Artykuł metodologiczny

Montaż bioreaktora do ciągłej hodowli złożonych zbiorowisk kałowych

DOI:

10.3791/68035

⸱

25 kwietnia 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Florida College of Medicine, 2Department of Medicine, Department of Infectious Diseases and Immunology, Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje montaż układów mini-bioreaktorów, które mają być wykorzystane do hodowli złożonego przepływu złożonych zbiorowisk kałowych w warunkach beztlenowych. Omówiono również metody montażu, inokulacji i pobierania próbek z reaktorów do dalszej analizy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiota, zwłaszcza bakterie, reagują na różne czynniki środowiskowe, takie jak mikro i makroelementy, związki farmakologiczne i mediatory stanu zapalnego, które dynamicznie zmieniają skład społeczności i produkcję metaboliczną mikroorganizmów. Zrozumienie, w jaki sposób fizjologiczne warunki hodowli wpływają na zbiorowiska i różnorodność mikroorganizmów oraz ich zdolność metaboliczną, przyczyni się do zdobycia ważnej wiedzy na temat ich wpływu na zdrowie i choroby. W tym miejscu przedstawiamy protokół zaadaptowany z szablonu opublikowanego przez Auchtung i in. w celu stworzenia układów mini-bioreaktorów, które mogą hodować złożone społeczności kałowe, definiować konsorcja bakterii lub pojedyncze szczepy w precyzyjnych warunkach, w tym dostępności składników odżywczych, temperatury, natężenia przepływu, pH i zawartości tlenu. Opisujemy proces budowy systemu mini-bioreaktora, w tym adaptacje mające na celu poprawę ograniczeń w opublikowanym protokole. Omówiono również konfigurację systemu mini-bioreaktora w warunkach beztlenowych z wykorzystaniem pożywek MEGA (zaadaptowanych z Han i wsp.), które są bogatymi pożywkami wspomagającymi wzrost różnych bakterii. Opisujemy inokulację humanizowanych próbek kału myszy jelitowych do systemu mini-bioreaktora, a następnie ustanowienie złożonych kultur społecznościowych w systemie mini-bioreaktora, które mogą być hodowane w ciągłym przepływie z aseptycznym pobieraniem próbek w celu monitorowania składu społeczności. System ten można dostosować do zmian w diecie i innych modyfikacji kulturowych. Opisane tutaj techniki pozwalają na scharakteryzowanie różnorodnych, wybrednych społeczności kałowych w dynamicznych warunkach lub w odpowiedzi na perturbacje w izolacji od czynników pochodzących od gospodarza.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiota jelitowa to rozległa sieć mikroorganizmów, w tym bakterii, grzybów, archeonów i wirusów, które zawierają ogromny genetyczny i metaboliczny repertuar, który znacznie przewyższa liczebnie ludzki gospodarz1. Bogata zdolność metaboliczna mikrobiomu obejmuje metabolity wytwarzane w wyniku bakteryjnego przetwarzania składników odżywczych w diecie, metabolity gospodarza modyfikowane chemicznie przez bakterie oraz metabolity syntetyzowane unikalnie przez mikrobiotę2. Mikrobiota jest zaangażowana w prawie wszystkie procesy biologiczne gospodarza, ale także w stany chorobowe, takie jak nieswoiste zapalenie jelit, rak, zaburzenia metaboliczne, a nawet zaburzenia neurologiczne2,3. Analiza wpływu mikrobioty na wkład mikrobioty gospodarza ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia roli określonych mikroorganizmów lub złożonych społeczności w zdrowiu i chorobie. Jednym z podejść, które umożliwia tę analizę, jest wykorzystanie bioreaktorów mikrobiologicznych, które hodują różne społeczności drobnoustrojów w dynamicznych warunkach. Istnieje wiele dostępnych na rynku bioreaktorów, które pozwalają na wzrost zbiorowisk bakterii kałowych w niemal każdym celu, w tym do uprawy bioproduktów na dużą skalę lub precyzyjnej kontroli określonych czynników odżywczych w celu badania procesów metabolicznych. Systemy te są jednak niezwykle kosztowne i wymagają intensywnego przygotowania, a także nie pozwalają na równoległe badanie różnych warunków eksperymentalnych. Aby uzyskać uproszczone podejście, które jest mniej kosztowne, bardziej elastyczne i pozwala na wiele równoległych warunków, przedstawiamy tutaj protokół konfiguracji i użytkowania macierzy mini-bioreaktorów w ciągłym przepływie, zaadaptowany z Auchtung et al.4.

Kompletna konfiguracja systemu mini-bioreaktora jest pokazana w Rysunek 1A. Ten system mini-bioreaktora wykorzystuje układy 6 studni reaktora, które są całkowicie niezależne od siebie i są ustawione w komorze beztlenowej pod przepływem perystaltycznym, aby umożliwić ciągłe dostarczanie i usuwanie mediów (Rysunek 1A). Każdy układ reaktora znajduje się na 60-pozycyjnej magnetycznej płycie mieszającej, z dwiema 48-kasetowymi pompami perystaltycznymi z 2-stopniowymi rurkami dla medium źródłowego i przepływu odpadów (Rysunek 1A). Komora beztlenowa wyposażona jest w monitor beztlenowy CAM-12 do pomiaru zawartości tlenu, kasetę katalizatora do usuwania tlenu o wydajności grzewczej oraz kolumnę do usuwania siarkowodoru do pochłaniania nadmiaru gazu z metabolizmu bakteryjnego. Każda studzienka reaktora jest wyposażona w wlot mediów źródłowych, wylot odpadów i port próbki, co pozwala na inokulację lub pobieranie próbek z każdej pojedynczej studzienki reaktora (Rysunek 1B).

