To badanie przedstawia metodologię dostarczania leków do siatkówki i nerwów wzrokowych dorosłego szczura. Dodatkowo wprowadzono unikalną metodę pobierania tkanek w celu odgórnego pobrania en bloc nerwu wzrokowego i siatkówki u dorosłego szczura.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Terapeutyczne dostarczanie do oczu i zaawansowane pobieranie tkanek u dorosłych szczurów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Terapeutyczne dostarczanie do tylnego odcinka oka, w tym siatkówki i nerwu wzrokowego, jest skomplikowane ze względu na obecność barier krew-mózg i krew-siatkówka. Małe modele zwierzęce, takie jak szczury, są wykorzystywane do badania różnych patologii oczu. Chociaż dostarczenie terapeutyczne do tylnego oka jest wyzwaniem, osiągnięcie tego celu jest niezbędne w leczeniu zaburzeń oczu, z których wiele wymaga walidacji na małych modelach zwierzęcych w celu uzyskania znaczenia translacyjnego. W związku z tym przedstawiono dwie techniki podawania terapeutycznego a posteriori: wstrzyknięcie do ciała szklistego (IVI) i wstrzyknięcie zagałkowe (RBI) do stosowania u dorosłych szczurów. Dodatkowo wprowadzono metodę usuwania en bloc oczu i nerwów wzrokowych dla różnych technik analizy histologicznej i molekularnej. Protokół sekcji umożliwia pełną obserwację układu neurowzrokowego przy jednoczesnej minimalizacji pośmiertnych uszkodzeń tkanek siatkówki i nerwu wzrokowego. Udało się dostarczyć terapeutyczną cyklosporynę do siatkówki i nerwu wzrokowego, z wykrywalnymi stężeniami obserwowanymi dwadzieścia cztery godziny po wstrzyknięciu zarówno przy użyciu IVI, jak i RBI. Ponadto udało się pobrać próbki siatkówki i nerwów en bloc w celu przeprowadzenia pełnej analizy histologicznej tkanki oka, co ułatwiło kompleksową obserwację siatkówki i szerszego układu neurowzrokowego.
Wprowadzenie
Dostarczanie leków do siatkówki i nerwu wzrokowego jest niezwykle trudne ze względu na skomplikowaną anatomię oka1,2, w szczególności obecność bariery krew-siatkówka (BRB)3,4,5. BRB służy do ochrony siatkówki przed inwazją krążenia ogólnoustrojowego, ale jest trudnym przeciwnikiem dla podawania terapeutycznego, ponieważ ogólnoustrojowe krążenie terapeutyczne jest często blokowane przez BRB6,7. Małe cząsteczki lipofilowe mogą łatwo dyfundować przez BRB, ale większe i hydrofilowe cząsteczki mają trudniejszy czas na uzyskanie dostępu do siatkówki6. Iniekcje doszklistkowe (IVI) i zagałkowe (RBI) umożliwiają dostarczanie leków do tkanek oka, pokonując ograniczenia narzucone przez BRB. IVI służy jako obiecujący kompromis poprzez podawanie środków terapeutycznych do wewnętrznego środowiska oka8,9. Ta metoda wymaga, aby lek przeszedł przez ciało szkliste, omijając w ten sposób BRB i dyfundując przez siatkówkę i naczyniówkę w celu dotarcia do nerwu wzrokowego7. RBI jest dostarczany za oko do przestrzeni zagałkowej10. Terapie mogą być dostarczane przez dyfuzję przez tkanki i gruczoły w przestrzeni zagałkowej, wpływając na nerw wzrokowy i otaczające struktury bez bezpośredniego wchodzenia do siatkówki, co utrzymuje integralność BRB. Dostarczając leki bezpośrednio lub pośrednio do oka, zarówno wstrzyknięcia doszklistkowe, jak i pozagałkowe mogą osiągnąć wyższe miejscowe stężenia leku terapeutycznego, co zwiększa jego skuteczność w porównaniu z podawaniem miejscowym lub ogólnoustrojowym (doustnym lub dożylnym)2. Jest to szczególnie ważne w przypadku zabiegów, które wymagają szybkiego działania lub dużej siły działania, co obserwuje się w wielu chorobach oczu. Celowane dostarczanie ogranicza również narażenie reszty ciała na lek, co zmniejsza ryzyko wystąpienia efektów niepożądanych i pomaga zminimalizować potencjalne działania niepożądane, które mogą wystąpić, gdy leki są podawane miejscowo, doustnie lub dożylnie11.
