Dwujęzyczny proces obliczeniowy do identyfikacji potencjalnych inhibitorów PLK1 w amerykańskim języku migowym i angielskim

Summary

Ten dwujęzyczny protokół zapewnia obliczeniowy proces odkrywania leków, oceniający interakcje białko-ligandy kinaz Polopodobnych 1 do 3 (PLK1–3) oraz właściwości absorpcji, dystrybucji, metabolizmu, wydalania, toksyczności i stabilności (ADMET-S) naturalnych cząsteczek pochodzących z bazy danych.

Abstract

Kinaza podobna do Polo 1 (PLK1) odgrywa kluczową rolę w fazach S, G2 i M cyklu komórkowego, a jej nadekspresja jest często obserwowana w wielu nowotworach, w tym raku piersi, gdzie przyczynia się do niestabilności genomowej i zaburzenia apoptozy. W przeciwieństwie do konwencjonalnych inhibitorów konkurencyjnych z ATP, które celują w domenę kinazową, selektywna inhibicja domeny polo-box (PBD) PLK1 oferuje obiecującą strategię zakłócania interakcji białko-ligand, kluczowych dla progresji mitozy, co wywołuje apoptozę w komórkach nowotworowych. Jednak wysokie podobieństwo strukturalne między PLK1 a jego homologami (PLK2 i PLK3), które są niezbędne odpowiednio dla funkcji neurologicznych i reakcji na stres, wymaga wyjątkowej selektywności, aby uniknąć efektów pozacelowych. Aby sprostać temu wyzwaniu, protokół obejmuje dwujęzyczny (amerykański język migowy i angielski) proces obliczeniowy, który integruje wirtualne przesiewanie, klasteryzację strukturalną, dokowanie białek i ligandów, przewidywanie powinowactwa wiązań, profilowanie ADMET-S oraz analizę stabilności mechaniki kwantowej (QM). Począwszy od bazy danych produktów naturalnych SuperNatural 3.0, związki zostały przefiltrowane według kryteriów istotności raka piersi i podobieństwa do leków, klastrowane w celu zapewnienia różnorodności chemicznej oraz oceniano ich interakcje ze strukturami PLK1-, PLK2- i PLK3-PBD. Chociaż wirtualne dokowanie i oceny, in silico ADMET-S, nie mogą jednoznacznie potwierdzić selektywności ani mechanizmu działania, to badanie generuje hipotezy testowalne i priorytetowo traktuje skoncentrowany zestaw kandydatów pochodzących z produktów naturalnych do przyszłych symulacji dynamiki molekularnej, walidacji biochemicznej lub badań eksperymentalnych.

Introduction

Kinazy podobne Polo (PLK) to rodzina kinaz białkowych, strukturalnie składająca się z domeny N-końcowej oraz C-końca, składającej się z jednej lub dwóch domen polo-box (PBD)^1,2. Liczba i funkcjonalna różnorodność tych domen polo-box różnią się w zależności od członków rodziny PLK. PLK1 uczestniczy w fazach S, G2 i M podziału komórkowego. W cyklu komórkowym PLK1 pełni funkcję punktu kontrolnego uszkodzenia DNA w fazie S oraz regulatora kondensacji chromosomowej i dojrzewania centrosomów w fazie G2. PLK1 sprzyja także wejściu mitotycznemu do fazy M, po czym następuje montaż wrzeciona, wejście anafazy i cytokineza ^3,4. Nadmierna ekspresja PLK1 prowadzi do niestabilności genetycznej spowodowanej nieprawidłowym tworzeniem się centrosomów, co skutkuje nieprawidłowym funkcjonowaniem cykli komórkowych uniemożliwiających komórkom regulację apoptozy. Taka nadekspresja obserwuje się w rakach płuc, głowy i szyi, przełyku, żołądka, jelita grubego oraz piersi⁴. Dlatego hamowanie PLK1 przez środki skierowane na PBD może wywołać apoptozę ^5,6. Ten sposób działania ma na celu osiągnięcie wysokiej selektywności, aby uniknąć hamowania PLK2 i PLK3, które są kluczowe dla funkcji neurologicznych i zarządzania stresem genotoksycznym³.

PLK2 działa jako supresor guza w określonych kontekstach, regulując przejście G1/S i wspierając degradację cykliny E, aby zapobiec niekontrolowanej proliferacji komórek. PLK3 wykazuje złożoną rolę zarówno w regulacji cyklu komórkowego, jak i w odpowiedzi na stres genotoksyczny, przyczyniając się do utrzymania integralności genomu poprzez aktywację punktów kontrolnych uszkodzenia DNA oraz indukcję apoptozy⁷. Co ważne, choć hamowanie PLK1 stało się obiecującą strategią terapeutyczną w leczeniu nowotworów, kluczowe role PLK2 i PLK3 w funkcjonowaniu neurologicznym i reakcji stresowej wymagają opracowania wysoce selektywnych inhibitorów, aby zminimalizować efekty pozacelowe na te kluczowe kinazy³. Ten kontekst biologiczny i podobieństwa strukturalne powyżej 38^% podkreślają znaczenie identyfikacji związków, które konkretnie atakują domenę polo-box (PBD) PLK1, bez zakłócania funkcji ochronnych PLK2 i PLK3 w normalnej fizjologii komórkowej.

Znane inhibitory kinazy polopodobnej (PLK), szczególnie te skierowane na PLK1, były szeroko badane ze względu na ich potencjalne zastosowania terapeutyczne w leczeniu nowotworów. Opracowano i wdrożono do badań klinicznych kilka związków, w tym BI 2536, volasertib (BI 6727), onvansertib (NMS-1286937) oraz GSK461364, często jako inhibitory konkurencyjne z ATP ^8,9,10. Inne typy inhibitorów są skierowane do PBD, w tym tymomochinon (TQ)^11,12, poloksyna ^13,14 oraz Allopole-A¹⁵. Chociaż podobno obiecujące, obecnie nie ma zatwierdzonych inhibitorów specyficznych dla PBD ani zaawansowanych badań klinicznych ze względu na wyzwania, w tym nieoptymalne właściwości ADMET-S oraz efekty pozacelowe⁶. Na przykład kilka inhibitorów PLK1-PBD to podobno niespecyficzne białkowe alkilatory¹⁶, co ogranicza ich zastosowanie kliniczne. Dlatego poprawa selektywności i profili ADMET-S potencjalnych inhibitorów PLK1-PBD pozostaje kluczowym celem w odkrywaniu leków.

Celem tego badania jest zbadanie potencjalnych inhibitorów PLK1-PBD o właściwościach ADMET-S za pomocą wirtualnego przesiewania, filtrowania podobieństwa strukturalnego, dokowania, obliczeń energii wiązania oraz oceny ADMET-S. PLK2 i PLK3 poddawano tym samym protokołom oceny potencjalnej selektywności. Chociaż istnieje wiele potoków obliczeniowych do odkrywania inhibitorów kinaz, niewiele z nich integruje równoległe selektywne przesiewanie PBD PLK1–3 z kompleksowymi analizami stabilności ADMET-S i kwantowo-mechanicznej, szczególnie z wykorzystaniem bibliotek produktów naturalnych. Workflow opiera się na ustalonych paradygmatach wirtualnego screeningu, ale jest dostosowany do dostępności edukacyjnej i wczesnego generowania hipotez. Protokół wymaga jedynie standardowego laptopa (8 GB RAM), darmowego oprogramowania akademickiego oraz braku wcześniejszej wiedzy programistycznej, co czyni go odpowiednim do szkół średnich, licencjackich i magisterskich, w tym do badań naukowych opartych na kursach (CURE).

Procesem obliczeniowym tej pracy jest przygotowanie białek, podczas którego struktury PLK1-PBD, PLK2-PBD i PLK3-PBD są pobierane z Protein Data Bank (PDB) lub modelowane i przetwarzane w celu rozwiązania rozbieżności strukturalnych. Następnie przeprowadzono przesiewowe badania w bazie naturalnych produktów, filtrujące związki na podstawie potencjału przeciwraka piersi oraz zgodności z Regułą Pięciu. Kolejne etapy to klastrowanie w 50 reprezentatywnych struktur na podstawie molekularnego fingerprintingu i podobieństwa. Przedstawiciele ci przeszli dokowanie białko-ligandów oraz obliczenia powinowactwa wiązania, generując dane interakcji dla trzech PLK. Następnie właściwości ADMET-S są oceniane za pomocą trzech różnych serwerów internetowych, aby przewidzieć farmakokinetykę, podobieństwo do leków, toksyczność oraz stabilność metaboliczną. Obliczenia QM zostały wykorzystane do oceny stabilności cząsteczkowej poprzez analizę najwyższego zajętego orbitalu molekularnego (HOMO) oraz najniższego niezajętego orbitalu molekularnego (LUMO) luki HOMO–LUMO. Na koniec dane ADMET-S zostały przeanalizowane w celu filtrowania i klasyfikowania związków na podstawie kryteriów fizykochemicznych, absorpcji, dystrybucji, metabolizmu, wydalania, toksyczności i stabilności jako potencjalnych i selektywnych inhibitorów PLK1-PBD.

