Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie wierzchołkowych organoidów jelitowych i ocena szybkości proliferacji organoidów za pomocą znakowania EdU

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68039

⸱

28 marca 2025

 ,  ,  ,  , 
1Small Animal Internal Medicine, Department for Small Animals and Horses, University of Veterinary Medicine, 2Cluster of Excellence Physics of Life, TU Dresden, 3Unit for Microbiology, Center for Pathobiology, Department for Biological Sciences and Pathobiology, University of Veterinary Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów wierzchołkowych z jelit ze standardowych kultur organoidów osadzonych w matrycy. Przedstawiono również późniejsze włączenie EdU do aktywnie proliferujących komórek i półautomatyczną kwantyfikację komórek EdU-dodatnich.

Streszczenie

Tutaj opisujemy generowanie pływających kultur organoidów jelitowych z wierzchołkowych kultur organoidów jelitowych osadzonych w hydrożelu. Równolegle ustanawia się pływające hodowle organoidów typu bazal-out w celu bezpośredniego porównania organoidów wierzchołkowych i bazowych. Organoidy wierzchołkowe i bazowe są następnie poddawane działaniu analogu tymidyny 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU), który jest integrowany z nowo zsyntetyzowanym DNA podczas fazy S podziału komórki. To włączenie do DNA można uwidocznić w morfologicznie nienaruszonych organoidach za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej. Komórki znakowane za pomocą Hoechst33342 i EdU są następnie oznaczane ilościowo w sposób półautomatyczny za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Obliczanie procentowego udziału komórek EdU-dodatnich w całkowitej liczbie komórek pozwala na analizę proliferacji komórek w organoidach trójwymiarowych (3D). Pomimo tego, że protokół ten jest stosowany tutaj do analizy proliferacji w organoidach jelitowych, ma zastosowanie do analizy różnego rodzaju barwień specyficznych dla jądra w innych organoidach lub dwuwymiarowych hodowlach komórkowych.

Wprowadzenie

Organoidy jelitowe to trójwymiarowe modele in vitro rekapitulujące nabłonek jelitowy składający się z różnych typów komórek. Te organoidy można łatwo ustalić z dorosłych komórek macierzystych wyizolowanych z krypt jelitowych1. Ponieważ organoidy są znacznie bliższe nabłonkowi in vivo, stają się coraz ważniejsze w badaniach biomedycznych. Organoidy jelitowe są wykorzystywane nie tylko do analizy mechanizmów fizjologicznych (np. sygnalizacja niszy jelitowej2,3 i różnicowanie komórek4,5), ale także do badań nad chorobami zakaźnymi6,7. Jednak hodowla spolaryzowanych komórek w 3D otaczających centralne światło jest wyzwaniem, ponieważ powierzchnia komórki wierzchołkowej staje się niedostępna w świetle organoidu. Badanie różnic między wierzchołkowymi i podstawno-bocznymi powierzchniami komórek może być ważne w badaniach metabolicznych, czego przykładem są różnice w wychwytywaniu kwasów tłuszczowych8 i infectious disease research9,10,11,12.

Generowanie tak zwanych organoidów wierzchołkowych jest łatwą opcją na pokonanie tego problemu. Usuwając macierz zewnątrzkomórkową ze standardowych kultur organoidów (tj. organoidów osadzonych w macierzy) i umieszczając te organoidy w pożywce wolnej od matrycy, można wywołać zmianę polaryzacji9.

