Artykuł metodologiczny

Protokół cytometrii elektroporacyjnej do mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek z wykorzystaniem hodowli komórkowej U2 OS

DOI:

10.3791/68005

⸱

13 czerwca 2025

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biology, Toronto Metropolitan University, 2Institute for Biomedical Engineering, Science and Technology (iBEST), a partnership between St. Michael's Hospital, a site of Unity Health Toronto, and Toronto Metropolitan University, 3Keenan Research Centre for Biomedical Science at St. Michael's Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroporacja to użycie impulsowych pól elektrycznych (PEF) do tworzenia przejściowych porów w hodowlach komórkowych w celu wprowadzenia ładunku molekularnego. Technika ta stała się ostatnio szeroko stosowana w warunkach badawczych i klinicznych. W tym miejscu opisujemy techniki elektroporacji z wykorzystaniem niedawno opracowanego "systemu cytometrii elektroporacyjnej" do wykonywania mikroskopii fluorescencyjnej na żywych komórkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pulsacyjne pola elektryczne (PEF) mają szeroki zakres zastosowań w badaniach medycznych i zastosowaniach klinicznych. Kluczowy obszar badań skupia się na elektroporacji (odwracalnej lub nieodwracalnej). Odwracalna elektroporacja jest stosowana od kilkudziesięciu lat do przenoszenia cząsteczek przez błony komórkowe, takie jak plazmidowe DNA, zwykle określane jako elektrotransfer genów (GET). I odwrotnie, nieodwracalna elektroporacja stała się popularną techniką w leczeniu raka, zapewniając nietoksyczną alternatywę poprzez trwałe rozerwanie komórek za pomocą PEF. Można to łączyć z różnymi rodzajami leków lub odczynników w celu wzmocnienia efektu, który stał się znany jako elektrochemioterapia (ECT). Jednak pomimo szerokiego sukcesu w praktycznych zastosowaniach, potrzebne jest dalsze wsparcie technologiczne i badania w celu ulepszenia obecnych technik. Aby rozwiązać ten problem, opracowano system cytometrii elektroporacyjnej, który wspiera eksperymenty z PEF na żywych komórkach z możliwością wykonywania długotrwałej mikroskopii fluorescencyjnej. Było to w połączeniu ze stabilną linią komórkową FUCCI(CA)5 U2-OS do oceny zmian w cyklu komórkowym w odpowiedzi na ekspozycję na PEF. W ten sposób uzyskano do 30-godzinnej mikroskopii poklatkowej, która zapewnia zmiany aktywności komórek w czasie rzeczywistym w oparciu o reporter FUCCI(CA)5. W rezultacie, zmiany specyficzne dla danej fazy były kwantyfikowalne na potrzeby dalszej analizy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pulsacyjne pola elektryczne (PEF) stały się powszechnym narzędziem do różnych zastosowań w biologii i zastosowaniach klinicznych1. Można je ogólnie podzielić na elektroporację (EP) i elektrostymulację (ES). Elektroporacja ma dwie poddziedziny znane jako elektroporacja odwracalna i nieodwracalna. Odwracalna elektroporacja (RE) jest używana od dziesięcioleci jako skuteczne narzędzie do przenoszenia ładunków molekularnych, takich jak plazmidowe DNA, do komórek różnych typów, takich jak ssaki, bakterie i drożdże2. Ostatnio nieodwracalna elektroporacja (IRE) zyskała na znaczeniu jako nietoksyczna alternatywa dla obecnych metod leczenia raka3. Wyłaniająca się poddziedzina jest określana jako ablacja w polu pulsacyjnym (PFA), która koncentruje się na nietermicznym usuwaniu tkanek, w szczególności w leczeniu niektórych dysfunkcji serca4. W połączeniu z lekami i innymi odczynnikami doprowadziło to do rozwoju elektrochemioterapii (ECT). Jednak obecna wiedza na temat leczenia PEF jest wyprzedzana przez zastosowania kliniczne5. Prezentujemy system cytometrii elektroporacyjnej do badania elektrochemioterapii. Cykl komórkowy stanowi kluczowy wskaźnik żywotności komórek, a zmiany mogą identyfikować efekty specyficzne dla fazy. Opracowując te narzędzia, protokoły mogą być szybciej dostosowywane, zapewniając skuteczniejsze leczenie szerszego zakresu nowotworów.

