Artykuł metodologiczny

Szacowanie RNA zawierającego powtórzenia telomeryczne z hybrydowych kompleksów DNA/RNA

DOI:

10.3791/67984

⸱

5 grudnia 2025

 ,  ,  ,  , 
1Betul-Ziya Eren Genome and Stem Cell Center, Erciyes University, 2Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 3INSERM-CNRS, Université de Nice

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten umożliwia izolację hybryd DNA:RNA oraz powiązanych z nimi RNA (w tym TERRA) w wielu tkankach. Chociaż nasze podejście obejmuje podzbiór interakcji hybrydowych, do pełnej charakterystyki całego genomu potrzebne byłoby dodatkowe mapowanie genomowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA zawierające powtórzenia telomeryczne (TERRA) to długie, niekodujące RNA transkrybowane ze wszystkich telomerów u wyższych eukariontów, a tylko część tych cząsteczek tworzy stabilne hybrydy DNA/RNA na telomerach. Przedstawiliśmy szczegółowy protokół molekularny do identyfikacji i oczyszczania tych hybrydowych szacunków. Ta uprościona metoda umożliwia bezpośrednią ekstrakcję naturalnie powstałych in vivo interakcji hybrydowych DNA/RNA i może być zastosowana do wykrywania wszystkich takich obszarów. Minimalizując kroki proceduralne, technika ta jest bardzo efektywna w izolowaniu RNA przyłączonego do DNA, szacując niezawodność i powtarzalność sekwencjonowania w dalszej fazie. Reagent izotiocjanianian guanidyny jest stosowany do całkowitej lizy i homogenizacji komórek, zachowując integralność kwasów nukleinowych (DNA i RNA), szczególnie hybryd DNA/RNA. Dodanie chloroformu inicjuje separację fazową poprzez wirowanie (trzy odrębne warstwy): dolną fazę fenol-chloroformową, fazę międzyfazową oraz górną fazę wodną. RNA, uwalniane zarówno z jądra, jak i cytoplazmy, pozostaje w fazie wodnej, podczas gdy DNA o wysokiej masie cząsteczkowej, w tym obszary hybrydy DNA/RNA, pozostaje ograniczone do interfazy. Dzięki alkoholowi izopropylowemu, a następnie wirówce, odzyskiwane są fazy wodne (wolne RNA), interfaza oraz DNA, szczególnie hybrydy DNA/RNA. Aby usunąć pozostałe ślady białek, próbka jest inkubowana proteinazą K. Stosuje się zabieg DNazą, ekstrakcji fenolem/chloroformem, alkoholem izopropylowym oraz wirowaniem w celu uwolnienia RNA hybrydyzowanego z DNA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkrypcja genomu prowadzi do powstawania tymczasowych cząsteczek hybrydowych, zwanych pętlami R, które składają się z trójniciowych struktur. Struktury te obejmują nici DNA niekodujące i kodujące, przy czym nić niekodująca jest przesunięta przez powstawanie hybryd z komplementarnym RNA1. Podczas transkrypcji genomu produkowana jest duża liczba niekodujących RNA z obu nici DNA w różnym tempie. Większość tych RNA pełni funkcję krótkotrwałych pośredników, ale niektóre odgrywają kluczową rolę w sieciach regulacyjnych rządzących biologią genomu, szczególnie tych pochodzących z obszarów niekodujących, takich jak telomery i centromery1. Rozmieszczenie hybryd DNA/RNA w genomie może również odzwierciedlać aktywność transkrypcyjną komórek w danym momencie.

Wraz ze wzrostem zainteresowania funkcjami regulacyjnymi niekodujących RNA, rośnie zainteresowanie śledzeniem ich transkrypcji i dystrybucji w genomie, szczególnie w formie tymczasowych hybryd DNA/RNA. Aby temu zaradzić, opracowaliśmy niezależny test do wykrywania stabilnych hybryd DNA/RNA, stosowalny do każdej komórki biologicznej lub tkanki. Metoda ta umożliwia izolację komplementarnych RNA, które współoczyszczają DNA, a następnie analizę za pomocą wytrącenia lub sekwencjonowania PCR.

Badania na podstawie modeli hodowli komórkowych wykazały, że podczas replikacji i transkrypcji DNA może wystąpić stres replikacyjny, uszkodzenia DNA, kolizje widełek replikacyjnych oraz przerwy na zatrzymywanie się polimerazy RNA II w wyniku wydarzeń topologicznych, strukturalnych i hybrydyzacyjnych. Procesy te, szczególnie rozwijanie podwójnej helisy DNA, wprowadzają stres skrętny, który może prowadzić do powstawania nieprawidłowych struktur, takich jak pętle R, podczas transkrypcji1.