Protocol

Identyfikatory Zasobów Badawczych (RRID) oraz numery wersji wszystkich używanych narzędzi programowych są dostępne w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie białka docelowego

1. Stwórz katalog roboczy dla tego projektu, w którym można przechowywać pliki strukturalne i wyniki obliczeniowe.
2. Odwiedź Protein Data Bank, aby pobrać identyfikator docelowego białka PLK1-PBD (4HCO¹¹) oraz skontaktować się z działem Chemistry at HARvard Molecular Mechanics - Graphical User Interface (CHARMM-GUI ^17,18), aby rozwiązać wszelkie rozbieżności strukturalne.
   1. Odwiedź CHARMM-GUI i zarejestruj konto akademickie. Po rejestracji konta akademickiego kliknij generator danych, następnie PDB Reader, wpisz PDB ID 4HCO i kliknij następny krok.
   2. Na następnej stronie upewnij się, że wybrano tylko PROA – łańcuch białkowy A i kliknij kolejny krok na kolejnych dwóch stronach.
   3. Pobierz step1_pdbreader.pdb do katalogu, przemianuj plik na 4hco lub preferred i użyj edytora tekstu lub kodu, aby przemianować wystąpienia histydyny (HSD) na (HIS).
3. Powtórz procedurę dla PLK2-PBD (identyfikator PDB: 4XB0¹⁹) za pomocą CHARMM-GUI.
   UWAGA: Dla struktur bez identyfikatorów PDB, takich jak PLK3-PBD, należy stosować struktury modelowane homologią lub Alphafold²⁰. Zapewnij dokładność sekwencji z Uniprot²¹.

2. Przesiewanie bazy danych produktów naturalnych

1. Odwiedź bazę danych Biblioteki SuperNatural 3.0 z produktami naturalnymi i wybierz podstronę²² dotyczącą chorób.
   1. Wybierz raka piersi z dowolnymi lub zerowymi granicami ufności, ponieważ wszystkie wyniki muszą być programowo filtrowane, i kliknij Znajdź. Kliknij na Pobierz kompletny plik wyników , aby zapisać wyniki w preferowanym katalogu jako .csv. Następnie użyj kodu do filtrowania tych o granicach ufności 0,900–1,000 (n = 1 193 na 73 406).
      UWAGA: Alternatywnie, identyfikator Encyklopedii Genów i Genomów z Kioto (KEGG) dla raka piersi można wpisać na podstronie²³ szlaków.
   2. Przejdź do podstrony FAQ , na dole znajdziesz cały zestaw danych dostępny do pobrania jako plik .csv. Pobierz to i użyj skryptu, aby dopasować łańcuchy Simplified Molecular Input Line Entry System (SMILES) ze zbioru danych do identyfikatorów SuperNatural dla 1 193 cząsteczek i przygotuj listę ich ciągów SMILES (smiles.csv).

3. Próbkowanie klastrowe

1. Pobierz dystrybucję Anaconda (https://www.anaconda.com/download) zawierającą niemal wszystkie pakiety open-source lub połącz zintegrowane środowisko programistyczne (IDE), takie jak RStudio (RStudio Desktop - Posit) lub Jupyter (Jupyter Notebook). Zainstaluj RDKit²⁴, otwartoźródłowy pakiet do chemii i uczenia maszynowego z wykorzystaniem Conda.
   UWAGA: Instrukcje instalacji Conda i tworzenia środowiska Conda można znaleźć w dokumentacji conda 25.9.2.dev31. Aby dowiedzieć się o instalacji RDKit i konfiguracji modułu w środowisku, zobacz dokumentację Installation — The RDKit 2025.03.6.
2. Umieść skrypt "Lipinski.py" w Pliku Uzupełniającym 1 w tym samym folderze co "smiles.csv" i uruchom go. Skrypt otwiera środowisko Conda, ładuje moduły, odczytuje plik stringów MILES, stosuje filtr oparty na Lipińskiej Zasadzie 5 do szacowania biodostępności i absorpcji (n = 999 z 1 193) oraz zapisuje listę ciągów SMILES jako "all.csv".
   UWAGA: Potwierdź, że "all.csv" zostało wygenerowane i zawiera ~999 związków (podzbiór filtrowany). Otwórz plik, aby zweryfikować, czy każdy wpis zawiera poprawny ciąg znaków MILES. Python działa w RStudio po wykonaniu następującego w konsoli: library(reticulate); retykulować::use_condaenv(imięNazwiskaWładzy)
3. Umieść skrypt "Clustering.py" (Plik Dodatkowy 1) w tym samym folderze co "all.csv" i uruchom go w preferowanym IDE. Skrypty ładują moduły klastrowania, odczytują plik stringów SMILES i grupują złożone w 50 klastrów na podstawie molekularnego fingerprintingu i podobieństwa Tanimoto.
   UWAGA: 50 reprezentatywnych struktur (rep_struct.csv, w Pliku Uzupełniającym 1) jest zapisanych w katalogu jako lista ciągów tekstów MILES. Podobieństwo Tanimoto (znane również jako indeks Jaccarda w informatyce)²⁵ to metryka służąca do ilościowego określenia podobieństwa strukturalnego między dwiema cząsteczkami na podstawie ich molekularnych odcisków palców, przy czym współczynnik Tanimoto mieści się od 0 (brak podobieństwa) do 1 (identyczne odciski palców). Upewnij się, że "rep_struct.csv" zawiera dokładnie 50 unikalnych wpisów SMILES reprezentujących każdy klaster.

4. Obliczanie powinowactwa i powinowactwa wiązań białko-ligandów

1. Odwiedź serwer internetowy Blind Docking Docking (CB-Dock2)²⁶ oparty na AutoDock Vina, który jest kierowany wykrywaniem wnękin.
   1. Przejdź do zakładki dokowania i prześlij białko 4HCO.
   2. Aby przesłać ligand, kliknij na draw ligand i wklej ligand z listy ciągów SMILES (rep_struct.csv, Plik Uzupełniający 1). Wpisz adres e-mail w następnym polu, aby łatwiej zbierać dane w pakowaniu, a następnie kliknij Auto Blind Docking. Powtórz to dla pozostałych 49 przedstawicieli małych cząsteczek, oznaczając je lig1, lig2, ..., lig50.
2. Wejdź do wyniku, który został wysłany mailem i pobierz foldery zip do podkatalogu zatytułowanego 4HCO, nazywając je zwyczajnie (4hco_lig1, 4hco_lig2, ..., 4hco_lig50).
   1. Rozpakuj foldery i usuń wszystkie pliki oprócz złożonych plików proteinowo-ligandowych kończących się na ".complex.pdb".
      UWAGA: Sprawdź, czy każdy katalog ligandów (4hco_lig1 do 4hco_lig50) zawiera odpowiadający mu plik ".complex.pdb".
   2. Otwórz przykładowy plik .complex.pdb w edytorze tekstu, aby dokładnie zanotować ID łańcucha proteinowego: P oraz identyfikator ligandu: A:unl, a następnie ponownie spakuj foldery za pomocą narzędzia do kompresji plików.
   3. Odwiedź serwer internetowy PROtein binDing enerGY prediction (PRODIGY), aby ocenić selektywność i powiązanie wiązania białko-ligandów²⁷.
      1. Kliknij na zakładkę PRODIGY-lig (białko-mała cząsteczka), aby przesłać folder z wieloma kompleksami białko-ligandów jednocześnie (np. 4hco_lig1). Wprowadź identyfikatory łańcucha białka i ligandów, zakończ weryfikację captcha i kliknij Submit Prodigy-Ligand.
      2. Po przetworzeniu danych kliknij na plik archiwalny wszystkich wyników (.zip), aby pobrać wyniki. Powtórz poprzedni krok i zbieraj wyniki dla wszystkich podkatalogów do 4hco_lig50.
   4. Powtarzaj wszystkie kroki dla białek 4XB0 i PLK3, zwracając szczególną uwagę na nazewnictwo plików (np. 4xb0_lig1 czy plk2_lig1).
      UWAGA: Potwierdzaj, że wyjściowe CSV dla wszystkich kompleksów białko-ligandów zostały pobrane i zawierają zarówno kolumny danych ΔG, jak i reszt interfejsowych.