Nasz niestandardowy system elektrocytometryczny (Rysunek 1) składa się z komory z aluminiowymi równoległymi elektrodami płytkowymi i dnem ze szkła nakrywkowego, a także prostego generatora impulsów rozpadu wykładniczego. Komora jest zbudowana z komory wydrukowanej w 3D, a szklane dno #1.5 jest przymocowane za pomocą kleju wrażliwego na nacisk klasy medycznej. Elektrody formowane są z samoprzylepnej folii aluminiowej umieszczonej na wspornikach wbudowanych w komorę, zapewniając dwie równoległe elektrody oddalone od siebie o 0,4 cm. Jest to powszechna konfiguracja dla elektrod komercyjnych i zapewnia solidną konstrukcję, która może szybko dostosować obecne protokoły. Komora może mieścić się w obudowach środowiskowych przeznaczonych do szkiełek o wymiarach 25 mm x 55 mm, co jest również powszechnym formatem szkiełek obsługiwanym przez komercyjnych dostawców mikroskopów. Generator impulsów zapewnia impulsy zaniku wykładniczego do 330 V, co pozwala na przeprowadzenie szerokiego zakresu eksperymentów, w tym elektroporacji odwracalnej i nieodwracalnej.

Aby zbadać wpływ PEF na cykl komórkowy, użyliśmy transgenicznej linii komórkowej ludzkiego kostniakomięsaka (U2 OS) wyrażającej Wskaźnik Cyklu Komórkowego Ubikwitynacji Fluorescencyjnej (CA)5 (FUCCI(CA)5), fluorescencyjny konstrukt reportera żywego cyklu komórkowego. System wprowadza dwie fluorescencyjne, skrócone formy Gemininy i Cdt1, które są produkowane i poddawane recyklingowi w określonych ilościach podczas cyklu komórkowego. Dodatkowo, apoptoza może być bezpośrednio monitorowana podczas eksperymentu przy użyciu stabilnie eksprymującej linii FUCCI(CA)5 komórek U2-OS. Podczas cyklu komórkowego reporter działa w sposób przewidywalny w każdej fazie, ponieważ są one wytwarzane i degradowane w tym samym tempie, co wersje funkcjonalne naturalnie wyrażane w komórce. Kiedy dochodzi do apoptozy, cykl ten zostaje zakłócony, a cykl komórkowy szybko się wyłącza. Zazwyczaj objawia się to wizualnie jako stęchłość fluorescencji w cyklu komórkowym, po której następują dramatyczne zmiany morfologiczne w jądrze, co jest wyraźnie widoczne ze względu na lokalizację reporterów w jądrze6. Pozwala to na wizualną identyfikację każdej fazy w pojedynczych komórkach w czasie (Rysunek 2). Odwracalna elektroporacja powoduje zmiany w warunkach wewnątrzkomórkowych, a do badań wybrano impuls rozpadu wykładniczego 180 V. Impuls ten został dobrany tak, aby jak najbardziej ograniczyć śmierć komórki, zapewniając jednocześnie elektroporację u większości populacji. Ustalono to na podstawie wcześniejszych badań nad optymalnymi parametrami impulsu elektroporacyjnego dla sześciu linii komórkowych ssaków. Gęstość energii impulsu 180 V była nieco niższa niż optymalne parametry transfekcji, zapewniając lepszą żywotność ogniwa przy wysokim poration7. Wpływ impulsu badano w komórkach niezsynchronizowanych i komórkach zsynchronizowanych w fazie S przy użyciu podwójnego bloku tymidyny z aplikacją PEF i bez niej (Rysunek 3). Wyniki wskazały na zmniejszenie średniej długości dla S i G2 w porównaniu z kontrolą. Wskazywało to, że faza S była wrażliwa na ekspozycję na PEF, co skutkowało szybszym cyklem komórkowym. Wykazano w ten sposób, że system cytometrii elektroporacyjnej był w stanie połączyć dostarczanie PEF z długoterminowym obrazowaniem żywych komórek w celu zbadania cyklu komórkowego. Chociaż wykorzystaliśmy tę platformę do obserwacji progresji komórek w cyklu komórkowym w odpowiedzi na PEF, jest to przydatne narzędzie do badania różnych zastosowań i warunków PEF i hodowli komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie hodowli komórkowej

