Regulacja chemogenetyczna w przeprogramowanych komórkach prekursorowych pochodzących z komórek macierzystych w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych

Summary

Tutaj opisujemy protokół inżynierii chemicznie przeprogramowanych komórek macierzystych w celu osiągnięcia precyzyjnej modulacji neuronalnej poprzez różnicowanie tych komórek w dopaminergiczne komórki prekursorowe, przeszczepianie ich do mysich modeli choroby Parkinsona oraz ocenę wyników behawioralnych i elektrofizjologicznych w celu potwierdzenia udanej integracji i funkcjonalnej skuteczności przeszczepionych komórek.

Abstract

Integracja receptorów projektanta aktywowanych wyłącznie przez (DREADD) z terapiami opartymi na komórkach macierzystych przedstawia zaawansowaną strategię precyzyjnej modulacji neuronów. W tym przypadku wykorzystaliśmy zmodyfikowane przez CRISPR ludzkie przeprogramowane komórki macierzyste eksprymujące pobudzające (hM3Dq) lub hamujące (hM4Di) receptory DREADD, aby ocenić funkcjonalną integrację i modulację przeszczepionych prekursorów dopaminergicznych w mysim modelu choroby Parkinsona (PD). Kluczowe kroki obejmowały wygenerowanie niefuzyjnych linii komórek macierzystych z ekspresją DREADD, różnicowanie ich w prekursory dopaminergiczne śródmózgowia i przeszczepienie tych komórek do prążkowia myszy z uszkodzeniem 6-hydroksydopaminą (6-OHDA). Przeprowadziliśmy oceny behawioralne i zapisy elektrofizjologiczne, aby przeanalizować efekty przeszczepionych komórek. Testy behawioralne, takie jak test cylindryczny, wykazały znaczną modulację funkcji motorycznych po podaniu N-tlenku klozapiny (CNO). W szczególności aktywacja hM4Di zmniejszyła przeciwległy ruch kończyn przednich, podczas gdy aktywacja hM3Dq wiązała się ze zwiększonym zachowaniem motorycznym. Zapisy elektrofizjologiczne ujawniły wyraźne reakcje synaptyczne. Aktywacja hM4Di zwiększała interwały międzyzdarowe i zmniejszała amplitudy szczytowe spontanicznych pobudzających prądów postsynaptycznych (sEPSC), podczas gdy aktywacja hM3Dq zmniejszała interwały międzyzdarciowe i zwiększała amplitudy pików, odzwierciedlając wzmocnioną sygnalizację pobudzającą. Podsumowując, integracja ocen behawioralnych i elektrofizjologicznych potwierdza precyzyjną funkcjonalną inkorporację zmodyfikowanych, chemicznie przeprogramowanych komórek macierzystych do obwodów nerwowych gospodarza.

Introduction

Receptory projektanta aktywowane wyłącznie przez (DREADD) to zmodyfikowane receptory sprzężone z białkiem G, które mogą być selektywnie aktywowane przez obojętne syntetyczne ligandy¹. Podejście chemogenetyczne stało się podstawowym narzędziem w neurobiologii, umożliwiając naukowcom badanie połączeń obwodów neuronowych z dużą precyzją i zwiększając nasze zrozumienie funkcji komórkowych zarówno in vivo, jak i in vitro poprzez selektywną aktywację lub hamowanie określonych regionów mózgu lub typów komórek^2,3.