5. Ocena ADMET-S

1. Odwiedź platformę ADMETlab3 3.0²⁸.
   1. Kliknij ROZPOCZNIJ w sekcji "ADMET Screening" i wpisz listę SMILES.
      1. Otwórz rep_struct.csv w katalogu, aby wkleić całą listę znaków SMILES do pola tekstowego i wyślij.
      2. Oceń farmakokinetykę i właściwości podobności do leków za pomocą kolorowego systemu punktacji platformy oraz pobierz wyniki oceny jako plik .csv do dalszej analizy.
      3. Przejdź do narzędzia SwissADME²⁹.
2. Wklej listę ciągów SMILES dla wszystkich 50 cząsteczek do pola wejściowego.
   1. Kliknij Run, aby obliczyć właściwości biodostępności i przepuszczalności, w tym penetrację BBB.
   2. Pobierz wynik jako plik .csv do integracji z innymi wynikami ADMET.
3. Pobierz i zainstaluj ToxTree³⁰ (Toxic Hazard Estimation by a decision tree) kompatybilne z systemem operacyjnym użytkownika.
   1. Otwórz oprogramowanie przez terminal za pomocą komendy: sh Toxtree.sh
   2. Wprowadź ciągi SMILES pojedynczo do ToxTree, aby sklasyfikować toksyczność zgodnie z regułami Cramera.
   3. Eksportuj wyniki jako plik .csv do integracji z innymi danymi ADMET.
      UWAGA: Sprawdź, czy wyjściowe CSV ADMETLab3 i SwissADME odpowiadają liczbie ligandów (n = 50) oraz czy wyniki Toxtree klasyfikują każdy związek według reguł Cramera (I–III).
4. Po zainstalowaniu ORCA³¹ utwórz folder o nazwie stability w katalogu roboczym oraz podfoldery dla każdej cząsteczki (na przykład plk1_lig1, plk1_lig2, ..., plk1_lig50).
   1. Użyj Avogadro (Avogadro), aby zbudować każdą cząsteczkę z jej łańcucha MILES: przejdź do zakładki Rozszerzenia i kliknij Optymalizuj geometrię, aby zoptymalizować cząsteczkę. Generuj pliki wejściowe ORCA za pomocą Extensions > ORCA > Generuj Input ORCA i zastosuj następujące ustawienia:
      ! B3LYP OPT FREQ def2-TZVP
      %maxcore 4000
      %koleś
      NPROCS 1
      koniec
   2. Zmodyfikuj pobrany plik .sh zadania dla każdego ligandu, aby zawierał unikalne nazwy stanowisk oraz adres e-mail. Następnie przenieś katalog "stabilności" do systemu wysokowydajnego (HPC), używając następujących poleceń:
      SS xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu
      MKdir ~/4hco
      scp -r /local/path/to/stability xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu:~/4hco
   3. Wykonaj zadania za pomocą Simple Linux Utility for Resource Management (menedżer obciążeń SLURM dla klastrów HPC) za pomocą skryptu pętli:
      dla i w {1..50}; do
      cd ~/4hco/stability/plk1_lig${i}
      chmod +x job_lig${i}.sh
      sbatch job_lig${i}.sh
      załatwione.
   4. Po otrzymaniu e-maili z zakończeniem zadania przejdź do folderów ligandów i otwórz pliki wyjściowe, aby przejrzeć dane i zanotować wartości HOMO i LUMO:
      cd ~/4hco/stabilność/plk1_lig1
      nano lig1.out

6. Analiza danych ADMET-S

1. Połącz dane o właściwościach fizykochemicznych pochodzące z radarowych map biodostępności i przepuszczalności SwissADME w plik .csv.
   1. Zapisz plik .csv z SwissADME i nazwij go "Physiochemical.csv."
   2. Umieść skrypt "Physiochemical.py" (Plik Uzupełniający 1) w tym samym folderze co "Physiochemical.csv" i uruchom go.
   3. Stosuj następujące kryteria: nHD: 0–7, nHA: 0–12, nStereo: <2, LogP: 0–3, LogD: 1–3, LogS: –4 do 0,5, Fsp3: >0,41 oraz nHet: 1–15.
2. Dane absorpcji i dystrybucji można wyprowadzić ze SwissADME.
   1. Zrób migawkę i zapisz wykres BOILED-Egg³² w SwissADME.
   2. Stosuj następujące kryteria: cząsteczki muszą leżeć w obszarze "jajka" i działać jako inhibitory p-glikoprotein, ponieważ preferowane są czerwone punkty.
3. Dane metaboliczne wywodź z ADMETlab3.0 dla substratu i inhibitorów cytochromu (CYP).
   1. Zapisz .csv plik z ADMETlab3.0 i nazwij go "Metabolism.csv".
   2. Edytuj plik .csv i zachowaj tylko kolumny CYP-inh i CYP-sub.
   3. Umieść skrypt "Metabolism.R" (Plik Uzupełniający 1) w tym samym folderze co "Metabolism.csv" i uruchom go.
   4. Należy stosować następujące kryteria: preferowane są inhibitory CYP p450 oraz niesubstrat jako kategoria 0.
4. Wyprowadz dane wydalnicze z ADMETlab3.0 dla oczyszczania i okresu półtrwania.
   1. Zapisz .csv plik z ADMETlab3.0 i nazwij go "Excretion.csv".
   2. Edytuj plik .csv i zachowaj tylko kolumny cl-plasma i t0.5.
   3. Umieść skrypt "Excretion.py" (Plik Uzupełniający 1) w tym samym folderze co "Excretion.csv" i uruchom go.
   4. Stosuj następujące kryteria: klirens osocza: 0,01–5 ml/min/kg.
   5. dane o toksyczności z Toxtree dla klasy toksyczności oraz ADMETlab3.0 dla liczby toksykoforów.
      1. Zapisz .csv z ADMETlab3.0 i nazwij go "Toxicity.csv."
      2. Edytuj plik .csv, zachowując tylko kolumnę Toksyfor, i dodaj nową kolumnę zapisującą klasę toksyczności każdego ligandu z Toxtree.
      3. Umieść skrypt "Toxicity.py" (Plik Uzupełniający 1) w tym samym folderze co "Toxicity.csv" i uruchom go.
      4. Zastosuj następujące kryterium: liczba toksykoforów powinna wynosić 0–2.
   6. Dane stabilności wyprowadzamy z plików wyjściowych ORCA. Te ("ORBITAL ENERGIES", konkretnie wartości energetyczne HUMO i LUMO).
      1. Stwórz tabelę Excel, zapisującą energie HUMO i LUMO każdego liganda jako osobne kolumny.
      2. Dodaj nową kolumnę obliczającą przerwę pasmową (HUMO–LUMO = przerwa pasmowa).
      3. Zapisz tabelę Excel jako "Stability.csv."
      4. Umieść skrypt "Stability.py" (Plik Uzupełniający 1) w tym samym folderze co "Stability.csv" i uruchom go.
      5. Stosuj następujące kryteria: różnica przerwy pasmowej powinna wynosić od 3,6 do 5 eV.

Results

Protokół pliku target protein structure zapewnia, że plik docelowego jest zoptymalizowany do analizy i dokowania opartego na strukturze. Powstały plik struktury, w formacie PDB, jest wolny od brakujących reszt i wodorów, brakujących typów atomów oraz niepotrzebnych składników, takich jak cząsteczki wody i współkrystalizowane ligandy. Rysunek 1A,B przedstawia różnice wizualne (wizualizowane przez Mol* Viewer³³) w strukturach przed i po przygotowaniu. Jeśli pozostaną jakiekolwiek pozostałości w formatowaniu (np. nierozpoznane nazwy atomów czy niepełne reszty), CB-Dock2 zazwyczaj zgłasza błąd podczas przesyłania. W takim momencie można wprowadzić drobne ręczne korekty, takie jak zmiana nazwy HSD na HIS lub usunięcie niestandardowych pozostałości, przed ponownym podjęciem kroku dokowania.

Rysunek 2 pokazuje wyniki klasteryzacji poprzez analizę głównych składników (PCA) opartą na molekularnym fingerprintingu i podobieństwie Tanimoto. Na rysunku każdy klaster jest zgrupowany przez owalny w odcieniu szarości, zawierający podobnie kolorowane kropki, które reprezentują cząsteczki w tych klastrach. Składniki PCA 1 i 2 na osiach zapewniają dwuwymiarową liniową reprezentację redukcji z elementów wysokich wymiarów w macierzach Tanimoto. W tym badaniu podobieństwo Tanimoto jest wykorzystywane podczas etapu próbkowania klastrów, aby zmniejszyć redundancję i zwiększyć różnorodność chemiczną wśród 999 naturalnych produktów zgodnych z Lipinskim. Poprzez parowe obliczanie podobieństw Tanimoto za pomocą molekularnych odcisków palców, zbiór danych dzieli się na 50 klastrów strukturalnie powiązanych związków. Następnie wybierana jest pojedyncza reprezentatywna cząsteczka z każdego klastra, co zapewnia, że ostateczny zestaw 50 ligandów obejmuje szeroką przestrzeń chemiczną, jednocześnie minimalizując redundancję obliczeniową podczas dokowania i analiz ADMET-S. Ta strategia zwiększa efektywność i reprezentatywność wirtualnego przesiewania, szczególnie przy pracy z dużymi bibliotekami produktów naturalnych, takimi jak SuperNatural 3.0. (patrz Rysunek 2).

Symulowane są optymalne pozy dla każdego kompleksu białko-ligand, a towarzyszą im przewidywane powinowactwa w postaci wyników Vina wśród pięciu pozycji CurPocket białka PLK1 w CB-Dock2, uwzględniając siły van der Waalsa i wiązania wodorowe. Przykładowa symulacja ligandu 1 na Rysunku 3 pokazuje najlepsze wiązanie z drugą pozą CurPocket (C2), z najniższym wynikiem Vina – –7,5 kcal/mol, w porównaniu do pozostałych czterech najlepszych poz. Dokowanie molekularne z CB-Dock2 odbywa się za pomocą funkcji punktacji opartej na parametrach empirycznych oraz stochastycznym algorytmie globalnej optymalizacji. CB-Dock2 został rygorystycznie zweryfikowany i wykazał lepsze wyniki w porównaniu z innymi nowoczesnymi metodami dokowania na ślepo, co czyni go doskonałym wyborem do badań dokowania^26,34. Serwer osiąga około 85% skuteczności w przewidywaniu pozycji wiązania (RMSD <2 Å), przewyższając popularne narzędzia, w tym pierwszą wersję CB-Dock, SwissDock, COACH-D oraz MTiAutoDock³⁴. Ta wysoka dokładność przypisuje się innowacyjnej integracji dwóch komplementarnych schematów dokowania w CB-Dock2: podejść opartych na strukturze i opartych na szablonach.

