Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i utrzymanie eksperymentu z izododatnią klatką z wykluczeniem biologicznym do przeszczepu kału u myszy wolnych od zarazków

DOI:

10.3791/68029

⸱

28 lutego 2025

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Florida College of Medicine, 2Department of Infectious Diseases and Immunology, University of Florida College of Medicine, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje najlepsze praktyki transferu myszy wolnych od zarazków do eksperymentalnych izolatorów jednoklatkowych (izoklatek) przy zachowaniu sterylnych warunków. Omówiono metody przeszczepu kału myszom wolnym od zarazków i pobierania żywych bakterii od tych "humanizowanych" myszy jelitowych w celu dalszych zastosowań.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy wolne od zarazków są ważnym narzędziem badawczym do zrozumienia wpływu mikroorganizmów na zdrowie i chorobę gospodarza, umożliwiając ocenę specyficznej roli jednostek, zdefiniowanych lub złożonych grup mikroorganizmów w odpowiedzi gospodarza. Hodowla myszy bez zarazków i eksperymentalne manipulacje, tradycyjnie hodowane i hodowane w izolatorach z elastyczną folią lub półsztywną, są kosztowne i wymagają licznego wyszkolonego personelu oraz dużej powierzchni w pomieszczeniach dla zwierząt. System klatkowy IsoPositive pozwala na eksperymentalną manipulację myszami wolnymi od zarazków w indywidualnych, hermetycznie zamkniętych, dodatnio ciśnieniowych klatkach izolacyjnych (izoklatkach), zmniejszając koszty i umożliwiając większą elastyczność w manipulacjach eksperymentalnych.

Tutaj opisany jest protokół transferu myszy wolnych od zarazków z izolatorów hodowlanych do izoklatek, a następnie transferu kału z ludzkiego kału dawcy do myszy w celu stworzenia stabilnych, długoterminowych "humanizowanych" myszy jelitowych do przyszłych badań. Opisano materiały i przygotowanie potrzebne do użytkowania systemu isocage, w tym użycie sterylizatora chemicznego z dwutlenkiem chloru do czyszczenia klatek, materiałów eksploatacyjnych, sprzętu i środków ochrony osobistej. Omówiono metody potwierdzania statusu wolnych od zarazków przenoszonych myszy oraz sposoby określania zanieczyszczenia w systemie klatkowym. Dalej omówiono procedurę hodowli, w tym ściółkę, pożywienie i zaopatrzenie w wodę. Opisano protokół przygotowania ludzkiej gnojowicy kałowej i zgłębnika do myszy wolnych od zarazków w celu stworzenia "humanizowanych" myszy jelitowych, wraz z pobieraniem kału w celu monitorowania składu społeczności mikrobiologicznej tych myszy. Eksperyment pokazuje, że dwa tygodnie po przeszczepie kału u człowieka pozwala na stabilną kolonizację mikrobioty dawcy w mysich gospodarzach, umożliwiając późniejsze wykorzystanie eksperymentalne. Ponadto opisano gromadzenie humanizowanych odchodów myszy w pożywkach zachowujących żywotność, umożliwiających wykorzystanie w dalszych eksperymentach funkcjonalnych. Ogólnie rzecz biorąc, metody te pozwalają na bezpieczne i skuteczne tworzenie humanizowanych społeczności myszy w eksperymentalnych klatkach gnotobiotycznych w celu dalszej manipulacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy wolne od zarazków są niezbędnym narzędziem w repertuarze badaczy mikrobiomu, pozwalającym na analizę wpływu mikrobioty na zdrowie gospodarza i stany chorobowe. Myszy wolne od zarazków rodzą się całkowicie bezpłodne i pozostają aksoniczne przez całe życie1. Kolonizacja myszy wolnych od zarazków specyficznymi szczepami bakteryjnymi umożliwia badania przyczynowo-skutkowe między tymi taksonami a funkcjami metabolicznymi, immunologicznymi lub innymi funkcjami gospodarza2,3,4,5. Szczególnie korzystna jest możliwość "humanizacji" myszy wolnych od zarazków na poziomie mikrobioty poprzez przeszczepianie kału uzyskanego od ludzkich dawców, a w przypadku przetrzymywania w warunkach barierowych zapobieganie zakażeniu mikroorganizmami pochodzącymi od myszy1. Takie podejście umożliwiło wiele ważnych odkryć w dziedzinie mikrobiomu, na przykład wpływ ludzkiego mikrobiomu jelitowego na odpowiedź immunoterapii nowotworów6,7,8.

Jednakże, podczas gdy humanizowane myszy wolne od zarazków są nieocenione dla wysiłków badawczych w dziedzinie mikrobiomu, istnieje wiele ograniczeń, które hamują szerszą adaptację tego podejścia. Myszy wolne od zarazków są hodowane i utrzymywane w dużych izolatorach półsztywnych lub z elastyczną folią, ale eksperymenty funkcjonalne wymagają ustawienia oddzielnych miniizolatorów, z jednym miniizolatorem mieszczącym kilka klatek, ale tylko w jednym warunku eksperymentalnym. To podejście oparte na miniizolatorze zwiększa powierzchnię zajmowaną przez przestrzeń i koszty, jednocześnie poważnie ograniczając liczbę warunków eksperymentalnych, które można badać w eksperymencie, oraz liczbę eksperymentów, które można przeprowadzać równolegle. Obiecującym rozwiązaniem jest zastosowanie indywidualnego, modułowego systemu klatkowego o nazwie ISOcage P Bioexclusion System (tutaj określanego jako system izoklatkowy)9,10. System izoklatek pozwala na eksperymentalną manipulację myszami wolnymi od zarazków w indywidualnych, hermetycznie zamkniętych, dodatnich ciśnieniowo klatkach izolacyjnych, umożliwiając oddzielne warunki eksperymentalne między każdą klatką, a nie między każdym miniizolatorem. Przy odpowiedniej technice aseptyki zwierzęta mogą być trzymane w izoklatkach przez okres do 12 tygodni w warunkach wolnych od zarazków lub humanizowane przez przeszczep kału ludzkiego w celu wykorzystania w dowolnym zgodnym podejściu eksperymentalnym (tj. mogą być wykonywane w warunkach aseptycznych). Wiele niezależnych eksperymentów może być przeprowadzanych równolegle przy użyciu systemu izoklatków, a zajmowana przestrzeń i koszty są znacznie mniejsze niż w przypadku przeprowadzania wielu eksperymentów w miniizolatorach.

Celem hodowli myszy wolnych od zarazków w elastycznych izolatorach hodowlanych folii jest staranne zachowanie statusu aksonicznego11. Techniki stosowane do monitorowania statusu wolnego od zarazków obejmują rutynowe wymazy z powierzchni ciała myszy i jamy ustnej, a także aseptyczne pobieranie próbek kału, które są zarówno hodowane, jak i testowane za pomocą komercyjnych testów opartych na PCR. Testy bakteryjne, serologiczne i grzybicze tych próbek są wymagane do określenia statusu wolnych od zarazków11. Kiedy myszy wolne od zarazków są przenoszone z izolatorów hodowlanych do izoklatek do użytku eksperymentalnego, myszy są wymazywane i testowane w celu potwierdzenia ich statusu wolnych od zarazków po przeniesieniu. Kontrole sterylności w izoklatkach są przeprowadzane poprzez aseptyczne pobieranie próbek kału, które są następnie hodowane w celu wykrycia zanieczyszczeń bakteryjnych, wirusowych i grzybiczych. Staranne gromadzenie i rejestrowanie wyników tych kontroli sterylności od urodzenia do końca protokołu eksperymentalnego jest konieczne, aby potwierdzić status tych myszy wolnych od zarazków.

