Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja pierwotnych komórek nabłonka nabłonka proksymalnego ludzkiego i ich zastosowanie w tworzeniu mikrofizjologicznego modelu kanału bliższego nerki

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67997

⸱

9 maja 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutics, School of Pharmacy, University of Washington, 2Department of Pharmacy, School of Pharmacy, University of Washington, 3Kidney Research Institute, Division of Nephrology, Department of Medicine, University of Washington, 4Barbara T. Murphy Division of Nephrology, Samuel Bronfman Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy zoptymalizowany protokół przetwarzania całych ludzkich nerek w celu izolacji i hodowli pierwotnych komórek nabłonkowych kanałów proksymalnych nerek oraz zastosowanie tych komórek w trójwymiarowej, mikrofluidycznej, mikrofizjologicznej platformie do ponownego odtworzenia kanału proksymalnego nerk.

Streszczenie

Choroby nerek dotykają ponad 850 milionów osób na całym świecie, w tym 37 milionów Amerykanów. Czynniki ryzyka przewlekłej choroby nerek obejmują wpływy środowiskowe, predyspozycje genetyczne, współistniejące schorzenia oraz historię ostrych uszkodzeń nerek. Te czynniki często rozwijają się miesiącami lub latami, co komplikuje badania podłużne etiologii i patofizjologii chorób. Zaawansowane modele nerek są potrzebne, aby lepiej zrozumieć mechanizmy choroby i poprawić przewidywanie nefrotoksyczności w opracowywaniu leków. Komórki nabłonkowe kanałów proksymalnych (PTEC) w nerkach odgrywają kluczową rolę w usuwaniu ksenobiotyków i toksyn oraz w reabsorpcji niezbędnych składników odżywczych. Wcześniej wykazaliśmy, że trójwymiarowe (3D) mikrofizjologiczne systemy (MPS), wypełnione izolowanymi pierwotnymi PTEC, mogą być wykorzystywane do badania interakcji leków nerkowych, oceny nefrotoksyczności związków oraz przewidywania kliringu leków. Przedstawiamy tutaj protokoły izolowania i hodowli pierwotnych PTEC z całych ludzkich nerek oraz ich zasiewania na platformie 3D MPS, która naśladuje fizjologię nerek in vivo . Protokół ten umożliwia długoterminowe badania potwierdzające żywotność PTEC, morfologię fizjologiczną oraz funkcjonalną polaryzację kluczowych białek transporterowych w urządzeniach MPS do 6 miesięcy.

Wprowadzenie

Nerka odgrywa kluczową rolę w usuwaniu i eliminacji szerokiego spektrum ksenobiotyków, toksyn oraz endogennych związków z organizmu. Osiąga się to poprzez filtrowanie krwi w celu usuwania produktów przemiany materii oraz regulację równowagi elektrolitów, poziomu płynów i pH. Każda ludzka nerka zawiera około miliona nefronow, czyli jednostek strukturalnych i funkcjonalnych nerki1. W tych nefronach wyspecjalizowane komórki nabłonkowe w kanalikach bliższych, zwane komórkami nabłonkowymi kanalików bliższych (PTEC), odpowiadają za reabsorpcję niezbędnych cząsteczek, takich jak glukoza, aminokwasy i jony, a także za wydzielanie substratów leków i potencjalnie toksycznych substancji do moczu 2,3,4. W niektórych przypadkach PTEC-y mogą także ponownie wchłaniać związki z moczu z powrotemdo krwiobiegu. Ze względu na ich kluczową rolę w interakcjach leków i toksyn, pierwotne PTEC wyizolowane z ludzkich nerek stanowią cenne narzędzie do badania interakcji lek-lek w nerkach (DDI) oraz oceny nefrotoksyczności związków.

Nefrotoksyczność wywołana lekami stanowi poważne wyzwanie kliniczne, ponieważ może prowadzić do ostrego uszkodzenia nerek i przewlekłej choroby nerek5. Dlatego głębsze zrozumienie fizjologii proksymalnej tubuli nerek jest niezbędne do dokładnego przewidywania i charakteryzowania potencjału nefrotoksycznego leków i toksyn. Tradycyjne modele in vitro, w tym uwiecznione linie komórkowe nerek (np. RPTEC-TERT1, HK-2), mają ograniczenia w naśladowaniu złożonej struktury i funkcji ludzkich kanałów bliższych6, które działają pod dynamicznym, laminarnym przepływem (o niskiej liczbie Reynoldsa) oraz jednolitą macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) in vivo 7,8. Dodatkowo, tradycyjne modele dwuwymiarowe (2D) często nie potrafią funkcjonalnie wyrażać głównych transporterów nerkowych (np. transporter anionów organicznych 1 i 3 (OAT1 i OAT3), transporter kationów organicznych 2 (OCT2)) z powodu szybkiej degradacji i internalizacji tych białek 6,9,10,11 . Modele zwierzęce, choć informacyjne, mogą nie w pełni odwzorowywać ludzkiej fizjologii nerek i często nie są tłumaczalne z powodu różnic gatunkowych w ekspresji i aktywności transporterów12. Na przykład mOct1 jest bazolateralnie wyrażany w myszych PTEC, podczas gdy u ludzi ekspresja białka błonowego OCT1 w nerkach jest niewykrywalna13,14.