Jak opisano, system bioreaktora umożliwia dynamiczną kontrolę temperatury, zużycia mediów i dostępności składników odżywczych, aby wspierać uprawę i utrzymanie zbiorowisk kałowych. Temperatura jest modulowana przez katalitor o wydajności grzewczej, co umożliwia szybkie wprowadzanie zmian temperatury w całej komorze beztlenowej. Zużycie mediów jest regulowane przez natężenia przepływu pomp perystaltycznych, które można modyfikować w celu zmiany obrotu mediów w reaktorach. Obrót mediami może być dostosowany do typów zbiorowisk uprawianych w reaktorach, na przykład dostosowany do wolno rosnących lub bardzo szybko rosnących szczepów docelowych. Wreszcie, dostępność składników odżywczych może być dynamicznie modyfikowana poprzez dodawanie składników przez indywidualne porty próbek dla każdej studzienki reaktora. Warunki statyczne, które mogą być modyfikowane na początku eksperymentu, ale które nie mają dynamicznej kontroli w systemie, to rodzaj mediów, zawartość tlenu i liczba jednoczesnych reaktorów. Badacze mogą zdecydować się na implementację dowolnego nośnika źródłowego, i chociaż jeden nośnik jest tutaj opisany, nieskończenie wiele innych typów nośników źródłowych zostało pomyślnie zaimplementowanych. Reaktory mogą pracować w warunkach tlenowych lub mikroaerofilowych (w zależności od dostępności komory mikroaerofilowej). Wreszcie, w zależności od potrzeb eksperymentalnych badacza można ustawić tyle lub tyle reaktorów, ile potrzeba. Podczas gdy reaktory są w zestawach po sześć w układzie, każdy reaktor działa niezależnie od innych i w razie potrzeby każdy może być podłączony do innego źródła.

Ten modułowy system bioreaktora może być całkowicie skonfigurowany za około $25,000 (nie wliczając komory anaerobowej lub komponentów specyficznych dla komory), a jedyną nienadającą się do ponownego użycia częścią jest rurka, którą można wymienić za mniej niż $100 za przebieg systemu. System jest w większości zautomatyzowany, ale wymaga codziennego sprawdzania poziomu pożywki, ponieważ butelki źródłowe pożywki będą musiały zostać wymienione, gdy są puste. Ponadto każde pobieranie próbek musi być wykonywane ręcznie, a wszelkie dynamiczne zmiany warunkowe w systemie będą musiały być inicjowane ręcznie (na przykład zmiana temperatury). Na podstawie oryginalnego protokołu systemowego opublikowanego przez Auchtung et al., wprowadzono kilka modyfikacji w celu poprawy ogólnej wydajności i użyteczności4. Po pierwsze, materiał do drukowania 3D układu bioreaktora jest modyfikowany tak, aby był półprzezroczystym przezroczystym tworzywem sztucznym podobnym do ABS, aby poprawić integralność strukturalną systemu poprzez wielokrotne rundy autoklawowania. Dodatkowo, zamiast rurki PTFE o średnicy zewnętrznej 1/8 cala (3,2 mm), zamiast tego stosuje się rurkę E-LFL, 2,06 mm ID, 100 stóp ze względu na mocniejszy materiał, który jest bardziej odporny na zapadanie się, co spowodowałoby zablokowanie przepływu w systemie. Wreszcie, dodatkowe złącze z gwintem 1/4 -28 mm do męskich adapterów z zadziorami służy do zmniejszania zmian w ślizganiu się rurki z butelek źródłowych pożywki. Od Hana i wsp., zaadaptowana receptura pożywek MEGA zapewnia niezdefiniowane, złożone, wysoce bogate podłoże, które umożliwia hodowlę wybrednych mikroorganizmów beztlenowych5. Pożywka jest modyfikowana w celu wykorzystania alternatywnego preparatu składnika histydyna-hematyna, ponieważ oryginał nie jest już dostępny na rynku. Wodorotlenek sodu jest również używany do pH pożywki do 7,0 lub dowolnego pożądanego pH. Ogólnie rzecz biorąc, system ten jest niedrogi i przyjazny dla użytkownika, zoptymalizowany i stanowi doskonały punkt wyjścia do systemów hodowli z ciągłym przepływem.

W tym protokole szczegółowo opisujemy konfigurację tego systemu matryc mini-bioreaktorów, w tym materiały, sterylizację systemu i późniejsze wykorzystanie do hodowli humanizowanych próbek kału mysich jelit. Ogólnym celem tej metody jest zbudowanie elastycznego i opłacalnego systemu bioreaktora, który można wykorzystać do hodowli zbiorowisk drobnoustrojów w kontrolowanych warunkach. Szczegółowy schemat procesu montażu systemu mini-bioreaktora znajduje się w Rysunek 2 i jest wymieniony na odpowiednich etapach w protokole. W naszym przykładzie zaszczepiamy dwa reaktory tą samą próbką kału od humanizowanych myszy jelitowych i opisujemy strukturę społeczności drobnoustrojów pod ciągłym przepływem pożywek MEGA.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat ideowy konfiguracji zestawu mini-bioreaktora w komorze beztlenowej. (A) Pełny widok kompletnego zestawu zestawu mini-bioreaktora w komorze beztlenowej. 6-dołkowy układ bioreaktora znajduje się na 60-pozycyjnej magnetycznej płycie mieszającej. Sieć trójnika luer źródłowego jest przymocowana do nośnika źródłowego po lewej stronie przez dwuotworową nakrętkę butelki. Dwie pompy perystaltyczne utrzymują 2-stopniowy przewód od sieci źródłowej i kanalizacyjnej odpowiednio po lewej i prawej stronie. Sieć trójnika luer na odpady opróżnia się do butelki na odpady po prawej stronie. Niezbędne wyposażenie do działania komory beztlenowej, w tym monitor CAM-12, skrzynka katalizatora o wydajności grzewczej oraz kolumna do usuwania siarkowodoru, są rozmieszczone w komorze wokół układu matrycy. (B) Widok z góry na porty źródła, próbki i odpadów podłączone do jednej studzienki reaktora z mediami umieszczonymi na odpowiedniej wysokości w reaktorze. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-introduction-2
Rysunek 2: Schemat przebiegu procesu montażu matrycy mini-bioreaktorów. (A) Widok z góry na układ mini-bioreaktora, pokazujący orientację portów źródła, odpadów i próbek. (B) Widok z boku układu mini-bioreaktora z widokiem ilustrującym kroki 2.3-2.4 protokołu. Rurka i złączka PTFE 1/8 cala (1) są mocowane i wkładane do portów odpływowych i próbek. Złączka (1) bez PTFE jest wkładana do portu źródłowego. (C) Widok z boku układu mini-bioreaktora ilustrujący kroki 2.5-2.6 protokołu. Złączka (2) jest podłączona do portu źródła i odpływu. Złączka (3) jest przymocowana do portu próbki, a do niej złączka (4) jest wkładana na górze. (D) Widok z boku układu mini-bioreaktora ilustrujący kroki 2.9-2.11. Rurka E-LFL 2,06 mm jest podłączona do portu źródła i odpływu, a drugi koniec jest podłączony do złączek (5), a następnie (6). Następnie podłącza się rurkę 2-punktową o odpowiedniej średnicy do złączki (6). Odwrotne połączenie jest następnie powtarzane na końcu rurki 2-stopowej, przy czym złączka (6) łączy się z rurką 2-oporową i mocuje (5) podłącza się do niej. Na koniec rurka E-LFL 2,06 mm zostanie podłączona do złączki (5) w celu podłączenia do sieci trójników luer. (E) Widok z góry na matrycę mini-bioreaktora wyświetlającą konfigurację sieci źródła i odpływu ciepła opisaną w krokach 2.12-2.15. Rurka E-LFL 2,06 mm zakończona złączką (5) służy do podłączenia każdego reaktora do kilku złączek (7), których ostatni otwór jest połączony z nakrętką na źródle lub butelce na odpady. (F) Widok z boku zespołu nakrętki butelki z dwoma otworami opisanego w krokach 2.16-2.17. Jeden otwór w nakrętce jest połączony z rurką PTFE, która jest umieszczona wewnątrz butelki. Do tego otworu wkładana jest złączka (1), a następnie złączka (2) i rurka E-LFL 2.06 mm podłączona do złączki (5). Ta armatura jest podłączona do sieci źródłowej lub odpływowej. Do otworu, który nie jest podłączony do rurki PTFE, wkłada się złączkę (1), a następnie złączkę (2), a rurkę E-LFL 2,06 mm podłącza się do innej złączki (5). Ten koniec jest zakryty folią podczas sterylizacji w autoklawie w celu przyszłego przyłączenia do sterylnego filtra strzykawkowego 0,22 μM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki kału użyte w tym badaniu zostały uzyskane z eksperymentów zatwierdzonych przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na University of Florida (UF) i przeprowadzonych w Zakładach Opieki nad Zwierzętami UF (IACUC Protocol #IACUC202300000005). Krótko mówiąc, mieszany płciowo, wolny od zarazków typ dziki (GF WT; Myszy C57BL/6) (hodowane i utrzymywane w izolatorach przez UF Animal Care Services Germ-free Division) przeniesiono z izolatorów hodowlanych i umieszczono w systemie biowykluczenia ISOcage P, aby umożliwić manipulację mikrobiologiczną. Równe jednostki tworzące kolonie (CFU) z ludzkiego kału dawcy zostały połączone w celu wprowadzenia zgłębnika do myszy. Dwa tygodnie po inokulacji próbki kału pobrano od tych myszy w sposób aseptyczny w celu przechowywania, a następnie wykorzystania w tym protokole.

