Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i utrzymanie eksperymentu z izododatnią klatką z wykluczeniem biologicznym do przeszczepu kału u myszy wolnych od zarazków

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68029

⸱

28 lutego 2025

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Florida College of Medicine, 2Department of Infectious Diseases and Immunology, University of Florida College of Medicine, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje najlepsze praktyki transferu myszy wolnych od zarazków do eksperymentalnych izolatorów jednoklatkowych (izoklatek) przy zachowaniu sterylnych warunków. Omówiono metody przeszczepu kału myszom wolnym od zarazków i pobierania żywych bakterii od tych "humanizowanych" myszy jelitowych w celu dalszych zastosowań.

Streszczenie

Myszy wolne od zarazków są ważnym narzędziem badawczym do zrozumienia wpływu mikroorganizmów na zdrowie i chorobę gospodarza, umożliwiając ocenę specyficznej roli jednostek, zdefiniowanych lub złożonych grup mikroorganizmów w odpowiedzi gospodarza. Hodowla myszy bez zarazków i eksperymentalne manipulacje, tradycyjnie hodowane i hodowane w izolatorach z elastyczną folią lub półsztywną, są kosztowne i wymagają licznego wyszkolonego personelu oraz dużej powierzchni w pomieszczeniach dla zwierząt. System klatkowy IsoPositive pozwala na eksperymentalną manipulację myszami wolnymi od zarazków w indywidualnych, hermetycznie zamkniętych, dodatnio ciśnieniowych klatkach izolacyjnych (izoklatkach), zmniejszając koszty i umożliwiając większą elastyczność w manipulacjach eksperymentalnych.

Tutaj opisany jest protokół transferu myszy wolnych od zarazków z izolatorów hodowlanych do izoklatek, a następnie transferu kału z ludzkiego kału dawcy do myszy w celu stworzenia stabilnych, długoterminowych "humanizowanych" myszy jelitowych do przyszłych badań. Opisano materiały i przygotowanie potrzebne do użytkowania systemu isocage, w tym użycie sterylizatora chemicznego z dwutlenkiem chloru do czyszczenia klatek, materiałów eksploatacyjnych, sprzętu i środków ochrony osobistej. Omówiono metody potwierdzania statusu wolnych od zarazków przenoszonych myszy oraz sposoby określania zanieczyszczenia w systemie klatkowym. Dalej omówiono procedurę hodowli, w tym ściółkę, pożywienie i zaopatrzenie w wodę. Opisano protokół przygotowania ludzkiej gnojowicy kałowej i zgłębnika do myszy wolnych od zarazków w celu stworzenia "humanizowanych" myszy jelitowych, wraz z pobieraniem kału w celu monitorowania składu społeczności mikrobiologicznej tych myszy. Eksperyment pokazuje, że dwa tygodnie po przeszczepie kału u człowieka pozwala na stabilną kolonizację mikrobioty dawcy w mysich gospodarzach, umożliwiając późniejsze wykorzystanie eksperymentalne. Ponadto opisano gromadzenie humanizowanych odchodów myszy w pożywkach zachowujących żywotność, umożliwiających wykorzystanie w dalszych eksperymentach funkcjonalnych. Ogólnie rzecz biorąc, metody te pozwalają na bezpieczne i skuteczne tworzenie humanizowanych społeczności myszy w eksperymentalnych klatkach gnotobiotycznych w celu dalszej manipulacji.

Wprowadzenie

Myszy wolne od mikroorganizmów (germ-free) stanowią niezbędne narzędzie w arsenale badaczy mikrobiomu, umożliwiając analizę wpływu mikrobioty na zdrowie gospodarza oraz stany chorobowe. Myszy wolne od mikroorganizmów rodzą się całkowicie sterylne i pozostają akseniczne przez całe życie1. Kolonizacja myszy wolnych od mikroorganizmów specyficznymi szczepami bakterii pozwala na prowadzenie badań przyczynowo-skutkowych między tymi taksonami a funkcjami metabolicznymi, odpornościowymi lub innymi funkcjami gospodarza2,3,4,5. Szczególnie korzystna jest możliwość „humanizacji” mikrobioty myszy wolnych od mikroorganizmów poprzez transplantację kału otrzymanego od ludzkich dawców, co przy zachowaniu warunków barierowych pozwala zapobiec kontaminacji mikroorganizmami pochodzenia mysiego1. Podejście to umożliwiło wiele istotnych odkryć w dziedzinie mikrobiomu, na przykład w zakresie wpływu ludzkiego mikrobiomu jelitowego na odpowiedź na immunoterapię nowotworów6,7,8.

Jednakże, mimo że humanizowane myszy wolne od mikroorganizmów (germ-free) są nieocenione w badaniach nad mikrobiomem, istnieje wiele ograniczeń, które hamują szersze zastosowanie tego podejścia. Myszy wolne od mikroorganizmów są hodowane i utrzymywane w dużych izolatorach o sztywnej lub elastycznej ścianie, jednak eksperymenty funkcjonalne wymagają przygotowania osobnych mini-izolatorów, z których jeden mieści kilka klatek, ale tylko w ramach jednego warunku eksperymentalnego. Podejście z wykorzystaniem mini-izolatorów zwiększa zapotrzebowanie na przestrzeń i koszty, jednocześnie drastycznie ograniczając liczbę warunków eksperymentalnych, które można zbadać w jednym doświadczeniu, oraz liczbę eksperymentów możliwych do przeprowadzenia równolegle. Obiecującym rozwiązaniem jest zastosowanie indywidualnego, modułowego systemu klatkowego zwanego ISOcage P Bioexclusion System (zwanego tutaj systemem isocage)9,10. System isocage umożliwia manipulacje eksperymentalne z myszami wolnymi od mikroorganizmów w indywidualnych, hermetycznie zamkniętych klatkach izolacyjnych z nadciśnieniem, co pozwala na zastosowanie odrębnych warunków eksperymentalnych dla każdej klatki, a nie dla każdego mini-izolatora. Przy zastosowaniu odpowiedniej techniki aseptycznej, zwierzęta mogą być utrzymywane w klatkach isocage przez maksymalnie 12 tygodni w warunkach wolnych od mikroorganizmów lub mogą zostać humanizowane poprzez przeszczep kału ludzkiego do wykorzystania w dowolnym kompatybilnym podejściu eksperymentalnym (tzn. takim, które może być wykonane w warunkach aseptycznych). Dzięki systemowi isocage można równolegle prowadzić wiele niezależnych eksperymentów, a zapotrzebowanie na przestrzeń i koszty są znacznie mniejsze niż w przypadku przeprowadzania wielu doświadczeń w mini-izolatorach.