Postępy w systemach mikrofizjologicznych (MPS) oraz technologiach organ-on-a-chip umożliwiły naukowcom opracowanie modeli in vitro, które wiernie naśladują trójwymiarową (3D) architekturę oraz dynamiczne warunki przepływu płynów w ludzkich organach15. Nasza grupa wcześniej scharakteryzowała dwa modele MPS za pomocą PTECs16,17 i wykorzystywała te modele do przeprowadzania badań toksyczności18, 19, 20 oraz dokładnego przewidywania utylizacji leków21. Zastosowanie pierwotnych PTEC w tych modelach przynosi istotne korzyści ze względu na ich zdolność do zachowania cech funkcjonalnych obserwowanych in vivo.

Przedstawiamy tutaj protokoły izolacji ludzkich PTEC-ów od nienaruszonej ludzkiej nerki pobranej od zmarłego dawcy za pośrednictwem zatwierdzonej przez United Network for Organ Sharing (UNOS) organizacji zajmującej się pozyskiwaniem narządów (UNOS) oraz stosowania tych hodowlowanych ludzkich PTEC-ów w platformie MPS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace były prowadzone zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu Waszyngtońskiego dotyczącymi obsługi tkanek ludzkich. Odpowiedni dawcy spełniają następujące wymagania: mniej niż 36 godzin zimnego czasu niedokrwiennego (CIT), brak znanych chorób nerek, dializ lub innych schorzeń (np. cukrzyca typu 1 lub 2, zapalenie wątroby typu B, zapalenie wątroby typu C, wirusowe niedobory odporności (HIV), zapalenie opon mózgowych wirusowo/bakteryjne, zakażenie gronkowcem aureus opornym na metycylinę, kiła, sepsa lub Covid-19). Całe ludzkie nerki użyte w tym badaniu pochodziły z zatwierdzonego przez UNOS OPO.

1. Przygotowanie szafek do zabezpieczeń biologicznych

  1. Spryskaj maskę 70% etanolem. Odczyszcz wszystkie powierzchnie i przedmioty wewnątrz szafki, aby stworzyć sterylne środowisko.
  2. Połóż niebieskie podkładki chłonne. Wykonuj całą pracę tkankową na tych podpaskach.
  3. Upewnij się, że w szafce biosafety jest dostępny niezbędny sprzęt i odpowiednio sterylizowany (żyletki, końcówki pipet serologicznych, pistolet serologiczny, sita komórkowe 100 μm, końcówki p1000, mikropipety 1000 μL, okrągłe naczynia hodowlujące 15 cm oraz rurki stożkowe).

2. Przygotowanie do przetworzenia nerek

  1. Przygotuj roztwór trawienia nerek, dodając 0,75 mg/mL kolagenazy IV + 0,75 mg/mL dyspazy II do soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS) Dulbecco z wapniem i magnezem. Przefiltruj roztwór przez filtr membranowy o średnicy 0,2 μm.
    UWAGA: Dla całej ludzkiej nerki u dorosłego człowieka wymagane jest około 14 stożkowych probówek o pojemności 50 mL, każda zawierająca ~35 mL roztworu trawiennego (łącznie 500 mL).
  2. Przygotuj podłoże PTEC, dodając 4,425 g Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 Dulbecco bez glukozy, 0,5 g proszku D-glukozy, 0,6 g wodorowęglanu sodu, 5 ml 100-krotnego suplementu insulinowotransferynowo-selenu (zawierającego 1000 mg/L insuliny, 550 mg/L transferynu i 0,67 mg/L selenitu sodu), 0,5 mL 50 μM hydrokortyzonu, oraz 5 mL 100x roztworu antymikotycznego antymikotycznego (zawierającego 10000 jednostek/mL penicyliny G sodu, 10000 μg/mL streptomycyny oraz 25 μg/mL amfotericyny B w 0,85% soli fizjologicznej) do 500 mL sterylnej autoklawowanej wody ultraczystej (Typ 1). Przefiltruj medium przez sterylny filtr membranowy o średnicy 0,2 μm. Rozmroź surowicę bydła płodu (FBS) i przygotuj 10 mL aliquotów w 14 stożkowych probówkach po 50 mL.
  3. Zbierz i oznacz dodatkowy zestaw stożkowych probówek o pojemności 50 mL. Na tym etapie upewnij się, że są 3 zestawy po 14 probówek po 50 mL.
  4. Podgrzej orbitalny shaker do 37 °C.

