATornado 120
Koraliki kontroli jakości/Koraliki do testu wydajnościThermofisher Scientific, USAN/A
Zbiorniki kwarantannowe NiedotyczyZbiorniki o całkowitej objętości 660 l
Prostokątne szklane zbiorniki/akwariaNieZbiorniki o całkowitej pojemności 200 l
LodówkaNieprzechowywania próbek w temperaturze 4 & stopni;
C Linijka 30 cmN/AN/ADo pomiaru długości ryby
Wodorowęglan soduHoneywell Fluka, Niemcy31437Wodorowęglan sodu (NaHCO3)
Chlorek soduSigma-Aldrich, NiemcyS9888
Sterylne narzędzia preparacyjne NIEDOTYCZY NIE DOTYCZY(np. skalpel, nożyczki, kleszcze z cienką końcówką, taca/deska do sekcji)
Zanurzone grzejniki cyfrowe TMC Iberia, Portugalia300 W, Cyfrowe grzałki V2Therm
Strzykawki 1 mLIVFSTORE, USA8300014579-MEASterylne, HSW Soft-Ject Strzykawki  do maceracji czujników temperatury głowy i nerki
GHL, NiemcyPT 1000
Tricaine (MS-222) ThermoFisher Scientific, Niemcy1180005003-aminobenzoesan etylu, sól kwasu metanosulfonowego, 98% (C10H15NO5S)
Sterylizator wody ultrafioletowej EHEIM, Niemcy5305010ClearUVC-36
 Fisher Scientific, NiemcyN/AFisherbrand IsotempTM (P/N U01318)
Oprawy wodoodporneN/AN/A N/A
testowy danych N dotyczy Cytometr przepływowy DMSO Uniwersalne dotyczy Nie dotyczy dotyczy Do Kąpiel wodna

Bibliografia

  1. Samaï, H. C., et al. Procedures for leukocytes isolation from lymphoid tissues and consequences on immune endpoints used to evaluate fish immune status: A case study on roach (Rutilus rutilus). Fish Shellfish Immunol. 74, 190-204 (2018).
  2. Mokhtar, D. M., Zaccone, G., Alesci, A., Kuciel, M., Hussein, M. T., Sayed, R. K. A. Main components of fish immunity: An overview of the fish immune system. Fishes. 8 (2), 93(2023).
  3. Lulijwa, R., et al. Characterisation of Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) blood and validation of flow cytometry cell count and viability assay kit. Fish Shellfish Immunol. 88, 179-188 (2019).
  4. Uribe, C., Folch, H., Enriquez, R., Moran, G. Innate and adaptive immunity in teleost fish: a review. Vet Med. 56 (10), 486-503 (2011).
  5. Bjørgen, H., Koppang, E. O. Anatomy of teleost fish immune structures and organs. Immunogenetics. 73 (1), 53-63 (2021).
  6. Santos, R. A., et al. In vitro modulation of gilthead seabream (Sparus aurata L.) leukocytes by Bacillus spp. extracellular molecules upon bacterial challenge. Fish Shellfish Immunol. 121, 285-294 (2022).
  7. Witeska, M., Kondera, E., Ługowska, K., Bojarski, B. Hematological methods in fish - Not only for beginners. Aquaculture. 547, 737498(2022).
  8. Titus, J., et al. Development and validation of a flow cytometry method to examine circulating leukocyte subpopulations in barramundi (Lates calcarifer). Comp Immunol Rep. 6, 200142(2024).
  9. Marmelo, I., et al. Eco-innovative aquafeeds biofortified with Asparagopsis taxiformis to improve the resilience of farmed white seabream (Diplodus sargus) to marine heatwave events. Heliyon. 10 (15), e35135(2024).
  10. Seibel, H., Baßmann, B., Rebl, A. Blood Will Tell: What Hematological Analyses Can Reveal About Fish Welfare. Front Vet Sci. 8, 616955(2021).
  11. Franke, A., Beemelmanns, A., Miest, J. J. Are fish immunocompetent enough to face climate change. Biol Lett. 20 (2), 20230346(2024).
  12. Fazio, F. Fish hematology analysis as an important tool of aquaculture: A review. Aquaculture. 500, 237-242 (2019).
  13. Fazio, F., Saoca, C., Costa, G., Zumbo, A., Piccione, G., Parrino, V. Flow cytometry and automatic blood cell analysis in striped bass Morone saxatilis (Walbaum, 1792): A new hematological approach. Aquaculture. 513, 734398(2019).