Celem hodowli myszy wolnych od drobnoustrojów (germ-free) w izolatorach hodowlanych z elastycznej folii jest staranne utrzymanie statusu aksenicznego11. Techniki stosowane do monitorowania statusu germ-free obejmują rutynowe wymazy z powierzchni ciała i jam ustnych myszy, a także aseptyczne pobieranie próbek kału, które są następnie poddawane hodowli oraz testom z wykorzystaniem komercyjnych zestawów opartych na metodzie PCR. Do określenia statusu germ-free wymagane są badania bakteriologiczne, serologiczne i mykologiczne tych próbek11. Podczas przenoszenia myszy germ-free z izolatorów hodowlanych do klatek izolacyjnych (isocages) w celu wykorzystania ich w eksperymentach, pobiera się wymazy i przeprowadza testy w celu potwierdzenia ich statusu germ-free w momencie transferu. Kontrole sterylności klatek izolacyjnych są przeprowadzane poprzez aseptyczne pobieranie próbek kału, które są następnie hodowane w celu wykrycia zanieczyszczeń bakteryjnych, wirusowych i grzybiczych. Staranne pobieranie i zapisywanie wyników tych kontroli sterylności od narodzin aż do zakończenia protokołu eksperymentalnego jest niezbędne do walidacji statusu germ-free tych myszy.

System isocage składa się z pojedynczych klatek (Rysunek 1), dysków transferowych do transportu z izolatorów hodowlanych (Rysunek 1) oraz regału isocage, w którym znajdują się klatki (Rysunek 2). Każda klatka isocage posiada zainstalowany na wlocie powietrza zasilającego wysokowydajny filtr cząsteczek (HEPA) oraz uszczelkę silikonową, która po zamknięciu tworzy szczelne zamknięcie, zapobiegając przedostawaniu się zanieczyszczeń do klatki wraz z powietrzem (Rysunek 1A). Pokrywa klatki może służyć jako sterylna powierzchnia robocza, gdy zostanie umieszczona do góry dnem w wysterylizowanej komorze z laminarnym przepływem powietrza (Rysunek 1A). Druciana kratka wewnątrz klatki utrzymuje pokarm i butelkę z wodą (Rysunek 1B). Do wszystkich manipulacji wymagających kontaktu z wewnętrznymi powierzchniami klatki używa się pęset autoklawowanych wewnątrz klatki. Sama klatka posiada wycięcia na wyjmowany uchwyt karty identyfikacyjnej zwierząt, a także dysze wlotowe i wylotowe powietrza, które łączą się z regałem isocage (Rysunek 1C-E). Klamry bezpiecznego zamknięcia oraz blokada na pokrywie uszczelniają klatkę, gdy jest ona gotowa do ponownego podłączenia do systemu regałów (Rysunek 1F). Sugerowaną ściółką jest Alpha-dri, zalecane jest również stosowanie autoklawowalnej chatki wzbogacającej środowisko (Rysunek 1F). Dyski transferowe służą do przenoszenia myszy wolnych od drobnoustrojów z izolatorów hodowlanych do klatek isocage i zawierają obrotową pokrywę komory z trójkątnym otworem umożliwiającym manipulację zwierzętami (Rysunek 1G-H). Dyski występują w rozmiarach małym (średnica 21.6 cm) i dużym (średnica 28 cm), przy czym oba mają pojemność dla ośmiu myszy. Do tworzenia szczelnych zamknięć na obwodzie i otworach powietrznych dysku używa się autoklawowanej taśmy; czynność tę wykonuje się przed namoczeniem w środku sterylizującym i transportem w torbie nasączonej sterylizantem (Rysunek 1I). Sam system regałów posiada ekran do monitorowania dmuchaw powietrza, stanu filtrów HEPA na poziomie regału oraz zasilania awaryjnego z baterii, które są standardowymi funkcjami systemu (Rysunek 2A). Zamknięty manometr Magnehelic wyświetla ciśnienie dodatnie utrzymywane przez system klatek, a automatyczny wizualny wskaźnik dokowania pokazuje status podłączenia klatek (wysunięta żółta zakładka oznacza, że żadna klatka nie jest podłączona lub dokowanie nie powiodło się) (Rysunek 2B-D). Do manipulacji klatkami isocage niezbędna jest również standardowa certyfikowana komora z laminarnym przepływem powietrza.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje właściwe metody skutecznego przenoszenia myszy wolnych od mikroorganizmów (germ-free) z izolatorów hodowlanych w warunkach aseptycznych do klatek izolatowych przy zachowaniu stanu germ-free, humanizację myszy germ-free przy użyciu zawiesiny kałowej od ludzkiego dawcy oraz pobieranie kału od myszy utrzymywanych w klatce izolatowej w celu potwierdzenia statusu germ-free lub zachowania żywotności mikroorganizmów do dalszych badań funkcjonalnych. W tym przykładzie myszy germ-free są humanizowane za pomocą połączonych próbek kału od ludzi leczonych immunoterapią raka płuc, podzielonych na respondentów i nierespondentów na terapię. W tym przypadku fenotyp odpowiedzi na immunoterapię został przeniesiony poprzez humanizację mikrobioty jelitowej do myszy biorców, które następnie mogły zostać zaszczepione komórkami nowotworowymi i leczone immunoterapią. Protokół przygotowania ludzkiej zawiesiny kałowej można łatwo dostosować do kału dowolnego ludzkiego dawcy lub dowolnego przedklinicznego modelu choroby, zgodnie z potrzebami badacza. Stosując ten protokół, możliwe jest przeniesienie mikrobioty od dowolnego ludzkiego dawcy kału do gospodarza germ-free, co umożliwia dalsze badanie roli mikrobioty w zdrowiu i chorobie.

Schemat systemu klatek dla gryzoni z filtrem XT HEPA, butelką z wodą i układem wlotowym powietrza.
Rycina 1: Schemat klatki izolatowej (isocage) i dysków transferowych. (A) Widok z góry spodu pokrywy klatki z etykietami wskazującymi położenie wewnętrznego filtra HEPA na poziomie klatki oraz silikonowej uszczelki. (B) Widok z góry wnętrza klatki z etykietami wskazującymi drutowaną kratkę pokrywy, wewnętrzną butelkę z wodą wraz z dzióbkiem oraz miejsce w drucianym koszyku na autoklawowalną karmę. (C) Widok z przodu klatki pokazujący wcięcia na uchwyt karty klatki. (D) Widok z góry pełnej klatki z nałożoną pokrywą, pokazujący sposób montażu filtra HEPA na dyszy wlotowej powietrza. (E). Widok z tyłu klatki pokazujący dysze wlotowe i wylotowe powietrza, które są łączone z systemem regałów isocage. (F) Widok boczny pełnej klatki z nałożoną pokrywą z etykietami wskazującymi zaciski bezpiecznego zamknięcia w pozycji otwartej, z białymi zakładkami na każdym zacisku, które blokują je w miejscu. Wnętrze klatki pokazuje ściółkę Alpha-dri ułożoną warstwowo na dnie oraz sugerowaną chatkę wzbogacającą umieszczoną w ściółce. (G) Widok z góry dysków transferowych z nałożoną pokrywą. (H) Widok z góry wnętrza dysku transferowego, pokazujący obrotową pokrywę komory z trójkątnym otworem umożliwiającym manipulację zwierzętami. (I) Widok boczny w pełni zmontowanego dysku transferowego pokazujący miejsce przyklejenia taśmy do autoklawowania, która tworzy szczelne zamknięcie podczas transferu z izolatora rozrodczego do klatki isocage. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Schemat szafy systemu bioizolacyjnego, filtr HEPA, ekran monitorujący, konfiguracja klatek eksperymentalnych.
Rysunek 2: Schemat szafy z systemem klatek izolatorskich (isocage). (A) Kompletna szafa isocage z podłączonymi klatkami oraz etykietą wskazującą ekran monitorujący stan dmuchawy powietrza, filtr HEPA i baterię awaryjną. W dolnej lewej części szafy znajduje się gniazdo na filtr HEPA poziomu szafy. (B) Zamknięty manometr Magnehelic pokazujący nadciśnienie utrzymywane przez szafę. (C) Podłączona klatka isocage bez widocznego żółtego wskaźnika dokowania, co świadczy o prawidłowym połączeniu szafy z dyszami powietrznymi. (D) Puste gniazdo w szafie z widocznym automatycznym wizualnym wskaźnikiem dokowania, wskazującym na brak klatki w tym miejscu i brak połączenia dysz powietrznych z klatką isocage. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na University of Florida (UF) i przeprowadzone w Obiektach Opieki nad Zwierzętami UF (Protokół IACUC #IACUC202300000005). Kolonie typu dzikiego wolne od zarazków (GF WT; Myszy C57BL/6) były hodowane i utrzymywane w izolatorach przez UF Animal Care Services Germ-free Division. Myszy GF WT o mieszanej płci przeniesiono z izolatorów hodowlanych i umieszczono w systemie biowykluczenia ISOcage P, aby umożliwić manipulację mikrobiologiczną.