UWAGA: Pobieranie i przygotowanie próbek kału opisane tutaj są przeznaczone tylko jako przykład prawidłowej procedury, ponieważ w zależności od rodzaju pobranych próbek (człowiek, mysz, inne zwierzę) i przechowywania tych próbek, procedura ta może się znacznie różnić. Osoby powinny zapoznać się z odpowiednią literaturą, aby opracować protokół pobierania i konserwacji próbek kału w oparciu o potrzeby indywidualnego badacza.

1. Typowe przygotowanie próbek kału do przechowywania w temperaturze -80 °C

  1. Wybierz pożywkę chroniącą żywotność beztlenową (tutaj użyliśmy Cary'ego Blaira). Podać 1 ml pożywki konserwującej do sterylnej, zakręcić nakrętkę 2 ml probówek w komorze bezpieczeństwa biologicznego, a następnie przenieść do komory beztlenowej.
  2. Przed otrzymaniem próbek kału upewnij się, że wszystkie zapasy (autoklawowane szpatułki, sterylna sól fizjologiczna i zakręcane fiolki kriogeniczne zawierające środki konserwujące) są wstępnie zredukowane na 24 godziny w komorze beztlenowej.
  3. Pobieraj próbki kału aseptycznie od myszy za pomocą sterylnych probówek zatrzaskowych w komorze bezpieczeństwa biologicznego za pomocą autoklawowanych kubków do pobierania kału i kleszczyków. Natychmiast po pobraniu zatrzaskowo zamroź probówki w ciekłym azocie.
  4. Natychmiast przenieś próbki do komory beztlenowej wraz z przenośną wagą do ważenia. Zważ wstępnie każdą probówkę. W przypadku próbek kału myszy oddzielne granulki kału można podzielić na porcje na probówkę. Jeśli używasz próbek ludzkich, użyj sterylnych szpatułek, aby wymieszać każdą próbkę i podzielić ją równo na fiolki kriogeniczne. Po ponownym zważeniu każdej probówki dodaj pożywkę w szacunkowym stosunku 1:10 pożywki kałowej (masa: masa) do każdej probówki, aby uzyskać optymalną konserwację.
    UWAGA: Po pobraniu zaleca się natychmiastowe zachowanie beztlenowe próbek kału. Próbki, które nie zostały natychmiast zakonserwowane, mogą mieć zmniejszoną żywotność, zmiany składu itp., w porównaniu ze świeżo zakonserwowanymi próbkami6,7,8. Pożywka konserwująca Cary Blair utrzymuje żywotność społeczności bakteryjnych, jednocześnie hamując ich dalszy wzrost i może być przechowywana w temperaturze -80 °C. W przypadku szacowanego stosunku pożywki konserwującej do kału, mimo że mokra masa próbki kału jest bardzo zmienna, jest to najlepsze dostępne oszacowanie.
  5. Oznaczyć, uszczelnić, wyjąć fiolki z komory beztlenowej, zamrozić ciekłym azotem i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do roku lub dłużej.