3. Izolacja PTEC od całej nerki

  1. Stosując technikę sterylną, umieść kontener z próbką tkanki w osłonie bezpieczeństwa biologicznego. Wyjmij torbę z pudełka i spryskaj zewnętrzną stronę 70% etanolem przed włożeniem do maski.
  2. Umieść nerkę na okrągłej misce hodowli o średnicy 15 cm. Aspiruj/odrzucaj pozostałe nośniki.
  3. Usuń otaczający tłuszcz i torebkę nerkową za pomocą sterylnych żyletek. Delikatnie nacinajcie torebkę nerkową, aby zrobić szczelinę w środku.
  4. Używając pęsety, zdejmij kapsułkę i użyj żyletek, aby odciąć tłuszcz przyczepiony do nerki. Wyrzuć zarówno kapsułkę, jak i tłuszcz do kolejnego naczynia do hodowli o średnicy 15 cm.
  5. Oddziel korę (~1 cm grubości) od rdzenia przedłużonego. Usuń rdzenie.
    UWAGA: Kora ma jaśniejszy brunatno-żółty kolor w porównaniu do rdzenia przedłużonego.
  6. Za pomocą żyletki pokrój tkankę na kawałki o wielkości <1 cm3 , aż uzyska efekt przypominający zawiesinę.
  7. Dodaj niewielką ilość buforu trawienia nerek do naczynia i przelej zawiesinę do pierwszego zestawu probówek po 50 ml zawierających 35 ml roztworu trawienia nerek. Rozprowadz ją równomiernie i nie przekraczaj objętości 45 mL na każdą probówkę.
  8. Przenieś wszystkie rurki na orbitalny shaker o temperaturze 37 °C i inkubuj przez 30 minut z maksymalną prędkością, która nie powoduje wypadania rurek. Po spryskaniu 70% etanolem przełóż rurki z powrotem do szafki zabezpieczeniowej.
  9. Odwróć rurki, aby się wymieszały i pozwól większym kawałkom tkanki osiąść na dnie. Przenieś jak najwięcej roztworu do 50 mL stożkowych rurek zawierających 10 mL surowicy płodowej bydła (FBS) bez przenoszenia nienaruszonej tkanki. Rozprowadzaj równomiernie i nie przekraczaj całkowitej objętości 45 mL na każdą probówkę.
  10. Wiruj probówki przy 200 g przez 7 minut. Po spryskaniu 70% etanolem przenieś rurki z powrotem do szafki zabezpieczeniowej.
  11. Ostrożnie zasysaj supernatant. Dodaj 10 ml medium PTEC do każdej probówki i ponownie zawiesij granulki.
  12. Przecieńcz powstałe zawiesiny komórkowe przez sita ogniwa o pojemności 100 μm do nowych stożkowych rurek o pojemności 50 mL.
  13. Wiruj i powstała komórka filtruje z 400 g przez 5 minut. Po spryskaniu 70% etanolem przenieś rurki z powrotem do szafki zabezpieczeniowej.
  14. Przemyj granulki 5 mL DPBS. Ponownie zawiesij granulki za pomocą końcówki p1000.
  15. Wiruj probówki z 400 g przez 5 minut. Po spryskaniu 70% etanolem przenieś rurki z powrotem do szafki zabezpieczeniowej, a następnie odpompuj supernatanty.
  16. Powtórz krok 3.15 jeszcze dwa razy, co daje łącznie trzy prania. Następnie ponownie zawiesij pellety komórkowe z 15 mL podłoża PTEC i nakładaj komórki na sterylne kolby T-75.
  17. Odpowiednio oznacz kolby i pozwól komórkom rosnąć w sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%CO2. Pozwól PTEC-om rosnąć niezakłócony w inkubatorze przez 48 godzin przed pierwszą zmianą podłoża.

4. Zmiany w mediach

  1. Aspiruj medium z kolbek.
  2. Płucz ogniwa 5 mL podgrzanego DPBS.
  3. Dodaj 5 ml podgrzanego materiału PTEC do kolb T-25.
  4. Zwróć kolbę do inkubatora.
  5. Zmieniaj podłoże co 48 godzin, aż kolba osiągnie co najmniej 70% zbiórki do przepuszczania lub użycia w eksperymentach.