Próbki kału ludzkiego uzyskano z prospektywnego badania obserwacyjnego, w którym zebrano próbki podłużnego kału od pacjentów, którzy otrzymali leczenie inhibitorem immunologicznego punktu kontrolnego (ICI)12. Świadomą zgodę uzyskano od pacjentów po zatwierdzeniu badania przez Advarra IRB (MCC#18611, Pro00017235). Pacjenci otrzymali i ukończyli zestaw do pobierania stolca z płynnym środkiem do transportu dentystycznego (LDTM), mający na celu zachowanie żywotności bakterii do badań funkcjonalnych. Ocena odpowiedzi charakteryzowała n=4 próbki jako odpowiadające (R) i n=6 jako niereagujące (NR). Homogenizowane próbki pacjentów zakonserwowane LDTM rozmrażano indywidualnie, każdą z nich umieszczono w komorze beztlenowej na nie więcej niż 90 s i łączono według fenotypu odpowiedzi (R: n = 4, NR: n = 6). Zebrane próbki zostały następnie podzielone na porcje i zamrożone w temperaturze -80 °C w celu wykorzystania w niniejszym protokole. Aby określić liczbę beztlenowych jednostek tworzących kolonie (CFU) w kale dawcy, kał każdego pacjenta seryjnie rozcieńczano do 1 × 10-5, a 10 μl każdego rozcieńczenia posiewano w dwóch egzemplarzach na beztlenowych płytkach agarowych do infuzji serca mózgu (BHI) i Luria Bertani (LB) oraz oszacowano liczbę CFU na gram stolca. Równe CFU od każdego pacjenta połączono z próbkami inokulum kału w celu wprowadzenia do myszy.

1. Przygotowanie klatek i autoklawowanie

  1. Przygotowanie klatki izoklatowej
    1. Napełnij klatki ~ 500 ml diety 2018SX lub dowolnej pożądanej wzbogaconej diety autoklawowalnej i ułóż na dnie ściółkę ALPHA-dri. Umieść autoklawowalną chatę wzbogacającą w łóżku klatki. Umieść pustą, nieuszczelnioną butelkę z wodą i dyszę oraz długie kleszcze z szeroką końcówką na ruszcie.
    2. Umieścić dwugatunkowy wskaźnik biologiczny w żywności w jednej klatce na cykl autoklawu. Umieść pasek integratora chemicznego na zewnątrz każdej klatki.
    3. Klatki należy sterylizować w autoklawie w cyklu próżniowym przez 45 minut w temperaturze 121 °C i minimalnym ciśnieniu 15 PSI, a następnie przez 30 minut schnięcia. Sterylizuj klatki za pomocą stojaka do dekontaminacji Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej (ISO), który pozwala na szczelne zamknięcie klatek, a para przechodzi przez wewnętrzny filtr HEPA, który utrzymuje sterylne środowisko do momentu otwarcia klatki.
    4. Napełnij butelki o pojemności 1 litra wodą pitną, uszczelnij gumowymi nakrętkami i umieść pasek integratora chemicznego na powierzchni butelki. Autoklaw w temperaturze 121 °C i minimalnym ciśnieniu 15 PSI przez 45 minut, korzystając z programu powolnego wydmuchiwania cieczy.
    5. Należy przeprowadzić wizualną kontrolę integratorów chemicznych umieszczonych na każdej klatce w celu natychmiastowej weryfikacji odpowiednich parametrów autoklawu.
      UWAGA: Wskaźnik biologiczny musi zostać usunięty przy pierwszym otwarciu izoklatki w sterylnych warunkach. Inkubować wskaźnik biologiczny przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i obserwować wszelkie zmiany koloru. Żywa zmiana koloru z oryginalnego niebiesko-fioletowego klarownego roztworu na żółtą lub mętną ciecz wskazuje na rozwój drobnoustrojów. Jeśli wskaźnik pozostaje przezroczysty i ma kolor niebiesko-fioletowy, oznacza to, że wnętrze koszyków jest całkowicie sterylne w tym cyklu autoklawu.

2. Preparat sterylizujący z dwutlenku chloru

UWAGA: Środek sterylizujący z dwutlenku chloru jest bardzo po aktywacji. Sterylizator z aktywowanego dwutlenku chloru traci ważność po 24 godzinach od zmieszania aktywatora z bazą. Sterylizator z dwutlenkiem chloru wytwarza opary, które mogą działać drażniąco na powierzchnie błon śluzowych i powodować podrażnienia w kontakcie ze skórą. Upewnij się, że pomieszczenie do przygotowania środka sterylizacyjnego ma dostęp do zlewu i odpowiedniej wentylacji. Podczas pracy ze środkiem sterylizującym z dwutlenkiem chloru należy założyć okulary ochronne, respirator i rękawice odporne na chemikalia, a także wymagane środki ochrony osobistej (PPE) w pomieszczeniach dla zwierząt.

  1. Baza mieszająca i aktywator
    1. Aby przygotować standardową objętość 6 litrów środka sterylizującego z dwutlenkiem chloru, najpierw odmierz 1 l środka sterylizującego z dwutlenkiem chloru w cylindrze z podziałką o pojemności 1 l i wlej do zbiornika o pojemności 20 litrów.
    2. Za pomocą tego samego cylindra z podziałką odmierz i wlej 4 l wody z kranu do zbiornika do zanurzania.
    3. Odłóż na bok cylinder z podziałką używaną jako podstawa i woda. Za pomocą nowego cylindra z podziałką odmierz 1 l aktywatora sterylizującego z dwutlenkiem chloru i wlej go do zbiornika do zanurzania.
    4. Po dodaniu aktywatora do zbiornika użyj cylindra z podziałką, aby wymieszać zawartość zbiornika.
  2. aktywacja
    1. Umieść pokrywkę na zbiorniku do namaczania i oznacz go jako sterylizujący dwutlenek chloru, podając datę i godzinę dodania aktywatora oraz imię i nazwisko personelu, który go przygotował. W razie potrzeby cylinder z podziałką używany do mieszania środka sterylizującego może być użyty do przeniesienia 1 litra do butelki z rozpylaczem.
    2. Przenieś zbiornik do namaczania i butelki z rozpylaczem do pomieszczenia dla zwierząt, gdzie znajduje się stojak i klatki Isocage. Sterylizator z aktywowanym dwutlenkiem chloru musi pozostać przez co najmniej 20 minut przed użyciem, aby zapewnić pełną aktywację.
      UWAGA: Do manipulowania dużą ilością klatek (>9) w zbiorniku do zanurzania można przygotować jednorazowo do 12 litrów. Do manipulowania 1 klatką lub w nagłych wypadkach 1,2 l środka sterylizującego z dwutlenkiem chloru można przygotować w mniejszym pojemniku, a następnie przenieść do 2 butelek z rozpylaczem o pojemności 1 l. Zaleca się, aby środek sterylizujący był przygotowany co najmniej 1 godzinę przed przewidywanym przeniesieniem myszy wolnych od zarazków.