2. Budowa 6-odwiertowej sieci reaktorów

  1. Użyj pliku CAD (plik uzupełniający 1) do drukowania 3D 6-dołkowego reaktora. Plik ten można przesłać do dowolnej firmy zajmującej się drukiem 3D w celu produkcji. Jako materiał drukarski należy użyć przezroczystego tworzywa sztucznego ABS, aby umożliwić wizualizację przez reaktory, a jednocześnie jest odporne na powtarzające się cykle autoklawowania.
    UWAGA: Zleciliśmy, aby 6-dołkowe matryce reaktorów zostały wykonane z półprzezroczystego tworzywa sztucznego podobnego do AB za pomocą stereolitografii. Zalecamy, aby tablica była pochylona (tj. Wydrukowano część 3D pod kątem 30%-45%) podczas produkcji, co zmniejsza niedokładności wymiarowe. Ta korekta spowoduje, że widoczne linie warstw będą przebiegać po przekątnej w poprzek układu, ale nie wpłynie to na wydajność reaktorów.
  2. Za pomocą narzędzia do gwintowania 25-28 mm wprowadzić gwinty do każdego otworu układu reaktora.
  3. Wytnij paski 12, 25 mm z rurki PTFE 1/8 cala i włóż jeden koniec każdego segmentu rurki do otworu gwintu męskiego złączki z gwintem luer do 25-28. Bezpiecznie przykręć złączki do wyznaczonych otworów odpływowych i próbnych tablicy (Rysunek 2B).
    UWAGA: Żyletka może być użyta do lekkiego ogolenia końców rurki do konfiguracji przypominającej stożek, aby rurka lepiej pasowała do włożenia.
  4. Włóż mikro mieszadło do każdej studzienki reaktora, a następnie wkręć gwint męski 1/4-28 w otwory źródłowe każdej studzienki reaktora (Rysunek 2B).
  5. Przykręć żeńskie złączki adaptera króćca węża luer x 1/8 cala do złączek gwintowanych 1/4-28 dla odpływu i źródła dla każdej studni reaktora (Rysunek 2C).
  6. Przykręć żeńskie złączki adaptera króćca węża luer x 3/32 cala do złączek gwintowanych 1/4-28 dla portu próbki. Umieść gumową przegrodę na adapterach zadziorów węża 3/32 cala i złóż górną część (Rysunek 2C).
  7. Wytnij dwa zestawy rurek E-LFL, 2,06 mm o następujących długościach dla przewodów odpływowych i źródłowych: 14 cm, 15,25 cm, 16,5 cm, 17,75 cm, 19 cm i 20,25 cm.
    UWAGA: Kolorowa taśma etykietowa owinięta wokół części środkowej może być używana do identyfikacji każdej długości rurki.
  8. Podłącz rurkę E-LFL 2.06 mm do żeńskich złączek adaptera kluski węża luer 1/8 cala do połączeń źródła i odpływu (Rysunek 2D). Użyj gorącej wody, aby rurka była bardziej plastyczna. Umożliwi to łatwe dopasowanie rurki do adapterów.
  9. Przymocuj męski luer z pierścieniem blokującym x 1/8 cala adapterem króćca węża do drugiego końca rurki. Przykręć żeński adapter króćca węża luer x 1/16 cala do tego (Rysunek 2D).
  10. Podłącz rurkę 2-oporową o odpowiednim rozmiarze do odpowiednich przyłączy odpływowych i źródłowych. Przewody kanalizacyjne wykorzystują rurkę 2-oporową o średnicy wewnętrznej 1,14 mm, podczas gdy przewody źródłowe wykorzystują rurkę o średnicy wewnętrznej 1,02 mm o średnicy wewnętrznej 2-oczka. Na drugim końcu rurki z 2 przystankami podłącz kolejną żeńską złączkę adaptera adaptera węża luer x 1/16 cala (Rysunek 2D).
  11. Wytnij 20, 5 cm kawałki rurki E-LFL, 2,06 mm i włóż męski luer z pierścieniem blokującym x 1/8 cala adapter adaptera węża do obu końców każdej rurki. Przymocuj jeden koniec rurki o długości 5 cm z męskim złączem luer z pierścieniem blokującym x złączka adaptera króćca węża 1/8 cala do niezajętej żeńskiej złączki adaptera węża luer x 1/16 cala na końcu każdej sekcji rurki z 2 przystankami. Powtórz ten proces dla pozostałych 19 kawałków rurki (Rysunek 2D).
  12. Podłącz rurkę E-LFL, 2.06 mm do przewodów źródłowych studni reaktora 1 i 2 za pomocą przeciwległych końców żeńskiego trójnika luer. Przymocuj jeden z 5-centymetrowych odcinków rurki z męskim luerem z pierścieniem blokującym x 1/8 cala złączkami adaptera na każdym końcu do środkowego wylotu trójnika, prowadząc do drugiego trójnika (Rysunek 2E).
  13. Podłącz rurkę źródłową E-LFL 2.06 mm do trzeciego reaktora po przeciwnej stronie drugiego trójnika. Na jednym końcu należy przymocować kolejną rurkę o długości 5 cm z męskim pierścieniem luer z pierścieniem blokującym x adapterem 1/8 cala, natomiast na drugim końcu powinna być dołączona żeńska rurka luer z pierścieniem blokującym x adapterem 1/8 cala. Postępuj zgodnie z tym samym wzorcem dla reaktorów 4, 5 i 6 (Rysunek 2E).
  14. Wytnij 25-centymetrowy kawałek rurki E-LFL, 2.06 mm, mocując męski luer z pierścieniem blokującym x 1/8 cala adapterem króćca węża do jednego końca rurki, który przymocuje się do ostatniego pozostałego żeńskiego złącza trójnika luer, a na drugim końcu przymocuj żeński adapter adaptera węża luer x 1/8 cala. Przykryj ten koniec folią aluminiową (Rysunek 2E).
    UWAGA: Podczas operacji ważne jest, aby otwarte końce były sterylne, dlatego zalecamy trzymanie ich zakrytych folią podczas autoklawowania i zabezpieczonych taśmą.
  15. Przygotuj linie odpływowe, powtarzając tę samą procedurę, co linie źródłowe opisane w krokach 2.12-2.14 (Rysunek 2E).
  16. Aby zmontować butelkę do zbierania odpadów, luźno przymocuj nakrętkę z dwoma otworami do butelki o pojemności 2 l. Włóż złączki z gwintem męskim 1/4-28 do obu otworów nasadki. Przymocuj żeński luer z adapterami króćca węża 1/8 cala do złączki z gwintem zewnętrznym, która nie łączy się z wstępnie dołączoną rurką PTFE w nasadce (Rysunek 2F).
  17. Następnie odetnij 5-centymetrowy kawałek rurki E-LFL 2,06 mm i podłącz go do adaptera zadzioru węża na butelce. Przymocuj męski luer z pierścieniem blokującym x adapter króćca węża 1/8 cala do drugiego końca rurki 5 cm i przykryj ją folią (ta rurka służy jako odpowietrznik; po autoklawowaniu zostanie dodany filtr strzykawkowy 0,22 μm, aby zapobiec zanieczyszczeniu; Rysunek 2F).
  18. Przykryj całą nakrętkę folią aluminiową. Autoklawować reaktory i butelkę na odpady w temperaturze 121 °C i co najmniej 15 psi przez 45 minut, korzystając z programu powolnego wydechu zwykle ustawionego dla cieczy. Po ostygnięciu reaktorów dokręć złączki i uszczelki z folii aluminiowej i umieść je w komorze beztlenowej na 48 godzin przed użyciem.