Terapia oparta na komórkach macierzystych stanowi obiecującą strategię leczenia chorób neurodegeneracyjnych. Skuteczność przeszczepionych komórek zależy od prawidłowej integracji, przeżycia i funkcjonalnego wkładu w tkanki gospodarza. Niekontrolowana aktywność komórkowa może prowadzić do negatywnych konsekwencji, w tym nowotworzenia⁴; co wymaga precyzyjnej kontroli tych komórek po przeszczepie. Wykorzystanie technologii DREADD w ludzkich przeprogramowanych komórkach macierzystych i pochodnych neuronach zapewnia środki do precyzyjnej kontroli aktywności neuronalnej poprzez podawanie CNO^2,5. W kontekście choroby Parkinsona (PD), która charakteryzuje się utratą neuronów dopaminergicznych, manipulowanie aktywnością neuronów dopaminergicznych pochodzących z komórek macierzystych ma kluczowe znaczenie dla badania ich danych synaptycznych i wzorców projekcji w modelach gryzoni^6,7,8,9,10. Włączenie pobudzających receptorów hM3Dq i hamujących hM4Di do tych modeli umożliwia precyzyjną modulację aktywności neuronalnej^11,12.

Połączenie ocen behawioralnych zwierząt i zapisów elektrofizjologicznych pozwala na kompleksową ocenę wpływu modulacji chemogenetycznej na przeszczepione komórki in vivo¹³. Oceny behawioralne, w tym rotacja wywołana apomorfiną, test cylindra i test rotarod, oceniają koordynację ruchową i dostarczają wglądu w zmiany w funkcjach motorycznych związane z eksperymentalnymi modelami PD¹⁴. Techniki elektrofizjologiczne, takie jak zapisy patch-clamp, umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym odpowiedzi synaptycznych i potencjałów czynnościowych, zapewniając kompleksowy wgląd w to, jak przeszczepione komórki integrują się z istniejącymi sieciami neuronowymi¹⁵. Łącząc oceny behawioralne z ocenami elektrofizjologicznymi, możemy zbadać, w jaki sposób modulacja chemogenetyczna wpływa na integrację i funkcjonalność tych komórek w obwodach nerwowych gospodarza¹⁶. Wstępne wyniki sugerują, że podawanie CNO skutecznie moduluje aktywność neuronalną w przeszczepionych komórkach, co skutkuje lepszymi wynikami funkcjonalnymi w modelach zwierzęcych.

W tym protokole, ludzkie przeprogramowane komórki macierzyste zostały zaprojektowane tak, aby wyrażały receptory hM3Dq lub hM4Di za pomocą technologii CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats). Po różnicowaniu zmodyfikowanych, przeprogramowanych komórek macierzystych w dopaminergiczne komórki prekursorowe śródmózgowia, komórki te przeszczepiono do mysich modeli PD w celu oceny ich integracji i regulacji funkcjonalnej w obwodach nerwowych gospodarza przy użyciu ocen behawioralnych i zapisów elektrofizjologicznych.

Protocol

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi określonymi przez Pekińskie Stowarzyszenie Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi oraz Narodowe Instytuty Zdrowia ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych. Ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) uzyskano od zdrowego dawcy za pisemną świadomą zgodą, jak opisano w poprzednim badaniu¹⁷.