Jak już wcześniej pisaliśmy, większość organoidów odwraca swoją polaryzację w ciągu 12 godzin. Jednak uzyskanie kultury zawierającej ponad 90% organoidów wierzchołkowych zajmuje 48-72 godziny. Pomimo swojej zalety polegającej na umożliwieniu dostępu do powierzchni komórki wierzchołkowej, organoidy wierzchołkowe wykazują znacznie zmniejszoną proliferację po odwróceniu polaryzacji, podczas gdy tempo śmierci komórki wzrasta13. Czynnik aktywności proliferacyjnej może stanowić zmienną zakłócającą w różnych analizach i należy go pamiętać podczas projektowania eksperymentu.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół tworzenia wierzchołkowych kultur organoidowych i pływających organoidów kontrolnych bazalnych do dalszych analiz. Ponadto opisujemy znakowanie 5-etynylo-2'-deoksyurydyną (EdU), włączoną do nowo zsyntetyzowanego DNA, a tym samym oznaczającą aktywnie proliferujące komórki. Dalej opisujemy półautomatyczną analizę obrazu tempa proliferacji organoidów za pomocą oprogramowania arivis Pro (Zeiss) poprzez kwantyfikację komórek EdU+. Schemat tego procesu jest przedstawiony w Rysunek 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Użyto organoidów jelitowych pochodzących od dorosłych komórek macierzystych od psów, ustalonych według Kramer et al., 202014. Zgodnie z wytycznymi uczelnianej komisji bioetycznej, wykorzystanie materiału tkankowego pobranego podczas wycięcia terapeutycznego lub sekcji zwłok jest ujęte w "zgodzie właściciela na leczenie" uczelni, która została podpisana przez wszystkich właścicieli pacjentów.

1. Hodowla organoidów

  1. Hoduj organoidy jelitowe pochodzące z dorosłych komórek macierzystych osadzone w wybranej matrycy ekstraktu z błony podstawnej (BME) na 24-dołkowych płytkach i dziel je mechanicznie za pomocą szklanych pipet, jak opisano szczegółowo w Pleguezuelos et al., 202015.
    UWAGA: W opisanym tutaj protokole Geltrex został użyty jako BME.
  2. Ostrożnie usunąć rafinowane podłoże (Tabela 1) z organoidów osadzonych w BME.
  3. Dodać 500 μl 0,05% trypsyny-EDTA do studzienki i odłączyć wszystkie kopuły matrycy od studzienki, wielokrotnie pipetując w górę i w dół. Przenieść organoidy do probówki o pojemności 15 ml i dobrze zawiesić, aby całkowicie zdysocjować matrycę hydrożelową.
  4. Inkubować organoidy z 0,05 % trypsyną-EDTA w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej, aż wszystkie organoidy zostaną zdysocjowane na pojedyncze komórki lub małe skupiska komórek.
  5. Rozcieńczyć zawiesinę trypsyny/komórek podłożem podstawowym (Tabela 1). Użyj co najmniej dwa razy więcej podłoża podstawowego niż trypsyny.
  6. Odwirować komórki w temperaturze 8 °C przy 420 × g przez 5 min. Usunąć jak najwięcej supernatantu.
  7. Komórki nasienne osadzone w BME w tylu studzienkach, ile użyto do trypsynizacji w kroku 1.3. i dostarczyć im rafinowaną pożywkę (Tabela 1).
  8. Inkubować komórki przez 3 dni w inkubatorze do hodowli komórkowych i przejść do kroku 2.1.