3. Przygotowanie nośnika MEGA

  1. Przygotować wszystkie roztwory podstawowe zgodnie z tabelą uzupełniającą 1, tabelą uzupełniającą 2, tabelą uzupełniającą 3, tabelą uzupełniającą 4, tabelą uzupełniającą 5, tabelą uzupełniającą 6, tabelą uzupełniającą 7, tabelą uzupełniającą 8.
  2. W szklanej butelce o pojemności 2 litrów dodaj wszystkie suche składniki z tabeli uzupełniającej 9, następnie 1640 ml wody ultraczystej, a następnie resztę płynnych składników z tabeli uzupełniającej 10. Dodać mieszadło i całkowicie rozpuścić na średnim ogniu (90 °C) na talerzu mieszającym. Pożywka będzie miała kolor od jasnoniebieskiego do fioletowego i nie będzie w pełni klarowna, ale nie będzie miała żadnych widocznych nierozpuszczonych grudek.
    UWAGA: Autoklawowanie glukozy i innych cukrów w obecności peptydów może prowadzić do modyfikacji i może obniżyć dostępny cukier w pożywce. W razie potrzeby wszystkie roztwory cukru można sterylnie przefiltrować i dodać do składników z tabeli uzupełniającej 10, jak opisano w kroku 3.7.
  3. Po całkowitym wymieszaniu dostosuj pH pożywki do 7,0, dodając 10 N wodorotlenku sodu (NaOH), mierząc dokładnie, ile objętości zostało dodane. Po pomiarze pH dodać 14,4 ml wody minus objętość dodanego wodorotlenku sodu, aby uzyskać objętość dokładnie 2 l.
  4. Przygotuj nakrętkę butelki z dwoma otworami, wkładając męski gwint luer 1/4-28 mm do obu otworów.
  5. W otworze nasadki, która nie jest wstępnie przymocowana do rurki PTFE, wytnij 5 cm kawałek rurki C-flex i podłącz go do króćca węża 1/8 cala żeńskiej złączki luer. Na drugim końcu rurki o długości 5 cm włóż kolejny męski luer z pierścieniem blokującym i adapterem do węża 1/8 cala i przykryj folią (zostanie ona również podłączona do filtra strzykawkowego 0,22 μM).
  6. Przykryj całą nakrętkę folią aluminiową i przykręć butelkę MEGA Media o pojemności 2 litrów. Autoklaw w temperaturze 121 °C i minimum 15 psi przez 45 minut, korzystając z programu powolnego wydmuchiwania cieczy.
  7. Wyjmij pożywkę z autoklawu i pozwól jej ostygnąć, mieszając, aż będzie letnia. Dodać składniki z tabeli uzupełniającej 10 do 2-litrowej butelki z pożywką w komorze bezpieczeństwa biologicznego, uszczelnić pokrywę, a następnie przenieść na płytkę mieszającą w celu homogenizacji. Po ostygnięciu podłoża dokręć złączki i uszczelki z folii aluminiowej i umieść je w komorze beztlenowej na 48 godzin przed użyciem.
    UWAGA: Zalecamy uruchomienie pompy źródłowej z prędkością 16 μl/min (0,94 ml/h) przez 16 godzin retencji. Przy takim natężeniu przepływu reaktor 6-dołkowy zużywa około 0,135 l mediów dziennie. Zalecamy również uruchomienie pompy ściekowej z prędkością 40 μl/min, aby zapobiec tworzeniu się zatorów w rurze kanalizacyjnej. Monitoruj rurki i przepływ, zwracając uwagę, że przepływ odpadów można odpowiednio zwiększyć, jeśli wystąpią blokady. Zarówno tempo przepływu źródeł, jak i odpadów można modyfikować, ale badacze powinni uważnie monitorować ich skład społeczności i tempo wzrostu, ponieważ mogą się one również zmieniać wraz z szybszym lub wolniejszym przepływem. Aby uruchomić reaktor 6-dołkowy przez tydzień, zalecamy przygotowanie co najmniej 2 litrów pożywki (zużywa to nieco ponad 1 litr).

4. Ustawienie matrycy w komorze beztlenowej

UWAGA: Konieczne jest oczyszczenie wnętrza kaptura i rękawic kaptura 3% nadtlenkiem wodoru, a następnie trzykrotne płukanie wodą dejonizowaną, aby upewnić się, że powierzchnia nie jest zanieczyszczona przed montażem. Jeśli połączenia zostaną wykonane szybko po zdjęciu folii i nie dojdzie do bezpośredniego kontaktu z wnętrzem armatury i rękawicami komory anaerobowej, ryzyko zanieczyszczenia jest minimalne

  1. Ustawić matrycę na magnetycznej płytce mieszającej w komorze beztlenowej. Upewnij się, że układ jest prawidłowo ustawiony, ustawiając regulator płytki mieszającej na maksymalną prędkość (1600 obr./min) i obserwując obracanie się mieszadeł.
  2. Zamontuj rurkę 2-stopową dla źródła i odpadów w zaciskach na odpowiednich pompach perystaltycznych. Jeśli robisz to na mniej niż 24 godziny przed planowanym użyciem, zablokuj zaciski na miejscu. W przeciwnym razie pozostaw go luźno, aż będzie gotowy do użycia, aby zmniejszyć zużycie rurki.
  3. Zdejmij zaślepkę foliową z żeńskich złączek adaptera węża luer x 1/8 cala na przewodach źródłowych i odpływowych i wkręć w złączki męskie luer do 1/4 -28 zagrożeń wkręconych w zaślepki (upewnij się, że ten otwór jest podłączony do wewnętrznej rurki PTFE).
  4. Zdjąć nakrętki foliowe i przymocować filtr strzykawkowy 0,22 μm do przewodu wentylacyjnego 5 cm butelki źródłowej i do przewodu odpowietrzającego butelki na odpady.
  5. Rozpocząć przepływ z umiarkowaną szybkością (1 ml/min na pompie źródłowej i 2 ml/min na pompie odpadowej), aby rozpocząć napełnianie reaktorów. Upewnij się, że rura przewodu odpływowego w każdej studzience reaktora znajduje się niżej niż rura źródłowa, co zapobiegnie przepełnieniu lub opróżnieniu każdej studzienki.
  6. Gdy reaktory zaczną się napełniać, upewnij się, że wszystkie osiągają tę samą objętość i że media wpływają do linii odpływowej. Przy opisanych tutaj pomiarach objętość robocza każdego reaktora wynosi 15 ml.
    UWAGA: Jeśli którykolwiek z reaktorów nie napełnia się, dokręć luźne złączki i sprawdź przewody źródłowe pod kątem problemów, w razie potrzeby zastępując je przygotowanymi dodatkami. Jeśli problem będzie się powtarzał, wymień butelkę źródłową, jeśli jest dostępna. Jeśli poziom medium wzniesie się powyżej wewnętrznej linii odpływowej w reaktorach, sprawdź, czy rurki PTFE po wewnętrznej stronie portu odpływowego reaktora są nadal na swoim miejscu.
  7. Po napełnieniu każdego reaktora należy dostosować ustawienia pompy do natężenia przepływu 16 μl/min, a następnie wyłączyć pompy.
  8. Pozostawić pożywkę na noc w reaktorach i butelkach na odpady przed inokulacją. Pozwala to na dalsze kondycjonowanie podłoża w stanie beztlenowym (łącznie ~72 h) i umożliwia użytkownikowi potwierdzenie sterylności systemu.
  9. Aby potwierdzić sterylność systemu przed inokulacją próbki kału, należy pobrać próbki z każdego reaktora i pożywki źródłowej bezpośrednio po początkowym napełnieniu (krok 4.7) i ponownie po kroku 4.8. Postępować zgodnie z procedurą aseptycznego pobierania próbek z reaktorów opisaną w kroku 6.
    1. Upewnij się, że pomiar gęstości optycznej wszystkich próbek jest taki sam, jak w przypadku podłoża źródłowego; jeśli zaobserwuje się zwiększoną gęstość optyczną, podejrzewa się zanieczyszczenie, a wszystkie media i system powinny zostać zdemontowane, oczyszczone i ponownie złożone.