Inne zastrzyki okołogałkowe, takie jak subjunctival, subtenior tylny i subretinal, mają swoje zalety i ograniczenia2,5. Zaobserwowano, że wstrzyknięcia do tylnego podczopa dostarczają wysokie stężenia leku do tkanek oka; Jednak wstrzyknięcie subtenonu jest bliżej twardówki niż naczynia oczodołowe5,< klasa SUP = "XREF">12. W przeciwieństwie do tego, RBI umieszcza terapeutyczny bliżej nerwu wzrokowego niż tylny subtenon lub subjunctival13. Może to oznaczać, że patologie nerwu wzrokowego faworyzują terapie dostarczane przez RBI w porównaniu z innymi typami iniekcji okołogałkowych. Iniekcje do tylnej części gardła wiążą się z ryzykiem, w tym zezem, strzępką strzępki i podwyższonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym5. Podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe jest również zgłaszanym czynnikiem ryzyka w iniekcjach dożylnych, podspojówkowych i podsiatkówkowych2. Te rodzaje iniekcji często wymagają powtarzalnego dawkowania w celu osiągnięcia pożądanego efektu terapeutycznego2. Inne czynniki ryzyka związane z iniekcjami podsiatkówkowymi, iniekcjami podspojówkowymi i IVI obejmują powstawanie zaćmy, krwotok siatkówkowy, odwarstwienie siatkówki i stan zapalny2. Te iniekcje IVI, podsiatkówkowe i podspojówkowe są bardziej inwazyjne niż zastrzyki RBI, ponieważ te zastrzyki są dogałkowe2. RBI można uznać za mniej inwazyjny, ponieważ umieszcza lek terapeutyczny w przestrzeni zagałkowej, bez bezpośredniego wprowadzania igły do gałki oka. Inne, mniej inwazyjne strategie terapeutyczne, takie jak podawanie miejscowe, nie zapewniają wystarczającego dostarczania leku, przy czym mniej niż 5% leku jest zatrzymywane na powierzchni oka2,5.
IVI to popularna technika w modelach przedklinicznych, która jest używana ze względu na jej zdolność do dostarczania środków terapeutycznych bezpośrednio do tylnego segmentu oka. IVI dostarcza lek bezpośrednio do ciała szklistego, co czyni go preferowaną techniką podawania w leczeniu miejscowym14. Technika IVI pozwala terapii ominąć barierę krew-siatkówka, która jest częstą przeszkodą w przenikaniu leku do siatkówki14. IVI wprowadza możliwość wystąpienia stanu zapalnego i uszkodzenia struktur oka, dlatego należy skrupulatnie przestrzegać procedury14. Aby zminimalizować odwarstwienie siatkówki i powstawanie zaćmy, Chiu i in. opisują podejście IVI, które kładzie nacisk na wprowadzenie i wstrzyknięcie pod kątem 45 stopni na poziomie par plana, unikając soczewki, siatkówki, mięśni ocznych i naczyń krwionośnych15. W tej technice igła o sile 30 G jest wprowadzana do twardówki nosa w celu terapeutycznego podawania15. IVI nadal wiąże się z ryzykiem ze względu na swój inwazyjny charakter. Potencjalne zagrożenia obejmują odwarstwienie siatkówki, powstanie zaćmy, zapalenie wnętrza gałki ocznej lub krwotok16. Inwazyjny charakter technik IVI zwiększa również ciśnienie wewnątrzgałkowe, jak wykazano w eksperymencie na oczach świń przeprowadzonym przez Ikjong Park et al.16. Badanie wykazało zmiany ciśnienia wewnątrzgałkowego podczas różnych etapów wprowadzania igły i wstrzykiwania płynu. Zgłaszają one znaczne wahania ciśnienia wewnątrzgałkowego podczas zabiegu16.