2. Indukcja odwrócenia polaryzacji i etykietowanie EdU

  1. Ostrożnie usunąć pożywkę z organoidów osadzonych w BME.
  2. Dodać 500 μl roztworu do zbierania organoidów do każdej studzienki i odłączyć wszystkie kopuły matrycy od studzienki, wielokrotnie pipetując w górę i w dół. Przenieść organoidy do probówki o pojemności 15 ml i dobrze zawiesić, aby całkowicie zdysocjować matrycę hydrożelową.
  3. Inkubować probówkę o pojemności 15 ml na lodzie przez 1,5 godziny. Dobrze wstrząsać probówką co 10 minut, aby zapobiec zbrylaniu się organoidów i zapewnić równomierną dysocjację pozostałych składników hydrożelu.
  4. Podczas inkubacji pokryć 96-dołkową płytkę roztworem zapobiegającym przywieraniu. Dla każdego dołka 24-dołkowej płytki trypsynizowanej w kroku 1.3 pokryj 8 dołków 96-dołkowej płytki. Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Do probówki o pojemności 15 ml dodać co najmniej dwa razy więcej PBS niż użyto roztworu do zbioru organoidów i odwirować w temperaturze 8 °C przy 150 × g przez 5 minut.
  6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić organoidy w 1 ml PBS.
  7. Przenieść 500 μl zawiesiny organoidu/PBS do oddzielnej probówki o pojemności 15 ml i ponownie odwirować obie probówki w temperaturze 8 °C przy 150 × g przez 5 minut.
  8. Usuń cały roztwór zapobiegający przywieraniu z płytki 96-dołkowej.
  9. Po odwirowaniu usunąć jak najwięcej supernatantu.
  10. Użyj jednej z probówek do generowania organoidów pływających na zewnątrz (BO), a drugiej probówki do organoidów wierzchołkowych (AO).
  11. W przypadku organoidów BO dodać 100 μl rafinowanej pożywki zawierającej 7,5% BME na dołek 96-dołkowej płytki do jednej probówki. Dobrze wymieszać i równomiernie rozprowadzić organoidy w żądanej liczbie dołków wstępnie pokrytej płytki 96-dołkowej.
  12. W przypadku organoidów AO dodać 100 μl zwykłej rafinowanej pożywki (bez dodatku BME) na dołek 96-dołkowej płytki do drugiej probówki. Dobrze wymieszać i równomiernie rozprowadzić organoidy w żądanej liczbie dołków wstępnie pokrytej płytki 96-dołkowej.
  13. Inkubować organoidy w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 3 dni.
    UWAGA: Różnice morfologiczne zaczną być widoczne po 1 dniu. Jednak wcześniej opublikowane wyniki pokazują, że zdecydowana większość organoidów potrzebuje około 3 dni, aby wykazać polarność wierzchołkową13.
  14. W określonych punktach czasowych, np. 24 h/48 h/72 h po indukcji odwrócenia polaryzacji, dodać 50 μl 3 μM EdU rozcieńczonych w rafinowanym podłożu do wszystkich studzienek organoidów, które mają być znakowane, aby otrzymać końcowe stężenie 1 μM EdU w każdym dołku.
  15. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1,5 godziny.
  16. Zbierz organoidy znakowane EdU za pomocą końcówek o szerokim otworze i przenieś je do probówki o pojemności 15 ml.
  17. Dodać równą ilość 4% PFA do każdej probówki (organoidy BO i AO; końcowe stężenie PFA = 2%) i dokładnie wymieszać.
  18. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  19. Dodać co najmniej dwa razy więcej PBS niż objętość probówki o pojemności 15 ml i odwirować w temperaturze 8 °C przy 80 × g przez 5 minut.
  20. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić organoidy w 1 ml PBS.
  21. Ponownie odwirować w temperaturze 8 °C i temperaturze 80 × g przez 5 minut.
  22. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić organoidy w 1 ml PBS i przenieść je do probówki o pojemności 1,5 ml. Przechowywać organoidy w temperaturze 4 °C do czasu przeprowadzenia reakcji barwienia EdU (patrz punkt 3).
  23. Powtórz kroki 2.14-2.22 dla każdego punktu czasowego, który ma być analizowany.

3. Reakcja barwienia Click-it EdU i barwienie Hoechst 33342

  1. Odwirować utrwalone organoidy (od kroku 2.22) w probówce o pojemności 1,5 ml w temperaturze 4 °C i 50 × g przez 5 minut.
  2. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić organoidy w 1 ml 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) rozcieńczonej w PBS za pomocą końcówek o szerokim otworze.
  3. Powtórz kroki 3.1 i 3.2 (kroki prania).
  4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić organoidy w 1 ml 0,5% Triton X-100 rozcieńczonego w PBS.
  5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  6. Odwirować organoidy w temperaturze pokojowej w temperaturze 50 × g przez 5 min.
  7. W świeżej probówce przygotuj 1x dodatek buforowy, mieszając 45 μl H2O z 5 μl 10x dodatku buforowego.
  8. W innej probówce przygotuj koktajl reakcyjny, mieszając następujące składniki: 385,8 μl H2O, 43 μl 10 x buforu reakcyjnego, 20 μl CuSO 4,1,2 μl azydku Alexa Fluor 647 i 50 μl o 1x dodatek buforowy (od kroku 3.7.).
    UWAGA: Ta mieszanina jest wystarczająca dla pięciu reakcji i może być skalowana w górę i w dół zgodnie z wymaganą liczbą reakcji barwienia.
  9. Powtórzyć kroki 3.1. i 3.2 dwukrotnie (etapy prania).
  10. Usunąć supernatant i dodać 100 μl koktajlu reakcyjnego (krok 3.8.) do każdej probówki z organoidami.
  11. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.
  12. Powtórz kroki 3.1 i 3.2 (kroki prania).
  13. Odwirować organoidy w stężeniu 50 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  14. Zawiesić organoidy w 1 ml 10 μg/ml Hoechst33342 rozcieńczonym w PBS.
  15. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut w ciemności.
  16. Powtórz kroki 3.1 i 3.2 (kroki prania).
  17. Odwirować organoidy w temperaturze 50 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  18. Organoidy nasienne w wybranej matrycy BME do szkiełka kompatybilnego z mikroskopią konfokalną (np. μ-Slide 18 basen)
  19. Obrazowanie organoidów pod mikroskopem konfokalnym.