1. Budowa niefuzyjnych linii komórkowych opartych na komórkach macierzystych DREADD

1. Zbuduj plazmid dawcy DREADD.
   UWAGA: Miejsca trawienia powinny być zaprojektowane zgodnie z sekwencją wektorów. Fragmenty powinny być syntetyzowane i amplifikowane z zakładkami 20-30 pz dopasowanymi do ramion fragmentów w celu zwiększenia wydajności montażu.
   1. Zaprojektuj i zsyntetyzuj fragment T2A-ZsGreen (Fragment I).
   2. Amplifikować fragment hM3Dq / hM4Di-T2A z oryginalnego plazmidu za pomocą PCR (fragment II). Ustaw reakcję PCR (całkowita objętość 50 μl) tak, aby zawierała 1x bufor PCR, 200 μM każdej mieszaniny dNTP, 0,5 μM starterów do przodu i do tyłu, 10-50 ng matrycy plazmidowego DNA i 1,25 U polimerazy DNA o wysokiej wierności. Przeprowadzić termocykl w następujących warunkach: wstępna denaturacja w temperaturze 98 °C przez 2,75 minuty w celu pełnej denaturacji matrycy; 32 cykle amplifikacji, składające się z 98 °C przez 15 s (denaturacja), 60 °C przez 30 s (wyżarzanie startera) i 72 °C przez 60 s (przedłużenie); końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 7 min.
   3. Strawić plazmid wektorowy odpowiednim enzymem, aby uzyskać wektor zlinearyzowany. Oczyścić wszystkie fragmenty za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i oznaczyć je ilościowo za pomocą spektrofotometru.
      UWAGA: Tutaj oryginalny plazmid został strawiony za pomocą MluI i SalI.
2. Delikatnie wymieszaj 50-100 ng zlinearyzowanego wektora, Fragmentu I i Fragmentu II w stosunku molowym 1:3:3, wraz z 2x Mieszanką Klonowania. Inkubować mieszaninę w temperaturze 55 °C przez 1 godzinę, aby ułatwić rekombinację homologiczną za pomocą zespołu Gibsona.
3. Wstaw przewodnik RNA ukierunkowany na miejsce AAVS1 do miejsca BbsI wektora pX458.
   UWAGA: Przeprowadź weryfikację sekwencji na wszystkich skonstruowanych plazmidach za pomocą sekwencjonowania Sangera.
4. Utrzymuj przeprogramowane komórki macierzyste w pożywce, dążąc do gęstości komórek 2-5 × 10⁶ komórek/ml.
   UWAGA: Przeprogramowane komórki macierzyste użyte tutaj zostały wyindukowane z ludzkich PBMC, jak opisano w poprzednim badaniu¹⁷. Monitorowanie stanu ogniw jest niezbędne, ponieważ stan ogniw znacząco wpływa na wydajność elektroporacji. Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z porównaniem nośników.
5. Wymieszaj 2-5 × 10⁶ komórek, po 2 μg każdego plazmidu dawcy (hM4Di-T2A-ZsGreen lub hM3Dq-T2A-ZsGreen) i 2 μg plazmidu gRNA w 100 μl buforu do elektroporacji i przenieś do kuwety w celu elektroporacji.
   UWAGA: Upewnij się, że mieszanina jest dobrze wymieszana i wolna od pęcherzyków przed przystąpieniem do elektroporacji. Zoptymalizuj parametry elektroporacji w zależności od typu ogniwa, aby zmaksymalizować wydajność transfekcji, ponieważ różne urządzenia mogą wymagać określonych regulacji.
6. Ustaw Nucleofector na program B16 i zainicjuj elektroporację, aby ułatwić wydajną transfekcję docelowych iNSC.
7. Dodać 1 ml 50 μg/ml poli-D-lizyny (PDL) do każdego dołka na 6-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny. Usunąć cały PDL z dołków i dodać 1,5 ml lamininy o stężeniu 5 μg/ml do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-4 godziny. Pokrytą płytkę należy natychmiast użyć lub przechowywać w temperaturze 2-8 °C przez 1 tydzień.