Większość danych o pętli R została wygenerowana przy użyciu drożdży lub hodowli komórek nowotworowych, opierając się na hybrydowym przeciwciele monoklonalnym DNA-RNA S9.6. Badania strukturalne wykazały, że fragment wiążący antygen (Fab) S9.6 wiąże się konkretnie z hybrydą RNA-DNA1 o długości 13 bp. Wykrywanie pętli R oparte na przeciwciałach głównie zidentyfikowało hybrydy tworzące się w regionach bogatych w guaninę podczas transkrypcji, gdzie prawdopodobne jest zwiększone zwiększanie hybrydyzacji RNA-DNA. Badania in vitro z wykorzystaniem przeciwciał S9.6 sugerują, że RNA zawierające cztery lub więcej kolejnych guanin w pobliżu ich 5′ końca są łatwiej wykrywalne, co koreluje ze zwiększonym powstawaniem pętliR-1. Różne enzymy, takie jak helikazy, topoizomerazy, RNaza H1 i RNaza H2, pomagają utrzymać równowagę pętli R podczas transkrypcji. Zakłócenie homeostazy pętli R-jest powiązane ze zwiększoną niestabilnością genomową, co przyczynia się do chorób takich jak nowotwory i choroby neurodegeneracyjne2.

Telomery, które kiedyś uważano za transkrypcyjne ciche, zostały stwierdzone jako transkrypcyjne jako długie niekodujące RNA, znane jako Telomeric Repeat-Containing RNA (TERRA)3. Transkrypty te pochodzą z obszarów subtelomerowych i zawierają powtórzenia telomerowe, odgrywając kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy telomerów4. W tym manuskrypcie nazywamy "TERRA-hybrydowe RNA" cząsteczkami RNA uwalnianymi z kompleksów hybrydowych DNA/RNA w wyniku obróbki DNazą I, przypuszczalnie obejmujące sekwencje TERRA na podstawie właściwości ekstrakcyjnych i specyficzności primerów.

Transkrypcja TERRA odbywa się w kierunku centromer-telomer i ma zmienną długość – od 100 bp do 9 kb, przy czym większość TERRA jest odzyskiwana w fazie wodnej jako wolna cząsteczka RNA. Niewielka część pozostaje przymocowana do DNA i jest związana z kluczowymi procesami biologicznymi, takimi jak rak i starzeniesię 4,5. Poziomy TERRA różnią się w zależności od loci podtelomerowych i są regulowane przez heterochromatyczny stan telomerów6. Badania hodowli komórkowych wskazują również, że transkrypcje TERRA z różnych obszarów subtelomerowych wykazują niejednorodność długości. W niektórych badaniach hodowli komórek pochodzących z nowotworów naukowcy odkryli, że obszar subtelomerowy 20q jest głównym źródłem transkryptów TERRA, a ten obszar jest często metylowany na wyspach CpG 7,8,9. U myszy obszar podtelomerowy chromosomu 18 jest głównym miejscem produkcji TERRA10,11. Dodatkowo, PAR-TERRA, czyli transkrypcje TERRA pochodzące z pseudoautosomalnych obszarów subtelomerowych komórek embrionalnych, wykazano nawet do 200 razy więcej TERRA niż chromosom18 11,12.

Transkrypcja TERRA jest kontrolowana przez metylację DNA i modyfikacje histonowe, takie jak trimetylacja H3K9 i H4K20, które hamują TERRA, podczas gdy acetylacja histonów pozytywnie koreluje z transkrypcją TERRA 6,13,14. TERRA wiąże się także z obszarami pozatelomerowymi, w tym miejscami międzygenowymi i intronami, co wskazuje na szerszą rolę w regulacji genomu2.

Dodatkowo, wyczerpanie TERRA prowadzi do dysregulacji wielu genów, szczególnie tych w pobliżu miejsc wiązania, co sugeruje jej rolę w epigenetycznej regulacji chromatyny i ekspresji genów2. Nagromadzenie TERRA przy skróconych telomerach sprzyja homologicznej rekombinacji (HR) poprzez rozciąganie telomerów, przyczyniając się do homeostazy długości telomerów15,16.