System izoklatek składa się z pojedynczych klatek (Rysunek 1), dysków transferowych do transportu z izolatorów hodowlanych (Rysunek 1) oraz stojaka na klatkę isocage, w którym znajdują się klatki (Rysunek 2). Każda klatka izoklatkowa zawiera wysokowydajny filtr cząstek stałych (HEPA) na poziomie klatki zainstalowany na wlocie powietrza nawiewanego oraz silikonową uszczelkę, która po zamknięciu tworzy hermetyczne uszczelnienie, zapewniając, że żadne zanieczyszczenia nie mogą dostać się do klatki przez powietrze (Rysunek 1A). Ta pokrywa klatki może być używana jako sterylna powierzchnia robocza po umieszczeniu do góry nogami w wysterylizowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego (Rysunek 1A). Rusztowy stojak w klatce trzyma butelkę z jedzeniem i wodą (Rysunek 1B). Kleszcze autoklawowane w klatce są używane do wszystkich manipulacji, które wymagają kontaktu z wewnętrznymi powierzchniami klatki. Sama klatka ma wycięcia na wyjmowany uchwyt na kartę klatki do identyfikacji zwierząt na zewnątrz oraz dysze wlotu i eksportu powietrza, które dokują się do stojaka na klatkę (Rysunek 1C-E). Bezpieczne zaciski zamykające i blokada zakładki na pokrywie uszczelniają klatkę, gdy jest ona gotowa do ponownego zadokowania w systemie regału (Rysunek 1F). Sugerowana ściółka to Alpha-dri, zalecana jest również chata wzbogacająca do autoklawowania (Rysunek 1F). Dyski transferowe służą do przenoszenia myszy wolnych od zarazków z izolatorów hodowlanych do izoklatek i zawierają obrotową pokrywę komory z trójkątnym otworem, aby umożliwić manipulację zwierzętami (Rysunek 1G-H). Dyski są dostępne w rozmiarach małych (21,6 cm średnicy) i dużych (28 cm średnicy), z których oba mają pojemność ośmiu myszy. Taśma autoklawizowana służy do tworzenia hermetycznych uszczelnień na obwodzie i otworach powietrznych dysku, co wykonuje się przed namoczeniem środkiem sterylizującym i transportem w worku nasączonym sterylizantem (Rysunek 1I). Sam system szaf posiada ekran do monitorowania dmuchaw powietrza, stanu filtra HEPA na poziomie szafy i awaryjnego zasilania bateryjnego szafy, które są wszystkimi funkcjami systemu (Rysunek 2A). Dołączony manometr Magnehelic wyświetla nadciśnienie utrzymywane przez system klatek, a automatyczny wizualny wskaźnik dokowania pokazuje stan dokowania klatek (żółta zakładka na zewnątrz oznacza, że żadna klatka nie jest zadokowana lub dokowanie się nie powiodło) (Rysunek 2B-D). Do manipulowania izoklatkami niezbędna jest również standardowa certyfikowana komora bezpieczeństwa biologicznego.

Protokół przedstawiony tutaj opisuje właściwe metody skutecznego przenoszenia myszy wolnych od zarazków z izolatorów hodowlanych w warunkach aseptycznych do izoklatek przy jednoczesnym zachowaniu statusu wolnych od zarazków, humanizacji myszy wolnych od zarazków za pomocą ludzkiej gnojowicy kałowej dawcy oraz pobierania kału od myszy trzymanych w izoklatce w celu potwierdzenia statusu wolnego od zarazków lub zachowania żywotności dla dalszych badań funkcjonalnych. W tym przykładzie myszy wolne od zarazków są humanizowane za pomocą zbiorczych próbek kału od ludzi leczonych immunoterapią z powodu raka płuc i dychotomizowane jako reagujące lub niereagujące na terapię. W tym przypadku fenotyp odpowiedzi na odpowiedź na immunoterapię został przeniesiony przez humanizację mikrobioty jelitowej na myszy biorców, które następnie można było dalej zaszczepić komórkami nowotworowymi i leczyć immunoterapią. Protokół ludzkiej gnojowicy kałowej można łatwo dostosować do dowolnego kału ludzkiego dawcy lub dowolnego modelu przedklinicznego choroby, którego życzy sobie badacz. Za pomocą tego protokołu możliwe jest przeniesienie dowolnej mikrobioty dawcy kału do gospodarza wolnego od zarazków, co umożliwia dalsze badania nad rolą mikrobioty w zdrowiu i chorobie.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat ideowy isocage i dysków transferowych. (A) Widok z góry na spód pokrywy klatki, z etykietami wskazującymi położenie wewnętrznego filtra HEPA na poziomie klatki i silikonowej uszczelki. (B) Widok z góry na wnętrze klatki, z etykietami wskazującymi pokrywę z pręta drucianego, wewnętrzną butelkę na wodę i dziobek oraz miejsce w ruszcie do przechowywania autoklawowalnej karmy. (C) Widok klatki z przodu z nacięciami dla posiadacza karty klatki. (D) Widok z góry na pełną klatkę z pokrywą na górze, pokazujący, jak filtr HEPA jest zainstalowany na dyszy wlotu powietrza. (E). Widok z tyłu klatki z widocznymi dyszami wlotowymi i odprowadzającymi powietrze, które dokują się do systemu zębatki isocage. (F) Widok z boku pełnej klatki z pokrywą na górze, z etykietami wskazującymi zaciski bezpiecznego zamknięcia w pozycji otwartej, z białymi wypustkami na każdym zacisku, które blokują je na miejscu. Wnętrze klatki pokazuje ściółkę Alpha-dri ułożoną warstwami na dole i sugerowaną urozmaiconą chatę umieszczoną w ściółce. (G) Widok z góry na tarcze transferowe z pokrywą na górze. (H) Widok z góry na wnętrze dysku transferowego, ukazujący obrotową pokrywę komory z trójkątnym otworem umożliwiającym manipulowanie zwierzętami. (I) Widok boczny w pełni zmontowanej tarczy transferowej pokazujący umieszczenie taśmy autoklawizowanej, która tworzy hermetyczne uszczelnienie podczas przenoszenia z izolatora hodowlanego do izoklatki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-introduction-2
Rysunek 2: Schemat ideowy systemu regałów isocage. (A) Kompletny stojak isocage z zadokowanymi klatkami i etykietą wskazującą ekran monitorowania stanu dmuchawy powietrza, stanu filtra HEPA i baterii awaryjnej. W lewym dolnym rogu stojaka znajduje się szczelina na filtr HEPA na poziomie stojaka. (B) Dołączony manometr Magnehelic pokazujący nadciśnienie utrzymywane przez zębatkę. (C) Zadokowana izoklatka bez widocznego żółtego wskaźnika dokowania, świadcząca o udanym połączeniu między zębatką a dyszami powietrznymi. (D) Puste gniazdo w szafie, z widocznym automatycznym wizualnym wskaźnikiem dokowania wskazującym, że nie ma stojaka na swoim miejscu i nie ma połączenia dysz powietrznych z izoklatką. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na University of Florida (UF) i przeprowadzone w Obiektach Opieki nad Zwierzętami UF (Protokół IACUC #IACUC202300000005). Kolonie typu dzikiego wolne od zarazków (GF WT; Myszy C57BL/6) były hodowane i utrzymywane w izolatorach przez UF Animal Care Services Germ-free Division. Myszy GF WT o mieszanej płci przeniesiono z izolatorów hodowlanych i umieszczono w systemie biowykluczenia ISOcage P, aby umożliwić manipulację mikrobiologiczną.