  1. Przygotować stabilną linię za pomocą odwracalnej elektroporacji o następujących parametrach: 100 μl zawieszonych komórek U2 OS (6 × 106 komórek/ml) z 5 μg plazmidowego DNA w kuwecie o średnicy 0,4 cm i impulsem prostokątnym 180 V przez 10 ms.
  2. Wydrukuj niestandardowy projekt komory za pomocą dowolnej odpowiedniej drukarki 3D i biokompatybilnego tworzywa sztucznego, takiego jak kwas polimlekowy (PLA) (patrz plik uzupełniający 1). Zdezynfekuj gotową komorę za pomocą etanolu (70%) i przechowuj w sterylnym pojemniku przed użyciem.
  3. Hoduj komórki U2-OS FUCCI(CA)5 na 10 cm płytce z 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco-High Glucose zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% PenStrep i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Gdy hodowla osiągnie 80% konfluencji, odessać pożywkę, przemyć kulturę komórkową solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i zdysocjować komórki za pomocą 1 ml 0,25% trypsyny przez 1,5 minuty.
  5. Zneutralizuj trypsynę, ponownie zawieszając hodowlę komórkową w 5 ml DMEM-High Glucose (zawierającego 10% FBS i 1% PenStrep).
  6. Z zawieszonej hodowli komórkowej pobrać próbkę o objętości 100 μl i umieścić ją w komorze systemu cytometrii elektroporacyjnej na dolnym szklanym szkiełku nakrywkowym. Upewnij się, że komora jest w 30% zlewająca się po wprowadzeniu próbki. Jeśli próbka wydaje się nadmiernie zlewać przed inkubacją, należy ją zassać i zmniejszyć objętość.
  7. Powoli dodaj 4 ml DMEM-High Glucose (zawierającego 10% FBS i 1% PenStrep) na drugi koniec komory, zapobiegając wypłukaniu próbki przez płyn.
  8. Umieścić standardowe szkiełko mikroskopowe na górze komory i inkubować komorę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny, upewniając się, że kultura całkowicie przylega do dna komory. Opcjonalnie użyj Hoechst 33342 (1 μg/ml) do barwienia jąder komórkowych w celu łatwiejszej kwantyfikacji komórek, a także apoptozy. Wykonaj barwienie 30 minut przed mikroskopią poklatkową.