5. Pasażowanie PTEC-ów

  1. Aspiruj medium z piersiówki. Dodaj 5 ml podgrzanego 0,05% trypsyny-EDTA do każdej kolby T-25 i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 1 do 2 minut, aby umożliwić trawienie trypsyny.
  2. Po odłączeniu komórek neutralizuj trypsynę 5 mL podgrzanego roztworu inhibitora trypsyny.
  3. Zawiesij ponownie 5 razy, aby usunąć komórki nadal przyczepione do kolbyki. Następnie przenieś zawiesinę ogniwa do stożkowych rurek 15 mL i wirować w 400 g przez 5 minut.
  4. Wypompuj supernatant.
    UWAGA: Zatrzymaj się tutaj, aby kriokonserwować PTEC i przejść do tego protokołu.
  5. Ponownie zawiesnij pellety komórkowe z 14 mL medium PTEC na probówkę. Przenieś zawiesiny ogniw do kolb T-75 (1 rurka na kolbę).
  6. Wykonaj potrząsanie T, aby równomiernie rozłożyć komórki po kolbie. Monitoruj komórki i wymieniaj medium co 48 godzin.

6. PTEC-y do kriokonserwacji

  1. Po kroku 5.6. ponownie zawiesij granulki komórkowe w 2 mL 10% DMSO i 90% niskoglukozowego PTEC dla każdej 15 mL stożkowej rurki i przelej 1 mL do jednej kriovialnej.
  2. Przełóż krioviale do pojemnika do zamrażania komórek, który pozwala na zamrażanie w kontrolowanej temperaturze, a następnie umieść pojemnik w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 24 godziny. Po 24 godzinach w temperaturze -80 °C należy przenieść krioviale do zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.

7. PTEC-y rozmrażające

  1. Rozmroz fiolkę z -80 °C w kąpieli wodnej 37 °C. Nie rozmrażaj w temperaturze pokojowej (RT). Gdy fiolka zostanie częściowo rozmrożona (powinien być widoczny mały kawałek lodu), dodaj 1 mL zawiesiny komórkowej do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z 10 ml wcześniej podgrzanego medium PTEC.
  2. Skręcaj zawiesinę ogniwową przy 400 g przez 5 minut. Aspiracja supernatantu i ponowna zawiesina komórek w 5 mL podgrzanego niskoglukozowego podłoża PTEC.
  3. Przełóż zawiesinę ogniw 5 ml do kolby T-25 i wykonaj potrząsanie T, aby równomiernie rozłożyć komórki po kolbie. Stąd postępuj zgodnie z sekcją 4, aby uzyskać zmiany w mediach.

8. Powlekanie urządzenia MPS matrycą kolagenową typu I

  1. Aspiruj PBS z urządzenia MPS i wyjmij urządzenie z opakowania. Wytrzyj urządzenie chusteczkami medycznymi i oznacz według uznania.
  2. Umieść urządzenie MPS w okrągłej misce hodowlającej o średnicy 15 cm i umieść ją w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowe do użycia. Na dnie naczynia trzymaj chusteczki medyczne, aby zapobiec wilgoci na urządzeniu MPS.
  3. Trzymaj 1 ml strzykawek z 22 g igieł Luer-Lok w temperaturze -20 °C do czasu zastosowania do zastrzyku kolagenu I.
  4. Na każde cztery urządzenia MPS, które trzeba napełnić, trzymaj jedną stożkową rurkę o pojemności 15 ml na lodzie. Na każdą stożkową probówkę o pojemności 15 ml używaj jednej strzykawki o pojemności 1 mL z przyłączoną tępo.
  5. Stosując sterylną technikę w szafie biobezpieczeństwa, otwórz wszystkie porty w urządzeniu MPS. Upewnij się, że szczeliny na górze każdego zaworu śrubowego są pionowo wyrównane z portem.
  6. Używając 1 mL strzykawki/igły, przepłucz komorę ECM 1 mL etanolu do portów #1, #3 i #6. Aspiruj etanol i pozwól mu całkowicie odparować (co najmniej 30 s), aby nie przeniknął do urządzenia MPS z portów #2, #4 i #5.
  7. Ustaw urządzenie MPS na 4 °C i trzymaj na lodzie mediów PTEC, M199 i 1 N NaOH.
  8. Oblicz skład macierzowy dla 1 mL mieszaniny kolagenu typu I dla około czterech urządzeń MPS zgodnie z Tabelą 1 (skala w razie potrzeby). W szafie biobezpieczeństwa mieszaj media PTEC, M199 i 1 N NaOH w tej kolejności, zgodnie z powyższymi obliczeniami, i trzymaj wszystkie rurki na lodzie.
  9. Ostrożnie dodaj bulion kolagenu typu I strzykawką o pojemności 1 ml do gotowej mieszanki. Mieszaj mieszankę kolagenową, pipetując w górę i w dół, aż masa uzyska stabilny kolor łososia-pomarańczowo-różowy.
  10. Krótko wiruj w probówce, aby zebrać roztwór na dnie. Upewnij się, że w roztworze nie ma bąbelków.
  11. Schłodzone strzykawki 1 mL z 22 g igłami Luer-Lok i urządzeniem MPS umieść w szafce biosafety i na lodzie. Napełnij schłodzoną strzykawkę o pojemności 1 ml mieszanką kolagenową i całkowicie unikaj pęcherzyków.
  12. Bardzo powoli i delikatnie wstrzykuj roztwór kolagenowy do portów #1, #3 i #6 w komorach schłodzonych urządzeń. Trzymaj urządzenie pionowo z portami skierowanymi w dół, aby pęcherzyki powietrza mogły przepływać w górę i z portów #2, #4 i #5.
    UWAGA: Na portach #2, #4 i #5 powinna być kropla mieszaniny kolagenowej, co wskazuje, że komory są w pełni pokryte.
  13. Wyjmij strzykawkę i włóż ją z powrotem do probówki 15 mL na lodzie. Odkręć zawór śrubowy dla portów #2, #4 i #5, aby uszczelnić wypełniony chip i umieść go na misce hodowli w temperaturze 4 °C na 30 minut.
  14. Po 30 minutach przenieś chip razem z naczyniem do szafki biosafety w sterylny sposób i rozłóż chipsy równomiernie i indywidualnie, aby równomiernie się nagrzewały.
  15. Do każdego naczynia włóż nawilżoną chusteczkę medyczną (aby zapobiec wysychaniu i odklejaniu się matrycy kolagenu I od ścian urządzenia MPS) i zabezpiecz naczynia półprzezroczystą, elastyczną folią uszczelniającą. Pozwól kolagenowi zpolimeryzować się przez noc w RT.