4. Półautomatyczna analiza obrazu

UWAGA: Do tej analizy użyto arivis Pro w wersji 4.2.2 (oprogramowanie do analizy obrazu).

  1. Zaimportuj obrazy z mikroskopu konfokalnego do oprogramowania do analizy obrazu i zdefiniuj folder, w którym zostanie zapisany plik analizy. Użyj opcji Obrazy jako punkty czasowe, aby zaimportować wiele obrazów (replikuj obrazy, różne punkty czasowe, różne zabiegi itp.). Każdy obraz będzie wtedy traktowany jako pojedynczy punkt czasowy, co umożliwi łatwe przełączanie między poszczególnymi obrazami.
  2. Otwórz panel analizy i zaimportuj potok analizy dostarczony jako plik uzupełniający 1 (arivis_EdU_pipeline).
  3. Użyj narzędzia Umieść nowe obiekty i Sfery ze znacznikiem Organoid, aby łatwo otoczyć wszystkie dobrze oddzielone organoidy.
  4. Przełącz się na następny obraz, tj. następny punkt czasowy, i przystąp do oznaczania organoidów dla wszystkich obrazów.
  5. W przypadku organoidów, które znajdują się bardzo blisko siebie i dlatego nie można ich rozdzielić w trybie Sphere, otwórz listę obiektów i aktywuj tag Organoid.
  6. Kontynuuj korzystanie z narzędzia Rysuj obiekty w trybie wielokąta, aby ręcznie zaznaczać kontury organoidów.
    UWAGA: Na liście obiektów wszystkie organoidy są teraz oznaczone i przypisane do określonego punktu czasowego. Ten punkt czasowy odpowiada kolejności obrazów zaimportowanych w kroku 4.1. Nazwy tych punktów czasowych można teraz zmienić, aby pasowały do oryginalnej nazwy obrazu, jeśli jest to preferowane.
  7. Na liście obiektów zaznacz wszystkie obiekty (=organoidy) i kliknij prawym przyciskiem myszy, a następnie kliknij Usuń znaczniki, aby usunąć znacznik Manual ze wszystkich obiektów.
  8. Dezaktywuj znacznik Organoid na liście obiektów i zaznacz wszystkie obszary w obrębie wcześniej zdefiniowanych obiektów, które powinny zostać wykluczone z analizy, za pomocą narzędzia Rysuj obiekty w trybie wielokąta. Obszary te mogą obejmować martwe komórki w świetle organoidu lub rozmyte obszary, które mogą zniekształcić analizę.
  9. Otwierając listę obiektów, upewnij się, że wszystkie organoidy są wymienione z tagiem Organoid, a wszystkie obszary, które powinny zostać wykluczone, mają znacznik Ręczny.
  10. Uruchom potok analizy, klikając strzałkę w lewym górnym panelu.
    UWAGA: Oprogramowanie segmentuje teraz wszystkie jądra w kanałach Hoechst33342 i EdU. Ten potok analizy uwzględnia tylko segmentowane jądra Hoechst33342+ i EdU+ o wielkości większej niż 15μm2 (tj. obszar w segmencie jądra), aby zapewnić, że małe jądra, najprawdopodobniej pochodzące z martwych komórek, są wyłączone z analizy.
  11. Wyniki analizy można znaleźć na liście obiektów, klikając znacznik Kolumny elementów.
  12. Przełącz się na główny widok szczegółowy i wybierz znacznik Organoidy w górnym panelu oraz funkcję Pierwszy punkt czasowy.
  13. W dolnym panelu wybierz cechy, które mają być wyświetlane dla każdego organoidu. Użyj obszaru projekcji (x/y/z) (woksel), średniej intensywności #1 (kanał EdU) i intensywności SD #1.
  14. Wyeksportuj wyniki (główny raport szczegółowy) za pomocą funkcji eksportu programu Excel.
  15. Zapisz plik analizy i zamknij oprogramowanie.