Rysunek 4 ilustruje mapę ciepła średnich przewidywanych powinowactw dla każdej kombinacji białko-ligand, korzystając z przewidywanych powinowactw serwera PRODIGY. Wyższe powinowactwa, oznaczane przez niższe energie molowe (kcal/mol) i bardziej zielone odcienie mapy cieplnej, są korzystnymi powinowactwami wiązania. Natomiast niższe powinowactwa, oznaczane przez wyższe energie molowe i bardziej czerwieńcze odcienie mapy cieplnej, są mniej korzystne. Z punktu widzenia selektywności idealnie jest posiadanie związków o korzystnych powinowactwach do docelowego białka (PLK1) względem homologów (PLK2–3). Na przykład ligand 27 jest selektywnym ligandem PLK1-PBD względem ligandu 45, który wykazuje podobne powinowactwa we wszystkich trzech białkach. Chociaż sygnały 3, 5, 6, 7, 27, 28, 34, 35 i 49 wykazują większą afinitet do PLK1-PBD niż PLK2/3, są one chemicznie zróżnicowane w przestrzeni dwuwymiarowych linii palców (średnia ECFP4 Tanimoto ≈ 0,135, brak pary ≥ 0,50), co sugeruje, że szersza specyficzność prawdopodobnie wynika z zachowanej geometrii kieszonkowej PBD oraz wspólnych 3D wzorców farmakofor/interakcji, a nie z tożsamości rusztowań. Rekomendacje obejmują porównanie interakcji z odciskiem palców oraz mapowanie farmakoforów w celu identyfikacji czynników strukturalnych rozpoznania PLK1-PBD.

Wyniki oceny właściwości fizykochemicznych przedstawiono na wykresie radarowym (rysunek 5). Oceniane właściwości obejmują interakcje atomowe, rozpuszczalność oraz biodostępność. Niektóre związki wyróżniają się bardziej pożądanymi właściwościami fizykochemicznymi w dopuszczalnych zakresach: nHD = 0–7, nHA = 0–12, nStereo < 2, LogP = 0–3, LogD = 1–3, LogS = –4 do 0,5, Fsp3 > 0,41 oraz nHet = 1–15. Ten wykres radarowy zapewnia kompleksową, wielowymiarową wizualizację właściwości fizykochemicznych 50 reprezentatywnych ligandów zidentyfikowanych w procesie przesiewowym obliczeniowym. Ma na celu ocenę, jak dobrze każdy związek spełnia wcześniej określone kryteria "lekowopodobne" poprzez wykreślanie jego właściwości względem ustalonych dolnych i górnych granic. Wykres przedstawia dziesięć kluczowych deskryptorów molekularnych rozmieszczonych wokół osi biegunowej, w tym pKa kwasowy i pKa zasadowy. Zacieniony obszar między zielonym wielokątem (Dolna granica) a niebieskim wielokątem (górny poziom) wyznaczał idealny lub akceptowalny zakres dla każdej własności, na podstawie progów podanych w protokole. Górne i dolne granice kwasu pKa (2–12 oraz zasad pKa (3–10) zostały przypisane na podstawie przeglądów literatury^{35, 36, 37}, ponieważ nie ma jednej górnej i dolnej granicy pKa w odkrywaniu leków. Każda kolorowa linia reprezentuje jeden z 50 ligandów. Kształt utworzony przez połączenie punktów danych dla pojedynczego ligandu pokazuje jego profil na wybranych dziesięciu właściwościach jednocześnie. Zdecydowana większość z 50 ligandów mieści się w granicach lub bardzo blisko akceptowalnego obszaru wyznaczonego przez zielone i niebieskie wielokąty. Wskazuje to, że początkowe etapy filtrowania, szczególnie zastosowanie Reguły Pięciu Lipińskiego oraz klastrowanie oparte na podobieństwie Tanimoto, były bardzo skuteczne w wzbogacaniu zbioru danych o cząsteczkach o korzystnych właściwościach lekowych. Zaleca się przedstawienie pełnego zakresu udokumentowanych wartości dla wszystkich parametrów.

Rysunek 6A–C przedstawia składniki danych ADME z ADMETlab3.0 i SwissADME. Zaczynając od absorpcji i dystrybucji, model BOILED-Egg³⁸ na Rysunku 6A z SwissADME przedstawia wchłanianie i dystrybucję leków poprzez lipofilowość i przepuszczalność, co wskazują żółte i białe elipsy na wykresie. Obejmuje substraty i inhibitory P-gp, reprezentowane odpowiednio niebieskimi i czerwonymi punktami, gdzie hamowanie P-gp jest kluczowe dla wyższych wskaźników wchłaniania. Na Rysunku 6B mapa ciepła metabolizmu wizualizuje hamowanie i podłoże około 7 odmian enzymów cytochromu p450 CYP. Pożądanym efektem dla ligandów jest pełnienie funkcji CYP jako nie-inhibitorów i niesubstratów (zielony), a preferowane wyniki potwierdzają bezpieczny profil bezpieczeństwa leku przy zerowych lub niskich interakcjach lek-lek. Rysunek 6C przedstawia dane wydalające dotyczące klirensu i okresu półtrwania leku. Wydalanie można wyróżnić po optymalnym klirencie osocza (<5 mL/min/kg). Okres półtrwania wszystkich leków przeciwnowotworowych zależy od mechanizmu działania, toksyczności i celu leku. Idealny okres półtrwania równoważy utrzymanie stężenia leku w ramach okna terapeutycznego, minimalizując toksyczność i umożliwiając wygodne harmonogramy dawkowania^39,40.

Przedstawiono połączenie dwóch typów ocen toksyczności. Na Rysunku 7A pokazano liczbę toksykoforów zidentyfikowanych przez ADMETlab3.0 dla każdego ligandu. Nie ma określonego progu ani informacji o dopuszczalnych zakresach toksykoforów. Na Rysunku 7B zastosowanie Toxtree dostarcza informacji dotyczących klasy toksyczności (I-III) oraz naruszeń i przestrzegania reguły Cramera. Przykładowy wynik dla ligandu 1 pokazuje wyniki toksyczności oraz jego kod SMILES na górnym pasku, a strukturę w lewym dolnym oknie. Identyfikacja toksyczności klasy w prawym górnym oknie wskazuje na wysoką toksyczność (Klasa III) na podstawie Reguł Cramera dla ligandu 1, a nie innych możliwości, takich jak Klasa II (średnia toksyczność) czy Klasa I (niska toksyczność). Okno w prawym dolnym rogu pokazuje pisemne uzasadnienie identyfikacji klas oparte na drzewie decyzyjnym reguły Cramera.

Obliczenia częstotliwości drgań w ORCA QM dla zoptymalizowanych konstrukcji obliczają wartości energii orbitalnej do określenia przerwy energetycznej. Rysunek 8 przedstawia przerwę pasmową (eV) każdego ligandu wyprowadzoną z różnicy między HOMO a LUMO. Zakres progowy jest reprezentowany w zacienionym obszarze między 3,6 eV a 5,0 eV, gdzie każdy punkt w zacienionym obszarze spełnia poziomy energii związane z bardziej pożądaną stabilnością i reaktywnością. Przegląd całego procesu obliczeniowego podsumowano na Rysunku 9, który ilustruje kolejne etapy od przygotowania białek docelowych i przesiewania bazy produktów naturalnych po ocenę ADMET-S, zaprojektowanych w celu identyfikacji selektywnych inhibitorów PLK1-PBD przy jednoczesnym zapewnieniu właściwości lekowych i stabilności chemicznej. Ta wizualna mapa roadmapa podkreśla modułowość, dostępność i przydatność protokołu do wdrażania edukacyjnego.

Tabela 1 operacjonalizuje protokół, przekształcając go z liniowej sekwencji instrukcji w solidny, świadomy błędów pipeline odpowiedni do użytku w klasie i samodzielnych badań. Wyraźnie odnosi się do powtarzalności, znanego wyzwania w obliczeniowym odkrywaniu leków, poprzez osadzanie kryteriów walidacji w kluczowych punktach przejścia. Na przykład potwierdzenie, że reszty histydynowe są jednolicie oznaczone jako "HIS" po przetwarzaniu CHARMM-GUI zapobiega cichym awariom podczas dokowania w dalszej fazie, a także weryfikacja integralności SMILES przed klastrowaniem zapobiega kaskadowym błędom w predykcji ADMET. Tabela podkreśla również projektowanie pedagogiczne, gdzie każda wskazówka dotycząca rozwiązywania problemów jest praktyczna przy minimalnym doświadczeniu obliczeniowym (na przykład "otwórz .complex.pdb w edytorze tekstu, aby sprawdzić identyfikatory łańcuchów"), co jest zgodne z celem manuskryptu, jakim jest dostępność dla osób niesłyszących, licencjackich/magisterskich oraz uczniów szkół średnich. Ponadto, poprzez oznaczanie kroków, w których wyniki nieproporcjonalnie wpływają na wyniki, takie jak ocena selektywności za pomocą porównawczego punktowania PRODIGY, tabela pomaga użytkownikom priorytetyzować uwagę i zasoby.