Aby wyjaśnić rolę TERRA i innych hybryd DNA/RNA, zastosowaliśmy test specjalnie zaprojektowany do izolacji cząsteczek RNA stabilnie hybrydyzowanych z DNA. Krótko mówiąc, jądra zostały wyizolowane i poddane RNazie wolnej od DNazy w celu usunięcia niechronionego RNA. Hybrydy DNA/RNA były następnie ekstrahowane za pomocą selektywnego trawienia DNazy, co uwalnia RNA, pierwotnie zhybrydizowane z DNA. Ta frakcja, określana jako "RNA powiązane z hybrydą DNA/RNA", została następnie przeanalizowana metodą RNA-seq i porównana z całkowitym rozpuszczalnym RNA uzyskanym standardową ekstrakcją fenol-chloroformu17. To podejście pozwoliło nam zidentyfikować zarówno telomeryczne, jak i nietelomeryczne miejsca powstawania hybryd RNA-DNA oraz porównać profile transkryptomiczne pul RNA związanych z DNA rozpuszczalnymi. Kiedyś uważana jedynie za produkt uboczny transkrypcji telomerów, TERRA jest obecnie uznawana za swoją podwójną rolę w utrzymaniu telomerów, wpływając na aktywność telomerazy i homologną rekombinację, które są kluczowe dla homeostazy długości telomerów. Co więcej, postępy w testach detekcyjnych umożliwiły bardziej szczegółowe zrozumienie dynamicznych interakcji między RNA a DNA w całym genomie. Ta wiedza toruje drogę do dalszego badania implikacji hybryd DNA/RNA, takich jak TERRA, w procesach komórkowych oraz ich potencjalnych powiązań z chorobami takimi jak nowotwory i zaburzenia neurodegeneracyjne. Trwające badania w tej dziedzinie niewątpliwie pogłębią nasze zrozumienie regulacji genomowej i jej znaczenia dla zdrowia i chorób.

Metoda identyfikacji cząsteczek TERRA oraz hybryd DNA/RNA w tym badaniu to ten sam zoptymalizowany protokół ekstrakcji guanidinium-tiocyanian-fenol-chloroform, opisany tutaj. Protokół ten został opracowany, aby umożliwić jednoczesną izolację hybryd RNA-DNA/RNA, całkowitego RNA oraz DNA genomowego w ramach jednolitego przepływu pracy. Poprzez strategiczną modyfikację klasycznej metody separacji trójfazowej, protokół ten ułatwia selektywne zachowanie hybryd DNA/RNA w interfazie fenolowej, minimalizując ich utratę – co jest wrodzonym ograniczeniem konwencjonalnych technik ekstrakcji.

Tradycyjnie wykrywanie i izolacja hybryd DNA/RNA opierały się na immunoprecipitacji za pomocą przeciwciała monoklonalnego S9.6, które specyficznie rozpoznaje struktury hybryd DNA/RNA18,19. To podejście oparte na S9.6, choć szeroko stosowane, może być ograniczone dostępnością przeciwciał, kosztami oraz potencjalną reaktywnością krzyżową. Dla porównania, nasz protokół oferuje opłacalną, niezależną od przeciwciał alternatywę, która jest łatwo stosowalna zarówno do próbek komórkowych, jak i tkankowych.

Aby dodatkowo poprawić czystość i integralność strukturalną izolowanej frakcji hybrydowej DNA/RNA, wprowadziliśmy deproteinizację pośredniczącą przez proteinazę K, a następnie zabieg DNazą I. Krok DNaza I selektywnie trawi nić DNA hybryd DNA/RNA, uwalniając tym samym hybrydyzowane RNA do dalszej izolacji i analizy molekularnej20. Takie podejście zapewnia, że gatunki RNA odzyskane są konkretnie tymi, które zostały stabilnie zhybrydyzowane z DNA in vivo. Dzięki modułowej konfiguracji i skalowalności, nasz protokół jest szeroko adaptowalny do różnorodnych kontekstów biologicznych, dostarczając badaczom solidne narzędzie do badania biologii hybrydowej DNA/RNA w szerokim zakresie systemów eksperymentalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły eksperymentalne dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Erciyes (numer licencji 19-07-2019, decyzja nr 19/127). W badaniu zastosowano myszy Balb/c : pięć zdrowych samic, 6 tygodni życia (25 g), oraz pięciu samców, 8 tygodni życia (30 g). Myszy były opiekowane i traktowane zgodnie z zasadami opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi (przepisy europejskie). Przedstawione tutaj badanie wykorzystało próbki krwi 13 zdrowych osób kontrolnych, pochodzące z wcześniejszego projektu badawczego, który uzyskał etyczną aprobatę Komitetu Etyki Człowieka Uniwersytetu Erciyes (Decyzja nr 17/002). Graficzne streszczenie tego protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Stosuj materiały wolne od RNaz oraz techniki aseptyczne na każdym etapie, aby zminimalizować rozkład RNA.