5. Określanie tempa proliferacji organoidów

  1. Otwórz plik głównego raportu szczegółowego wyeksportowany w kroku 4.14.
  2. Dla każdego analizowanego obrazu znajduje się jedna osobna zakładka. Oblicz sumę powierzchni/wokseli dla jąder i barwienia EdU dla każdego obrazu. Następnie skopiuj wszystkie wynikowe dane do nowej karty zbiorczej i pogrupuj wszystkie dane odnoszące się do tego samego punktu czasowego.
  3. Następnie oblicz całkowitą powierzchnię jąder komórkowych (tj. sumę obszaru Hoechst33342+ i obszaru EdU+) dla każdego obrazu.
  4. Następnie podziel całkowitą powierzchnię przez siebie (= 100%), a średnią powierzchnię EdU+ przez całkowitą powierzchnię (= procent DNA EdU+).
  5. Wykreślić procentową zawartość proliferacyjnego DNA organoidów BO i AO na osi y i różne punkty czasowe na osi x.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Organoidy hodowane przez 3 dni po trypsynizacji powinny mieć idealnie rozmiar od 50-250 µm, jak przedstawiono na Rysunku 2A. Organoidy znacznie większe od tej wartości mogą nie odwracać polarności w sposób efektywny. Większe organoidy mogą również zacząć pączkować, a zauważyliśmy, że organoidy te również mogą mieć problemy z efektywną zmianą polarności. Organoidy z polarnością basal-out oraz apical-out wykazują wyraźne różnice morfologiczne już w obrazowaniu w polu jasny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje szczegółowo, w jaki sposób indukować odwrócenie polaryzacji w standardowych hodowlach organoidów jelitowych pochodzących z dorosłych komórek macierzystych. Organoidy wierzchołkowe służą do uzyskania dostępu do powierzchni komórki wierzchołkowej, która jest zwykle zorientowana w kierunku światła organoidu. Możliwość zbadania powierzchni wierzchołkowej może mieć duże znaczenie w niektórych zastosowaniach, ponieważ jest to część błony komórkowej, która jest narażona na działanie całej zawartości przewod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez zasoby VetImaging Core Facility (VetCore, Vetmeduni, Austria). Pragniemy podziękować Ursuli Reichart za jej wsparcie w zakresie półilościowej analizy obrazu. GC jest stypendystą DOC (numer grantu 26349) Austriackiej Akademii Nauk (ÖAW) na Wydziale Chorób Wewnętrznych Małych Zwierząt w Vetmeduni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 24-dołkoweBiologix07-6024
[Leu15]-Gastrin I człowiek, ≥ 95% (HPLC)Sigma-AldrichG-9145
µ-Slide 18-dołkowy szklany dnoibidi81817
100X Suplement penicyliny-streptomycyny dla MediaGibco/Thermo15140122
A 83-01 Tocris Bioscience2939/10 
Płyn do płukania zapobiegający przywieraniuStemCell Technologies7010
arivis Pro ZeissVersion 4.2.2
B27 SerumFree Supplement (50X), płynnyGibco/Thermo17504044
Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)Abcamab145597
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA7906-100G
Zestaw do proliferacji komórek Click-iT EdU do obrazowania, barwnik Alexa Fluor 647Thermo ScientificC10340
DMEM-F12Suplement Gibco/Thermo11320033
GeltrexGibco/ThermoA1413202
GlutaMAX Gibco/Thermo35050061
Roztwór buforowy HEPES 1 M, płynnyGibco/Thermo15630056
Human FGF-basicPeproTech100-18B-100µ G
Człowiek HGF PeproTech100-39-100&mikro; G 
Ludzki IGF-I PeproTech100-11-100&mikro; G
Człowiek NOGGIN (ssak) PeproTech120-10C-200&mikro; G 
N-acetylo-L-cysteina, testowana hodowla komórkowa, BioReagent Sigma-AldrichA9165-5G 
Roztwór do zbierania organoidówThermoC10340
Triton(TM) X-100, do biologii molekularnejSigma-AldrichT8787-250ML
Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaGibco/Thermo25300054