Kluczową siłą tego zintegrowanego przepływu pracy jest zdolność do ujawniania rozbieżności między komplementarnymi prognozami obliczeniowymi, ujawniając przypadki brzegowe, które podkreślają ograniczenia każdej pojedynczej metody. Na przykład ligand 5 dla PLK1-PBD wykazywał silny wynik CB-Dock2 Vina (−7,9 kcal/mol) oraz korzystne powinowactwo PRODIGY (ΔG = −9 kcal/mol, Rysunek 4), mimo to nie przeszedł kilku filtrów ADMET. Nie spełniał modelu absorpcji i rozkładu BOILED-Egg, przedstawiał mniej pożądaną wartość klirencji w osoczu (9,3 mL/min/kg, Rysunek 6), co sugeruje szybkie wyeliminowanie, i został sklasyfikowany przez Toxtree jako Cramer Class III (wysoka toksyczność) zawierający pięć toksyforów (Rysunek 7A). Z kolei ligand 33 wykazywał umiarkowaną przez PRODIGY przewidywaną afinitet PLK1 (−5,4 kcal/mol), ale spełniał wszystkie kryteria ADMET, wykazując niską toksyczność (klasa I), optymalny LogP (0,7) oraz korzystny rozkład absorpcji i klirens plazmy. Pomimo słabszego powinowactwa, ligand 33 jest kandydatem bardziej przypominającym lek. Ten kontrast ilustruje fundamentalną zasadę wczesnego etapu odkrywania leków: sama wysoka więźliwość jest niewystarczająca bez korzystnej farmakokinetyki i bezpieczeństwa. Jednocześnie związki takie jak ligand 5, choć mają słabe wyniki ADMET, mogą nadal dostarczać cennych pomysłów na przyszłą optymalizację, aby poprawić bezpieczeństwo lub stabilność metaboliczną bez utraty potencjalności.

Chociaż wczesne filtry w tym procesie są przeznaczone do segregacji i priorytetyzacji, a nie do trwałego wykluczenia, dalsze uproszczenie 50 kandydatów oznacza niektórych jako "top hity" poprzez zastosowanie pożądanych limitów dostępnych w narzędziach ADMET i literaturze. Spośród 50 przesiewowych ligandów ocenionych na 114 deskryptorach związanych z ADMET i elektronicznych, 13 spełniło co najmniej 95 pożądanych kryteriów właściwości. Spośród nich sześć związków (10, 13, 14, 32, 43 i 47) wykazało zarówno korzystne profile ADMET-S, jak i wyższe powinowactwo wiązania do PLK1-PBD niż PLK2/3, dlatego są uznawane za najważniejsze kandydaty inhibitorów (Rysunek 10). Porównawcze analizy podobieństwa strukturalno-funkcjonalnego i ilościowego wykazały, że zidentyfikowane trafienia dzielą kluczowe cechy farmakoforyczne ze znanymi inhibitorami PLK1-PBD, co sugeruje potencjalną zbieżność w zachowaniu wiązania. Wszystkie trafienia zawierały aromatyczne lub heteroaromatyczne rusztowania, które odzwierciedlają hydrofobowe systemy pierścieniowe TQ, Poloxiny i Allopole-A, umożliwiając interakcje π–π oraz hydrofobowe w kieszeni PBD. Funkcjonalne nakładanie się było widoczne dzięki zachowanym motywom wiązań wodorowych (grupy karboksylowe, amidowe i karbonylowe), analogiczne do tych pośredniczących w kluczowych kontaktach polarnych w inhibitorach referencyjnych. Elastyczne alifatyczne i cykliczne linkery obecne w kilku uderzeniach odpowiadają konformacyjnej adaptacji analogów Poloxiny, ułatwiając orientację w kierunku niezbędnych reszt wiązania. Ilościowo wyniki podobieństwa Tanimoto (0,36–0,54) potwierdziły umiarkowane podobieństwo strukturalne między trafieniami a znanymi inhibitorami, przy czym Hity 10, 13 i 14 najbardziej przypominały Poloxinę, Hit 32 TQ, a Hity 43 i 47 Allopole-A. Łącznie wyniki te podkreślają wyraźne nakładanie się strukturalne i funkcjonalne, wskazując, że trafienia prawdopodobnie naśladują topologię wiązania i wzorce interakcji zweryfikowanych inhibitorów PLK1-PBD, zachowując jednocześnie wystarczającą nowość do dalszej optymalizacji (Rysunek 10).

Aby ocenić odporność przepływu pracy obliczeniowej, znane inhibitory PLK1-PBD (Poloxinpan¹⁴ i Allopole-A¹⁵) zostały przeanalizowane jako pozytywne kontrole, przy czym Metformina i Imeglimin (dwa strukturalnie niepowiązane środki przeciwcukrzycowe bez zgłaszanej aktywności PLK1-PBD) były kontrolą ujemną w analizach ADMET-S, dokowania i wiążenia. Pozytywne kontrole wykazywały powinowactwa wiązania odpowiednio –5,8 i –5,6 kcal/mol, podczas gdy kontrolne negatywne wykazywały słabsze powinowactwa –5,1 kcal/mol (Metformina) i –4,8 kcal/mol (Imeglimin), co odpowiadało ich brakiem aktywności wiązającej PBD. Co ciekawe, ocena ADMET-S wykazała, że negatywne kontrole spełniały bardziej pożądane opisy (88 z 114 właściwości) niż pozytywne (80 z 114), co potwierdzało zdolność workflow do rozróżniania farmakokinetycznej atrakcyjności od specyficznego potencjału wiązania dla celu. Te wiązania wzmacniają znaczenie utrzymania zrównoważonej perspektywy: związki nie powinny być przedwcześnie odrzucane wyłącznie na podstawie suboptymalnych prognoz ADMET, jeśli wykazują silną afinitet do celu, ponieważ takie rusztowania mogą nadal stanowić cenne punkty wyjścia do optymalizacji. Z kolei cząsteczki o doskonałych właściwościach farmakokinetycznych, ale słabym wiązaniu, mogą służyć jako niskie ryzyko dla rozwoju analogowego. Dalsza walidacja biochemiczna i komórkowa jest konieczna, aby potwierdzić te obserwacje obliczeniowe i udoskonalić kryteria priorytetyzacji.