9. Tworzenie lumenu rurkowego z kolagenem typu IV jako ECM w urządzeniu MPS

  1. Sterylizuj rurki C-flex, przepłukując je ultraczystą wodą (Typ 1) i czystym etanolem, a następnie autoklawuj całą linię rurek.
  2. W szafie biobezpieczeństwa otwórz wszystkie porty urządzenia MPS wypełnionego kolagenem typu I (zawór śrubowy będzie pionowy względem portów) i usuń przewód wystający z portów #1, #3 i #6, aby utworzyć lumeny rurkowe.
  3. Włóż metalowe sprzęgły do portów #1, #3 i #6.
  4. Przygotuj roztwór 10 mL kolagenu typu IV o stężeniu 5 μg/mL w podłożu PTEC.
  5. Włóż 24 cale sterylnej rurki C-flex na metalowe wystające z portów #1, #3 i #6.
  6. Napełnij 1 mL strzykawek z 22-g-igłową igłową Luer-Lok 0,5 mL roztworu kolagenu typu IV.
  7. Umieść napełnioną strzykawkę na pompie infuzyjnej i podłącz rurkę od portu #1 do strzykawki. Powtórz ten krok dla portów #3 i #6.
  8. Za pomocą pompy strzykawkowej podaj roztwór kolagenu typu IV do portów MPS z częstotliwością 10 μL/min przez 30 minut. Po wpuszczeniu portów pozwól kolagenowi zastygnąć w inkubatorze 37 °C przez noc, zanim użyjesz ich następnego dnia.
    UWAGA: Urządzenia MPS pokryte kolagenem IV mogą być przechowywane do tygodnia w temperaturze 4 °C.