1. Hodowla myszy

  1. Aby określić odpowiednią dawkę znieczulenia potrzebną do eutanazji, zważ każdą mysz i podaj ketaminę w dawce 60 mg/kg oraz ksylazynę w dawce 10 mg/kg przez zastrzyk dootrzewnowkowy.
  2. Po podaniu znieczulenia należy potwierdzić pełną znieczulenie przez brak odruchu cofania się pedału (szczypanie palca) oraz brak reakcji na stymulację dotykową. Po potwierdzeniu znieczulenia przeprowadź eutanazję przez zwichnięcie szyjki macicy.

2. Próbki ludzkie

  1. Wybierz uczestników jako zdrowe grupy kontrolne po przesiewaniu, aby wykluczyć wszelkie przewlekłe choroby (takie jak cukrzyca, choroby sercowo-naczyniowe, nadciśnienie czy nowotwory), ostre infekcje, choroby autoimmunologiczne lub zapalne, choroby neurologiczne lub psychiatryczne oraz niedawne stosowanie leków na receptę17.
  2. Pobierz próbki biopsji skóry z obszaru za kolanem (doł podplinowy) każdego ochotnika za pomocą narzędzia do dziurkania o średnicy 2 mm. Przed zabiegiem podskórno podaj znieczulenie miejscowe, a wszystkie biopsje wykonuj w warunkach sterylnych.