3. Sterylizacja

  1. Załóż środki ochrony osobistej
    1. Jako główny manipulator klatki załóż okulary ochronne, respirator, rękawice odporne na chemikalia, sterylny fartuch chirurgiczny, bouffant, pokrowce na rękawy i ochraniacze na buty. Noś fartuchy pod środkami ochrony indywidualnej, ponieważ każdy kontakt tkaniny ze środkiem sterylizującym z dwutlenkiem chloru spowoduje rozległe plamy.
    2. Zalecany jest asystent głównego manipulatora klatki. Niech asystent założy te same środki ochrony osobistej, co główny manipulator klatki, chociaż może nosić niesterylny fartuch chirurgiczny.
  2. Przygotowanie szafy bezpieczeństwa biologicznego
    1. Umieść 10 chusteczek w zbiorniku na sterylizujący dwutlenek chloru i upewnij się, że są całkowicie przemoczone.
    2. Przenieś nasączone chusteczki do szafki bezpieczeństwa biologicznego i namocz wszystkie powierzchnie szafki w następującej kolejności od tyłu do przodu: płaska powierzchnia robocza, lewa strona, tył okapu, prawa strona i przednia szyba wewnętrzna. Wykonaj bezdotykowe namaczanie niezabezpieczonych powierzchni komory bezpieczeństwa biologicznego, ściskając chusteczki po tych powierzchniach bez ich dotykania.
    3. Po jednej rundzie czyszczenia umieść chusteczki z powrotem w zbiorniku na sterylizację dwutlenkiem chloru, aby je namoczyć.
  3. Przygotowanie izoklatek
    1. Przygotuj dużą plastikową torbę, napełniając ją co najmniej 100 ml środka sterylizującego z dwutlenkiem chloru za pomocą cylindra z podziałką i potrząśnij torbą, aby upewnić się, że wszystkie powierzchnie wewnętrzne są przemoczone. Umieść torbę na dowolnej płaskiej powierzchni.
    2. Wyjmij pojedynczą klatkę izolacyjną ze stojaka i umieść ją w zbiorniku do namaczania ze sterylnym dwutlenkiem chloru, tak aby każda powierzchnia klatki miała kontakt z cieczą. Użyj nasączonych chusteczek w zbiorniku, aby dalej szorować powierzchnie klatki, aby zapewnić pełny kontakt z cieczą.
    3. Po namoczeniu klatki poproś asystenta o otwarcie nasączonej plastikowej torby. Umieść klatkę w torbie i poproś asystenta o natychmiastowe zamknięcie otworu. Spryskaj otwór worka środkiem sterylizującym z dwutlenkiem chloru za pomocą butelki z rozpylaczem. Postępuj zgodnie z tą procedurą dla każdego klatki, która ma być używana; W jednej torbie 36" 32" 48" zmieszczą się do czterech klatek.
    4. Zanurz tyle wysterylizowanych butelek z wodą o pojemności 1 l, ile potrzeba (1 l wody na 2 klatki) w zbiorniku na sterylizację dwutlenkiem chloru, a następnie umieść je w innej nasączonej plastikowej torbie. Po umieszczeniu wszystkich zapasów w torbie zamknij worek i spryskaj otwór worka środkiem sterylizującym z dwutlenku chloru za pomocą butelki z rozpylaczem.
    5. Po zapakowaniu wszystkich koszyków i zapasów zanurz rękawice odporne na chemikalia w środku sterylizującym z dwutlenkiem chloru (jak najgłębiej w rękawice, nie sięgając do otworu).
  4. Okres sterylizacji 20 min
    1. Pełna sterylizacja wymaga co najmniej 20 minut kontaktu z płynem. Jak tylko ostatni przedmiot zostanie wysterylizowany, a plastikowa torba do namaczania zostanie zamknięta, poproś asystenta o ustawienie 20-minutowego timera. Upewnij się, że po uruchomieniu timera rękawice odporne na chemikalia nie dotykają żadnej powierzchni, która nie jest nasączona środkiem sterylizującym z dwutlenkiem chloru.
    2. Wykonaj proces sterylizacji komory bezpieczeństwa biologicznego (krok 3.2) kilkakrotnie, aż zegar wskaże, że minęło 20 minut.
    3. Poproś asystenta, aby często potrząsał zewnętrznymi powierzchniami nasączonej plastikowej torby, aby zapewnić stały kontakt płynu z powierzchniami klatki i butelek w środku.
    4. Po upływie 20 minut poproś asystenta, aby otworzył nasączoną plastikową torbę, aby odsłonić wysterylizowane klatki i butelki z wodą, uważając, aby dotykać tylko zewnętrznych powierzchni torby.
    5. Używając wysterylizowanych rękawic odpornych na chemikalia, przenieś każdą klatkę i butelkę do wysterylizowanej szafki bezpieczeństwa biologicznego. Jeśli jest zbyt wiele klatek, aby zmieścić się w szafie bezpieczeństwa biologicznego, pozostaw pozostałe klatki w plastikowych torbach, ponieważ pozostaną sterylne tak długo, jak długo otwór plastikowej torby zostanie zamknięty i nasączony środkiem sterylizującym z dwutlenku chloru między każdym otworem.