10. Siewowanie pierwotnych PTEC-ów w urządzeniu MPS

  1. Sprawdź urządzenie MPS pod mikroskopem, aby upewnić się, że lumen utworzył się prawidłowo.
  2. Włóż wcześniej sterylizowaną strzykawkę o pojemności 5 ml z igłą 22 g do probówki 15 mL zawierającej 5 mL etanolu.
  3. Pobierz pellet ogniwa PTEC w stożkowej probówce o pojemności 15 mL z kolby T-25, wykonując kroki 5.1. do 5,3. Dodaj 80 μL podłoża PTEC do osadu komórkowego i delikatnie go zawiesz.
  4. Przenieś zawiesinę ogniwową do mikrorurki o pojemności 1,5 mL.
  5. Wyjmij talerz z urządzeniem MPS z inkubatora i umieść go w szafce zabezpieczeń biologicznych. Zamknij porty #2, #4 i #5 i obróć zawór śrubowy poziomo względem portów.
  6. Delikatnie przesuń rurkę zawierającą PTEC, aby ponownie zawiesować komórki. Napełnij strzykawkę komórkami i włóż igłę do portu wtryskowego najdalej od portów zaworów śrubowych.
  7. Ostrożnie naciśnij tłok strzykawki, aby wstrzyknąć komórki. Wizualizuj komórki po wstrzyknięciu pod mikroskopem.
    UWAGA: Komórki powinny poruszać się przez lumen. Jeśli w świetle nie zauważono komórek, sprawdź, czy igła została dobrze wprowadzona do portu do wstrzykiwania i w razie potrzeby ponownie ją włóż. Pełna strzykawka komórek może wypełnić wszystkie trzy lumeny urządzenia.
  8. Kontynuuj iniekcje komórek z pozostałych dwóch portów. Po wstrzyknięciach zamknąć porty #2, #4 i #5 i umieścić urządzenie MPS z powrotem w inkubatorze 37 °C. Utrzymuj płytkę poziomo, aby komórki nie wychodziły z lumenu przez grawitację.
  9. W przypadku dodatkowych urządzeń MPS należy przemyć strzykawkę etanolem po jej opróżnieniu i przemyć DPBS przed pobraniem komórek.
  10. Pozwól urządzeniom MPS leżeć na noc niezakłócone.
  11. Następnego dnia podłącz urządzenia MPS do pomp strzykawkowych.
  12. W szafce biosafety napełnij strzykawki o pojemności 5 ml medium PTEC. Następnie zamontować końcówki 22 G Luer-Lok z 24-calową rurką C-flex przymocowaną do strzykawek.
  13. Włóż strzykawki z mediem PTEC do pompy strzykawkowej. Zaparuj przewody, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
  14. Podłącz zagruntowane przewody rurowe do portów #1, #3 i #6 i obróć zawory śrubowe w pionową pozycję, aby wprowadzić przepływ medium.
  15. Ustaw przepływ pompy strzykawkowej na 0,5 μL/min. Umieść naczynie z urządzeniem MPS z powrotem do inkubatora 37 °C i pozwól komórkom utworzyć rurki (w ciągu 5 do 7 dni) pod ciągłą perfuzją w ośrodku przed rozpoczęciem eksperymentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Morfologia i konfluencja izolowanych pierwotnych PTEC w czasie w kulturze 2D
Po izolacji od kory nerkowej PTEC-y mogły rosnąć niezakłócone przez co najmniej 48 godzin przed pierwszą zmianą ośrodka. Około tydzień po hodowli komórek powinny pojawić się małe partie PTEC-ów w całej kolbie z jednolitą morfologią nabłonkową, przypominającą bruk (Rysunek 1A,B). W zależności od tempa wzrostu PTEC od różnych dawców, konfluencja komórek powinna osiągnąć około 50%...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

MPS, czyli technologie organ-on-a-chip, oferują bardzo istotną platformę in vitro do podsumowania kluczowych aspektów fizjologii człowieka, co zmniejsza uzależnienie od modeli zwierzęcych w opracowywaniu leków i ocenach toksykologicznych. Niedawno ustawa FDA Modernization Act 2.0 (2022) pozwoliła na uwzględnienie MPS, między innymi alternatyw, w wnioskach o nowe leki badawczenr 29. Protokół ten opisuje standardową procedurę operacyjną dysocjacji PTEC z tkanki korowej dawcy człowieka oraz ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają konfliktów interesów ani ujawnień finansowych związanych z tym badaniem.