3. Ekstrakcja hybryd DNA/RNA ze wszystkich typów komórek

  1. Pobieranie tkanek i liza
    1. Do każdego pobrania należy użyć 500 μL krwi serca, całego kompleksu podwzgórzo-przysadkowego, całego nadnercza lub pobranej próbki plemnika z pojedynczej myszy.
    2. Przenieś wszystkie pobrane próbki do sterylnych probek o pojemności 1,5 mL. Dodaj 500 μL fenolu do każdej probówki. Dokładnie pobrać próbki krwi z wiru, by wymieszać.
      1. W przypadku próbek tkanek należy całkowicie ujednolicić za pomocą strzykawki o średnicy 2 mm, aż nie pozostaną widoczne fragmenty.
    3. Umieść probówki na bloku chłodzącym, aby zachować integralność próbki.
      UWAGA: Zawsze stosuj się do wytycznych bezpieczeństwa laboratoryjnego podczas obsługi niebezpiecznych odczynników, takich jak fenol, chloroform i octan amonu.
  2. Separacja faz
    1. Dodaj 180 μL chloroformu do każdej rurki i krótko wymieszaj w wir. Inkubuj rurki na lodzie przez 15 minut, aby umożliwić separację fazową.
    2. Sprawdź próbki – upewnij się, że faza wodna wydaje się czysta. Jeśli faza jest pochmurna, ponownie przeprowadź wir i powrót do lodu na dodatkowe 5 minut.
    3. Próbki z wirówki w temperaturze 12 000 × g, 4 °C przez 15 minut.
  3. Wytrącanie RNA
    1. Ostrożnie przelej przezroczystą fazę wodną do nowej sterylnej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, umieszczonej na bloku chłodzącym.
    2. Dodaj równą objętość (1:1) izopropanolu do fazy wodnej, krótko wymieszaj wir i inkubuj na lodzie przez 15 minut.
    3. Wirówka w 12 000 × g, 4 °C przez 15 minut.
      UWAGA: Pellet RNA powinien być widoczny na dnie tubki.
  4. Płukanie pelletu RNA
    1. Ostrożnie odwróć rurkę, aby wyrzucić supernatant bez zakłócania pelletu.
    2. Dodaj 1,5 mL etanolu 70% do pelletu. Delikatnie stukaj w tubkę przez 5 sekund, żeby się umyć.
    3. Wirówka w 7 500 × g, 4 °C przez 5 minut.
    4. Odwróć rurkę, aby wyrzucić supernatant. Powtórz mycie etanolem 2 razy (łącznie trzy mycia).
  5. Oczyszczanie RNA
    1. Po końcowym myciu etanolem odwróć rurkę i pozwól resztkom etanolu wyschnąć na powietrzu lub ostrożnie usuń pipetą.
    2. Dodaj 100 μL wody wolnej od RNaz do pelletu RNA i delikatnie pipetuj w górę i w dół lub przesuwaj rurkę, aby całkowicie zawiesować RNA.
      UWAGA: Zawsze trzymaj próbki RNA na lodzie lub na schłodzonej stoczce/bloku chłodzącym, aby zapobiec degradacji.
  6. Ilościowa i magazynowanie RNA
    1. Umieść rurkę zawierającą ponownie zawiesinowane RNA na lodzie.
    2. Zmierz stężenie i czystość RNA za pomocą spektrofotometru. Zapisz absorpcję na poziomie 260 nm (A260), aby określić stężenie RNA. Oceń czystość, obliczając stosunki A260/A280 oraz A260/A230.
    3. Do zastosowań końcowych używaj wyłącznie próbek RNA o stosunkach A260/A280 między 1,9 a 2,1.
      UWAGA: W tym badaniu typowe stężenia RNA wahały się od 100 do 180 ng/μL.
    4. Przechowuj próbki RNA w temperaturze −80 °C do dalszego użycia.
  7. Usuwanie białek i izolacja DNA
    1. Po izolacji RNA zachowaj interfazę z etapu ekstrakcji fenolowej.
      UWAGA: Ten etap jest konieczny, ponieważ interfaza zawiera DNA, które może być dalej przetwarzane do izolacji DNA po dodaniu fenolu i wirówce.
    2. Przejdź do ekstrakcji DNA, wykonując kroki 3.2.1-3.4.1, zaczynając od interfazy jako materiału wyjściowego. Ostrożnie przenieś całą interfazę (zawierającą DNA) z ekstrakcji fenolowej do sterylnej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, umieszczonej na stojaku chłodzącym.
    3. Trawienie białek: Do probówki dodaj 0,5 mL buforu lizycznego (20 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM EDTA; 0,1% SDS; 400 μg/mL proteinazy K). Inkubuj przez noc w temperaturze 56 °C, aby trawić białka.
    4. Wytrącanie DNA z solą
      1. Następnego dnia dodaj 100 μL 5 M octana amonu do każdej próbki i krótko wymieszaj. Wirówka w 1 788 × g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
      2. Ostrożnie przelej przezroczystą fazę wodną do nowej sterylnej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Dodaj taką samą objętość izopropanolu o jakości molekularnej (stosunek 1:1) do fazy wodnej, wymieszaj przez delikatną inwersję i wiruj w 1 788 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usuń supernatant, nie naruszając granulki DNA.
      3. Przemyj granulat DNA 1 mL etanolu 70%, następnie wiruj w 1 788 × g przez 10 minut.
      4. Usuń i wyrzuć płyn etanolowy. Pozwól granulatowi DNA na krótko wyschnąć powietrze.
      5. Ponownie zawiesz wysuszony granulek DNA w 50 μL wody wolnej od nukleazy.
  8. Usuń wolne kwasy nukleinowe, aby oczyścić DNA:
    1. Załaduj rozpuszczone DNA na kolumnę spinową DNA. Wiruj w 15 000 × g przez 15 sekund i odrzucaj przepływ.
    2. Przemyj kolumnę 2 razy 70% etanolem, wirując za każdym razem przez 1 minutę przy 15 000 × g. Po każdym myciu wyrzucaj przepływ.
    3. Przełóż kolumnę spinową do czystej probówki o pojemności 1,5 mL. Dodaj 30 μL wody wolnej od nukleazy do matrycy kolumny, inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie wiruj przez 1 minutę w stężeniu 15 000 × g , aby wyeludować DNA.
    4. Umieść wyeludowane DNA w lodzie. Podziel próbkę na dwie probówki: jedną do przechowywania DNA w temperaturze 4 °C, drugą do kolejnej ekstrakcji hybrydowej DNA/RNA.
  9. Ekstrakcja RNA przyłączonego do DNA (hybrydy DNA/RNA)
    1. Leczenie DNazą
      1. Przygotuj mieszaninę trawienia DNazy, łącząc 5 μL (15 U) DNazy I i 75 μL buforu trawienia DNazy 10x.
      2. Dodaj 80 μL mieszaniny DNazy do suszonego pelletu DNA. Inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    2. Ekstracja fenol-chloroformem
      1. Dodaj 300 μL fenolu do próbki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
      2. Dodaj 180 μL chloroformu do mieszanki i inkubuj przez dodatkowe 5 minut w temperaturze pokojowej.
      3. Wirówka z maksymalną prędkością (np. 15 000 × g) przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby oddzielić fazy. Ostrożnie przenieś górną fazę wodną (zawierającą hybrydy RNA:DNA) do nowej rurki.
  10. Izolacja hybrydowa DNA/RNA
    1. Zakończ izolację hybryd DNA/RNA od kroków 3.3 do 3.5.2.
    2. Dodaj równą objętość (1:1) izopropanolu do fazy wodnej, krótko wymieszaj wir i inkubuj na lodzie przez 15 minut.
    3. Wirówka w 12 000 × g, 4 °C przez 15 minut. Szukaj pelletu RNA na dnie rurki. Ostrożnie odwróć rurkę, aby wyrzucić supernatant bez zakłócania pelletu.
    4. Dodaj 1,5 mL etanolu 70% do pelletu. Delikatnie stukaj w tubkę przez 5 sekund, żeby się umyć. Wirówka w 7 500 × g, 4 °C przez 5 minut. Odwróć rurkę, aby wyrzucić supernatant. Powtórz mycie etanolem 2 razy (łącznie trzy mycia).
  11. Oczyszczanie RNA:
    1. Po końcowym myciu etanolem odwróć rurkę i pozwól resztkom etanolu wyschnąć na powietrzu lub ostrożnie usuń pipetą.
    2. Dodaj 30 μL wody wolnej od RNazy do hybrydy DNA/RNA i delikatnie pipetuj w górę i w dół lub przesuwaj rurkę, aby w pełni zawiesić RNA.
    3. Przechowuj próbki hybrydowe DNA/RNA w temperaturze −80 °C do dalszego użycia.