Próbki kału ludzkiego uzyskano z prospektywnego badania obserwacyjnego, w którym zebrano próbki podłużnego kału od pacjentów, którzy otrzymali leczenie inhibitorem immunologicznego punktu kontrolnego (ICI)12. Świadomą zgodę uzyskano od pacjentów po zatwierdzeniu badania przez Advarra IRB (MCC#18611, Pro00017235). Pacjenci otrzymali i ukończyli zestaw do pobierania stolca z płynnym środkiem do transportu dentystycznego (LDTM), mający na celu zachowanie żywotności bakterii do badań funkcjonalnych. Ocena odpowiedzi charakteryzowała n=4 próbki jako odpowiadające (R) i n=6 jako niereagujące (NR). Homogenizowane próbki pacjentów zakonserwowane LDTM rozmrażano indywidualnie, każdą z nich umieszczono w komorze beztlenowej na nie więcej niż 90 s i łączono według fenotypu odpowiedzi (R: n = 4, NR: n = 6). Zebrane próbki zostały następnie podzielone na porcje i zamrożone w temperaturze -80 °C w celu wykorzystania w niniejszym protokole. Aby określić liczbę beztlenowych jednostek tworzących kolonie (CFU) w kale dawcy, kał każdego pacjenta seryjnie rozcieńczano do 1 × 10-5, a 10 μl każdego rozcieńczenia posiewano w dwóch egzemplarzach na beztlenowych płytkach agarowych do infuzji serca mózgu (BHI) i Luria Bertani (LB) oraz oszacowano liczbę CFU na gram stolca. Równe CFU od każdego pacjenta połączono z próbkami inokulum kału w celu wprowadzenia do myszy.

1. Przygotowanie klatek i autoklawowanie

  1. Przygotowanie klatki izoklatowej
    1. Napełnij klatki ~ 500 ml diety 2018SX lub dowolnej pożądanej wzbogaconej diety autoklawowalnej i ułóż na dnie ściółkę ALPHA-dri. Umieść autoklawowalną chatę wzbogacającą w łóżku klatki. Umieść pustą, nieuszczelnioną butelkę z wodą i dyszę oraz długie kleszcze z szeroką końcówką na ruszcie.
    2. Umieścić dwugatunkowy wskaźnik biologiczny w żywności w jednej klatce na cykl autoklawu. Umieść pasek integratora chemicznego na zewnątrz każdej klatki.
    3. Klatki należy sterylizować w autoklawie w cyklu próżniowym przez 45 minut w temperaturze 121 °C i minimalnym ciśnieniu 15 PSI, a następnie przez 30 minut schnięcia. Sterylizuj klatki za pomocą stojaka do dekontaminacji Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej (ISO), który pozwala na szczelne zamknięcie klatek, a para przechodzi przez wewnętrzny filtr HEPA, który utrzymuje sterylne środowisko do momentu otwarcia klatki.
    4. Napełnij butelki o pojemności 1 litra wodą pitną, uszczelnij gumowymi nakrętkami i umieść pasek integratora chemicznego na powierzchni butelki. Autoklaw w temperaturze 121 °C i minimalnym ciśnieniu 15 PSI przez 45 minut, korzystając z programu powolnego wydmuchiwania cieczy.
    5. Należy przeprowadzić wizualną kontrolę integratorów chemicznych umieszczonych na każdej klatce w celu natychmiastowej weryfikacji odpowiednich parametrów autoklawu.
      UWAGA: Wskaźnik biologiczny musi zostać usunięty przy pierwszym otwarciu izoklatki w sterylnych warunkach. Inkubować wskaźnik biologiczny przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i obserwować wszelkie zmiany koloru. Żywa zmiana koloru z oryginalnego niebiesko-fioletowego klarownego roztworu na żółtą lub mętną ciecz wskazuje na rozwój drobnoustrojów. Jeśli wskaźnik pozostaje przezroczysty i ma kolor niebiesko-fioletowy, oznacza to, że wnętrze koszyków jest całkowicie sterylne w tym cyklu autoklawu.

2. Preparat sterylizujący z dwutlenku chloru

UWAGA: Środek sterylizujący z dwutlenku chloru jest bardzo po aktywacji. Sterylizator z aktywowanego dwutlenku chloru traci ważność po 24 godzinach od zmieszania aktywatora z bazą. Sterylizator z dwutlenkiem chloru wytwarza opary, które mogą działać drażniąco na powierzchnie błon śluzowych i powodować podrażnienia w kontakcie ze skórą. Upewnij się, że pomieszczenie do przygotowania środka sterylizacyjnego ma dostęp do zlewu i odpowiedniej wentylacji. Podczas pracy ze środkiem sterylizującym z dwutlenkiem chloru należy założyć okulary ochronne, respirator i rękawice odporne na chemikalia, a także wymagane środki ochrony osobistej (PPE) w pomieszczeniach dla zwierząt.

  1. Baza mieszająca i aktywator
    1. Aby przygotować standardową objętość 6 litrów środka sterylizującego z dwutlenkiem chloru, najpierw odmierz 1 l środka sterylizującego z dwutlenkiem chloru w cylindrze z podziałką o pojemności 1 l i wlej do zbiornika o pojemności 20 litrów.
    2. Za pomocą tego samego cylindra z podziałką odmierz i wlej 4 l wody z kranu do zbiornika do zanurzania.
    3. Odłóż na bok cylinder z podziałką używaną jako podstawa i woda. Za pomocą nowego cylindra z podziałką odmierz 1 l aktywatora sterylizującego z dwutlenkiem chloru i wlej go do zbiornika do zanurzania.
    4. Po dodaniu aktywatora do zbiornika użyj cylindra z podziałką, aby wymieszać zawartość zbiornika.
  2. aktywacja
    1. Umieść pokrywkę na zbiorniku do namaczania i oznacz go jako sterylizujący dwutlenek chloru, podając datę i godzinę dodania aktywatora oraz imię i nazwisko personelu, który go przygotował. W razie potrzeby cylinder z podziałką używany do mieszania środka sterylizującego może być użyty do przeniesienia 1 litra do butelki z rozpylaczem.
    2. Przenieś zbiornik do namaczania i butelki z rozpylaczem do pomieszczenia dla zwierząt, gdzie znajduje się stojak i klatki Isocage. Sterylizator z aktywowanym dwutlenkiem chloru musi pozostać przez co najmniej 20 minut przed użyciem, aby zapewnić pełną aktywację.
      UWAGA: Do manipulowania dużą ilością klatek (>9) w zbiorniku do zanurzania można przygotować jednorazowo do 12 litrów. Do manipulowania 1 klatką lub w nagłych wypadkach 1,2 l środka sterylizującego z dwutlenkiem chloru można przygotować w mniejszym pojemniku, a następnie przenieść do 2 butelek z rozpylaczem o pojemności 1 l. Zaleca się, aby środek sterylizujący był przygotowany co najmniej 1 godzinę przed przewidywanym przeniesieniem myszy wolnych od zarazków.