Podziękowania

Część tych prac była wspierana przez kontrakt NASA 80ARC023CA001, National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS) (U2CTR004867, UH3TR000504, UG3TR002158), wspólnie przez NCATS oraz Center for the Advancement of Science in Space (CASIS) (UG3TR002178), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (P30ES00703), National Institute of General Medical Sciences (T32GM007750), nieograniczoną darowiznę Northwest Kidney Centers na rzecz badań nad nerkami oraz Szkoły Farmacji na Uniwersytecie Waszyngtońskim (nagroda Ji-Ping Wang i stypendium Bradley).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 mL strzykawek Luer-Lok TipBecton, Dickinson309628
Rurki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 mLProdukty naukowe CELLTREAT229442
15 mL sterylna stożkowa rurka z polipropylenowegoFisher Scientific14-959-53A
Urządzenie mikrofizjologiczne 3DNortisTCC-001
5 mL strzykawek Luer-Lok TipBecton, Dickinson309646
50 mL sterylna rurka stożkowa z polipropylenuFisher Scientific12-565-271
Antybiotyk przeciwmykotyczny (100x)ThermoFisher Scientific15240062
Kolagenaza, typ IV, proszekThermoFisher Scientific17104019
D-(+)-glukozaMilliporeSigmaG8270
Zdefiniowany inhibitor trypsynyThermoFisher ScientificR007100
Dimetylsulfotlenek, bioreagent, chemikalia termonaukoweThermoFisher ScientificJ66650-AK
Dispase II, prochThermoFisher Scientific17105041
Dulbecco' s MEM (DMEM)/F-12 bez glukozyAmerykańskie Biologiczne Nauki o ŻyciuD9807-02
Fosforanowa sól fizjologiczna Dulbecco (DPBS), wapń, magnezThermoFisher Scientific14040117
Serum płodowe bydłe (FBS), PremiumThermoFisher ScientificA5670701
Zestawy do pipetowania Finnpipette F2 Good Laboratory (GLP)ThermoFisher Scientific05-719-511Mikropipety
Końcówki pipety Fisherbrand SureOne Micropoint, uniwersalne dopasowanie, bez filtrówFisher Scientific02707407, 02707410, 02707438
Świeża, cała ludzka nerkaNovabiosishttps://www.novabiosis.com/research-organ-allocation-services/Ludzkie nerki zostały pobrane za pomocą Novabiosis, zatwierdzonego przez UNOS OPO
Nawilżony inkubator (37 stopi; C oraz 5% CO2)Fisher Scientific51033556
HydrokortyzonMilliporeSigmaH0888
Inkubujący Orbitalny PotrząsaczAvantor12620-946
Insulina-transferyna-selen (100X) (ITS -G)ThermoFisher Scientific41400045
Fiolki kriogeniczne z wewnętrznym wątkiemCorning430487
Kimtech Science KimwipesKimberly-Clark Professional34120
Sztuby (igła), 22 G x 0,5 calaInstech Laboratories, Inc.LS22
Średnia 199, sole Earle'a (10x)ThermoFisher Scientific21180021
Mała wirówka stołowa Megafuge 8ThermoFisher Scientific75007210
Metalowy sprzęg ()Instech Laboratories, Inc.SC 20/15
Mr. Frosty Pojemnik MrażonyThermoFisher Scientific5100-0036
Mikroskop Nikon Eclipse Ti-SNikon Instrumentshttps://www.thelabworldgroup.com/product/nikon-eclipse-ti-fluorescent-microscope/Oryginalny model wycofany 
Kolby Nunc nieobrobione, T-25ThermoFisher Scientific169900
Kolby Nunc nieobrobione, T-75ThermoFisher Scientific156800
Pipeta, 10 mL, Graduated, 1/10 mL, sterylnaGreiner Bio-One607180
Rurki krzemowe, rurki C-flex, (ID: 0,020", OD: 0,083")Cole-Parmer06422-00
Żyletka jednoostrza (sterylna)BiosealKI-205/50
Wodorowęglan soduMilliporeSigmaS6297
Wodorotlenek soduMilliporeSigmaS8045
Sterylne jednorazowe filtry z membranami PESThermoFisher Scientific567-0020
Naczynia do hodowli tkankowej, 150 mm  x 20 mm z wywietrzeniemGenesee Scientific25-203
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaThermoFisher Scientific25300054
Kolagen typu I, ogon szczuraCorning354236
Kolagen typu IV, myszCorning354233