Bibliografia

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  2. Li, Y., et al. BMP suppresses Wnt signaling via the Bcl11b-regulated NuRD complex to maintain intestinal stem cells. EMBO J. 43 (23), 6032-6051 (2024).
  3. Gaowa, A., Leangpanich, S., Park, E. J., Kawamoto, E., Shimaoka, M. Irisin promotes intestinal epithelial cell proliferation via Wnt/β-catenin and focal adhesion kinase signaling pathways. Sci Rep. 14, 25702(2024).
  4. Basak, O., et al. Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells. Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190 (2017).
  5. Ludikhuize, M. C., et al. Mitochondria define intestinal stem cell differentiation downstream of a FOXO/Notch axis. Cell Metab. 32 (5), 889-900.e7 (2020).
  6. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science (1979). 353 (6306), 1387-1393 (2016).
  7. Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nat Med. 26 (7), 1077-1083 (2020).
  8. Joo, S. -S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals. 12 (3), 372(2022).
  9. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Rep. 26, 2509-2520.e4 (2019).
  10. Sasaki, N., et al. Development of a scalable coculture system for gut anaerobes and human colon epithelium. Gastroenterology. 159 (1), 388-390.e5 (2020).
  11. Mayorgas, A., et al. A novel strategy to study the invasive capability of adherent-invasive escherichia coli by using human primary organoid-derived epithelial monolayers. Front Immunol. 12, 646906(2021).
  12. Csukovich, G., et al. Neutralising effects of different antibodies on clostridioides difficile toxins TcdA and TcdB in a translational approach. Int J Mol Sci. 24 (4), 3867(2023).
  13. Csukovich, G., et al. Polarity reversal of canine intestinal organoids reduces proliferation and increases cell death. Cell Prolif. 57 (2), e13544(2023).
  14. Kramer, N., et al. Generation of differentiating and long-living intestinal organoids reflecting the cellular diversity of canine intestine. Cells. 9 (4), 822(2020).
  15. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).
  16. Dutta, D., Heo, I., O'Connor, R. Studying infection in 3D tissue-derived human organoid culture systems by microinjection. J Vis Exp. (151), e59610(2019).
  17. Kumar, A., et al. Decreased SLC26A3 expression and function in intestinal epithelial cells in response to Cryptosporidium parvum infection. Am J Physiol Cell Physiol. 317 (6), C1205-C1212 (2019).
  18. Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Curr Opin Immunol. 48, 15-22 (2017).
  19. Csukovich, G., Pratscher, B., Burgener, I. A. The world of organoids: Gastrointestinal disease modelling in the age of 3R and one health with specific relevance to dogs and cats. Animals. 12 (18), 2461(2022).
  20. Han, X., et al. Creating a more perfect union: Modeling intestinal bacteria-epithelial interactions using organoids. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 12 (2), 769-782 (2021).
  21. Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. J Virol. 94 (21), e01006-e01020 (2020).
  22. Smith, D., et al. The development of ovine gastric and intestinal organoids for studying ruminant host-pathogen interactions. Front Cell Infect Microbiol. 11, 733811(2021).
  23. Nash, T. J., Morris, K. M., Mabbott, N. A., Vervelde, L. Inside-out chicken enteroids with leukocyte component as a model to study host-pathogen interactions. Commun Biol. 4 (1), 377(2021).
  24. Hanson, K. I., Weiss, A. A. Intestinal tissue response to Shiga toxin exposure. mBio. 15 (9), e0123224(2024).
  25. Hovhannisyan, P., et al. Infection of human organoids supports an intestinal niche for Chlamydia trachomatis. PLoS Pathog. 20 (8), e1012144(2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organoidy z wierzchołkiem na zewnątrzorganoidy z podstawą na zewnątrzmikroskopia konfokalnahodowla organoidów w zawiesinieodwrócenie polarności komórkowejbarwienie jąder komórkowychoprogramowanie do analizy obrazu
Wytwarzanie wierzchołkowych organoidów jelitowych i ocena szybkości proliferacji organoidów za pomocą znakowania EdU
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.