4. Transfer myszy wolny od zarazków

  1. Przygotowanie izoklatek
    1. Aby otworzyć hermetycznie zamkniętą klatkę izolacyjną, podnieś białe zaczepy na dwóch zaciskach po bokach pokrywy, a następnie wyciągnij każdy zacisk na boki. Pokrywa musi być wolna od dolnej części klatki, aby można było zdjąć pokrywę z klatki. Umieść pokrywę do góry nogami po lewej stronie klatki i używaj jej jako sterylnej stacji roboczej.
      UWAGA: Alternatywą dla używania pokryw klatek lub wnętrza autoklawowanych toreb na narzędzia jako sterylnej powierzchni roboczej jest zastosowanie obłożeń sterylizowanych w autoklawie, które zapewniają większą powierzchnię i zapobiegają niezamierzonemu zanieczyszczeniu pokrywy klatki w przypadku popełnienia błędu.
    2. Używając sterylnych kleszczyków znajdujących się w klatce na ruszcie, wyjmij pustą butelkę z wodą i umieść ją po wewnętrznej stronie pokrywy. Otwórz butelkę na wodę o pojemności 1 l, zdejmując gumową uszczelkę, i wlej wodę do butelki, aby ją napełnić. Umieść dyszę na butelce z wodą za pomocą kleszczyków i mocno dociśnij, aby uszczelnić.
    3. Użyj sterylnych kleszczy, aby podnieść ruszt i cofnij go o kilka cali, aby umożliwić otwarcie dna klatki. Oprzyj sterylne kleszcze na ruszcie, upewniając się, że uchwyty nie stykają się z powierzchniami klatki.
  2. Korzystanie z dysku transferowego
    UWAGA: Przeszkolony personel wolny od zarazków jest odpowiedzialny za pielęgnację i konserwację izolatorów hodowlanych. Biorąc pod uwagę ryzyko związane z otwieraniem izolatorów hodowlanych, personel ten przeprowadza sterylizację dysku transferowego, przygotowanie i przeniesienie myszy wolnych od zarazków z izolatorów do izoklatek. Aby pokrótce opisać proces, krążki transferowe są przygotowywane w butli nadającej się do sterylizacji w autoklawie, aby umożliwić sterylizację. Wskaźniki biologiczne służą do weryfikacji ich sterylności. Taśma do uszczelniania dysków transferowych jest również autoklawowana wewnątrz cylindra. Wysterylizowany cylinder zawierający te materiały jest przymocowany za pomocą tulei transferowej do izolatora, a myszy są przenoszone z klatek na dysk. Pokrywę umieszcza się następnie na dysku, a taśma autoklawizowana służy do stworzenia hermetycznego uszczelnienia na obwodzie dysku i otworach powietrznych. Zapieczętowany dysk jest natychmiast umieszczany w porcie wyjściowym izolatora. Następnie zamyka się nasadkę portu izolatora domowego, a zewnętrzna część dysku jest dokładnie przecierana środkiem sterylizującym i umieszczana w torbie nasączonej środkiem sterylizującym, monitorowanej przez 20 minut, aby zapewnić całkowitą dekontaminację. Personel zajmujący się hodowlą wolnych od zarazków dostarcza następnie te dyski personelowi badawczemu. Myszy nie mogą być trzymane w zapieczętowanym dysku dłużej niż 30 minut od momentu zapieczętowania dysku transferowego, dlatego ważne jest, aby wszystkie poprzednie kroki w tym protokole zostały wykonane z wystarczającą ilością czasu przed przybyciem dysku transferowego.
    1. Po otrzymaniu dysku transferowego poproś asystenta, aby przytrzymał i częściowo rozwinął plastikową pokrywę, tak aby nasączona powierzchnia dysku transferowego była odsłonięta, ale nie dotykana przez asystenta.
    2. Po otrzymaniu dysku transferowego poproś asystenta, aby przytrzymał i częściowo rozwinął plastikową pokrywę, tak aby nasączona powierzchnia dysku transferowego była odsłonięta, ale nie dotykana przez asystenta.
    3. Zakładając rękawice odporne na chemikalia nasączone środkiem sterylizującym z dwutlenkiem chloru, wyjmij krążek transferowy z plastikowego opakowania, uważając, aby nie dotknąć żadnej powierzchni, która nie jest nasączona środkiem sterylizującym. Następnie umieść dysk transferowy na płaskiej powierzchni wysterylizowanej szafy bezpieczeństwa biologicznego.
    4. Aby otworzyć dysk transferowy, odklej taśmę, uszczelnij obwód dysku i wyrzuć go na zewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego. Zdejmij pokrywę dysku transferowego i wyrzuć go na zewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego.
    5. Wewnątrz dysku transferowego znajduje się obrotowa pokrywa komory z pojedynczym otworem. Użyj sterylnych kleszczyków uprzednio spoczywających na ruszcie klatki, aby manipulować pokrywą komory, aby przesunąć otwór do myszy potrzebny do przeniesienia.
  3. Przenoszenie myszy z dysku do izoklatki
    1. Za pomocą kleszczy chwyć podstawę ogona myszy przez otwór w plastikowej pokrywie dysku, a następnie podnieś i przenieś mysz do izoklatki przez przestrzeń otwartą wcześniej między rusztem a klatką. Powtórz tę czynność dla wszystkich myszy przeznaczonych do tej klatki.
    2. Gdy wszystkie myszy zostaną przeniesione do tej izoklatki, wymień ruszt za pomocą kleszczy. Następnie podnieś pokrywę klatki i umieść ją z powrotem na klatce za pomocą kleszczy.
    3. Podnieś każdy clamp pokrywy klatki do góry i ostrożnie opuść po bokach klatki, a następnie dociśnij białe zaczepy, aby uszczelnić pokrywę klatki.
    4. Po zamknięciu klatki poproś asystenta o spryskanie każdej dyszy w miejscu dokowania na stojaku klatki środkiem sterylizującym z dwutlenku chloru. Następnie zdejmij klatkę z okapu i przekaż ją asystentowi, który może następnie zadokować klatkę na stojaku.
    5. Powtórz te czynności dla każdej myszy na dysku transferowym.
  4. Czyszczenie komory bezpieczeństwa biologicznego
    1. Po zakończeniu wszystkich transferów myszy do izoklatki opróżnij kaptur z wszelkich zanieczyszczeń i całkowicie wytrzyj chusteczkami nasączonymi sterylantem z dwutlenkiem chloru.
    2. Przetrzyj kaptur alkoholem izopropylowym, aby usunąć resztki środka sterylizującego z dwutlenkiem chloru. Przestrzeń pod powierzchnią roboczą okapu zbiera dużą ilość sterylizantu z procesu sterylizacji. Usuń to poprzez absorpcję suchymi chusteczkami i przetrzyj alkoholem izopropylowym.
    3. Płynny środek sterylizujący z dwutlenkiem chloru wyrzucić do odpływu zlewu 24 godziny po aktywacji. Materiały stałe zanieczyszczone środkiem sterylizującym należy utylizować jak zwykłe odpady.
      UWAGA: Myszy wolne od zarazków przeniesione do warunków izoklatki pozostawia się na 1 tydzień, aby zaaklimatyzować się w nowym środowisku przed jakąkolwiek interwencją. Zmniejsza to stres odczuwany przez zwierzęta, który może kolidować z wynikami badań. Pod koniec tego 1-tygodniowego okresu aklimatyzacji zbierz kał zgodnie z opisem w kroku 6, aby potwierdzić status wolnego od zarazków przed jakąkolwiek interwencją.