Rysunek 1: Porównania konstrukcyjne między nieprzygotowaną a CHARMM-GUI przygotowaną strukturą 4HCO. (A) Struktura 4HCO przesłana bezpośrednio z PDB, podkreślająca brakujące reszty. (B) Struktura 4HCO po protokole przygotowania CHARMM-GUI. 4HCO (PLK1-PBD związany z TQ) został wybrany, ponieważ należy do nielicznych kryształów PLK1-PBD z ligandem organicznym, co czyni go bezpośrednio zastosowanym w odkryciu inhibitora małocząsteczkowego opartego na strukturze. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Analiza głównych składników (PCA) 999 naturalnych produktów zgodnych z Lipinskim według klastrowania K-means na podstawie molekularnego fingerprintingu i podobieństwa Tanimoto. Każda kropka reprezentuje związek związkowy, zabarwiony przypisanym klastrem (1–50), z klastrami pogrupowanymi szarymi elipsami, aby podkreślić podobieństwo chemiczne. Ścisłe klastrowanie wewnątrz klastrów oraz separacje między klastrami wskazują, że klasteryzacja oparta na Tanimoto skutecznie zmniejszyła redundancję strukturalną, jednocześnie zachowując różnorodność chemiczną w całym zbiorze danych. Ta różnorodność zapewnia, że 50 reprezentatywnych ligandów wybranych do dokowania w dół obejmujących szeroki obszar przestrzeni chemicznej, zwiększając odporność i uogólnialność wyników wirtualnego przesiewania. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Ślepe dokowanie CB-Dock2 identyfikuje pozycję wiązania ligandu 1 o wysokiej afinitecie w domenie PLK1 polo-box (PBD). Prezentowana konformacja C2 w CurPocket (wynik Vina = −7,5 kcal/mol) reprezentuje optymalną pozycję spośród pięciu przewidywanych miejsc wiązania, charakteryzującą się korzystnymi kontaktami van der Waalsa oraz wiązaniami wodorowymi z kluczowymi resztami PBD (Trp414, His538 i Lys540). Ten wynik potwierdza zastosowanie ślepego dokowania opartego na strukturze do lokalizowania biologicznie istotnych kieszeni wiązań w przypadku braku współkrystalizowanego ligandu, pokazując, jak workflow priorytetowo traktuje pozy z najsilniejszą przewidywaną energią wiązania do analizy selektywności w dalszej fazie. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Mapa ciepła serwera PRODIGY przewidywała powinowactwa na podstawie kombinacji białek i ligandów. Heatmap bezpośrednio odpowiada na nakładanie się ligandów związanych z PLK1, PLK2 i PLK3. Podczas gdy niektóre ligandy (w tym ligand 45) wykazują porównywalne powinowactwa wiązania we wszystkich trzech izoformach PLK, co sugeruje słabą selektywność, inne (w szczególności ligandy 3, 5, 6, 7, 27, 28, 34, 35 i 49) wykazują silną preferencję PLK1 (ΔΔG ≥ 3,0 kcal/mol w porównaniu do PLK2/PLK3), co odpowiada celowi selektywnej inhibicji PBD. Ilościowo 20 z 50 ligandów wykazuje niemal dwukrotną selektywność dla PLK1 względem PLK2 i PLK3, opierając się na wartościach ΔG przewidzianych przez PRODIGY. To różnicowe wiązanie przypisuje się subtelnym zmianom w kieszonkach wiązania PBD, które rejestruje protokół ślepego dokowania. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 5: Reprezentacja właściwości fizykochemicznych połączona z ADMETlab3.0 i SwissADME. Parametry to: nHD = liczba dawców wodoru, nHA = liczba akceptorów wodoru, zasadowe pKa, kwaśne pKa, nStereo = liczba stereocentrów, LogP = współczynnik dystrybucji n-oktanol/woda, LogD = współczynnik rozkładu n-oktanol/woda przy pH=7,4, LogS = wartość rozpuszczalności wodnej, Fsp3 = liczba sp3 zhybrydyzowanych węgli/całkowita liczba węgla oraz nHet = liczba heteroatomów. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 6: Kombinacja wyników ADME z ADMETlab3.0 i SwissADME. (A) Wykres BOILED-Egg Wildman-Crippin LogP (WLOGP) vs. Topologiczny obszar powierzchni polarnej (TPSA) ze SwissADME reprezentujący przepuszczalność bariery krew-mózg (BBB) w obszarze żółtym (żółtkowy), absorpcję przez przewód pokarmowy (HIA) w białej elipsie, substraty P-glikoproteiny oraz niesubstraty odpowiednio w niebieskim i czerwonym punktach. Cząsteczki znajdujące się poza "jajeczkiem" uważa się za mające słabe wchłanianie i rozkład. (B) Mapa ciepła metabolizmu z różnymi identyfikatorami cytochromu P450 (CYP) dotyczącymi stabilności metabolizmu wątroby (HLM), gdzie czerwony służy jako inhibitory/substraty, a zielony jako nie-inhibitory/nie-substraty, pozostawiając zielony jako pożądany. (C) Wydalanie obejmuje parametry, oczyszczanie plazmy oraz okres półtrwania. Przerywana czerwona linia oznacza pożądany prześwit plazmy (<5 mL/min/kg), natomiast 5-15 mL/min/kg i >15 mL/min/kg oznaczają odpowiednio umiarkowany i wysoki prześwit. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Rysunek 7: Zintegrowane profilowanie toksyczności ujawnia krytyczne ryzyko bezpieczeństwa wśród przesiewających ligandów. (A) Rozkład ilości toksykoforów wśród 50 reprezentatywnych produktów naturalnych, zgodnie z prognozami ADMETlab3.0. (B) Przykładowe wyniki toksyczności dla ligandu 1, wskazujące toksyczność klasy III oznaczone na czerwono, z rozwlekłym wyjaśnieniem powiązanych zasad Cramera podanymi w poniższym polu tekstowym. To podwójne podejście oceny (toksykofory + klasa Cramera) umożliwia wczesną triażę związków wysokiego ryzyka. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 8: Energie przerwy energetycznej HOMO–LUMO (w eV) dla 50 reprezentatywnych ligandów pochodzących od produktu naturalnego, obliczone za pomocą ORCA na poziomie teorii B3LYP/def2-TZVP. Obszar zacieniany (3,6 do 5,0 eV) oznacza optymalne okno stabilności: przerwy pasmowe poniżej 3,6 eV sugerują wysoką reaktywność chemiczną lub potencjalną fotodegradację, podczas gdy wartości powyżej 5,0 eV mogą wskazywać na słabą polaryzowalność elektronową i obniżoną zdolność wiązania. Ligandy mieszczące się w tym zakresie wykazują korzystną równowagę stabilności kinetycznej i odpowiedzi molekularnej, co wspiera ich priorytetyzację jako potencjalnych kandydatów na inhibitory PLK1-PBD. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 9: Schemat przepływowy dwujęzycznego obliczeniowego procesu odkrywania leków. Proces rozpoczyna się od przygotowania struktur PBD PLK1-PLK3, następnie następuje przesiewowe badanie bazy SuperNatural 3.0 skoncentrowane na chorobach oraz filtrowanie za pomocą Reguły Pięciu Lipińskiego (masa cząsteczkowa ≤ 500 Da, dawcy wiązań wodorowych ≤ 5, akceptory ≤ 10, LogP ≤ 5). Związki reprezentatywne są wybierane po klasteryzacji, a następnie oceniane za pomocą dokowania białko-ligand, prognozowania powinowactwa wiązania oraz kompleksowego profilowania ADMET-S, w tym absorpcji, dystrybucji, metabolizmu, wydalania, toksyczności oraz oceny stabilności QM. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 10: Porównawcze nakładanie się strukturowo-funkcjonalnych ligandów z czołowymi ligandami kandydatami a znanymi inhibitorami PLK1-PBD. Na rysunku przedstawiono sześć najważniejszych związków kandydatów (10, 13, 14, 32, 43 i 47) zidentyfikowanych w wyniku połączonych analiz wirtualnego przesiewania, klasteryzacji, powinowactwa wiązania oraz profilowania ADMET-S. Ligandy te spełniały co najmniej 95 z 114 pożądanych deskryptorów fizykochemicznych i farmakokinetycznych oraz wykazywały wyższe powinowactwa wiązania do PLK1-PBD w porównaniu do PLK2/3. Aby ocenić potencjalną zbieżność strukturalną i funkcjonalną, każdy ligand porównano ze znanymi inhibitorami PLK1-PBD TQ, Poloxiną i Allopole-A, na podstawie wspólnych podstawowych motywów farmakoforycznych oraz parowych współczynników podobieństwa Tanimoto (odcisków ECFP4). Umiarkowane wyniki podobieństwa (0,36–0,54) oraz typowe grupy funkcjonalne, takie jak pierścienie aromatyczne lub heteroaromatyczne, pary dawcy/akceptor wiązań wodorowych oraz hydrofobowe linkery, wskazują na częściowe nakładanie się cech wiązania. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Etap workflow	Punkt kontrolny pośredni (jak potwierdzić sukces)	Krytyczny krok (dlaczego decyduje o sukcesie/porażce)	Typowe problemy i wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów
1. Przygotowanie białka docelowego	• Plik PDB ładuje się bez błędów w widoku Mol*. • Brak brakujących pozostałości w kieszeni wiązania (inspekcja wizualna). • Reszty histydyny oznaczone jako "HIS" (nie HSD/HSE)	Niedokładna struktura białka → fałszywe kieszenie wiązające → mylące pozy dokowania. CHARMM-GUI zapewnia prawidłową protonację, umieszczanie wodoru oraz usuwanie wód/ligandów.	Problem: CB-Dock2 odrzuca plik PDB. Napraw: Usuń niestandardowe reszty, upewnij się, że obecny jest tylko łańcuch białkowy i standaryzuj nazwy atomów/reszt za pomocą edytora tekstu.
2. Filtrowanie produktów naturalnych (Lipinski'a Rule 5)	• "all.csv" zawiera tylko ważne SMILES (niepuste, chemicznie analizowalne). • Liczenie spodziewanych dopasowań (np. 999/1 193).	Nieprawidłowy SMILES powoduje awarię RDKit, serwerów dokujących i narzędzi ADMET. Filtrowanie musi zachować ważność chemiczną.	Problem: Skrypt zawodzi podczas klastrowania. Poprawka: Dodaj walidację SMILES za pomocą Chem.MolFromSmiles(smiles, sanitize=True) w Pythonie; Loguj i usuwaj nieprawidłowe wpisy przed dalszą pracą.
3. Próbkowanie klastrowe	• 50 unikalnych SMIELIÓW w "rep_struct.txt". • Wykres PCA (rys. 2) pokazuje wyraźne rozdzielenie klastrów.	Słabe klasteryzowanie → redundantnych lub niezróżnicowanych przedstawicieli → nieefektywne selekcjonowanie.	Problem: Wszystkie cząsteczki skupiają się w jednej grupie. Poprawka: Zweryfikować typ odcisku palca (np. Morgan/ECFP4), próg Tanimoto oraz standaryzację MILES. Rozważ zwiększenie liczby klastrów, jeśli różnorodność jest niska.
4. Dokowanie ligandów białkowych (CB-Dock2)	• Każdy ligand zwraca ≥1 plik ".complex.pdb". • Wyniki Vina są ujemne (np. ≤ −5 kcal/mol). • Ligand jest umieszczony w CurPocket (nie powierzchni).	Dokowanie definiuje pozycję wiązania i powinowactwa. Błędna poza → fałszywe prognozy PRODIGY.	Problem: Zadanie się nie udaje lub ligand nie jest oddobodowany. Poprawka: Ponowne pobranie ligandu w CB-Dock2 za pomocą SMILES; upewnij się, że w nazwie pliku nie ma specjalnych znaków; Sprawdź e-mail pod kątem statusu pracy. Jeśli jest uporczywy, spróbuj SwissDock jako kopię zapasową.
5. Pokrewstwo Wiązania (PRODIGY)	• PRODIGY zwraca wartości ΔG dla wszystkich kompleksów. • Powinowactwa korelują z wynikami CB-Dock (Vina) (spójność trendów).	Ocena selektywności opiera się na dokładnym ΔG dla PLK1 vs. PLK2/PLK3. Błędnie przypisane identyfikatory łańcucha/ligandu → błędne prognozy.	Problem: błąd "Łańcuch nie znaleziony". Poprawka: Otwórz .complex.pdb w edytorze tekstu; potwierdzić identyfikator łańcucha białkowego (np. "P") oraz nazwę reszty ligandowej (np. "UNL"); poprawnie wprowadzać w PRODIGY.
6. Ocena ADMET-S	• Wszystkie 50 wyników SMILES w SwissADME, ADMETlab3.0 i ToxTree. • Brak wierszy "N/A" lub "Error" w wyjściowych CSV.	Niespójne dane ADMET → błędne rankingi kandydatów. Platformy mogą zawieść na egzotycznych rusztowaniach produktów naturalnych.	Problem: ADMETlab3.0 odrzuca SMILES. Poprawka: Kanonikalizuj SMMILES za pomocą RDKit (MolToSmiles(MolFromSmiles(...))). W ToxTree wprowadzaj jedną cząsteczkę na raz i weryfikuj renderowanie struktury.
7. Stabilność kwantowa (ORCA)	• Każde zadanie ORCA kończy się bez "SCF not converged" lub "geometry error". • Wartości HOMO/LUMO obecne w pliku wyjściowym (.out).	Przerwa energetyczna determinuje stabilność/reaktywność chemiczną. Nieudane zadania = brakujące dane do filtra klucza.	Problem: Zadanie ORCA się zawiesza. Poprawka: ponownie zoptymalizuj geometrię w Avogadro; upewnij się, że nie ma duplikatów atomów; zwiększ %maxcore lub przejdź na bazę def2-SVP dla dużych cząsteczek.
8. Zintegrowane filtrowanie ADMET-S	• Ostateczna lista ligandów spełnia wszystkie kryteria (np. LogP 0–3, przerwa energetyczna 3,6–5 eV, klasa Cramera I/II). • Ligand ≥1 wykazuje selektywność PLK1 (ΔΔG ≥ 2 kcal/mol vs. PLK2/3).	Zbyt rygorystyczne lub niespójne progi eliminują realne leady; zbyt łagodne progi wywołują toksyczne/niestabilne związki.	Problem: Żaden ligand nie przechodzi przez wszystkie filtry. Naprawa: Luzuj jedno kryterium na raz (np. pozwól na LogP ≤ 4 lub 3 toksykofory) i dokumentuj kompromisy. Porównaj z znanymi lekami do benchmarkingu.