8. Przenieś elektroporowane ogniwa na sześciodołkowe płytki, które zostały pokryte PDL i lamininą. Rozprowadź około 500 000 komórek na studzienkę w objętości 2 ml pożywki hodowlanej na studzienkę.
9. Po 72 godzinach elektroporacji użyj cytometru przepływowego, aby posortować fluorescencyjne komórki dodatnie.
   1. Ponownie zawiesić zdysocjowane komórki w DPBS i przefiltrować przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm.
   2. Skonfiguruj sorter z kanałem FITC do wykrywania ZsGreen. Włączyć niepoddane działaniu iNSC jako kontrole ujemne w celu określenia fluorescencji wyjściowej.
   3. Skalibruj przyrząd za pomocą dysz 100 μm przy ciśnieniu w osłonie 20 psi. Zaimplementuj czterokierunkowy tryb sortowania czystości z potwierdzeniem pojedynczej komórki.
10. Umieść pojedyncze komórki ZsGreen⁺ na 96-dołkowych płytkach wstępnie pokrytych PDL i lamininą, a następnie dodaj 200 μl pożywki hodowlanej na basenik, aby wspomóc początkowy wzrost. Przechowywać w pożywce hodowlanej przez 7-14 dni
    UWAGA: Codziennie monitoruj studzienki pod kątem oznak wzrostu i fluorescencji wskazujących na udaną integrację i oznaczaj studzienkę dodatnią.
11. Wyizolować pojedyncze klony wykazujące fluorescencję za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w zestaw filtrów GFP. Klony ekranu przy 10-krotnym powiększeniu. Oznacz studzienki zawierające kolonie monoklonalne trwałym, jednolitym sygnałem ZsGreen. Rejestruj obrazy jasnego pola i fluorescencji, aby udokumentować morfologię i intensywność fluorescencji.
    UWAGA: Przed obrazowaniem wymień świeże podłoże, aby zmniejszyć fluorescencję tła. Wyklucz kolonie o nieregularnej morfologii lub autofluorescencji.
12. Rozpręż komórki dodatnie na powlekanych płytkach 48-dołkowych. Następnie podziel na dwie części, jedną dla hodowli, a drugą dla genotypowania.
13. Ekstrakcja genomowego DNA z potencjalnych klonów. Przygotuj reakcje PCR z dwiema parami starterów: jedną parą w celu potwierdzenia insercji genu będącego przedmiotem zainteresowania, drugą starterem w celu rozróżnienia klonów homozygotycznych i heterozygotycznych. Przeprowadzić cykl termiczny w następujących warunkach: wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 5 min; 38 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 45 s; końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 7 min. Rozwiąż produkty PCR na 2% żelu agarozowym.
    UWAGA: Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z podkładami. Potwierdź insercję interesującego genu za pomocą pojedynczego pasma 650 pz (starter 1). Zidentyfikuj heterozygotyczne klony na podstawie obecności pojedynczego prążka 630 pz, a klony homozygotyczne na podstawie braku tego pasma (starter 2).
14. Rozpręż dodatnie komórki na powlekanych płytkach sześciodołkowych.
15. Roztrawić komórki i umyć je w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez odwirowanie w stężeniu 250 × g przez 3 minuty. Zamrażać komórki w pożywce do kriokonserwacji z 10% DMSO o gęstości 2,5 × 10⁶ komórek w fiolce.