5. Inokulacja próbki kału

  1. Umieść sterylne końcówki do pipet o szerokim otworze, sterylną sól fizjologiczną, stożkowe probówki o pojemności 50 ml, sterylne pipety serologiczne o pojemności 25 ml, strzykawki o pojemności 5 ml i igły o rozmiarze 16 w celu kondycjonowania w środowisku beztlenowym przez co najmniej 24 godziny.
  2. Oblicz ilość materiału kałowego potrzebną do zaszczepienia żądanej liczby reaktorów. Każda studzienka reaktora wymaga 3,8 ml supernatantu w 25% zawiesinie kałowej o stężeniu 25% m/v. W przypadku sześciu studzienek reaktora łącznie 22,8 ml 25% gnojowicy kałowej o stężeniu 25% m/v powinno zapewnić wystarczającą ilość supernatantu do inokulacji, która będzie wymagała 5,7 g stałego kału
    3. .
  3. Przenieść zakonserwowane próbki kału w fiolkach kriogenicznych do komory beztlenowej i pozostawić do rozmrożenia przez 15 minut.
  4. Użyj końcówki pipety o szerokim otworze, aby przenieść materiał kałowy z fiolek kriogenicznych do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, szczelnie zamknąć i odwirować przy 200 x g przez 5 minut, aby osadzić cząstki.
  5. Przenieść z powrotem do komory beztlenowej i usunąć supernatant. Za pomocą autoklalawowanej szpatułki laboratoryjnej przenieś ciała stałe w kale do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, uzyskując całkowitą masę 5,7 g. Dodać 17,1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej beztlenowej do probówki i szczelnie zamknąć.
  6. Wyjąć stożkowe rurki z komory, homogenizować przez wir przez 5 minut, a następnie odwirować przy 200 x g przez 5 minut w celu osadzenia cząstek.
  7. Sterylizuj przegrody na wierzchu każdego reaktora 10% chusteczką laboratoryjną z wybielaczem przez co najmniej 2 minuty, podczas gdy próbki umieszcza się w wirówce.
  8. Umieścić próbki z powrotem w komorze beztlenowej i za pomocą sterylnych pipet serologicznych przenieść supernatanty do nowych probówek stożkowych o pojemności 50 ml.
  9. Załaduj 3,8 ml supernatantu z zawiesiny kałowej do sześciu oddzielnych strzykawek o pojemności 5 ml z igłami 16 G 1,5 cala.
  10. Usuń chusteczkę, włóż igłę przez przegrodę i powoli wstrzyknij gnojowicę kałową do reaktora.
  11. Pozwól, aby zbiorowiska kału osiedliły się w każdym reaktorze przez około 16-18 godzin przed rozpoczęciem przepływu do reaktora. Ustaw magnetyczną płytkę mieszającą na maksymalną prędkość od momentu wstrzyknięcia gnojowicy kałowej (1600 obr./min).

6. Aseptyczne pobieranie próbek ze studni reaktora

  1. Nakłuć opakowanie na sześciu sterylnych strzykawkach o pojemności 1 ml i sześciu sterylnych igłach 22G 3 cale i umieścić je w komorze beztlenowej w celu odgazowania na 24 godziny.
  2. Bezpośrednio przed pobraniem próbek należy wysterylizować przegrody na wierzchu każdego reaktora 10% chusteczką laboratoryjną z wybielaczem przez co najmniej 2 minuty.
  3. Usuń laboratoryjną chusteczkę wybielacza i natychmiast przymocuj igłę do strzykawki i włóż igłę do środka przegrody pierwszej studzienki reaktora.
  4. Pobrać 1 ml próbki, wyjąć igłę z przegrody i przenieść próbkę ze strzykawki do oznaczonej probówki o pojemności 1,7 ml do dalszego użytku. Gumowa przegroda ponownie się uszczelni po wyjęciu igły. Użyj nowej igły i strzykawki do każdej studzienki reaktora, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
  5. Jeśli supernatant jest pożądany, wyjmij probówki z komory beztlenowej i odwiruj przy 20 000 x g przez 1 minutę, aby osadzać komórki bakteryjne
    6. .
  6. Przenieść supernatant do oddzielnie oznakowanej probówki o pojemności 1,7 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.