4. Synteza cDNA

UWAGA: Zapewnij integralność RNA, cDNA i DNA, używając materiałów wolnych od RNazy/DNazy oraz utrzymując próbki na lodzie przez cały czas trwania procedury.

  1. Dla każdej próbki należy użyć 6 μL (20 ng RNA; izolowane w kroku 3.6.5 dla wolnego RNA lub kroku 3.13.3 dla hybrydowego RNA DNA/RNA). Przenieś wymaganą objętość RNA do oznaczonych probówek PCR.
  2. Przygotuj mieszankę do syntezy cDNA zgodnie z instrukcjami producenta zestawu. Dla każdej reakcji upewnij się, że mieszanka główna zawiera transkryptoazę odwrotną, dNTP, startery, bufor oraz inhibitory RNazy. Dla każdej reakcji połącz 14 μL mieszanki głównej z 6 μL próbki RNA w probówce PCR (objętość całkowita: 20 μL na reakcję). Uwzględnić co najmniej jedną kontrolę transkryptozy bez odwrotnej (-RT) poprzez przygotowanie reakcji równoległej bez dodawania enzymu transkryptozy odwróconej, przy użyciu tej samej ilości RNA.
  3. Synteza cDNA wykonana jest w cyklerze termicznym, stosując program temperaturowy określony w Tabeli 1.
  4. Rozcieńcz powstałe cDNA w stosunku 1:5 wodą wolną od nukleazy i przechowywaj w temperaturze −80 °C do analizy qPCR.

5. Określanie poziomów ekspresji TERRA za pomocą Q-PCR

  1. Przygotuj mieszaninę reakcji qPCR za pomocą zestawu qPCR opartego na SYBR Green, zgodnie z instrukcjami producenta. Dla każdej reakcji połącz 1 μL SYBR Green Master Mix, 0. μL przedniego podkładu dla TERRA (patrz Tabela 2), 0. μL odwróconego podkładu dla TERRA (patrz b) oraz μL wody wolnej od nukleazy.
  2. Do każdej dołki płytki qPCR z 96 dołkami należy podać 16 μL mieszanki reakcyjnej.
  3. Do każdego dołku dodaj 4 μL rozcieńczonego cDNA (od kroku 4.6), co daje końcową objętość reakcji 20 μL.
    UWAGA: Dla każdej próbki należy uwzględnić co najmniej dwa techniczne replikacje oraz dwa replikacje biologiczne. Uwzględnić środki kontroli bez szablonów (NTC) do wykrywania zanieczyszczenia oraz kontroli transkryptozy bez odwrotnej procedury, aby zapewnić specyficzność sygnałów pochodzących z RNA.
  4. Wykonaj qPCR za pomocą programu temperaturowego określonego w Tabeli 3.
  5. Znormalizuj ekspresję TERRA do β-Aktyny (gen housekeeping) za pomocą metody 2-ΔΔCt .