5. Doustne podawanie ludzkiej gnojowicy kałowej myszom wolnym od zarazków

  1. Przygotowanie autoklawowanych materiałów do zgłębników
    1. Umieść igły do zgłębnika doustnego w samouszczelniających się woreczkach sterylizacyjnych (1 na mysz), a sterylne strzykawki o pojemności 1 ml w samouszczelniających się woreczkach sterylizacyjnych (1 na mysz) na 1 dzień przed zabiegiem doustnego zgłębnika. Umieść te zlewki polipropylenowe o pojemności 600 ml (1 na mysz) i parę długich kleszczyków w torbie bezpiecznej dla autoklawu i sterylizuj w autoklawie.
    2. Niezwłocznie po wyjęciu worka z autoklawu należy zakleić worek taśmą pakową i przechowywać do następnego dnia.
  2. Przygotowanie ludzkiej gnojowicy kałowej
    1. W dniu pobrania należy przenieść kał ludzki homogenizowany i przechowywany w beztlenowych pożywkach konserwujących (w tym przypadku płynnych pożywkach do transportu dentystycznego) z zamrażarki o temperaturze -80 °C do komory beztlenowej. Rozcieńczyć homogenizowany materiał kałowy w stosunku około 1:10 w sterylnym, beztlenowym roztworze soli fizjologicznej w stożkowej probówce o pojemności 10 ml.
    2. Uszczelnij probówkę zawierającą ludzką gnojowicę kałową parafilmem, homogenizuj przez wir, a następnie odwiruj przy 200 g przez 5 minut w celu osadzenia cząstek.
    3. Umieścić probówkę z powrotem w komorze beztlenowej i przenieść supernatant do innej stożkowej probówki o pojemności 10 ml. Uszczelnić probówkę zawierającą ludzki supernatant kałowy parafilmem, wyjąć ją z komory beztlenowej i umieścić w wtórnym szczelnym pojemniku. Przetransportuj pojemnik wraz z autoklawowaną torbą z zapasami do zgłębnika do miejsca utrzymania zwierząt.
      UWAGA: Niezbędne jest oszacowanie całkowitej jtk/ml kału ludzkiego przeznaczonego do zgłębnika do celów sprawozdawczych. Nie jest jasne, jakie jest minimalne obciążenie CFU, aby zapewnić odpowiednią kolonizację, ale wyższe CFU prowadzą do lepszego wszczepienia stolca dawcy13. Jeśli ładunek CFU ludzkiego kału powoduje niskie wskaźniki wszczepienia, należy pobrać próbki kału ludzkiego. Zastosowanie pożywki zachowującej żywotność poprawi odzysk CFU z pobranych próbek kału. W celu oznaczenia beztlenowej/tlenowej liczby jtk w kale dawcy, należy seryjnie rozcieńczyć próbkę do 1 x 10-5 i nanieść 10 μl każdego rozcieńczenia w dwóch powtórzeniach na tlenowych i beztlenowych płytkach agarowych BHI i LB. Po 24 godzinach (tlenowy) i 48 h (beztlenowy) policz jtk na gram stolca.
  3. Przygotowanie izoklatek
    1. Powtórz kroki 2 i 3, z tą różnicą, że w tych klatkach znajdują się myszy i należy zadbać o to, aby w ciągu 30 minut od wyjęcia stojaka każda izoklatka została umieszczona w wysterylizowanym kapturze, a pokrywa odpowietrzona, aby umożliwić przepływ powietrza do myszy.
    2. Wysterylizować autoklawowany worek z materiałem do zgłębków i probówkę z ludzkim kałem z kroków 5.1 i 5.2 poprzez nasycenie dwutlenkiem chloru sterylizantem w podobny sposób jak w przypadku butelek na wodę (tj. zanurzyć je w środku sterylizującym, a następnie umieścić w torbie nasączonej środkiem sterylizującym).
    3. Przenieść izoklatki i zgłębniki doustne do komory bezpieczeństwa biologicznego po zakończeniu 20-minutowego okresu sterylizacji. Przebij autoklawowaną torbę zaopatrzeniową, dociskając ją do zawartych w niej długich kleszczy, a następnie wyjmij zapasy i wyrzuć worek na zewnątrz kaptura.
  4. Zgłębnik
    1. Załóż nowy sterylny fartuch chirurgiczny i sterylne rękawice chirurgiczne zamiast rękawic odpornych na chemikalia, aby zapobiec kontaktowi resztek sterylizatora z dwutlenkiem chloru z myszami. W razie potrzeby poproś asystenta o pomoc w tym procesie.
    2. Przygotuj igły do zgłębnika, rozpakowując każdą torebkę sterylizacyjną i użyj wnętrza worka jako suchej, sterylnej powierzchni spoczynkowej. Podłącz igłę do każdej strzykawki, otwórz rurkę do gnojowicy kałowej i wciągnij 200 μl gnojowicy kałowej do każdej strzykawki.
    3. Za pomocą kleszczy chwyć podstawę ogona pojedynczej myszy w klatce i umieść ją na ruszcie. Delikatnie przytrzymuj mysz poprzez drapanie i trzymając mysz w pionowej pozycji pionowej, włóż igłę i delikatnie wstrzyknij gnojowicę kałową, a następnie natychmiast wyjmij igłę.
    4. Umieść mysz bezpośrednio w jednym ze wysterylizowanych kubków w celu obserwacji. Powtórz ten proces dla każdej myszy w klatce. Po tym, jak wszystkie myszy otrzymają zgłębnik, użyj kleszczy, aby przesunąć każdą mysz z powrotem do łóżka klatki i uszczelnić klatkę zgodnie z opisem w krokach 4.3.2-4.3.4.
      UWAGA: W przypadkach, gdy używane są dwie lub więcej oddzielnych gnojowicy kałowej, wymagana jest całkowita ponowna sterylizacja komory bezpieczeństwa biologicznego oraz wymaganych klatek i materiałów. W przypadkach, gdy grupa myszy pozostaje wolna od zarazków, zaleca się, aby myszy te otrzymały zgłębniki kontrolne przed leczeniem jakiejkolwiek innej grupy.
    5. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w kroku 4.4, aby pozbyć się materiałów sterylizujących zawierających dwutlenek chloru i nasączonych nimi środkiem sterylizującym. Wszelkie materiały zanieczyszczone ludzką gnojowicą kałową należy traktować jako odpady biomedyczne i utylizować je zgodnie z procedurami bezpieczeństwa i higieny pracy.