3. Sterylizacja

  1. Załóż środki ochrony osobistej
    1. Jako główny manipulator klatki załóż okulary ochronne, respirator, rękawice odporne na chemikalia, sterylny fartuch chirurgiczny, bouffant, pokrowce na rękawy i ochraniacze na buty. Noś fartuchy pod środkami ochrony indywidualnej, ponieważ każdy kontakt tkaniny ze środkiem sterylizującym z dwutlenkiem chloru spowoduje rozległe plamy.
    2. Zalecany jest asystent głównego manipulatora klatki. Niech asystent założy te same środki ochrony osobistej, co główny manipulator klatki, chociaż może nosić niesterylny fartuch chirurgiczny.
  2. Przygotowanie szafy bezpieczeństwa biologicznego
    1. Umieść 10 chusteczek w zbiorniku na sterylizujący dwutlenek chloru i upewnij się, że są całkowicie przemoczone.
    2. Przenieś nasączone chusteczki do szafki bezpieczeństwa biologicznego i namocz wszystkie powierzchnie szafki w następującej kolejności od tyłu do przodu: płaska powierzchnia robocza, lewa strona, tył okapu, prawa strona i przednia szyba wewnętrzna. Wykonaj bezdotykowe namaczanie niezabezpieczonych powierzchni komory bezpieczeństwa biologicznego, ściskając chusteczki po tych powierzchniach bez ich dotykania.
    3. Po jednej rundzie czyszczenia umieść chusteczki z powrotem w zbiorniku na sterylizację dwutlenkiem chloru, aby je namoczyć.
  3. Przygotowanie izoklatek
    1. Przygotuj dużą plastikową torbę, napełniając ją co najmniej 100 ml środka sterylizującego z dwutlenkiem chloru za pomocą cylindra z podziałką i potrząśnij torbą, aby upewnić się, że wszystkie powierzchnie wewnętrzne są przemoczone. Umieść torbę na dowolnej płaskiej powierzchni.
    2. Wyjmij pojedynczą klatkę izolacyjną ze stojaka i umieść ją w zbiorniku do namaczania ze sterylnym dwutlenkiem chloru, tak aby każda powierzchnia klatki miała kontakt z cieczą. Użyj nasączonych chusteczek w zbiorniku, aby dalej szorować powierzchnie klatki, aby zapewnić pełny kontakt z cieczą.
    3. Po namoczeniu klatki poproś asystenta o otwarcie nasączonej plastikowej torby. Umieść klatkę w torbie i poproś asystenta o natychmiastowe zamknięcie otworu. Spryskaj otwór worka środkiem sterylizującym z dwutlenkiem chloru za pomocą butelki z rozpylaczem. Postępuj zgodnie z tą procedurą dla każdego klatki, która ma być używana; W jednej torbie 36" 32" 48" zmieszczą się do czterech klatek.
    4. Zanurz tyle wysterylizowanych butelek z wodą o pojemności 1 l, ile potrzeba (1 l wody na 2 klatki) w zbiorniku na sterylizację dwutlenkiem chloru, a następnie umieść je w innej nasączonej plastikowej torbie. Po umieszczeniu wszystkich zapasów w torbie zamknij worek i spryskaj otwór worka środkiem sterylizującym z dwutlenku chloru za pomocą butelki z rozpylaczem.
    5. Po zapakowaniu wszystkich koszyków i zapasów zanurz rękawice odporne na chemikalia w środku sterylizującym z dwutlenkiem chloru (jak najgłębiej w rękawice, nie sięgając do otworu).
  4. Okres sterylizacji 20 min
    1. Pełna sterylizacja wymaga co najmniej 20 minut kontaktu z płynem. Jak tylko ostatni przedmiot zostanie wysterylizowany, a plastikowa torba do namaczania zostanie zamknięta, poproś asystenta o ustawienie 20-minutowego timera. Upewnij się, że po uruchomieniu timera rękawice odporne na chemikalia nie dotykają żadnej powierzchni, która nie jest nasączona środkiem sterylizującym z dwutlenkiem chloru.
    2. Wykonaj proces sterylizacji komory bezpieczeństwa biologicznego (krok 3.2) kilkakrotnie, aż zegar wskaże, że minęło 20 minut.
    3. Poproś asystenta, aby często potrząsał zewnętrznymi powierzchniami nasączonej plastikowej torby, aby zapewnić stały kontakt płynu z powierzchniami klatki i butelek w środku.
    4. Po upływie 20 minut poproś asystenta, aby otworzył nasączoną plastikową torbę, aby odsłonić wysterylizowane klatki i butelki z wodą, uważając, aby dotykać tylko zewnętrznych powierzchni torby.
    5. Używając wysterylizowanych rękawic odpornych na chemikalia, przenieś każdą klatkę i butelkę do wysterylizowanej szafki bezpieczeństwa biologicznego. Jeśli jest zbyt wiele klatek, aby zmieścić się w szafie bezpieczeństwa biologicznego, pozostaw pozostałe klatki w plastikowych torbach, ponieważ pozostaną sterylne tak długo, jak długo otwór plastikowej torby zostanie zamknięty i nasączony środkiem sterylizującym z dwutlenku chloru między każdym otworem.