  14. Lulijwa, R., Alfaro, A. C., Merien, F., Meyer, J., Young, T. Advances in salmonid fish immunology: A review of methods and techniques for lymphoid tissue and peripheral blood leucocyte isolation and application. Fish Shellfish Immunol. 95, 44-80 (2019).
  15. Esteban, M. Á, Muñoz, J., Meseguer, J. Blood cells of sea bass (Dicentrarchus labrax l.). Flow cytometric and microscopic studies. Anat Rec. 258 (1), 80-89 (2000).
  16. Inoue, T., Moritomo, T., Tamura, Y., Mamiya, S., Fujino, H., Nakanishi, T. A new method for fish leucocyte counting and partial differentiation by flow cytometry. Fish Shellfish Immunol. 13 (5), 379-390 (2002).
  17. Ye, R. R., et al. Immune competence assessment in marine medaka (Orzyias melastigma)-a holistic approach for immunotoxicology. Environ Sci Pollut Res. 24 (36), 27687-27701 (2017).
  18. American Veterinary Medical Association. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, IL. (2020).
  19. FlowJoTM Software (for Windows). Version v10.8.1 (BD Life Sciences). , At https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/software/flowjo-v10-software (2023).
  20. Mhalhel, K., et al. Review on Gilthead Seabream (Sparus aurata) aquaculture: Life cycle, growth, aquaculture practices and challenges. J Mar Sci Eng. 11 (10), 2008(2023).
  21. Toni, M., Manciocco, A., Angiulli, E., Alleva, E., Cioni, C., Malavasi, S. Review: Assessing fish welfare in research and aquaculture, with a focus on European directives. Animal. 13 (1), 161-170 (2018).
  22. Kır, M. Thermal tolerance and standard metabolic rate of juvenile gilthead seabream (Sparus aurata) acclimated to four temperatures. J Therm Biol. 93, 102739(2020).
  23. Esteban, M. Á, Meseguer, J. Phagocytic defence mechanism in sea bass (Dicentrarchus labrax L.): An ultrastructural study. Anat Rec. 240 (4), 589-597 (1994).
  24. Esteban, M. Á, Mulero, V., Muñoz, J., Meseguer, J. Methodological aspects of assessing phagocytosis of Vibrio anguillarum by leucocytes of gilthead seabream (Sparus aurata L.) by flow cytometry and electron microscopy. Cell Tissue Res. 293 (1), 133-141 (1998).
  25. Rodríguez, A., Esteban, M. Á, Meseguer, J. Phagocytosis and peroxidase release by seabream (Sparus aurata L.) leucocytes in response to yeast cells. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 272 (1), 415-423 (2002).
  26. Hamoutene, D., Payne, J. F., Volkoff, H. Effects of tebufenozide on some aspects of lake trout (Salvelinus namaycush) immune response. Ecotoxicol Environ Saf. 69 (2), 173-179 (2007).
  27. Pierrard, M. -A., Roland, K., Kestemont, P., Dieu, M., Raes, M., Silvestre, F. Fish peripheral blood mononuclear cells preparation for future monitoring applications. Anal Biochem. 426 (2), 153-165 (2012).
  28. Guardiola, F. A., Logothetis, P., Meseguer, J., Esteban, M. Á Evaluation of silver nanospheres on viability and innate cellular parameters of gilthead seabream (Sparus aurata L.) head-kidney leucocytes. Fish Shellfish Immunol. 69, 99-107 (2017).
  29. Campos-Sánchez, J. C., Guardiola, F. A., Esteban, M. Á In vitro effects of cantharidin on gilthead seabream (Sparus aurata) head-kidney leucocytes. Fish Shellfish Immunol. 123, 20-35 (2022).
  30. Korytář, T., Dang Thi, H., Takizawa, F., Köllner, B. A multicolour flow cytometry identifying defined leukocyte subsets of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Fish Shellfish Immunol. 35 (6), 2017-2019 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja leukocytówgradient gęstości Percollocena żywotności komórekcharakterystyka komórek odpornościowychfiksacja leukocytówbarwienie żywych i martwych komórekimmunologia ryb
Izolacja, utrwalenie i charakterystyka młodocianych leukocytów nerkowych dorady za pomocą cytometrii przepływowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.