6. Pobieranie kału od humanizowanych myszy w celu zachowania żywotności

  1. Przygotuj materiały eksploatacyjne do sterylizacji w autoklawie
    1. Umieść krótkie kleszczyki z szeroką końcówką w samouszczelniających się woreczkach sterylizacyjnych (1 na mysz), zlewkach polipropylenowych o pojemności 600 ml (1 na mysz) i parze długich kleszczyków w torbie bezpiecznej dla autoklawu i sterylizuj w autoklawie 1 dzień przed zabiegiem pobierania kału.
    2. Niezwłocznie po wyjęciu worka z autoklawu należy zakleić worek taśmą pakową i przechowywać do następnego dnia.
  2. Przygotowanie probówki z podłożem konserwującym
    1. Wybierz pożywkę chroniącą żywotność beztlenową (tutaj użyto Cary'ego Blaira). Porcję 1 ml pożywki konserwującej do sterylnych, zakręcanych probówek o pojemności 2 ml w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dla optymalnej konserwacji zaleca się stosunek kału do podłoża 1:10.
    2. Każdą probówkę należy wstępnie oznaczyć trwałym markerem, ale należy pamiętać, że narażenie na sterylizator z dwutlenkiem chloru może usunąć trwałe etykiety markerowe z powierzchni plastikowych. Inną metodą jest pozostawienie probówek nieoznakowanych i poproszenie asystenta o etykietowanie probówek natychmiast po pobraniu przed zamrożeniem.
    3. Umieść te probówki w standardowym stojaku na probówki z polipropylenu, aby umożliwić przechowywanie probówek w pozycji pionowej, a jednocześnie umożliwić sterylizację przez kontakt ze środkiem sterylizującym z dwutlenkiem chloru.
  3. Klatki do sterylizacji i szafa bezpieczeństwa biologicznego
    1. Powtórz kroki 2 i 3, aby wysterylizować klatki izologiczne i komorę bezpieczeństwa biologicznego. Ponownie należy upewnić się, że w ciągu 30 minut od wyjęcia stojaka każda izoklatka zostanie umieszczona w wysterylizowanym kapturze, a pokrywa zostanie odpowietrzona, aby umożliwić przepływ powietrza do myszy.
    2. Dodatkowo wysterylizuj autoklawowaną torbę i stojak zawierający przygotowane probówki poprzez nasycenie dwutlenkiem chloru i sterylizatorem i umieść je w nasączonej plastikowej torbie zawierającej klatki. Celem jest pełny kontakt cieczy ze wszystkimi powierzchniami każdej rurki i samym stojakiem.
  4. Pobieranie i przechowywanie próbek kału
    1. Po zakończeniu 20-minutowego okresu sterylizacji przenieś izoklatki, autoklawowane materiały eksploatacyjne i stojak na probówki do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Przebij autoklawowaną torbę z zaopatrzeniem, dociskając ją do zawartych w niej długich kleszczy, wyjmij zapasy i wyrzuć worek na zewnątrz kaptura.
    2. Załóż nowy sterylny fartuch chirurgiczny i sterylne rękawice chirurgiczne zamiast rękawic odpornych na chemikalia, aby zapobiec kontaktowi resztek sterylizatora z dwutlenkiem chloru z myszami. W razie potrzeby poproś asystenta o pomoc w tym procesie.
    3. Przygotuj kleszcze z końcówką, odwijając woreczki i używając wewnętrznej powierzchni woreczka jako sterylnego obszaru. Umieść stojak na probówki na powierzchni okapu bezpieczeństwa biologicznego.
    4. Za pomocą długich kleszczy chwyć podstawę ogona pojedynczej myszy w klatce i umieść je bezpośrednio w jednym ze wysterylizowanych kubków w celu obserwacji. Powtórz ten proces dla każdej myszy w klatce.
    5. Obserwuj myszy, dopóki nie zostaną wyprodukowane co najmniej dwie świeżo przekazane granulki kału.
      1. Za pomocą kleszczyków z końcówką podnieś granulki kału i umieść je bezpośrednio w probówce. Natychmiast uszczelnij zakrętkę, pokrywę i przekaż ją asystentowi.
      2. Poproś asystenta, aby oznaczył rurkę i natychmiast homogenizował stolec poprzez wirowanie. Po uzyskaniu jednorodności probówkę należy zatrzaskowo zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać przez długi czas w temperaturze -80 °C.
    6. Powtórz proces zbierania kału dla każdej myszy w klatce. Po zebraniu kału umieść każdą mysz w klatce domowej i ponownie zadokuj klatki na stojaku. Powtórz krok 4.4, aby wyczyścić okap i wyrzucić odpady.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ludzkie próbki kału, połączone w grupy według fenotypu osób odpowiadających i nieodpowiadających na leczenie ICI (opisanego wcześniej w protokole), podano drogą gavage mieszanym płciowo myszom GF-WT, umieszczonym w 3 izoklatkach na grupę (n = 1-2 myszy/klatka, n = 6 dla osób odpowiadających i n = 5 dla osób nieodpowiadających). Myszy poddano aklimatyzacji przez 1 tydzień po transferze. Następnie zebrano próbki kału od tych myszy (w warunkach wolnych od drobnoustrojów). Następnie myszom podano drogą gavage 1 × 107

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół zapewnia powtarzalną, bardzo szczegółową metodę humanizacji myszy wolnych od zarazków trzymanych w eksperymentalnych izoklatkach. Możliwość wyłącznego przeszczepiania kału od ludzi do mysich gospodarzy jest nieoceniona w badaniach nad mikrobiomem. Bez zanieczyszczenia mikrobiotą komensalną specyficzną dla myszy można badać wpływ bakterii rezydujących u ludzi na różne stany zdrowia i choroby lub wpływ interwencji, takich jak dieta lub podawanie leków, na mikrobiotę człowieka 16,17,18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni Wydziałowi Usług Wolnych od Zarazków UF Animal Care Services za pomoc w hodowli gnotobiotyków, dr Brooke Bloomberg i dr Laurze Eurell za pomoc weterynaryjną i IACUC oraz Josee Gauthier za pomoc w sekwencjonowaniu genu 16S rRNA. Badania te były częściowo wspierane przez UF Health Cancer Center Funds (C.J.) i UF Department of Medicine Gatorade Fund (C.J.). R.Z.G. został wsparty ze środków UF Health Cancer Center. R.C.N. był wspierany przez National Institutes of Health TL1 Training Grant na Uniwersytecie Florydy (TL1TR001428, UL1TR001427), National Cancer Institute of the National Institutes of Health Team-Based Interdisciplinary Cancer Research Training Program T32CA257923 oraz UF Health Cancer Center. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez UF Health Cancer Center, wspierane częściowo przez środki stanowe przewidziane w Fla. Stat. § 381.915 oraz National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer P30CA247796. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health lub stanu Floryda. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sterylna strzykawka BD Slip Tip 1 mLFisher Scientific309659
2,0 ml Rurka z nakrętką, bez radełkowania, z listwą podłogową, naturalna, sterylna rurka E-Beam z dołączoną nasadkąFisher Scientific14-755-228
36 x 32 x 48 "3 Mil Gusset Poly BagsUlineS-13455
5-galonowy zbiornik aktywatora sterylizatora dwutlenku chloru Exspor Ecolab6301680
zbiornik o pojemności 5 galonów na bazie sterylizatora dwutlenku chloru Exspor Ecolab6301194
Zlewki polipropylenowe 600 mlFisher ScientificS01914
Pościel ALPHA-driShepherd Specialty Papers
Komora anaerobowaProdukty Coy LabTyp B
Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasa 2Certyfikowany przez Nuaire
autoklawowalny filtr HEPA IsoCage XT Extreme TemperatureTecniplast1245ISOFHXT
Przezroczyste soczewki LPX IQuity Gogle ochronne Mocowanie922205455
DuPont  Tyvek  Tuleja - 18"UlineS-13893E
DWK Nauki Przyrodnicze DURAN 45 mm Nasadka z kauczuku naturalnego wciskanaFisher Scientific01-258-107Gumowa nakrętka do butelek autoklawu 1 L
Butelki z opryskiwaczem HDPE Dynalon Quick MistFisher Scientific03-438-12B
Cylindry z podziałką polipropylenową FisherScientific03-007-44
Ryby  Kleszcze preparacyjne o zaostrzeniuFisher Scientific08-887
Fisherbrand Woreczki do sterylizacji z natychmiastowym uszczelnieniemFisher Scientific01-812-51
Kleszcze do zastosowań ogólnych Fisherbrand Straight, Szeroka, Mocna Fisher Scientific16-100-107
Marka rybacka  Bezołowiowa taśma autoklawuFisher Scientific15-901-110
Igła do gaźniaka, wielokrotnego użytku ze stali nierdzewnej. Prosty. Igła o rozmiarze 22, średnica końcówki 1,25 mm, długość 38 mm lub 1,5 cala (doz)Braintree ScientificN-PK 020
H-B Instrument Durac TimerFisher Scientific13-202-015
IsoPositive Klatki i stojaki (tj. izoklatki)Tecniplast   Klatki ISO30P30 (6 szer. x 5 wys.), jednostronne
rękawice odporne na chemikalia nitrylowe Rozmiar S (7), M (8) lub L (9) 18" długości, 22 mil,Grainger4T426
średnie, niesterylne, bezpudroweMedSupply PartnersKG-1101M
Oliwka / Purpurowy bagnet Gaz & Wkłady parowe / filtr cząstek stałych 2Ct   3M/Fastenal50051138541878
Poliwęglan RadDisk Mini dla myszy 8-75 x 4BraintreeScientific IRD-P M
Polipropylenowe czapki Bouffant - 24", niebieskieUlineS-10480BLU
Puritan Cary-Blair Medium, 5 mlFisher Scientific22-029-646
S, M i L Niebieska silikonowa dwutrybowa półmaska na głowę z uprzężą na głowę   3M/Fastenal50051131370826
Sgpf Series Sterylne bezpudrowe rękawice lateksowe, CT International, Grubość = 6.5 mm, Długość = 30.5 cm (12), Rozmiar rękawicy = 8.5, Kolor rękawicy = BiałyFisher Scientific18-999-102F
Antypoślizgowy pokrowiec na butyUline  S-25639
Fartuch chirurgiczny, ręcznik, sterylny, duży, 32/csThomas ScientificKIM 95111
Teklad Global 18% białkowa dieta dla gryzoni ekstrudowana (sterylizowalna) Inotiv2018SX
Thermo Scientific Nalgene Wytrzymały prostokątny zbiornik LLDPE z pokrywą (objętość 20 l)Thermo Scientific14-831-330J
VERIFY Dwugatunkowe samodzielne wskaźniki biologiczneSterisHealthcare S3061
WypAll L40 1⁄ Wycieraczki 4-krotneUlineS-8490
Rękawice nitrylowe Ansell ,