2. Przygotowanie mikroskopu

  1. Najpierw włącz odwrócony mikroskop fluorescencyjny z kontrolą środowiska i komorą, co pozwoli na ustabilizowanie się warunków przed wykonaniem elektroporacji.
    UWAGA: Każdy odwrócony mikroskop fluorescencyjny z systemem środowiskowym, który akceptuje szkiełko o wymiarach 25 mm x 55 mm x 16 mm. Konstrukcja została pierwotnie zaprojektowana do pracy z referencyjnym mikroskopem odwróconym (patrz tabela materiałów) i odpowiednim systemem środowiskowym.
    Nagrzewanie stolika może powodować przesunięcie obrazu z powodu rozszerzania się metalu.
  2. Podczas gdy system otoczenia osiąga optymalną temperaturę, podłącz multimetr cyfrowy do kondensatora generatora impulsów i przełącznika wysokiego napięcia za pomocą odpowiednich elektrycznych. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy użyć zaciskowych "aligator", aby umożliwić szybki montaż i demontaż z komorą elektroporacyjną.
  3. Następnie wybierz powiększenie 20x i za pomocą oprogramowania mikroskopu upewnij się, że kanały FITC (GFP) i A594 (TexRed/mCherry) (opcjonalnie kanał DAPI dla Hoechst 33342) są wybrane odpowiednio do dwóch białek fluorescencyjnych w systemie FUCCI(CA)5. Użyj niskich ustawień ekspozycji (zwykle <0,05 s), aby uniknąć uszkodzeń zdjęć w długotrwałych filmach poklatkowych.
  4. Zoptymalizuj ostrość i jakość obrazu, wykonując zdjęcia testowe przed rozpoczęciem filmu poklatkowego.
    UWAGA: Fluorescencja powinna być tylko tak jasna, jak jest to konieczne do wizualizacji kolorów.
  5. Zaprogramuj film poklatkowy tak, aby rejestrował od 3 do 6 punktów widzenia co 10 minut przez 24 godziny, aby uzyskać dużą ilość danych dotyczących cyklu komórkowego na film poklatkowy, jednocześnie łagodząc uszkodzenia zdjęć.
    UWAGA: Czas ten może się różnić w zależności od skali czasowej aktywności komórkowej.
  6. Upewnij się, że autofokus jest włączony dla kanału A594, aby uzyskać najlepsze wyniki śledzenia kultury komórkowej podczas filmu poklatkowego.
  7. Pozostaw oprogramowanie w trybie czuwania do czasu wykonania elektroporacji. Po dostarczeniu impulsu natychmiast aktywuj tryb poklatkowy, aby zapewnić najwyższą możliwą dokładność danych.

3. Elektroporacja

  1. Umieścić komorę cytometrii elektroporacyjnej w mikroskopie z odpowiednią komorą środowiskową. Przed elektroporacją pozostaw komorę zamkniętą z uruchomionym systemem środowiskowym, aby upewnić się, że cykl ogniw nie zostanie zakłócony.
  2. Podłącz multimetr cyfrowy do generatora impulsów i podłącz generator impulsów do elektrod komory za pomocą z zaciskiem krokodylkowym, otwierając komorę środowiskową.
  3. Naładuj kondensator w generatorze impulsów do 180 V i szybko rozładuj impuls do komory, aż multimetr cyfrowy wskaże 0 woltów.
  4. Odłącz połączenia elektryczne z komorą i załóż pokrywę tak szybko, jak to możliwe, aby zapewnić odpowiednie warunki hodowli.
  5. Natychmiast aktywuj film poklatkowy, gdy system środowiskowy mikroskopu jest na swoim miejscu.

4. Akwizycja danych poklatkowych

  1. Po zakończeniu tworzenia filmu poklatkowego użyj oprogramowania mikroskopu, aby zapisać film poklatkowy jako pojedynczy film na podstawie obrazów zarejestrowanych w czasie trwania filmu. Popraw jakość wizualną na tym etapie, aby pomóc w ręcznym oznaczaniu ilościowym.
    UWAGA: Można wybrać dowolną liczbę klatek na sekundę; Jednak 6 klatek/s zapewnia umiarkowaną prędkość odtwarzania z 1 sekundą wideo, co daje 1 godzinę czasu rzeczywistego.
  2. Po przygotowaniu filmu poklatkowego śledź fazy komórek w czasie, obserwując zmiany w sygnałach FITC i A594