2. Przeszczepiono komórki prekursorowe pochodzące z komórek macierzystych DREADD do myszy modelowych PD

1. Podać dootrzewnowe wstrzyknięcie dezypraminy w stężeniu 5 mg/ml (10 mg/kg) myszom z niedoborem odporności 30 minut przed zabiegiem. Znieczulić myszy 2% izofluranem.
2. Przeprowadzić jednostronne stereotaktyczne wstrzyknięcia 3 μl 6-hydroksydopaminy (6-OHDA, 5 μg/μL). Celuj w prawe ciało prążkowia przy użyciu następujących współrzędnych: przednio-tylny = 0,5 mm, boczny = 2,1 mm i pionowy = -3,2 mm.
   UWAGA: 6-OHDA należy rozpuścić w roztworze soli fizjologicznej zawierającym 0,2% kwasu askorbinowego. Zapewnij precyzyjne ukierunkowanie, aby zminimalizować zmienność nasilenia zmian.
   UWAGA: 6-OHDA jest cytotoksyczny i wytwarza reaktywne formy tlenu, które indukują stres komórkowy. Obchodź się ostrożnie.
3. Podać dootrzewnowe wstrzyknięcie apomorfiny (1 mg/kg, 0,5 mg/ml rozpuszczonej w soli fizjologicznej) w celu potwierdzenia zmian 4 tygodnie po operacji. Wybierz myszy z uszkodzeniami, które wykazują ponad 100 przeciwległych obrotów w ciągu 30-minutowego okresu obserwacji, do kolejnych eksperymentów.
   UWAGA: Apomorfina jest agonistą receptora dopaminowego, który bezpośrednio aktywuje superwrażliwe receptory postsynaptyczne w odnerwionym prążkowiu, zaburzając równowagę obustronnej aktywności obwodu nigrostriatalnego. Rotacja indukowana apomorfiną służy do oceny nasilenia jednostronnych zmian dopaminergicznych przez 6-OHDA.
4. Komórki nasienne i hodowlane w powlekanych płytkach sześciodołkowych (150 000 komórek na dołek). Inkubować w pożywce różnicującej fazy 1 przez 10 dni, odświeżając pożywkę co 2 dni. W dniu 11 należy przejść na pożywkę różnicującą fazy 2 i kontynuować inkubację do dnia 13, zmieniając pożywkę każdego dnia.
   UWAGA: Patrz Tabela materiałów w celu porównania podłoża różnicującego.
5. Zbierz komórki w 10 i 13 dniu różnicowania, a następnie wymieszaj je w stosunku 1:7. Zawiesić mieszaninę w buforze do przeszczepu w stężeniu 100 000 komórek/μL.
   UWAGA: Patrz Tabela materiałów w celu porównania bufora do przeszczepów.
6. Podać stereotaktyczne wstrzyknięcie całkowitej objętości 4 μl przygotowanej zawiesiny komórkowej do myszy z chorobą Parkinsona.
7. Wykonaj test cylindryczny w różnych punktach czasowych po przeszczepie komórek. Umieść szklaną zlewkę (średnica: 20 cm, wysokość: 30 cm) na płaskiej, nieodbijającej światła powierzchni. Umieść kamerę z widokiem z góry nad cylindrem, aby uchwycić pełną średnicę.
   UWAGA: Owiń cylinder czarnymi zasłonami, aby wyeliminować zewnętrzne bodźce wzrokowe.
8. Umieść każdą mysz na środku cylindra i rozpocznij jednoczesne nagrywanie wideo (3 min/sesję). Po zakończeniu sesji umieść mysz z powrotem w klatce domowej.
   UWAGA: Zaaklimatyzuj myszy w pomieszczeniu testowym przez 30 minut w warunkach oświetleniowych. Wyczyść cylinder 70% etanolem między próbami, aby wyeliminować sygnały węchowe.
9. Oceń zdolność ruchową kończyn górnych myszy przez 3 minuty. Oblicz liczbę kontaktów ze ścianą wykonanych przez upośledzoną kończynę przednią w stosunku do całkowitej liczby kontaktów wykonanych przez obie kończyny przednie.
10. Podawać sól fizjologiczną lub CNO w dawce 1,2 mg/kg mc. we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Przeprowadź test cylindra, aby ocenić modulację behawioralną w modelu myszy PD po podaniu CNO
    UWAGA: Przed przystąpieniem do oceny należy odczekać około 40 minut na regenerację.