RBIs były z powodzeniem wykorzystywane w poprzednich badaniach jako sposób terapeutycznego dostarczania gryzoniom. W jednym z takich badań porównano działanie różnych analogów prostaglandyn podawanych za pośrednictwem RBI17. Szczurom albinosom podano RBI z igłą o wadze 26 G i zastrzykiem o pojemności 0,1 ml wprowadzoną przez boczną część sklepienia dolnego pod kątem 45 stopni17. Protokół zastosowany w tym badaniu został zaadaptowany z wcześniej opisanej metody, w której szczury znieczulono poprzez dootrzewnowe (IP) wstrzyknięcie chloralhydrate18. W innym badaniu przeprowadzonym na szczurach porównano krople miejscowe z zastrzykami dogałkowymi19. Szczury zostały znieczulone poprzez wstrzyknięcie IP ketaminy/ksylazyny, a RBI podano za pomocą igły 30 G19. W przeciwieństwie do wcześniej omówionych metod sedacji, w jednym z badań obserwujących wpływ RBI na tłuszcz oczodołowy zastosowano wziewny izofluran do uspokojenia szczurów przed RBI20. Chociaż badania te dostarczają informacji na temat tego, jakie środki znieczulające i specyfikacje igieł mogą być skuteczne, nie omówiono ułożenia i obchodzenia się ze zwierzętami podczas zabiegu.
Różne badania na myszach również przeprowadzają RBI dla metod dostarczania terapeutycznego. W jednym z badań porównano RBI z bocznym wstrzyknięciem żyły ogonowej w celu skutecznego wywołania zespołu nerczycowego21. W drugim badaniu porównano również te same dwie techniki iniekcji w podawaniu środków kontrastowych do obrazowania serca22. Myszy znieczulono wziewnym izofluranem i wstrzyknięto w przyśrodkową stronę oka22. W obu badaniach dostosowano metodę RBI do wcześniej napisanego protokołu. Ważne jest, aby zauważyć, że protokół ten nazwał ich wstrzyknięcie jako retro-orbitalne, ale opisał miejsce wstrzyknięcia jako przestrzeń zagałkową za okiem. Autorzy tego protokołu wykorzystali wziewny izofluran jako preferowaną metodę sedacji, zwracając uwagę na szybki czas aktywacji i regeneracji myszy23. W przypadku RBI oko zostało częściowo wysunięte z oczodołu poprzez wywieranie nacisku na skórę wokół oka23. Następnie igła została wprowadzona do przyśrodkowej kanty skośnej do dołu pod kątem 30 stopni i była wprowadzana aż do podstawy oka23. Należy zachować ostrożność podczas wywierania nacisku na zwierzę, ponieważ może dojść do przypadkowego zablokowania przepływu krwi lub zapadnięcia się tchawicy23. Wstrzykiwacz jest również ślepy na końcówkę igły po wkłuciu, a zatem uszkodzenie oka jest powiązanym ryzykiem. 23 Uszkodzenie oka po podaniu terapeutycznym jest krytycznym ryzykiem w tym eksperymencie, ponieważ spowodowanie dodatkowego uszkodzenia bezpośrednio podważa wyniki badania. Należy również zauważyć, że opisana wcześniej technika pozycjonowania i obchodzenia się z nią została przeprowadzona na myszach i nie zawierała uwag dotyczących możliwości zastosowania u szczurów.
Istnieje wiele sposobów, w jakie próbowano usunąć nerw wzrokowy i siatkówkę. Jedna z takich metod polegała na usunięciu nerwów wzrokowych i oczu en bloc, zachowując nienaruszony skrzyżowanie wzrokowe24. Ta metoda jest najbardziej porównywalna z obecnym badaniem, ponieważ poszczególne oczy i nerwy wzrokowe są również zachowane do usunięcia en bloc; Jednak skrzyżowanie wzrokowe jest oddzielone. Zachowanie ostrożności w tej procedurze miałoby ogromne znaczenie ze względu na złożoność procedury. W obecnej metodzie rozpoczynamy sekcję przez czaszkę ogonową i pracujemy rostralnie, aby zapewnić dostęp w sposób, który ogranicza uszkodzenie nerwów wzrokowych i pozwala na pozostawienie całego nerwu w stanie nienaruszonym. Co więcej, utrzymanie nerwu w stanie nienaruszonym i przyczepionym do oka ma kluczowe znaczenie dla procesu osadzania, ponieważ uszkodzenie każdej części nerwu może odpowiadać innej obserwacji patologicznej24. Orientacja nerwu wzrokowego jest ważna do rozważenia, ponieważ sposób jego osadzenia pozwala na różne przekroje poprzeczne, co może być ważne dla analizy histologicznej.