Tabela 1: Kluczowe punkty kontrolne jakości, punkty decyzyjne o dużym wpływie oraz strategie rozwiązywania problemów w ośmioetapowym dwujęzycznym procesie obliczeniowym identyfikacji selektywnych inhibitorów PLK1-PBD. Każdy wiersz odpowiada głównej fazie protokołu od przygotowania białka do zintegrowanego filtrowania ADMET-S i określa (i) sposób weryfikacji pomyślnego ukończenia (pośredni punkt kontrolny), (ii) dlaczego etap jest kluczowy dla ogólnego sukcesu lub porażki (uzasadnienie kroku krytycznego) oraz (iii) praktyczne rozwiązania typowych awarii technicznych (wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów). Ta tabela służy zarówno jako mapa drogowa walidacji, jak i pomoc dydaktyczna dla studentów i badaczy wdrażających protokół w środowiskach akademickich lub o ograniczonych zasobach.

Plik uzupełniający 1: Skrypty Pythona. Zawiera skrypt Pythona dla aplikacji reguł Lipinskiego; skrypt Python używany do analizy klasteryzacji; skrypt Pythona do obliczeń właściwości fizykochemicznych; skrypt R do analizy metabolizmu; skrypt Pythona do analizy wydalania; skrypt Pythona do przewidywania toksyczności; skrypt Pythona do oceny stabilności; oraz łańcuchy SMILES z 50 analizowanych związków. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Badanie to koncentruje się na eksploracyjnym procesie obliczeniowym mającym na celu identyfikację i ocenę potencjalnych inhibitorów PLK1-PBD poprzez wirtualne przesiewanie, dokowanie oraz analizę ADMET-S. Pipeline skutecznie priorytetowo traktuje związki na podstawie przewidywanych trendów wiązania i właściwości farmakokinetycznych. W tym protokole identyfikowany jest zestaw możliwych inhibitorów PLK1, a ich właściwości ADMET i wiążące się białka PLK1–3 są oceniane. Protokół wykorzystuje podejście skoncentrowane na chorobie, aby zidentyfikować 50 cząsteczek z bazy danych liczącej około 73 400 (Rysunek 9). Następnie te 50 cząsteczek poddano ocenie ADMET-S, podczas której obliczono ich właściwości farmakokinetyczne i farmakodynamiczne, podobność do leku oraz stabilność. Ponadto obliczono ich powinowactwo wiązawcze do białek PLK1–3, aby ocenić ich siłę hamującą wobec PLK1 oraz selektywność. Na podstawie wyników kilka cząsteczek wykazało bardziej pożądane właściwości. Kolejne badania odkrywające leki mogą zdecydować się na eliminację niektórych cząsteczek i skupienie się na kilku z tych badań, lub mogą powstrzymać się od wczesnej eliminacji i wykorzystać te wyniki później w procesie projektowania leku do optymalizacji właściwości ADMET.

Biologiczne uzasadnienie skupienia się na PLK1, PLK2 i PLK3, z wyłączeniem PLK4 i PLK5, opiera się zarówno na aspektach strukturalnych, jak i funkcjonalnych. PLK4 i PLK5 są wykluczone z tych badań ze względu na wyraźne różnice strukturalne i funkcjonalne względem PLK1 oraz ograniczone znaczenie dla terapii nowotworów. PLK1, charakteryzujący się domeną kinazową i domeną pola (PBD), odgrywa kluczową rolę w regulacji zdarzeń mitotycznych, co czyni go kluczowym celem leczenia nowotworów⁴¹. W przeciwieństwie do tego, PLK4 i PLK5 są strukturalnie rozbieżne: PLK4 zawiera krypticzne pudełko polo-box (CPB) zamiast kanonicznego PBD i funkcjonuje głównie w duplikacji centrioli. Jednocześnie PLK5 nie posiada funkcjonalnej domeny kinazowej i jest eksprimowany niemal wyłącznie^{w mózgu}. Biorąc pod uwagę minimalne nakładanie się struktury z PLK1-PBD oraz ograniczone znaczenie dla dysregulacji mitozy w nowotworach, ich włączenie nie wpłynie znacząco na selektywność dla inhibitorów PLK1-PBD. W związku z tym strategia selekcyjna oferuje biologicznie istotne i obliczeniowo wykonalne ramy oceny selektywności. Co ważne, sześć głównych ligandów kandydatów (10, 13, 14, 32, 43 i 47) wykazywało jeszcze korzystniejsze energie wiązania i profile ADMET-S niż znane inhibitory TQ i Allopole-A, co wskazuje na nich jako potencjalne modulatory PLK1-PBD.

Aby wspierać solidne wdrożenie, szczególnie przez studentów lub badaczy nowych w narzędziach do wykrywania leków obliczeniowych, w Tabeli 1 przedstawiono podsumowanie kluczowych punktów kontrolnych (również w sekcji Protokół), kluczowych kroków oraz wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów w procesie pracy. Tabela wspiera elastyczność; na przykład, jeśli użytkownik nie ma dostępu do HPC, może zauważyć, że analiza stabilności ORCA jest odroczona, a jeśli serwer WWW jest niedostępny, sugeruje się alternatywy takie jak SwissDock. Ta elastyczność zapewnia, że workflow pozostaje skuteczny w różnych kontekstach instytucjonalnych, jednocześnie zachowując rzetelność naukową i wzmacniając nowość badania jako inkluzywnego, dwujęzycznego i edukacyjnego wkładu w odkrywanie leków na wczesnym etapie. Chociaż cały proces jest zaprojektowany jako zintegrowany potok, kilka kluczowych etapów zasadniczo decyduje o jego sukcesie lub porażce (patrz Tabela 1). Dodatkowo, towarzyszące mu wideo zawiera zsynchronizowane angielskie napisy oraz amerykański system migowy (ASL), zaprojektowany tak, by zapewnić równy dostęp bez rozpraszania. Instrukcje osoby podpisującej są wyrównane czasowo z akcjami na ekranie, na przykład znakowanie "następny", a następnie pauza, gdy kursor klika przycisk "Następny". Podczas etapu przygotowania 4HCO sygnator używa znakowania palcami ("A" i "B") do prowadzenia wyboru łańcucha, precyzyjnie odzwierciedlonego w nagraniu ekranu. W segmencie wyświetlania SuperNatural 3.0 okno sygnatariusza zmienia rozmiar i przesuwa się w prawy górny róg, kierując uwagę na ikonę "ścieżki", zatrzymując się, gdy kursor podąża za nim. Te decyzje projektowe zapewniają, że widzowie głusi i niedosłyszący otrzymują takie samo zintegrowane, w czasie rzeczywistym wskazówki jak osoby słyszące, skutecznie odtwarzając doświadczenie laboratoryjne prowadzone przez instruktora na żywo.