4. Transfer myszy wolny od zarazków

  1. Przygotowanie izoklatek
    1. Aby otworzyć hermetycznie zamkniętą klatkę izolacyjną, podnieś białe zaczepy na dwóch zaciskach po bokach pokrywy, a następnie wyciągnij każdy zacisk na boki. Pokrywa musi być wolna od dolnej części klatki, aby można było zdjąć pokrywę z klatki. Umieść pokrywę do góry nogami po lewej stronie klatki i używaj jej jako sterylnej stacji roboczej.
      UWAGA: Alternatywą dla używania pokryw klatek lub wnętrza autoklawowanych toreb na narzędzia jako sterylnej powierzchni roboczej jest zastosowanie obłożeń sterylizowanych w autoklawie, które zapewniają większą powierzchnię i zapobiegają niezamierzonemu zanieczyszczeniu pokrywy klatki w przypadku popełnienia błędu.
    2. Używając sterylnych kleszczyków znajdujących się w klatce na ruszcie, wyjmij pustą butelkę z wodą i umieść ją po wewnętrznej stronie pokrywy. Otwórz butelkę na wodę o pojemności 1 l, zdejmując gumową uszczelkę, i wlej wodę do butelki, aby ją napełnić. Umieść dyszę na butelce z wodą za pomocą kleszczyków i mocno dociśnij, aby uszczelnić.
    3. Użyj sterylnych kleszczy, aby podnieść ruszt i cofnij go o kilka cali, aby umożliwić otwarcie dna klatki. Oprzyj sterylne kleszcze na ruszcie, upewniając się, że uchwyty nie stykają się z powierzchniami klatki.
  2. Korzystanie z dysku transferowego
    UWAGA: Przeszkolony personel wolny od zarazków jest odpowiedzialny za pielęgnację i konserwację izolatorów hodowlanych. Biorąc pod uwagę ryzyko związane z otwieraniem izolatorów hodowlanych, personel ten przeprowadza sterylizację dysku transferowego, przygotowanie i przeniesienie myszy wolnych od zarazków z izolatorów do izoklatek. Aby pokrótce opisać proces, krążki transferowe są przygotowywane w butli nadającej się do sterylizacji w autoklawie, aby umożliwić sterylizację. Wskaźniki biologiczne służą do weryfikacji ich sterylności. Taśma do uszczelniania dysków transferowych jest również autoklawowana wewnątrz cylindra. Wysterylizowany cylinder zawierający te materiały jest przymocowany za pomocą tulei transferowej do izolatora, a myszy są przenoszone z klatek na dysk. Pokrywę umieszcza się następnie na dysku, a taśma autoklawizowana służy do stworzenia hermetycznego uszczelnienia na obwodzie dysku i otworach powietrznych. Zapieczętowany dysk jest natychmiast umieszczany w porcie wyjściowym izolatora. Następnie zamyka się nasadkę portu izolatora domowego, a zewnętrzna część dysku jest dokładnie przecierana środkiem sterylizującym i umieszczana w torbie nasączonej środkiem sterylizującym, monitorowanej przez 20 minut, aby zapewnić całkowitą dekontaminację. Personel zajmujący się hodowlą wolnych od zarazków dostarcza następnie te dyski personelowi badawczemu. Myszy nie mogą być trzymane w zapieczętowanym dysku dłużej niż 30 minut od momentu zapieczętowania dysku transferowego, dlatego ważne jest, aby wszystkie poprzednie kroki w tym protokole zostały wykonane z wystarczającą ilością czasu przed przybyciem dysku transferowego.
    1. Po otrzymaniu dysku transferowego poproś asystenta, aby przytrzymał i częściowo rozwinął plastikową pokrywę, tak aby nasączona powierzchnia dysku transferowego była odsłonięta, ale nie dotykana przez asystenta.
    2. Po otrzymaniu dysku transferowego poproś asystenta, aby przytrzymał i częściowo rozwinął plastikową pokrywę, tak aby nasączona powierzchnia dysku transferowego była odsłonięta, ale nie dotykana przez asystenta.
    3. Zakładając rękawice odporne na chemikalia nasączone środkiem sterylizującym z dwutlenkiem chloru, wyjmij krążek transferowy z plastikowego opakowania, uważając, aby nie dotknąć żadnej powierzchni, która nie jest nasączona środkiem sterylizującym. Następnie umieść dysk transferowy na płaskiej powierzchni wysterylizowanej szafy bezpieczeństwa biologicznego.
    4. Aby otworzyć dysk transferowy, odklej taśmę, uszczelnij obwód dysku i wyrzuć go na zewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego. Zdejmij pokrywę dysku transferowego i wyrzuć go na zewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego.
    5. Wewnątrz dysku transferowego znajduje się obrotowa pokrywa komory z pojedynczym otworem. Użyj sterylnych kleszczyków uprzednio spoczywających na ruszcie klatki, aby manipulować pokrywą komory, aby przesunąć otwór do myszy potrzebny do przeniesienia.
  3. Przenoszenie myszy z dysku do izoklatki
    1. Za pomocą kleszczy chwyć podstawę ogona myszy przez otwór w plastikowej pokrywie dysku, a następnie podnieś i przenieś mysz do izoklatki przez przestrzeń otwartą wcześniej między rusztem a klatką. Powtórz tę czynność dla wszystkich myszy przeznaczonych do tej klatki.
    2. Gdy wszystkie myszy zostaną przeniesione do tej izoklatki, wymień ruszt za pomocą kleszczy. Następnie podnieś pokrywę klatki i umieść ją z powrotem na klatce za pomocą kleszczy.
    3. Podnieś każdy clamp pokrywy klatki do góry i ostrożnie opuść po bokach klatki, a następnie dociśnij białe zaczepy, aby uszczelnić pokrywę klatki.
    4. Po zamknięciu klatki poproś asystenta o spryskanie każdej dyszy w miejscu dokowania na stojaku klatki środkiem sterylizującym z dwutlenku chloru. Następnie zdejmij klatkę z okapu i przekaż ją asystentowi, który może następnie zadokować klatkę na stojaku.
    5. Powtórz te czynności dla każdej myszy na dysku transferowym.
  4. Czyszczenie komory bezpieczeństwa biologicznego
    1. Po zakończeniu wszystkich transferów myszy do izoklatki opróżnij kaptur z wszelkich zanieczyszczeń i całkowicie wytrzyj chusteczkami nasączonymi sterylantem z dwutlenkiem chloru.
    2. Przetrzyj kaptur alkoholem izopropylowym, aby usunąć resztki środka sterylizującego z dwutlenkiem chloru. Przestrzeń pod powierzchnią roboczą okapu zbiera dużą ilość sterylizantu z procesu sterylizacji. Usuń to poprzez absorpcję suchymi chusteczkami i przetrzyj alkoholem izopropylowym.
    3. Płynny środek sterylizujący z dwutlenkiem chloru wyrzucić do odpływu zlewu 24 godziny po aktywacji. Materiały stałe zanieczyszczone środkiem sterylizującym należy utylizować jak zwykłe odpady.
      UWAGA: Myszy wolne od zarazków przeniesione do warunków izoklatki pozostawia się na 1 tydzień, aby zaaklimatyzować się w nowym środowisku przed jakąkolwiek interwencją. Zmniejsza to stres odczuwany przez zwierzęta, który może kolidować z wynikami badań. Pod koniec tego 1-tygodniowego okresu aklimatyzacji zbierz kał zgodnie z opisem w kroku 6, aby potwierdzić status wolnego od zarazków przed jakąkolwiek interwencją.