3. Profilowanie elektrofizjologiczne in vivo komórek modulowanych chemicznie

1. Znieczulić myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 250 mg/kg pentobarbitalu. Usuń mózg i natychmiast umieść go w lodowatym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym na bazie sacharozy (s-ACSF), aby zachować integralność komórkową. Za pomocą wibratomu pokrój mózg na sekcje o grubości 300-400 μm.
   UWAGA: Pracuj szybko, aby utrzymać mózg w niskich temperaturach, aby zachować funkcje komórkowe. Patrz tabela materiałów dla s-ACSF stosowanego w preparowaniu świeżych wycinków mózgu.
2. Przenieść próbki do komory wypełnionej ACSF o zrównoważonym stężeniu 95%_O2 i 5% CO₂ w temperaturze 34 °C, upewniając się, że ta temperatura jest utrzymywana przez cały czas trwania doświadczenia.
   UWAGA: Patrz tabela materiałów dla ACSF.
3. Załaduj szklane pipety lodowatym roztworem wewnątrzkomórkowym, o rezystancji elektrod w zakresie od 7 do 10 MΩ,
   UWAGA: Zobacz tabelę materiałów dla roztworu wewnątrzkomórkowego. Pipety szklane są wykonane ze szklanych kapilar za pomocą ściągacza do mikropipet¹⁸. Przed rozpoczęciem eksperymentów sprawdź, czy szklane pipety nie przeciekają, upewniając się, że końcówki są wystarczająco ostre, aby przeniknąć przez błonę komórkową. Szybko przygotuj pipety, aby zminimalizować wahania temperatury w roztworze wewnątrzkomórkowym.
4. Umieścić plastry w zanurzonej komorze rejestracyjnej przekrwione (2 ml/min) natlenionym ACSF w temperaturze 34 °C. Umieścić pipety za pomocą mikromanipulatorów z napędem silnikowym pod mikroskopią kontrastową z różnicowymi zakłóceniami w podczerwieni. Ustal konfigurację całej komórki, stosując delikatne ssanie (opór > 1 GΩ) do połatanych neuronów w regionach przeszczepu. Ogniwa cęgowe przy napięciu -70 mV za pomocą wzmacniacza krosowego; nabierz podstawowe sEPSC przez 8 minut przy częstotliwości próbkowania 10 kHz (filtrowane przy 2 kHz) i stale monitoruj rezystancję dostępu (cel: <20 MΩ; odrzucić, jeśli >25 MΩ lub wahania >10%).
   UWAGA: Podczas ssania należy stosować odpowiedni nacisk, aby uniknąć niepożądanego przemieszczenia lub pęknięcia komórek, a następnie ostrożnie wyregulować pozycję pipety, aby uzyskać dobre uszczelnienie. Jeśli jakość zgrzewu jest niska, wyrzuć pipetę i spróbuj ponownie.
5. Dodać 50 μM CNO do komory rejestracyjnej natychmiast po zakończeniu pomiaru podstawowego i kontynuować rejestrację danych przez dodatkowe 16 minut, obserwując zmiany częstotliwości lub amplitudy sEPSC.
6. Przeprowadzić procedurę wymłukiwania, zastępując roztwór CNO świeżym ACSF, aby skutecznie usunąć CNO z komory rejestracyjnej. Kontynuuj rejestrowanie danych przez pozostałą część eksperymentu, aby ocenić ewentualne odzyskanie aktywności synaptycznej.

Results

Rysunek 1 pokazuje kluczowe etapy tego metodologicznego podejścia do zmodyfikowanych ludzkich przeprogramowanych komórek macierzystych wyrażających pobudzające (hM3Dq) lub hamujące (hM4Di) receptory DREADD w celu oceny funkcjonalnej integracji i modulacji pochodnych prekursorów dopaminergicznych w mysim modelu choroby Parkinsona (PD). Rysunek 2 przedstawia strategię wprowadzania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 do wprowadzania niefuzyjnych konstruktów hM4Di-T2...

Discussion

W protokole tym wykorzystano technologię CRISPR do inżynierii ludzkich przeprogramowanych komórek macierzystych w celu ekspresji pobudzających receptorów hM3Dq i hamujących hM4Di. Modulację aktywności neuronalnej za pomocą CNO oceniano poprzez przeszczep komórek do mysich modeli choroby Parkinsona, którym towarzyszyły oceny behawioralne i zapisy elektrofizjologiczne.