6. Określenie długości telomerów

  1. Przygotuj mieszankę qPCR do pomiaru długości telomerów 21. Dla każdej reakcji połącz 1 μL SYBR Green Master Mix, 0. μL zapalnika telomerowego (patrz Tabela 2), 0. μL zapalnika odwrotnego telomeru (patrz Tabela 2) oraz μL wody wolnej od nukleazy.
  2. Do każdej dołki płytki qPCR z 96 dołkami należy podać 16 μL mieszanki reakcyjnej telomerów.
  3. Dodaj 4 μL DNA genomowego (od kroku 3.10.5) do każdego dołku, co daje końcową objętość reakcji 20 μL.
  4. Wykonaj qPCR zgodnie z odpowiednimi parametrami programu określonymi przez producenta (patrz Tabela 3).
  5. Równolegle przygotować reakcje dla pojedynczej kopii genu referencyjnego (36B4) przy użyciu tych samych stężeń i końcowej objętości.
  6. Krzywe standardowe zostały wygenerowane za pomocą seryjnego rozcieńczenia syntetycznego telomerowego oligonukleotydu (Tabela 2) w celu oszacowania względnej obfitości i efektywności amplifikacji. Nie przeprowadzono absolutnej ilości. Względna długość telomerów oblicza się jako stosunek T/S (liczba powtórzeń telomerów do liczby genów pojedynczych kopii) metodą ΔCt21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu zidentyfikowaliśmy i porównaliśmy poziomy wolnej TERRA, DNA/RNA hybrydowej TERRA oraz długości telomerów w wielu tkankach myszy (krew, plemnik, skóra, podwzgórze, przysadka mózgowa, nadnercza), a także w ludzkiej krwi i próbkach skóry, aby zbadać dynamikę specyficzną dla tkanek oraz jej związek z biologią telomerów. Wolna TERRA została wyizolowana z fazy wodnej po ekstrakcji fenol-chloroformu (kroki protokołu 3.6.1-3.6.5), wzbogacając o cząsteczki TERRA cyto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Centralną siłą przedstawionego tutaj protokołu jest stopniowe wyodrębnianie i rozróżnianie wolnej TERRA oraz hybrydowej DNA/RNA TERRA ze złożonych próbek tkanek. Kluczowe kroki obejmują staranne rozdzielenie frakcji wodnej i międzyfazowej podczas ekstrakcji fenol-chloroformowej, ponieważ zanieczyszczenie krzyżowe może zaburzyć rozróżnienie między wolną a hybrydową TERRA. Kolejne leczenie frakcją międzyfazową DNazą I jest również kluczowe: niewystarczające trawienie może pozostawić RNA związane z DNA niedostępne, podczas ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Erciyes University Scientific Research Unit za wsparcie tej pracy poprzez numery grantów TYL-2019-9224 oraz TSA-2022-11929.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 mL rurek PCR i nbsp;Greiner671201
15 mL Falcon TubesIzolatorium078.02.001
2 mL strzykawkiHayatNie ma
96- Płyta wielowgłębiowaGreiner50-720-3203
Absolute EthanolMerck1070172511
Octan amonnuSigma238074-500G
zestaw synhezy cDNARoche07 912 439 001
ChloroformMerck1024451000
DNAse I Kit ZymoE1010
EDTASigmaE9884-1KG
Szklana butelkaIzolatoriumLB. IS.061.01.901
Cylindr z podziałemIzolatorium  015.01.901
izotiocyjanian guanidyny, nbsp;SigmaG9277-100G
IzoproponalneMerck1096342511
Light Cycler 480 IIRoche5015278001
Rurki mikrowirówki (1,5 mL)Greiner616201
Mikropipety (10 & micro; L)GilsonFD10001
Mikropipety (100 & mikro; L)GilsonFD10004
Mikropipety (1000 &; L)GilsonFD10003
Mikropipety (2 & mikro; L)GilsonGFAM00064
NanodropShimadzuC101-E112
PBS TabletSigmaP4417-50TAB
Urządzenie PCRSensoquestT3-0140
PGL3 Podstawowy WektorPromega #212936
Końcówki pipety (10 & micro; L, 200 & mikro; L, 1000 & mikro; L)Greiner772352
Plastikowe szalki PetriegoGreiner627102
Proteinaza KSigmaP6556-10MG
SDSSigma8170342500
Pipeta serologicznaGreiner760107
SpinGilsonPMC880
Sybr Green MasterRoche4707516001
TermomieszarkaEppendorf#5355
Baza TrizmaSigma1503-1KG         
TrizolBiorad7326890
Unimax 1010 DT ShakerHeidolph543-12310-00-6
WirHeidolph541-10000-00-1
Kolumny Zymo-Spin IZymoC1003-50