7. Demontaż i czyszczenie systemu mini-bioreaktora

  1. Odłącz butelkę źródłową od trójnika źródła luer i zwiększ natężenie przepływu (1 ml/min na pompie źródłowej i 2 ml/min na pompie odpadowej), aby rozpocząć opróżnianie rurki. Poczekaj, aż rurka całkowicie się opróżni. Wyłącz płytkę mieszającą.
  2. Gdy rurka jest pusta, odłącz butelkę na odpady od trójnika luer. Następnie umieść zespół reaktora w śluzie powietrznej komory beztlenowej i wyjmij go z komory.
  3. Odłącz wszystkie odcinki przewodów E-LFL 2.06 mm i przewodów PTFE i zutylizuj je. Odłącz wszystkie złączki i umieść je w 10% roztworze wybielacza.
  4. Usuń mini-mieszadła z każdej płytki i umieść je w roztworze wybielacza. Odwróć układ reaktora, aby opróżnić pożywkę do oddzielnego 10% roztworu wybielacza do dezynfekcji. Następnie zanurz pustą matrycę w świeżym roztworze wybielacza.
  5. Pozwól, aby wszystkie złączki i układ reaktora nasączone były 10% roztworem wybielacza przez 30 minut (dłuższe moczenie spowoduje odbarwienia).
  6. Przepłucz armaturę i układ reaktora wodą dejonizowaną, a następnie zanurz na noc w enzymatycznym roztworze detergentu zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Trzykrotnie przepłucz armaturę i układ reaktora wodą dejonizowaną, a następnie pozostaw do całkowitego wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 3 dni. Po wyschnięciu układ reaktora i armatura mogą być ponownie użyte do montażu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki kału pobrano od myszy skolonizowanych ludzką gnojowicą kałową 2 tygodnie po inokulacji i przechowywano w temperaturze -80 °C. System bioreaktora został skonfigurowany z ciągłym przepływem mediów MEGA dla dwóch odwiertów reaktora replikowanego (Rysunek 3A). Gnojowicę kałową przygotowano z osadów kałowych myszy zgodnie z protokołem opisanym w kroku 6, a oba reaktory zaszczepiono przez port próbki gnojowicą gnojowicą myszy. Po całonocnej inkubacji zbiorowisk kałowy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany w tym protokole system mini-bioreaktorów umożliwia hodowlę niezależnych zbiorowisk kałowych do równoległych eksperymentów. Ta zdolność do badania społeczności drobnoustrojów w izolacji czynników gospodarza jest niezbędnym podejściem do zrozumienia wewnętrznej zdolności mikroorganizmów do przystosowania się do środowiska. Protokół ten można łatwo dostosować do hodowli określonych konsorcjów bakteryjnych, a w razie potrzeby nawet pojedynczych kultur izolowanych. Opisywana tutaj pożywka MEGA jest bogatym, beztlenowy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni Josee Gauthier za pomoc w sekwencjonowaniu genu 16S rRNA. Badania te były częściowo wspierane przez UF Health Cancer Center Funds (C.J.) i UF Department of Medicine Gatorade Fund (C.J.). R.Z.G. został wsparty ze środków UF Health Cancer Center. R.C.N. był wspierany przez National Institutes of Health TL1 Training Grant na Uniwersytecie Florydy (TL1TR001428, UL1TR001427), National Cancer Institute of the National Institutes of Health Team-Based Interdisciplinary Cancer Research Training Program T32CA257923 oraz UF Health Cancer Center. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez UF Health Cancer Center, wspierane częściowo przez środki stanowe przewidziane w Fla. Stat. § 381.915 oraz National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer P30CA247796. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health lub stanu Floryda. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu, gromadzeniu i analizie badań; decyzja o publikacji; lub przygotowanie manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 ml BD Slip Tip Strzykawka, sterylna, jednorazowego użytkuFisher Scientific 309659
Gwint 1/4-28 mm do męskiego adaptera kolczastego (3,2 mm), 5 sztukCole-Parmer008NB32-KD5LAby zbudować 1 6-dołkową matrycę, potrzebujesz 2 opakowań
10M NaOH (wodorotlenek sodu)Sigma72068-100ML
2.0ml Rurka z nakrętką, NonKnrug, Skirted, Natural, E-Beam Sterylna probówka z dołączoną nasadkąFisher Scientific14-755-228
2mag MIXdrive 60 Napęd mieszający2mag4006060-pozycyjna magnetyczna płyta mieszająca (opcjonalnie dodatek o wydajność grzewczą - kat# 40260)
6-dołkowy układ reaktora, podobny do ABS Półprzezroczysty przezroczysty plastikProtolabs NiestandardoweZobacz dodatkowe pliki dla pliku .stl do druku
3D Absolutny etanol (200 dowodów)Fisher ScientificBP2818
Kwas octowy, lodowatySigmaA6283
Adapter, nylon, męski luer do gwintu 1/4-28, 25/op.Cole-ParmerEW-45505-82Aby zbudować 1 6-dołkową matrycę, potrzeba 6 (1 opakowanie)
Folia aluminiowaFisher Scientific01-213-100
Komora beztlenowaCoy Lab ProductsTyp B
Bel-Art  SP Scienceware Pchły Micro Spinbar Mieszadła magnetyczne (1/pk)Fisher Scientific22-261679Aby zbudować 1 6-dołkową matrycę, potrzebujesz 6 
Komora bezpieczeństwa biologicznego klasa 2Kwas masłowy Nuaire
SigmaB103500 
CaCl2 · 2H2O (dwuwodny chlorek wapnia)SigmaC7902
Chusteczki bakteriobójcze Clorox Healthcare z wybielaczem, bezzapachowe, 6 "x 5", opakowanie 150 chusteczekOffice Depot129202
D-(-)-FruktozaSigmaF0127-100G
D-(+)-CellobioseSigmaC7252-100G
D-(+)-GlukozaSigmaG8270-100G
D-(+)-monohydrat maltozySigmaM5885-100G
Drill America Plug Ręczny kran DWTP1/4-28Home Depot305699489
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco, 1X bez Ca i Mg, sterylnaGenesee25-508
Żeńska luer & times; 1/16″ adapter zadzioru węża, nylon, 25 / opakowanieCole-ParmerEW-45502-00Aby zbudować 1 6-dołkową matrycę, potrzebujesz 24 (1 opakowanie)
Żeński luer & razy; 1/8 i Prime; adapter zadzioru węża, Nylon 25 / opakowanieCole-ParmerEW-45502-04Aby zbudować 1 6-dołkową matrycę, potrzebujesz 6 (1 opakowanie)