Wykonane na zamówienie urządzenie znane jako stół operacyjny do laboratorium dla małych zwierząt (SALOOT, platforma chirurgii okulistycznej) składa się z serii materiałów drukowanych w 3D, które zapewniają znieczulenie i utrzymują zwierzę w stabilnej pozycji do terapeutycznych zastrzyków do oka. Konstrukcja SALOOT pozwala na stabilność struktury głowy i oka podczas zabiegów okulistycznych, co poprawia szybkość i powtarzalność operacji, umożliwiając jednocześnie dostarczanie znieczulenia gazowego i oczyszczanie cząstek wydychanych. SALOOT to trójwymiarowy drukowany blok z wklęsłą redukcją, która utrzymuje ciało szczura z węższym obszarem z przodu, aby utrzymać głowę zwierzęcia w stożku nosowym z wlotem izofluranu. Pod stożkiem nosowym znajduje się mały zbiornik i wylot spalin. Opracowano następujące metody terapeutycznego dostarczania do oka i precyzyjnego pobierania tkanki oka; Zostały one zaprojektowane do badania tkanek po urazie oka, dlatego ważne jest, aby nakreślić skutki urazu, wstrzyknięcia, leczenia i sekcji, aby uniknąć mylącej interpretacji wyników.
Ten artykuł przedstawia dwie metody terapeutycznych iniekcji do oczu, doszklistkowe i pozagałkowe, do stosowania u dorosłych szczurów. Ponadto przedstawiono metodę pobierania tkanek w celu usunięcia en bloc nienaruszonego nerwu wzrokowego i siatkówki od dorosłego szczura. Techniki te umożliwiają badanie ocznych i okołogałkowych skutków indukowanej patologii i leczenia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wizualnych oraz zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania na Uniwersytecie Stanowym Ohio. Do tego badania wykorzystano samce szczurów Sprague Dawley o wadze ~200 g i wieku około 2 miesięcy25. Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Iniekcja doszklistkowa (IVI)
- Podłącz izofluran i przewody odpływowe do portów przyłączeniowych SALOOT. Znieczulenie zwierzęcia należy zastosować przy użyciu standardowych procedur izofluranu zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wizualnych oraz zatwierdzonym protokołem IACUC.
UWAGA: Alternatywnie, jeśli zwierzę było już pod narkozą z innej sesji badań okulistycznych (tj. mieszanina ketaminy i ksylazyny; 90 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny), przenieś zwierzę na platformę chirurgii okulistycznej i miareczkuj znieczulenie izofluranem (1-4%) podawanym tlenem (0,5-1 l/min natężenie przepływu), aby zapewnić utrzymanie odpowiedniej głębokości znieczulenia. - Umieść platformę chirurgii okulistycznej ze znieczulonym zwierzęciem pod żywym mikroskopem operacyjnym. Oceń głębokość znieczulenia za pomocą odruchu wycofania pedału.
- Umieść dwie krople 0,5% roztworu okulistycznego chlorowodorku tetrakainy (znieczulenie miejscowe) do oka lub oczu, które mają być operowane. Nakładaj miejscowe smarujące maści okulistyczne, takie jak hypromeloza 0,3%, na oko po przeciwnej stronie, jeśli nie ma być wykonywana manipulacja.
UWAGA: Smarująca miejscowa maść okulistyczna nie jest dodawana do oka manipulowanego przed zabiegiem, aby zapewnić wyraźną wizualizację podczas zabiegu i rozprowadzania roztworu tetrakainy. Po zabiegu można nałożyć maść smarującą.- Następnie użyj jednej lub dwóch kropli 5% jodu powidonu na powierzchnię oka i za pomocą bawełnianego wacika nałóż powidon-jod na skórę otaczającą oko.
- Użyć strzykawki o pojemności 10 μl z igłą 33 G z końcówką typu 4 o długości 10 mm i kącie 15 stopni i pobrać 0,9% bakteriostatyczny chlorek sodu. Przepłukać strzykawkę i igłę solą fizjologiczną przed zanurzeniem igły w sterylizatorze z gorącymi kulkami.
- Pozwól mu ostygnąć przed kontynuowaniem. Po ostygnięciu igły sporządzić odpowiednią ilość środka terapeutycznego do żądanej ilości (4 μl).
UWAGA: Do badań potwierdzających słuszność koncepcji wykorzystano nierozcieńczony tusz do tatuażu i niebieski barwnik Evan's Blue w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Niebieski proszek Evana zmieszano z PBS aż do zmętnienia. Do badań terapeutycznych potwierdzających słuszność koncepcji wykorzystano następujące stężenia: ibudilast w dawce 1 mg/ml, kwas tauroursodeoksycholowy (TUDCA) 5 mg/ml, cyklosporyna w iniekcji 250 mg/ml i anakinra 100 mg/0,67 ml. Proszki terapeutyczne rozcieńczono w 0,9% soli bakteriostatycznej.