5. Doustne podawanie ludzkiej gnojowicy kałowej myszom wolnym od zarazków

  1. Przygotowanie autoklawowanych materiałów do zgłębników
    1. Umieść igły do zgłębnika doustnego w samouszczelniających się woreczkach sterylizacyjnych (1 na mysz), a sterylne strzykawki o pojemności 1 ml w samouszczelniających się woreczkach sterylizacyjnych (1 na mysz) na 1 dzień przed zabiegiem doustnego zgłębnika. Umieść te zlewki polipropylenowe o pojemności 600 ml (1 na mysz) i parę długich kleszczyków w torbie bezpiecznej dla autoklawu i sterylizuj w autoklawie.
    2. Niezwłocznie po wyjęciu worka z autoklawu należy zakleić worek taśmą pakową i przechowywać do następnego dnia.
  2. Przygotowanie ludzkiej gnojowicy kałowej
    1. W dniu pobrania należy przenieść kał ludzki homogenizowany i przechowywany w beztlenowych pożywkach konserwujących (w tym przypadku płynnych pożywkach do transportu dentystycznego) z zamrażarki o temperaturze -80 °C do komory beztlenowej. Rozcieńczyć homogenizowany materiał kałowy w stosunku około 1:10 w sterylnym, beztlenowym roztworze soli fizjologicznej w stożkowej probówce o pojemności 10 ml.
    2. Uszczelnij probówkę zawierającą ludzką gnojowicę kałową parafilmem, homogenizuj przez wir, a następnie odwiruj przy 200 g przez 5 minut w celu osadzenia cząstek.
    3. Umieścić probówkę z powrotem w komorze beztlenowej i przenieść supernatant do innej stożkowej probówki o pojemności 10 ml. Uszczelnić probówkę zawierającą ludzki supernatant kałowy parafilmem, wyjąć ją z komory beztlenowej i umieścić w wtórnym szczelnym pojemniku. Przetransportuj pojemnik wraz z autoklawowaną torbą z zapasami do zgłębnika do miejsca utrzymania zwierząt.
      UWAGA: Niezbędne jest oszacowanie całkowitej jtk/ml kału ludzkiego przeznaczonego do zgłębnika do celów sprawozdawczych. Nie jest jasne, jakie jest minimalne obciążenie CFU, aby zapewnić odpowiednią kolonizację, ale wyższe CFU prowadzą do lepszego wszczepienia stolca dawcy13. Jeśli ładunek CFU ludzkiego kału powoduje niskie wskaźniki wszczepienia, należy pobrać próbki kału ludzkiego. Zastosowanie pożywki zachowującej żywotność poprawi odzysk CFU z pobranych próbek kału. W celu oznaczenia beztlenowej/tlenowej liczby jtk w kale dawcy, należy seryjnie rozcieńczyć próbkę do 1 x 10-5 i nanieść 10 μl każdego rozcieńczenia w dwóch powtórzeniach na tlenowych i beztlenowych płytkach agarowych BHI i LB. Po 24 godzinach (tlenowy) i 48 h (beztlenowy) policz jtk na gram stolca.
  3. Przygotowanie izoklatek
    1. Powtórz kroki 2 i 3, z tą różnicą, że w tych klatkach znajdują się myszy i należy zadbać o to, aby w ciągu 30 minut od wyjęcia stojaka każda izoklatka została umieszczona w wysterylizowanym kapturze, a pokrywa odpowietrzona, aby umożliwić przepływ powietrza do myszy.
    2. Wysterylizować autoklawowany worek z materiałem do zgłębków i probówkę z ludzkim kałem z kroków 5.1 i 5.2 poprzez nasycenie dwutlenkiem chloru sterylizantem w podobny sposób jak w przypadku butelek na wodę (tj. zanurzyć je w środku sterylizującym, a następnie umieścić w torbie nasączonej środkiem sterylizującym).
    3. Przenieść izoklatki i zgłębniki doustne do komory bezpieczeństwa biologicznego po zakończeniu 20-minutowego okresu sterylizacji. Przebij autoklawowaną torbę zaopatrzeniową, dociskając ją do zawartych w niej długich kleszczy, a następnie wyjmij zapasy i wyrzuć worek na zewnątrz kaptura.
  4. Zgłębnik
    1. Załóż nowy sterylny fartuch chirurgiczny i sterylne rękawice chirurgiczne zamiast rękawic odpornych na chemikalia, aby zapobiec kontaktowi resztek sterylizatora z dwutlenkiem chloru z myszami. W razie potrzeby poproś asystenta o pomoc w tym procesie.
    2. Przygotuj igły do zgłębnika, rozpakowując każdą torebkę sterylizacyjną i użyj wnętrza worka jako suchej, sterylnej powierzchni spoczynkowej. Podłącz igłę do każdej strzykawki, otwórz rurkę do gnojowicy kałowej i wciągnij 200 μl gnojowicy kałowej do każdej strzykawki.
    3. Za pomocą kleszczy chwyć podstawę ogona pojedynczej myszy w klatce i umieść ją na ruszcie. Delikatnie przytrzymuj mysz poprzez drapanie i trzymając mysz w pionowej pozycji pionowej, włóż igłę i delikatnie wstrzyknij gnojowicę kałową, a następnie natychmiast wyjmij igłę.
    4. Umieść mysz bezpośrednio w jednym ze wysterylizowanych kubków w celu obserwacji. Powtórz ten proces dla każdej myszy w klatce. Po tym, jak wszystkie myszy otrzymają zgłębnik, użyj kleszczy, aby przesunąć każdą mysz z powrotem do łóżka klatki i uszczelnić klatkę zgodnie z opisem w krokach 4.3.2-4.3.4.
      UWAGA: W przypadkach, gdy używane są dwie lub więcej oddzielnych gnojowicy kałowej, wymagana jest całkowita ponowna sterylizacja komory bezpieczeństwa biologicznego oraz wymaganych klatek i materiałów. W przypadkach, gdy grupa myszy pozostaje wolna od zarazków, zaleca się, aby myszy te otrzymały zgłębniki kontrolne przed leczeniem jakiejkolwiek innej grupy.
    5. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w kroku 4.4, aby pozbyć się materiałów sterylizujących zawierających dwutlenek chloru i nasączonych nimi środkiem sterylizującym. Wszelkie materiały zanieczyszczone ludzką gnojowicą kałową należy traktować jako odpady biomedyczne i utylizować je zgodnie z procedurami bezpieczeństwa i higieny pracy.