Pierwszym krytycznym krokiem w generowaniu stabilnie eksprymowanych, niefuzyjnych konstruktów DREADD w chemogenicznie przeprogra...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Rapid Taq Master Mix	Vazyme	P222-01	używany do analizy genotypowania
2 razy; Bezproblemowa mieszanka klonowania Biomed	Gene Tech.	CL117-01	używany do budowy plazmidu
6-OHDA	Sigma-Aldrich	H4381	używany do ustanawiania modelu myszy PD
AAVS1-Pur-CAG-EGFP	Addgene	80945	używany jako kontrola
AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry	Addgene	80947	oryginalny plazmid do budowy hM4Di-T2A-ZsGreen
AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherry	Addgene	80948	oryginalny plazmid do budowy hM3Dq-T2A-ZsGreen
AAVS1-CAG-hM4Di-T2A-ZsGreen	N/A	N/A	Skonstruowany plazmid dawcy oparty na #80947
AAVS1-CAG-hM3Dq-T2A-ZsGreen	N/A	N/A	Skonstruowany plazmid dawcy na podstawie #80948
Accutase	Invitrogen	A11105-01	Używany do trawienia komórek
AMAXA Nucleofector	Lonza	AAD-1001S
Apomorfina	Sigma-Aldrich	A4393
Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF)	Nie	Nie	dotyczy125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 25 mM glukozy, i  26 mM Kwas NaHCO3
Askorbinowy Kwas	Sigma-Aldrich	1043003
B-27 Suplement	Gibco	17504044
BDNF	Peprotech	450-02
cAMP	Sigma-Aldrich	D0627
CHIR99021	Yeasen	53003ES10
N-tlenek klozapiny	Enzo	BML-NS105
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Dezypramina	Sigma-Aldrich	D3900
D-glukoza	Sigma-Aldrich	G5767
DMEM/F12	Gibco	11330-032
DMEM/F12	Gibco	11320-033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
FGF8	Peprotech	100-25
GDNF	Peprotech	450-10
GlutaMax	Gibco	35050-061
Motek' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)	Gibco	14175095
Czynnik hamujący białaczkę ludzką (hrLIF)	Milipory	LIF1010
Mrożony płyn wewnątrzkomórkowy	N/A	N/A	130 mM K-glukonian, 16 mM KCl, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 4 mM Na2-ATP, 0,4 mM Na3-GTP, 0,3% neurobiotyny
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028
Laminin	Roche	11243217001
Ściągacz do mikropipet	Sutter Instrument Company	P-1000
N-2 Suplement	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal-A Medium	Gibco	10888-022
Aminokwasy endogenne kwasy (NEAA)	Gibco	11140-050
PBS	Pakiet oprogramowania Gibco	10010023
pCLAMP 11	Urządzenia molekularne	Nie dotyczy	Oprogramowanie do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych z zaciskiem krosowym
Faza 1 pożywka	różnicująca N/A	N/A	96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% suplement B-27, 1% suplement N-2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 1 &mikro; M SAG1 i 100 ng/ml FGF8
Faza 2 różnicowanie pożywki	Nie dotyczy		nie dotyczy 96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% suplement B-27, 1% suplement N-2, 1% NEAA i 1% GlutaMax, 10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml GDNF, 1 ng/mL TGF-β III, 10 i mikro; M DAPT, 0,2 mM kwas askorbinowy i 0,5 mM cAMP.
Bromowodorek poli-D-lizyny (PDL)	Sigma-Aldrich	P7886
Startery do genotypowania	Nie	dotyczy	Insercja Dla Ciebie: TCTTCACTCGCTGGGTTCCCTT; Odwrotny odwrót wstawiania: CCTGTGGGAGGAAGAGAAGAGGT; homozygotyczność Foward: CGTCTCCCTGGCTTTAGCCA; Odwrotność homozygotyczności: GATCCTCTCTGGCTCTCCATCG
pX458	Addgene	152199
SAG1	Enzo	ALX-270-426-M01
SB431542	Yeasen	53004ES50
sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy na bazie sacharozy (s-ACSF)			234 mM sacharoza, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, 11 mM Dglukoza, 0,5 mM CaCl2 i 10 mM Hodowla
komórek macierzystych Media	Nie dotyczy	Nie dotyczy	48% DMEM/F12 (Gibco, 11330-032) i 48% Neurobasal, z dodatkiem 1% B27, 1% N2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 10 ng/mL hrLIF, 2 &mikro; M SB431542 oraz 3 i mikro; M CHIR99021
TGF-β III	Peprotech	100-36E
Bufor transplantacyjny	N/A N	/A	Bufor HBSS z 5 g/L D-glukozy, 100 ng/ml BDNF, 100 ng/mL GDNF i 0,2 mM
wibratome	Leica	VT1000 S
Urządzenia molekularne	do zacisków krosowych na całe komórki	Zacisk MultiClamp700B