- Pozwól mu ostygnąć przed kontynuowaniem. Po ostygnięciu igły sporządzić odpowiednią ilość środka terapeutycznego do żądanej ilości (4 μl).
- Używając cienkich kleszczyków okulistycznych z zębami, delikatnie chwyć tkankę twardówki na rąbku, aby się ustabilizować. Wokół tęczówki pojawi się słaby czerwony pierścień. Użyj tego pierścienia jako punktu orientacyjnego, włóż igłę, skośną stroną do dołu i wstrzyknij ją do tylnego oka.
UWAGA: Upewnij się, że igła jest ustawiona pod kątem w kierunku siatkówki i wkłada igłę tylko w 2/3 wysokości (Rysunek 1). Upewnij się, że igła nie rysuje soczewki, ponieważ doprowadzi to do powstania zaćmy. - Po wstrzyknięciu leku należy powoli wyjąć igłę. Zamknij oko i utrzymuj ciśnienie przez co najmniej 10-15 s przed spłukaniem solą fizjologiczną.
- Odstawić zwierzę od izofluranu i usunąć go z platformy chirurgii okulistycznej. Umieść kroplę hypromelozy 0,3% w każdym oku, a następnie pozwól zwierzęciu dojść do siebie na poduszce grzewczej.
2. Wtrysk retrogałkowy (RBI)
- Podłącz izofluran i przewody odpływowe do portów przyłączeniowych SALOOT. Znieczulić zwierzę za pomocą standardowych procedur izofluranu.
UWAGA: Alternatywnie, jeśli zwierzę było już pod narkozą z innej sesji badań okulistycznych (tj. mieszanina ketaminy i ksylazyny; 90 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny), przenieś zwierzę na platformę chirurgii okulistycznej i miareczkuj znieczulenie izofluranem (1-4%) podawanym tlenem (0,5-1 l/min natężenie przepływu), aby zapewnić utrzymanie odpowiedniej głębokości znieczulenia. - Umieść platformę chirurgii okulistycznej ze znieczulonym zwierzęciem pod żywym mikroskopem operacyjnym. Oceń głębokość znieczulenia za pomocą odruchu wycofania pedału.
- Umieść dwie krople 0,5% roztworu okulistycznego chlorowodorku tetrakainy (znieczulenie miejscowe) do oka lub oczu, które mają być operowane. Nakładaj miejscowe smarujące maści okulistyczne, takie jak hypromeloza 0,3%, na oko po przeciwnej stronie, jeśli nie ma być wykonywana manipulacja.
UWAGA: Smarująca miejscowa maść okulistyczna nie jest dodawana do oka manipulowanego przed zabiegiem, aby zapewnić wyraźną wizualizację podczas zabiegu i rozprowadzania roztworu tetrakainy. Po zabiegu można nałożyć maść smarującą.- Następnie użyj jednej lub dwóch kropli 5% jodu powidonu na powierzchnię oka i za pomocą włóczni do oczu nałóż powidon-jod na skórę otaczającą oko.
- Zaopatrzyć się w strzykawkę insulinową o pojemności 0,5 ml z igłą 28 g. Sporządzić interesującą Cię terapię do żądanej ilości (100 μl).
UWAGA: Do badań potwierdzających słuszność koncepcji wykorzystano nierozcieńczony tusz do tatuażu i niebieski barwnik Evan's Blue w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Niebieski proszek Evana zmieszano z PBS aż do zmętnienia. Do badań terapeutycznych potwierdzających słuszność koncepcji wykorzystano następujące stężenia: ibudilast w dawce 10 mg/ml, TUDCA w dawce 50 mg/ml, cyklosporyna w iniekcji 250 mg/ml i anakinra w dawce 100 mg/0,67 ml. Proszki terapeutyczne rozcieńczono w 0,9% soli bakteriostatycznej. - Używając cienkich kleszczyków okulistycznych z zębami, delikatnie chwyć dolną powiekę, aby się ustabilizować. Wbić igłę skośną stroną do dołu, pod kątem w połowie odległości między godziną 6 a 7 wzdłuż dolnej krawędzi oczodołu, aż do wyczucia tylnej części panewki ocznej. Lekko odciągnąć igłę do tyłu, a następnie powoli wstrzyknąć środek terapeutyczny (Rysunek 2).