Bibliografia

  1. Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatr Nephrol. 26 (9), 1529-1533 (2011).
  2. Zhang, X., et al. Tubular secretion of creatinine and kidney function: an observational study. BMC Nephrol. 21, 108(2020).
  3. Wang, K., Kestenbaum, B. Proximal tubular secretory clearance. Clin J Am Soc Nephrol. 13 (8), 1291-1296 (2018).
  4. Yin, J., Wang, J. Renal drug transporters and their significance in drug-drug interactions. Acta Pharm Sin B. 6 (5), 363-373 (2016).
  5. Connor, S., Roberts, R. A., Tong, W. Drug-induced kidney injury: challenges and opportunities. Toxicol Res (Camb). 13 (4), tfae119(2024).
  6. Meijer, T., et al. Characterization of organic anion and cation transport in three human renal proximal tubular epithelial models. Cells. 13 (12), 1008(2024).
  7. Theocharis, A. D., Skandalis, S. S., Gialeli, C., Karamanos, N. K. Extracellular matrix structure. Adv Drug Deliv Rev. 97, 4-27 (2016).
  8. Miceli, C., et al. Fluid flow-induced shear stress controls the metabolism of proximal tubule kidney epithelial cells through primary cilium-dependent lipophagy and mitochondria biogenesis. Autophagy. 16 (12), 2287-2288 (2020).
  9. Tsang, Y. P., Hao, T., Mao, Q., Kelly, E. J., Unadkat, J. D. Dysregulation of the mRNA expression of human renal drug transporters by proinflammatory cytokines in primary human proximal tubular epithelial cells. Pharmaceutics. 16 (2), 285(2024).
  10. Bajaj, P., et al. Freshly isolated primary human proximal tubule cells as an in vitro model for the detection of renal tubular toxicity. Toxicology. 442, 152535(2020).
  11. Brown, C. D. A., et al. Characterisation of human tubular cell monolayers as a model of proximal tubular xenobiotic handling. Toxicol Appl Pharmacol. 233 (3), 428-438 (2008).
  12. Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrol Dial Transplant. 28 (10), 2432-2438 (2013).
  13. Morse, B. L., et al. Pharmacokinetics of organic cation transporter 1 (OCT1) substrates in Oct1/2 knockout mice and species difference in hepatic OCT1-mediated uptake. Drug Metab Dispos. 48 (2), 93-105 (2020).
  14. Samodelov, S. L., Kullak-Ublick, G. A., Gai, Z., Visentin, M. Organic cation transporters in human physiology, pharmacology, and toxicology. Int J Mol Sci. 21 (21), 7890(2020).
  15. Wikswo, J. P. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Exp Biol Med. 239 (9), 1061-1072 (2014).
  16. Weber, E. J., et al. Development of a microphysiological model of human kidney proximal tubule function. Kidney Int. 90 (3), 627-637 (2016).
  17. Chapron, A., et al. An improved vascularized, dual-channel microphysiological system facilitates modeling of proximal tubular solute secretion. ACS Pharmacol Transl Sci. 3 (3), 496-508 (2020).
  18. Adler, M., et al. A quantitative approach to screen for nephrotoxic compounds in vitro. J Am Soc Nephrol. 27 (4), 1015-1028 (2016).
  19. Chang, S., et al. Human liver-kidney model elucidates the mechanisms of aristolochic acid nephrotoxicity. JCI Insight. 2 (22), e95978(2017).
  20. Weber, E. J., et al. Human kidney on a chip assessment of polymyxin antibiotic nephrotoxicity. JCI Insight. 3 (24), e123673(2018).
  21. Imaoka, T., et al. Bridging the gap between in silico and in vivo by modeling opioid disposition in a kidney proximal tubule microphysiological system. Sci Rep. 11 (1), 21356(2021).
  22. Van Ness, K. P., Chang, S., Weber, E. J., Zumpano, D., Eaton, D. L., Kelly, E. J. Microphysiological systems to assess nonclinical toxicity. Curr Protoc Toxicol. 73, 14.18.1-14.18.28 (2017).
  23. Lidberg, K. A., et al. Serum protein exposure activates a core regulatory program driving human proximal tubule injury. J Am Soc Nephrol. 33 (5), 949-965 (2022).
  24. Sakolish, C., et al. Technology transfer of the microphysiological systems: a case study of the human proximal tubule tissue chip. Sci Rep. 8 (1), 14882(2018).
  25. Hart, A., et al. Identification of prognostic biomarkers for antibiotic associated nephrotoxicity in cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 23 (2), 293-299 (2024).
  26. Lidberg, K. A., et al. Antisense oligonucleotide development for the selective modulation of CYP3A5 in renal disease. Sci Rep. 11 (1), 4722(2021).
  27. Imaoka, T., et al. Microphysiological system modeling of ochratoxin A-associated nephrotoxicity. Toxicology. 444, 152582(2020).
  28. Chapron, B. D., et al. Reevaluating the role of megalin in renal vitamin D homeostasis using a human cellderived microphysiological system. ALTEX. 35 (4), 504-515 (2018).
  29. Adashi, E. Y., O'Mahony, D. P., Cohen, I. G. The FDA modernization act 2.0: drug testing in animals is rendered optional. Am J Med. 136 (9), 853-854 (2023).
  30. Qi, W., Johnson, D. W., Vesey, D. A., Pollock, C. A., Chen, X. Isolation, propagation and characterization of primary tubule cell culture from human kidney (methods in renal research). Nephrology. 12 (2), 155-159 (2007).
  31. Mihevc, M., Petreski, T., Maver, U., Bevc, S. Renal proximal tubular epithelial cells: review of isolation, characterization, and culturing techniques. Mol Biol Rep. 47 (12), 9865-9882 (2020).
  32. Shaver, C. M., et al. Cellfree hemoglobin augments acute kidney injury during experimental sepsis. Am J Physiol Renal Physiol. 317 (4), F922-F929 (2019).
  33. Sbarbati, R. Separation of human endothelial cells from fibroblasts by centrifugation in Percoll gradients. Biosci Rep. 5 (6), 469-472 (1985).
  34. Horn, P., et al. Isolation of human mesenchymal stromal cells is more efficient by red blood cell lysis. Cytotherapy. 10 (7), 676-685 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

kom rki kanalik w proksymalnychnerkowy model mikrofizjologicznyizolacja kom rek nerekpierwotne kom rki nab onkoweplatforma 3D MPSprzewidywanie nefrotoksyczno ciocena transportu lek wtechniki hodowli kom rkowejtrawienie trypsynkriotrawienie kom rek
Izolacja pierwotnych komórek nabłonka nabłonka proksymalnego ludzkiego i ich zastosowanie w tworzeniu mikrofizjologicznego modelu kanału bliższego nerki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.