Żeński luer i razy; 3/32 i Prime; adapter zadzioru węża, Nylon, 25 / opakowanieCole-ParmerEW-45502-02Aby zbudować 1 6-dołkową matrycę, potrzebujesz 6 (1 opakowanie)
Żeński trójnik luer, nylon, 25 / opakowanieCole-ParmerEW-45502-56Aby zbudować 1 6-dołkową matrycę, potrzebujesz 10 (1 opakowanie)
FeSO4 i middot; 7H2O (siarczan żelaza [II] siedmiowodny)SigmaF8633
HematynaSigmaH3281
HistydynaSigmaH7750
Kwas izowalerianowySigma 129542
K2HPO4 dwuzasadowy (wodorofosforan dipotasu)SigmaP2222-1KG
KH2PO4 monozasadowy (diwodorofosforan potasu)SigmaP0662-500G
Końcówki do pipet z dużą kryząFisher Scientific02-707-134
Chlorowodorek L-cysteinySigmaC1276-10G
Męski luer z pierścieniem blokującym i czasami; 1/8 i Prime; adapter zadzioru węża, Nylon, 25 sztuk w opakowaniuCole-ParmerEW-45505-04Aby zbudować 1 6-dołkową matrycę, potrzebujesz 42 (2 opakowania)
Ekstrakt mięsnySigma70164-500G
Med Vet International  Igła Exel, 20G x 1", Podskórna, 100/pudełko, 26417Fisher Scientific50-209-2532
Menadione (Witamina K3)SigmaM5625
MgSO4  &środkowa kropka; 7H2O (siedmiowodny siarczan magnezu)SigmaM1880-500G 
Milli-Q woda
NaCl (chlorek sodu)SigmaS9888-500G 
NaHCO3 (wodorowęglan sodu)SigmaS5761-500G
Omnifi t Q-series dwuotworowa nakrętka na butelkęCole-Parmer00945Q-2Aby zbudować 1 6-dołkową matrycę, potrzebujesz 1
PMP IPC-N L 24CHNL 8RLR 115VMasterFlexISM939C-115V, wymagaj 1 dla źródła i 1 dla odpadów
Precision Seal i gumowa septa, biała, rurka szklana o średnicy zewnętrznej 7 mm (100/op)Millipore SigmaZ553905-100EAAby zbudować 1 6-dołkową matrycę, potrzebujesz 6 sept
kwasu propionowegoSigmaP5561 
Przewód pompy, 2-stopniowy, Tygon S3 E-Lab, średnica wewnętrzna 1.02 mm; 12/PKVWRMFLX96460-28Aby zbudować 1 6-odwiertową matrycę, potrzeba 6  (1 opakowanie)
Rurka do pompy, 2-stopowa, Tygon S3 E-Lab, 1.14 mm ID; 12/PKVWRMFLX96460-30Aby zbudować 1 6-dołkową matrycę, potrzebujesz 6 (1 opakowanie)
Puritan Cary-Blair Medium, 5 mlFisher Scientific22-029-646
Okrągłe butelki do przechowywania mediów PYREX 2L, z nakrętką GL45Fisher Scientific06-414-1E
ŻyletkiGenesee12-640
Rezazuryna, sól sodowaACROS Organics firmy ThermoFisherAC41890-0010
Skrobia rozpuszczalnaSigmaS9765-100G
Mikroszpatułki ze stali nierdzewnej, ostrze przypominające łyżkęFisher ScientificS50823
TBNG TYGON ELFL 2.06MMID 100'VWRMFLX06449-42Aby zbudować 1 6-dołkową matrycę, potrzebujesz 205,5 cm
Suplement minerałów śladowychATCCMD-TMS
Pepton tryptykazy (BBL)Fisher ScientificB11921
Rurka, PTFE, 1/8′ (3,2 mm) OD i czasy; 1,5 mm ID, 10 MCole-Parmer008 T32-150-10Aby zbudować 1 6-odwiertową matrycę, potrzebujesz 300 mm
Tween 80SigmaP1754 
Suplement witaminowyATCCMD-VS
Ekstrakt z drożdży (Bacto)Fisher ScientificDF0127-17-9
24-kanałowej pompy perystaltycznej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biol. 14 (8), e1002533(2016).
  2. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metab. 26 (1), 110-130 (2017).
  3. Rooks, M. G., Garrett, W. S. Gut microbiota, metabolites and host immunity. Nat Rev Immunol. 16 (6), 341-352 (2016).
  4. Auchtung, J. M., Robinson, C. D., Farrell, K., Britton, R. A. MiniBioReactor Arrays (MBRAs) as a tool for studying C. difficile physiology in the presence of a complex community. Methods Mol Biol. 1476, 235-258 (2016).
  5. Han, S., et al. A metabolomics pipeline for the mechanistic interrogation of the gut microbiome. Nature. 595 (7867), 415-420 (2021).
  6. Bilinski, J., et al. Fresh versus frozen stool for fecal microbiota transplantation-assessment by multimethod approach combining culturing, flow cytometry, and next-generation sequencing. Front Microbiol. 13, 872735(2022).
  7. Li, X. M., et al. Effects of stool sample preservation methods on gut microbiota biodiversity: New original data and systematic review with meta-analysis. Microbiol Spectr. 11 (3), e0429722(2023).
  8. Fouhy, F., et al. The effects of freezing on faecal microbiota as determined using MiSeq sequencing and culture-based investigations. PLoS One. 10 (3), e0119355(2015).
  9. Sun, X., et al. Microbiota-derived metabolic factors reduce Campylobacteriosis in mice. Gastroenterology. 154 (6), 1751-1763.e2 (2018).
  10. He, Z., et al. Campylobacter jejuni promotes colorectal tumorigenesis through the action of cytolethal distending toxin. Gut. 68 (2), 289-300 (2019).
  11. Newsome, R. C., et al. Interaction of bacterial genera associated with therapeutic response to immune checkpoint PD-1 blockade in a United States cohort. Genome Med. 14 (1), 35(2022).
  12. Ziv, N., Brandt, N. J., Gresham, D. The use of chemostats in microbial systems biology. J Vis Exp. (80), e50168(2013).
  13. Wille, J., Coenye, T. Biofilm dispersion: The key to biofilm eradication or opening Pandora's box. Biofilm. 2, 100027(2020).
  14. Biagini, F., et al. Designs and methodologies to recreate in vitro human gut microbiota models. Bio-des Manuf. 6 (3), 298-318 (2023).
  15. Qi, Y., Yu, L., Tian, F., Zhao, J., Zhai, Q. In vitro models to study human gut-microbiota interactions: Applications, advances, and limitations. Microbiol Res. 270, 127336(2023).
  16. Gościniak, A., Eder, P., Walkowiak, J., Cielecka-Piontek, J. Artificial gastrointestinal models for nutraceuticals research-achievements and challenges: A practical review. Nutrients. 14 (13), 2560(2022).
  17. Marrero, D., et al. Gut-on-a-chip: Mimicking and monitoring the human intestine. Biosens Bioelectron. 181, 113156(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

R norodno mikrobiotykomora beztlenowapompy perystaltycznemagnetyczny mieszad oinokulacja ka emsk ad konsorcjumbeztlenowce wymagaj ce

Powiązane artykuły