6. Pobieranie kału od humanizowanych myszy w celu zachowania żywotności

  1. Przygotuj materiały eksploatacyjne do sterylizacji w autoklawie
    1. Umieść krótkie kleszczyki z szeroką końcówką w samouszczelniających się woreczkach sterylizacyjnych (1 na mysz), zlewkach polipropylenowych o pojemności 600 ml (1 na mysz) i parze długich kleszczyków w torbie bezpiecznej dla autoklawu i sterylizuj w autoklawie 1 dzień przed zabiegiem pobierania kału.
    2. Niezwłocznie po wyjęciu worka z autoklawu należy zakleić worek taśmą pakową i przechowywać do następnego dnia.
  2. Przygotowanie probówki z podłożem konserwującym
    1. Wybierz pożywkę chroniącą żywotność beztlenową (tutaj użyto Cary'ego Blaira). Porcję 1 ml pożywki konserwującej do sterylnych, zakręcanych probówek o pojemności 2 ml w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dla optymalnej konserwacji zaleca się stosunek kału do podłoża 1:10.
    2. Każdą probówkę należy wstępnie oznaczyć trwałym markerem, ale należy pamiętać, że narażenie na sterylizator z dwutlenkiem chloru może usunąć trwałe etykiety markerowe z powierzchni plastikowych. Inną metodą jest pozostawienie probówek nieoznakowanych i poproszenie asystenta o etykietowanie probówek natychmiast po pobraniu przed zamrożeniem.
    3. Umieść te probówki w standardowym stojaku na probówki z polipropylenu, aby umożliwić przechowywanie probówek w pozycji pionowej, a jednocześnie umożliwić sterylizację przez kontakt ze środkiem sterylizującym z dwutlenkiem chloru.
  3. Klatki do sterylizacji i szafa bezpieczeństwa biologicznego
    1. Powtórz kroki 2 i 3, aby wysterylizować klatki izologiczne i komorę bezpieczeństwa biologicznego. Ponownie należy upewnić się, że w ciągu 30 minut od wyjęcia stojaka każda izoklatka zostanie umieszczona w wysterylizowanym kapturze, a pokrywa zostanie odpowietrzona, aby umożliwić przepływ powietrza do myszy.
    2. Dodatkowo wysterylizuj autoklawowaną torbę i stojak zawierający przygotowane probówki poprzez nasycenie dwutlenkiem chloru i sterylizatorem i umieść je w nasączonej plastikowej torbie zawierającej klatki. Celem jest pełny kontakt cieczy ze wszystkimi powierzchniami każdej rurki i samym stojakiem.
  4. Pobieranie i przechowywanie próbek kału
    1. Po zakończeniu 20-minutowego okresu sterylizacji przenieś izoklatki, autoklawowane materiały eksploatacyjne i stojak na probówki do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Przebij autoklawowaną torbę z zaopatrzeniem, dociskając ją do zawartych w niej długich kleszczy, wyjmij zapasy i wyrzuć worek na zewnątrz kaptura.
    2. Załóż nowy sterylny fartuch chirurgiczny i sterylne rękawice chirurgiczne zamiast rękawic odpornych na chemikalia, aby zapobiec kontaktowi resztek sterylizatora z dwutlenkiem chloru z myszami. W razie potrzeby poproś asystenta o pomoc w tym procesie.
    3. Przygotuj kleszcze z końcówką, odwijając woreczki i używając wewnętrznej powierzchni woreczka jako sterylnego obszaru. Umieść stojak na probówki na powierzchni okapu bezpieczeństwa biologicznego.
    4. Za pomocą długich kleszczy chwyć podstawę ogona pojedynczej myszy w klatce i umieść je bezpośrednio w jednym ze wysterylizowanych kubków w celu obserwacji. Powtórz ten proces dla każdej myszy w klatce.
    5. Obserwuj myszy, dopóki nie zostaną wyprodukowane co najmniej dwie świeżo przekazane granulki kału.
      1. Za pomocą kleszczyków z końcówką podnieś granulki kału i umieść je bezpośrednio w probówce. Natychmiast uszczelnij zakrętkę, pokrywę i przekaż ją asystentowi.
      2. Poproś asystenta, aby oznaczył rurkę i natychmiast homogenizował stolec poprzez wirowanie. Po uzyskaniu jednorodności probówkę należy zatrzaskowo zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać przez długi czas w temperaturze -80 °C.
    6. Powtórz proces zbierania kału dla każdej myszy w klatce. Po zebraniu kału umieść każdą mysz w klatce domowej i ponownie zadokuj klatki na stojaku. Powtórz krok 4.4, aby wyczyścić okap i wyrzucić odpady.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie próbki kału, zebrane według fenotypu odpowiadającego na ICI i niereagującego (wcześniej opisanego w protokole), zostały przeniesione do mieszanych płci myszy GF-WT umieszczonych w 3 izoklatkach na grupę (n = 1-2 myszy / klatka, n = 6 dla odpowiadającego i n = 5 dla niereagującego). Myszom pozwolono zaaklimatyzować się przez 1 tydzień po przeniesieniu. Następnie pobrano próbki kału od tych myszy (warunki wolne od zarazków). Myszy następnie poddano badaniu 1 × 107 CFU z ludzkimi kałami zebranymi przez os...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół zapewnia powtarzalną, bardzo szczegółową metodę humanizacji myszy wolnych od zarazków trzymanych w eksperymentalnych izoklatkach. Możliwość wyłącznego przeszczepiania kału od ludzi do mysich gospodarzy jest nieoceniona w badaniach nad mikrobiomem. Bez zanieczyszczenia mikrobiotą komensalną specyficzną dla myszy można badać wpływ bakterii rezydujących u ludzi na różne stany zdrowia i choroby lub wpływ interwencji, takich jak dieta lub podawanie leków, na mikrobiotę człowieka 16,17,18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni Wydziałowi Usług Wolnych od Zarazków UF Animal Care Services za pomoc w hodowli gnotobiotyków, dr Brooke Bloomberg i dr Laurze Eurell za pomoc weterynaryjną i IACUC oraz Josee Gauthier za pomoc w sekwencjonowaniu genu 16S rRNA. Badania te były częściowo wspierane przez UF Health Cancer Center Funds (C.J.) i UF Department of Medicine Gatorade Fund (C.J.). R.Z.G. został wsparty ze środków UF Health Cancer Center. R.C.N. był wspierany przez National Institutes of Health TL1 Training Grant na Uniwersytecie Florydy (TL1TR001428, UL1TR001427), National Cancer Institute of the National Institutes of Health Team-Based Interdisciplinary Cancer Research Training Program T32CA257923 oraz UF Health Cancer Center. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez UF Health Cancer Center, wspierane częściowo przez środki stanowe przewidziane w Fla. Stat. § 381.915 oraz National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer P30CA247796. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health lub stanu Floryda. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sterylna strzykawka BD Slip Tip 1 mLFisher Scientific309659
2,0 ml Rurka z nakrętką, bez radełkowania, z listwą podłogową, naturalna, sterylna rurka E-Beam z dołączoną nasadkąFisher Scientific14-755-228
36 x 32 x 48 "3 Mil Gusset Poly BagsUlineS-13455
5-galonowy zbiornik aktywatora sterylizatora dwutlenku chloru Exspor Ecolab6301680
zbiornik o pojemności 5 galonów na bazie sterylizatora dwutlenku chloru Exspor Ecolab6301194
Zlewki polipropylenowe 600 mlFisher ScientificS01914
Pościel ALPHA-driShepherd Specialty Papers
Komora anaerobowaProdukty Coy LabTyp B
Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasa 2Certyfikowany przez Nuaire
autoklawowalny filtr HEPA IsoCage XT Extreme TemperatureTecniplast1245ISOFHXT
Przezroczyste soczewki LPX IQuity Gogle ochronne Mocowanie922205455
DuPont  Tyvek  Tuleja - 18"UlineS-13893E