Poza korzyściami istnieje wiele sposobów na usprawnienie pracy pracy. Po pierwsze, można modyfikować początkowe filtrowanie; Zamiast metod skoncentrowanych na chorobach i próbkowaniu klastrowym, można zacząć od symulacji dokowania wszystkich cząsteczek w bazie danych produktów naturalnych, aby określić, które związki najlepiej nadają się do wiązania białek ligand-cel. Ponadto konieczne są bardziej szczegółowe oszacowania, aby dokładnie przewidzieć powinowactwo wiązania. Obliczenia PRODIGY "bez elektrostatyczności" powinowactwa białko-ligandów polegają na dopasowaniu, liczeniu sklasyfikowanych typów kontaktów atomowych zaangażowanych w interakcję (węgiel-węgiel, azot-azot, tlen-tlen i inne atomy) w wytrenowanym modelu wielokrotnej regresji liniowej z czterokrotną walidacją krzyżową, a ta metoda znacząco korelowała z eksperymentalnymi powinowactwami w różnych przypadkach^42,43. Można stosować alternatywne podejścia, takie jak FoldX⁴⁴, fastDRH⁴⁵, modele głębokiego uczenia⁴⁶ oraz MD z zaawansowanym próbkowaniem, a w zależności od dokładności każdej metody⁴⁷ oczekiwane są różne stopnie zgodności w prognozach.

Kolejnym aspektem jest to, że różne narzędzia programowe używane w ocenie ADMET-S generują liczne wskaźniki, a zrozumienie każdego wskaźnika stosowanego do oceny kandydatów na narkotyki jest kluczowe. Jednym ze sposobów zapewnienia dokładności może być poddanie kilku leków na rynku protokołowi, aby ustalić, jak spełniają progi. W tym kontekście toksyczność wymaga dalszych badań, ponieważ cząsteczki nie są odrzucane wyłącznie na podstawie profili toksyczności z wyrafinowanych drzew decyzyjnych, takich jak reguły Cramera, gdyż wiele dostępnych leków ma podobne klasyfikacje. Liczba toksykoforów również nie jest w pełni informacyjna na temat toksyczności, nawet w połączeniu z profilami toksyczności. W tym kontekście rozszerzeniem tego przepływu pracy byłoby przeprowadzenie porównawczych przeglądów próbek małych cząsteczek z dostępnymi lekami w celu uzyskania interpretacji. Na przykład badacze odwołali się do wcześniejszej literatury dokumentującej zastosowanie i obserwacje obliczeń DFT w obecnych lekach przeciwraka piersi, takich jak Tamoksyfen⁴⁸, Letrozol⁴⁹, oraz Cisplatin⁵⁰przy interpretacji stabilności określonej przez obliczenia QM wartości przerwy energetycznej HOMO–LUMO. Wcześniej stosowano podobne procesy do identyfikacji potencjalnych inhibitorów dla różnych celów chorób/zaburzeń⁵¹. Ostatnio Stafford i ^in.6 omawili strategie projektowania inhibitorów PLK1-PBD oraz możliwości terapeutyczne w leczeniu nowotworów. Najnowsze badania zidentyfikowały inhibitory podwójnego celowania przeciwko PLK1-PBD i PLK4-PB3 za pomocą modelowania farmakoforów sterowanych strukturą, wirtualnego przesiewania, dokowania molekularnego, symulacji dynamiki molekularnej (MD) oraz oceny biologicznej⁵². Zhou i in. zidentyfikowali również inhibitory PLK1-PBD z biblioteki morskich produktów naturalnych, wykorzystując farmakoforę 3D QSAR, ADMET, skakanie rusztowań, dokowanie molekularne oraz MD⁵³.

Ogólnie rzecz biorąc, nowość tego badania jest czterokrotna. Po pierwsze, jest to dwujęzyczny protokół obliczeniowy, realizowany zarówno w amerykańskim języku migowym, jak i angielskim, co przyczynia się do zwiększenia dostępności i inkluzji w STEM, szczególnie dla uczniów i badaczy z niesłyszącymi i niedosłyszącymi zaburzeniami. To dwujęzyczne prowadzenie jest rzadkością w dziedzinie komputerowego odkrywania leków i jest zgodne z misją Uniwersytetu Gallaudeta, jakim jest pionier sprawiedliwej edukacji naukowej. Po drugie, choć PLK1 pozostaje atrakcyjnym celem przeciwnowotworowym, rygorystyczne badania obliczeniowe oceniające selektywność PLK1, PLK2 i PLK3 z wykorzystaniem zintegrowanych kryteriów strukturalnych, energetycznych i ADMET-S są rzadkie. Większość wcześniejszych badań koncentrowała się wyłącznie na hamowaniu domeny kinazowej lub brakowało porównawczego profilowania selektywności. Praca ta wypełnia tę lukę, oferując początkowy, eksploracyjny współbieżny protokół przesiewowy przeciwko trzem PLK-PBD, z filtrami priorytetowo przyjmującymi związki oparte na wysokim powinowactwie PLK1 i minimalnym wiązaniu poza celem. Po trzecie, workflow został zaprojektowany z myślą o efektywności i użyteczności, szczególnie w środowiskach edukacyjnych i ograniczonych zasobach. Cały proces od filtrowania baz danych po ocenę ADMET-S można zakończyć w ciągu dwóch tygodni na standardowym sprzęcie akademickim (laptop z 8 GB RAM), korzystając z darmowego oprogramowania webowego (CB-Dock2, PRODIGY, SwissADME, ADMETlab). Obliczania powinowactwa dokowania i wiązania nie są czasochłonnymi krokami (~30 sekund na ligand). Najbardziej czasochłonnym krokiem jest analiza stabilności w QM z ORCA, którą można odłożyć na późniejsze etapy lub uruchomić na zasobach wysokowydajnych, jak pokazano. Skrypty są modułowe i wymagają jedynie podstawowych edycji wiersza poleceń lub Jupyter Notebook, co umożliwia płynną integrację z istniejącymi programami nauczania. Czas działania jest skromny, a filtrowanie baz danych i zgodność z Lipinskiego zajmują minuty; Skupienie ~1000 cząsteczek kończy się w mniej niż 30 minut na typowym pulpicie. Wszystkie narzędzia programistyczne są dostępne swobodnie do użytku akademickiego, wieloplatformowego (Windows, macOS, Linux) i nie wymagają licencji komercyjnych, co znacząco obniża bariery wejścia. Po czwarte, zidentyfikowane ligandy wykazują obiecujące powinowactwa wiązania zgodne z interakcjami w zakresie nanotrzonowców, połączone z korzystnym podobieństwem do leków, stabilnością metaboliczną i niskim profilem toksyczności. Kilku kandydatów wyłania się jako silne, selektywne wiąźniki PLK1-PBD o pożądanych właściwościach ADMET-S, co wymaga dalszej weryfikacji poprzez symulacje dynamiki molekularnej lub testy in vitro .

Dlatego poza użytecznością metodologiczną, badanie to pokazuje, jak dostępne, otwartoźródłowe i wydajne narzędzia obliczeniowe mogą być wykorzystane jako punkt wyjścia do rozwiązania wysokowartościowego wyzwania biomedycznego, jednocześnie wspierając inkluzywne szkolenia naukowe. W miarę jak inhibitory PLK1-PBD zyskują na popularności w onkologii, ten sposób pracy dostarcza powtarzalnego, przyjaznego dla edukacji wzorca odkrywania leków na wczesnym etapie. Jego wszechstronność sprawia, że nadaje się do szkół średnich, licencjackich i magisterskich, a także stanowi doskonałą podstawę dla CURE, które oferują studentom autentyczne, praktyczne możliwości badawcze. W przeciwieństwie do potoków opartych wyłącznie na dokowaniu w domenie kinazowej lub przesiewaniu pojedynczym białkiem, podejście to równocześnie ocenia selektywność PBD dla PLK1–3, co jest konieczne ze względu na ich >38% homologię strukturalną oraz rozbieżne role biologiczne. Co więcej, łącząc klastry, ADMET-S i stabilność QM w ramach otwartego dostępu, ryzyko redundancji i straty zostało zmniejszone w porównaniu do brute-force wirtualnego screeningu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADMETLab3	Simulations Plus. Inc	V3.0	Właściwości ADMET
Alfafold	Wyszukaj w Google DeepMind & Izomorphic Labs (spółki zależne Alphabet)	V3.0.1	Modelowanie białek 3D
Anaconda/Conda	Anaconda, Inc.	V24.9.2	Open source system zarządzania pakietami
CB-Dock2	Laboratorium Yang Cao	V2.0	Ślepe dokowanie białkowo-ligandowe
CHARMM-GUI	Uniwersytet Lehigh	V3.8	Manipulacja i symulacja biomolekularna
DARWIN NA DOSTĘPIE	Uniwersytet Delaware	Nie ma	Obliczenia wysokowydajne
ORCA	FAccTs GmbH	V6.1.0	Pakiet chemii kwantowej
Bank Danych Białek	Światowy Bank Danych Białek	RRID:SCR_006555	Baza danych białek
RDKit	Open source	RRID:SCR_014274	Programowanie cheminformatyczne
SuperNatural 3.0	Instytut Fizjologii i Nauk-IT (Berlin)	V3.0	Biblioteka cząsteczek naturalnych
SwissADME	Szwajcarski Instytut Bioinformatyki	RRID:SCR_017865	Właściwości ADME
Toxtree	Ideaconsult Ltd	V3.1.0	Klasyfikacja toksyczności