Bibliografia

  1. Park, J. C., Im, S. -H. Of men in mice: the development and application of a humanized gnotobiotic mouse model for microbiome therapeutics. Exp Mol Med. 52 (9), 1383-1396 (2020).
  2. Li, F., et al. Microbiome remodelling leads to inhibition of intestinal farnesoid X receptor signalling and decreased obesity. Nat Commun. 4, 2384(2013).
  3. Schwabe, R. F., Jobin, C. The microbiome and cancer. Nat Rev Cancer. 13 (11), 800-812 (2013).
  4. Wen, L., et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).
  5. Gray, S. M., et al. Mouse adaptation of human inflammatory bowel diseases microbiota enhances colonization efficiency and alters microbiome aggressiveness depending on recipient colonic inflammatory environment. Microbiome. 12 (1), 147(2024).
  6. Gopalakrishnan, V., et al. Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients. Science. 359 (6371), 97-103 (2018).
  7. Matson, V., et al. The commensal microbiome is associated with anti-PD-1 efficacy in metastatic melanoma patients. Science. 359 (6371), 104-108 (2018).
  8. Routy, B., et al. Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors. Science. 359 (6371), 91-97 (2018).
  9. Paik, J., et al. Potential for using a hermetically-sealed, positive-pressured isocage system for studies involving germ-free mice outside a flexible-film isolator. Gut Microbes. 6 (4), 255-265 (2015).
  10. Hecht, G., et al. A simple cage-autonomous method for the maintenance of the barrier status of germ-free mice during experimentation. Lab Anim. 48 (4), 292-297 (2014).
  11. Dremova, O., et al. Sterility testing of germ-free mouse colonies. Front Immunol. 14, 1275109(2023).
  12. Newsome, R. C., et al. Interaction of bacterial genera associated with therapeutic response to immune checkpoint PD-1 blockade in a United States cohort. Genome Med. 14 (1), 35(2022).
  13. Le Roy, T., et al. Comparative evaluation of microbiota engraftment following fecal microbiota transfer in mice models: age, kinetic and microbial status matter. Front Microbiol. 9, 3289(2018).
  14. Lebeuf, M., et al. Contaminants and where to find them: microbiological quality control in axenic animal facilities. Front Microbiol. 12, (2021).
  15. He, Z., et al. Campylobacter jejuni promotes colorectal tumorigenesis through the action of cytolethal distending toxin. Gut. 68 (2), 289-300 (2019).
  16. Wu, G. D., et al. Linking long-term dietary patterns with gut microbial enterotypes. Science. 334 (6052), 105-108 (2011).
  17. Ross, F. C., et al. The interplay between diet and the gut microbiome: implications for health and disease. Nat Rev Microbiol. 22 (11), 671-686 (2024).
  18. Maier, L., et al. Extensive impact of non-antibiotic drugs on human gut bacteria. Nature. 555 (7698), 623-628 (2018).
  19. Walter, J., Armet, A. M., Finlay, B. B., Shanahan, F. Establishing or exaggerating causality for the gut microbiome: Lessons from human microbiota-associated rodents. Cell. 180 (2), 221-232 (2020).
  20. Berland, M., et al. High engraftment capacity of frozen ready-to-use human fecal microbiota transplants assessed in germ-free mice. Sci Rep. 11 (1), 4365(2021).
  21. Choo, J. M., Rogers, G. B. Establishment of murine gut microbiota in gnotobiotic mice. iScience. 24 (2), 102049(2021).
  22. Bokoliya, S. C., Dorsett, Y., Panier, H., Zhou, Y. Procedures for fecal microbiota transplantation in murine microbiome studies. Front Cell Infect Microbiol. 11, 711055(2021).
  23. Li, Y., Cao, W., Gao, N. L., Zhao, X. -M., Chen, W. -H. Consistent alterations of human fecal microbes after transplantation into germ-free mice. Genomics Proteomics Bioinformatics. 20 (2), 382-393 (2022).
  24. Turnbaugh, P. J., Ridaura, V. K., Faith, J. J., Rey, F. E., Knight, R., Gordon, J. I. The effect of diet on the human gut microbiome: a metagenomic analysis in humanized gnotobiotic mice. Sci Transl Med. 1 (6), 6ra14(2009).
  25. Staley, C., et al. Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning. Microbiome. 5 (1), 87(2017).
  26. Lebeuf, M., Turgeon, N., Faubert, C., Robillard, J., Paradis, É, Duchaine, C. Managing the bacterial contamination risk in an axenic mice animal facility. Can J Microbiol. 67 (9), 657-666 (2021).
  27. Basic, M., et al. Monitoring and contamination incidence of gnotobiotic experiments performed in microisolator cages. Int J Med Microbiol. 311 (3), 151482(2021).
  28. Amorim, N., et al. Refining a protocol for faecal microbiota engraftment in animal models after successful antibiotic-induced gut decontamination. Front Med. 9, 770017(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przeszczep kału od człowiekatransfer mikrobiomumyszy zhumanizowanesterylizator do dwutlenku chlorukomora z laminarnym przepływem powietrzagavage zawiesiny kałowejstruktura społeczności mikrobiologicznejmysi model nowotworu
Przygotowanie i utrzymanie eksperymentu z izododatnią klatką z wykluczeniem biologicznym do przeszczepu kału u myszy wolnych od zarazków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.