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allison, D. F., Wang, G. G. R-loops: formation, function, and relevance to cell stress. Cell Stress. 3, 38-46 (2019).
  2. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdiscip Rev RNA. 5, 407-419 (2014).
  3. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat-containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318, 798-801 (2007).
  4. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318, 798-801 (2007).
  5. Oliva-Rico, D., Herrera, L. A. Regulated expression of the lncRNA TERRA and its impact on telomere biology. Mech Ageing Dev. 167, 16-23 (2017).
  6. Azzalin, C. M., Lingner, J. Telomeres: the silence is broken. Cell Cycle. 7, 1161-1165 (2008).
  7. Roake, C. M., Artandi, S. E. Approaching TERRA Firma: genomic functions of telomeric noncoding RNA. Cell. 170, 8-9 (2017).
  8. Xu, Y., et al. Finding a human telomere DNA-RNA hybrid G-quadruplex formed by human telomeric 6-mer RNA and 16-mer DNA using click chemistry: a protective structure for telomere end. Bioorg Med Chem. 22, 4419-4421 (2014).
  9. Montero, J. J., López De Silanes, I., Graña, O., Blasco, M. A. Telomeric RNAs are essential to maintain telomeres. Nat Commun. 7, 1-13 (2016).
  10. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdiscip Rev RNA. 5, 407-419 (2014).
  11. De Silanes, I. L., et al. Identification of TERRA locus unveils a telomere protection role through association to nearly all chromosomes. Nat Commun. 5, 4723(2014).
  12. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318, 798-801 (2007).
  13. Roake, C. M., Artandi, S. E. Approaching TERRA Firma: genomic functions of telomeric noncoding RNA. Cell. 170, 8-9 (2017).
  14. Pfeiffer, V., Lingner, J. TERRA promotes telomere shortening through exonuclease 1-mediated resection of chromosome ends. PLoS Genet. 8, e1002747(2012).
  15. Balk, B., Dees, M., Bender, K., Luke, B. The differential processing of telomeres in response to increased telomeric transcription and RNA-DNA hybrid accumulation. RNA Biol. 11, 95-100 (2014).
  16. Yu, T. Y., Kao, Y. W., Lin, J. J. Telomeric transcripts stimulate telomere recombination to suppress senescence in cells lacking telomerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 3377-3382 (2014).
  17. Mehmetbeyoglu, E., et al. Decrease in RNase HII and accumulation of lncRNAs/DNA hybrids: a causal implication in psoriasis. Biomolecules. 12 (3), 368(2022).
  18. Boguslawski, S. J., et al. Characterization of monoclonal antibody to DNA.RNA and its application to immunodetection of hybrids. J Immunol Methods. 89, 123-130 (1986).
  19. Phillips, D. D., et al. The sub-nanomolar binding of DNA-RNA hybrids by the single-chain Fv fragment of antibody S9.6. J Mol Recognit. 26, 376-381 (2013).
  20. Ginno, P. A., Lott, P. L., Christensen, H. C., Korf, I., Chédin, F. R-loop formation is a distinctive characteristic of unmethylated human CpG island promoters. Mol Cell. 45, 814-825 (2012).
  21. O'Callaghan, N. J., Fenech, M. A quantitative PCR method for measuring absolute telomere length. Biol Proced Online. 13, 1-10 (2011).
  22. Arora, R., Azzalin, C. M. Telomere elongation chooses TERRA ALTernatives. RNA Biol. 12, 938-941 (2015).
  23. Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nat Struct Mol Biol. 20, 1199-1206 (2013).
  24. Roake, C. M., Artandi, S. E. Approaching TERRA Firma: genomic functions of telomeric noncoding RNA. Cell. 170, 8-9 (2017).
  25. Luke, B., Lingner, J. TERRA: telomeric repeat-containing RNA. EMBO J. 28, 2503-2510 (2009).
  26. Cañas, J. C., Aguilera, A., Gómez-González, B. Detection of R-loops by in vivo and in vitro cytosine deamination in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 2528, 39-53 (2022).
  27. Cerritelli, S. M., Sakhuja, K., Crouch, R. J. RNase H1, the gold standard for R-loop detection. Methods Mol Biol. 2528, 91-114 (2022).
  28. Skourti-Stathaki, K. Detection of R-loop structures by immunofluorescence using the S9.6 monoclonal antibody. Methods Mol Biol. 2528, 21-29 (2022).
  29. Kianmehr, L., et al. Analysis of RNA/DNA hybrid profiles in blood from autistic patients reveals differences in mRNA and non-coding RNA regions. bioRxiv. , (2024).
  30. Yilmaz Sukranli, Z., et al. Experimentally altering microRNA levels in embryos alters adult phenotypes. Sci Rep. 14, 19014(2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

RNA telomerycznehybrydy DNA RNAszacowanie TERRAniekoduj ce RNAoczyszczanie hybrydseparacja fazowaproteinaza Ktrawienie DNazekstrakcja fenolo chloroformowaizolacja kwas w nukleinowych

Powiązane artykuły