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z systemu FUCCI (Rysunek 2), uzyskano wizualne dane dotyczące cyklu komórkowego, mierząc długość czasu, w którym każdy kolor był wyrażany przez komórkę w wyniku ekspresji białka i unbikwitynacji. Na podstawie wyników niezsynchronizowanych i zsynchronizowanych eksperymentów (Rysunek 3) było oczywiste, że ekspozycja na PEF w fazie S regulowała cykl komórkowy. Świadczyło o tym zmniejszenie średniej długości fazy, co wskazuje na szybszy cykl komórkowy. Co więcej, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przy prawidłowym wykonaniu dane dotyczące fazy cyklu komórkowego można określić ilościowo dla dużych ilości pojedynczych komórek przez okres do 24 godzin. Protokół ten dostarczył danych dotyczących cyklu komórkowego porównywalnych z alternatywnymi metodami, takimi jak FAC. Jest to powszechnie stosowana metoda, w której komórki są znakowane fluorescencyjnie w miarę przechodzenia przez cykl komórkowy. Po inkubacji przez co najmniej 24 godziny sortuje się je według intensywności fluorescencji, korelując z wielkością populac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować zarówno członkom Gupta Lab, jak i Rackus Group za ich nieustające wsparcie w laboratorium i poza nim. Dotacje hojnie udzielone dzięki partnerstwu z Mitacs.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zjeżdżalnia komorowa (wydrukowana w 3D/oceniona) N/AN/A
Płytka hodowlana (10 cm)Sarstedt83.3902
Delta VisionOlympusN/AMożna również używać alternatywnych modeli mikroskopów. Upewnij się, że stage i system środowiskowy mogą pomieścić szkiełko komorowe do elektroporacji (55 mm x 
DMEM – Wysoka zawartość glukozyGibco11965092
płodowa surowica bydlęca ThermoFisherA5256701 
Drukarka 3D i3 MK3SPrusaN/AMożna używać alternatywnych modeli drukarek, które mogą korzystać z plików STL. 
Długopis StrepThermoFisher15070063
buforowana fosforanemGibco10010031
tFUCCI(CA)5Addgene153521
TrypsinSigma-Aldrich9002-07-07
Linia komórkowa U2-OSATCCHTB-96
Sól fizjologiczna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), 3044(2018).
  2. Kandušer, M., Miklavčič, D. Electroporation in biological cell and tissue: An overview. Electrotechnologies for extraction from food plants and biomaterials. Food Engineering Series. , Springer. New York. (2009).
  3. Cemazar, M., Sersa, G. Recent advances in electrochemotherapy. Bioelectricity. 1 (4), 204-213 (2019).
  4. Iyengar, S. K., Iyengar, S., Srivathsan, K. The promise of pulsed field ablation and the challenges ahead. Front Cardiovasc Med. 10, 1235317(2023).
  5. Miklavčič, D., Mali, B., Kos, B., Heller, H., Serša, H. Electrochemotherapy: From the drawing board into medical practice. Biomed Eng Online. 13 (1), 29(2014).
  6. Ando, R., Sakaue-Sawano, A., Shoda, K., Miyawaki, A. Two coral fluorescent proteins of distinct colors for sharp visualization of cell-cycle progression. Cell Struct Funct. 48 (2), 132-144 (2023).
  7. Nesmith, T., Vieira, C., Rackus, D., Gupta, G. An electroporation cytometry system for long-term, live cell cycle analysis. Biomicrofluidics. 18 (4), 044105(2024).
  8. Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science. 166 (3906), 747-749 (1969).
  9. Chao, H. X., et al. Evidence that the human cell cycle is a series of uncoupled, memoryless phases. Mol Sys Bio. 15 (3), e8604(2019).
  10. Diehl, F. F., Sapp, K. M., Vander Heiden, M. G. The bidirectional relationship between metabolism and cell cycle control. Trends Cell Bio. 34 (2), 136-149 (2024).
  11. Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382(2013).
  12. Klein, S. G., et al. Toward best practices for controlling mammalian cell culture environments. Front Cell Dev Bio. 10, 788808(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pulsed Electric FieldsLive Cell ImagingU2 OS CellsCell Cycle AnalysisTime Lapse MicroscopyFUCCI ReporterS Phase SynchronizationMicrofluidic Cell Culture

Powiązane artykuły