DWK Nauki Przyrodnicze DURAN 45 mm Nasadka z kauczuku naturalnego wciskanaFisher Scientific01-258-107Gumowa nakrętka do butelek autoklawu 1 L
Butelki z opryskiwaczem HDPE Dynalon Quick MistFisher Scientific03-438-12B
Cylindry z podziałką polipropylenową FisherScientific03-007-44
Ryby  Kleszcze preparacyjne o zaostrzeniuFisher Scientific08-887
Fisherbrand Woreczki do sterylizacji z natychmiastowym uszczelnieniemFisher Scientific01-812-51
Kleszcze do zastosowań ogólnych Fisherbrand Straight, Szeroka, Mocna Fisher Scientific16-100-107
Marka rybacka  Bezołowiowa taśma autoklawuFisher Scientific15-901-110
Igła do gaźniaka, wielokrotnego użytku ze stali nierdzewnej. Prosty. Igła o rozmiarze 22, średnica końcówki 1,25 mm, długość 38 mm lub 1,5 cala (doz)Braintree ScientificN-PK 020
H-B Instrument Durac TimerFisher Scientific13-202-015
IsoPositive Klatki i stojaki (tj. izoklatki)Tecniplast   Klatki ISO30P30 (6 szer. x 5 wys.), jednostronne
rękawice odporne na chemikalia nitrylowe Rozmiar S (7), M (8) lub L (9) 18" długości, 22 mil,Grainger4T426
średnie, niesterylne, bezpudroweMedSupply PartnersKG-1101M
Oliwka / Purpurowy bagnet Gaz & Wkłady parowe / filtr cząstek stałych 2Ct   3M/Fastenal50051138541878
Poliwęglan RadDisk Mini dla myszy 8-75 x 4BraintreeScientific IRD-P M
Polipropylenowe czapki Bouffant - 24", niebieskieUlineS-10480BLU
Puritan Cary-Blair Medium, 5 mlFisher Scientific22-029-646
S, M i L Niebieska silikonowa dwutrybowa półmaska na głowę z uprzężą na głowę   3M/Fastenal50051131370826
Sgpf Series Sterylne bezpudrowe rękawice lateksowe, CT International, Grubość = 6.5 mm, Długość = 30.5 cm (12), Rozmiar rękawicy = 8.5, Kolor rękawicy = BiałyFisher Scientific18-999-102F
Antypoślizgowy pokrowiec na butyUline  S-25639
Fartuch chirurgiczny, ręcznik, sterylny, duży, 32/csThomas ScientificKIM 95111
Teklad Global 18% białkowa dieta dla gryzoni ekstrudowana (sterylizowalna) Inotiv2018SX
Thermo Scientific Nalgene Wytrzymały prostokątny zbiornik LLDPE z pokrywą (objętość 20 l)Thermo Scientific14-831-330J
VERIFY Dwugatunkowe samodzielne wskaźniki biologiczneSterisHealthcare S3061
WypAll L40 1⁄ Wycieraczki 4-krotneUlineS-8490
Rękawice nitrylowe Ansell ,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, J. C., Im, S. -H. Of men in mice: the development and application of a humanized gnotobiotic mouse model for microbiome therapeutics. Exp Mol Med. 52 (9), 1383-1396 (2020).
  2. Li, F., et al. Microbiome remodelling leads to inhibition of intestinal farnesoid X receptor signalling and decreased obesity. Nat Commun. 4, 2384(2013).
  3. Schwabe, R. F., Jobin, C. The microbiome and cancer. Nat Rev Cancer. 13 (11), 800-812 (2013).
  4. Wen, L., et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).
  5. Gray, S. M., et al. Mouse adaptation of human inflammatory bowel diseases microbiota enhances colonization efficiency and alters microbiome aggressiveness depending on recipient colonic inflammatory environment. Microbiome. 12 (1), 147(2024).
  6. Gopalakrishnan, V., et al. Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients. Science. 359 (6371), 97-103 (2018).
  7. Matson, V., et al. The commensal microbiome is associated with anti-PD-1 efficacy in metastatic melanoma patients. Science. 359 (6371), 104-108 (2018).
  8. Routy, B., et al. Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors. Science. 359 (6371), 91-97 (2018).
  9. Paik, J., et al. Potential for using a hermetically-sealed, positive-pressured isocage system for studies involving germ-free mice outside a flexible-film isolator. Gut Microbes. 6 (4), 255-265 (2015).
  10. Hecht, G., et al. A simple cage-autonomous method for the maintenance of the barrier status of germ-free mice during experimentation. Lab Anim. 48 (4), 292-297 (2014).
  11. Dremova, O., et al. Sterility testing of germ-free mouse colonies. Front Immunol. 14, 1275109(2023).
  12. Newsome, R. C., et al. Interaction of bacterial genera associated with therapeutic response to immune checkpoint PD-1 blockade in a United States cohort. Genome Med. 14 (1), 35(2022).
  13. Le Roy, T., et al. Comparative evaluation of microbiota engraftment following fecal microbiota transfer in mice models: age, kinetic and microbial status matter. Front Microbiol. 9, 3289(2018).
  14. Lebeuf, M., et al. Contaminants and where to find them: microbiological quality control in axenic animal facilities. Front Microbiol. 12, (2021).
  15. He, Z., et al. Campylobacter jejuni promotes colorectal tumorigenesis through the action of cytolethal distending toxin. Gut. 68 (2), 289-300 (2019).
  16. Wu, G. D., et al. Linking long-term dietary patterns with gut microbial enterotypes. Science. 334 (6052), 105-108 (2011).
  17. Ross, F. C., et al. The interplay between diet and the gut microbiome: implications for health and disease. Nat Rev Microbiol. 22 (11), 671-686 (2024).
  18. Maier, L., et al. Extensive impact of non-antibiotic drugs on human gut bacteria. Nature. 555 (7698), 623-628 (2018).
  19. Walter, J., Armet, A. M., Finlay, B. B., Shanahan, F. Establishing or exaggerating causality for the gut microbiome: Lessons from human microbiota-associated rodents. Cell. 180 (2), 221-232 (2020).
  20. Berland, M., et al. High engraftment capacity of frozen ready-to-use human fecal microbiota transplants assessed in germ-free mice. Sci Rep. 11 (1), 4365(2021).
  21. Choo, J. M., Rogers, G. B. Establishment of murine gut microbiota in gnotobiotic mice. iScience. 24 (2), 102049(2021).
  22. Bokoliya, S. C., Dorsett, Y., Panier, H., Zhou, Y. Procedures for fecal microbiota transplantation in murine microbiome studies. Front Cell Infect Microbiol. 11, 711055(2021).
  23. Li, Y., Cao, W., Gao, N. L., Zhao, X. -M., Chen, W. -H. Consistent alterations of human fecal microbes after transplantation into germ-free mice. Genomics Proteomics Bioinformatics. 20 (2), 382-393 (2022).
  24. Turnbaugh, P. J., Ridaura, V. K., Faith, J. J., Rey, F. E., Knight, R., Gordon, J. I. The effect of diet on the human gut microbiome: a metagenomic analysis in humanized gnotobiotic mice. Sci Transl Med. 1 (6), 6ra14(2009).
  25. Staley, C., et al. Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning. Microbiome. 5 (1), 87(2017).
  26. Lebeuf, M., Turgeon, N., Faubert, C., Robillard, J., Paradis, É, Duchaine, C. Managing the bacterial contamination risk in an axenic mice animal facility. Can J Microbiol. 67 (9), 657-666 (2021).
  27. Basic, M., et al. Monitoring and contamination incidence of gnotobiotic experiments performed in microisolator cages. Int J Med Microbiol. 311 (3), 151482(2021).
  28. Amorim, N., et al. Refining a protocol for faecal microbiota engraftment in animal models after successful antibiotic-induced gut decontamination. Front Med. 9, 770017(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przeszczep ka u od cz owiekatransfer mikrobiomumyszy zhumanizowanesterylizator do dwutlenku chlorukomora z laminarnym przep ywem powietrzagavage zawiesiny ka owejstruktura spo eczno ci mikrobiologicznejmysi model nowotworu

Powiązane artykuły