- Delikatnie i powoli wyjąć igłę. Następnie zamknij oko i utrzymuj ciśnienie przez co najmniej 10-15 s przed przepłukaniem solą fizjologiczną.
- Odstawić zwierzę od izofluranu i usunąć go z platformy chirurgii okulistycznej. Umieść kroplę hypromelozy 0,3% w każdym oku, a następnie pozwól zwierzęciu dojść do siebie na poduszce grzewczej.
3. Izolacja tkanki oka
- Po uprzednim poddaniu zwierzęcia eutanazji przez uduszenie CO2 lub w inny sposób określony w zatwierdzonym protokole IACUC, należy umieścić zwierzę w pozycji leżącej mostka. Wykorzystaj poprzeczne nacięcie skóry nad szyją grzbietową, rozciągające się do poziomu małżowiny usznej.
- Wypreparuj mięśnie grzbietowe, aby odsłonić staw szczytowo-potyliczny. Użyj nożyczek majonezowych, aby naciąć staw szczytowo-potyliczny, oddzielając głowę od ciała (Ryc. 3). Za pomocą sekcji delikatnie usuń skórę z czaszki grzbietowej od poziomu nosa do szyi grzbietowej, pozostawiając nienaruszoną skórę wokół obu oczu.
- Włóż parę średnich prostych hemostatów lub igieł do otworu wielkiego u podstawy czaszki. Użyj hemostatów, aby delikatnie przebić się przez boczną czaszkę rozciągającą się od otworu wielkiego do okolicy skroniowej po obu stronach (Ryc. 3).
- Podczas usuwania górnej części czaszki utrzymuj hemostatyki równolegle do grzbietowej strony mózgu. Dzięki temu mózg pozostanie nienaruszony i nie zostanie nacięty w procesie usuwania kości.
- Za pomocą płaskiej szpatułki delikatnie odbij mózg rostralnie, aby odsłonić nerwy wzrokowe. Należy zachować ostrożność, aby napięcie spowodowane ciężarem mózgu nie zostało przyłożone do nerwów wzrokowych.
- Po odsłonięciu nerwów weź parę średnich mikronożyczek i wykonaj małe nacięcie w poprzek skrzyżowania wzrokowego, odcinając oba nerwy od mózgu. W tym momencie mózg można wyrzucić lub umieścić w paraformaldehydzie w PBS (4% PFA) na 24 godziny w temperaturze 4 °C w celu oceny histologicznej.
- Za pomocą małych nożyczek do tęczówki i pary zębatych mikrokleszczyków okulistycznych ostrożnie usuń nadmiar tkanki (tj. powieki, tkankę łączną itp.) z okolic oka. Po zakończeniu oko powinno znajdować się w oczodole, ale nadal obecne są tylko mięśnie i gruczoły zewnątrzgałkowe.
- Używając hemostatów w połączeniu z małymi nożyczkami do tęczówki, przetnij oczodół, bardzo uważając, aby nie przeciąć nerwu wzrokowego, gdy przechodzi on przez kanał wzrokowy. Ostrożnie oderwij kość z tyłu zębodołu za pomocą hemostatów, a dla bardziej precyzyjnej kontroli użyj małych nożyczek do preparacji.
- Po usunięciu kości delikatnie przeciąć okolice oczodołu za pomocą mikronożyczek i cienkich kleszczy, aby usunąć poduszeczki tłuszczowe, gruczoły i mięśnie zewnątrzgałkowe. Upewnij się, że podczas tego procesu zwracasz uwagę na nerwy wzrokowe.
- Oko powinno być w stanie delikatnie odbić doogonowo w kierunku wnętrza czaszki. W tym momencie użyj małych mikronożyczek i cienkich kleszczy, aby usunąć tkankę łączną otaczającą nerw na dolnym grzbiecie czaszki.
- Po usunięciu tej tkanki oko i cały nerw wzrokowy powinny być w stanie zostać podniesione z czaszki en bloc. Powtórz te kroki dla przeciwległego oka i nerwu.
- Ponadto oczyść nerw wzrokowy i oko z nadmiaru tkanki, takiej jak osłonka opony twardej. Jeżeli tkanki nie muszą być konserwowane do analizy histologicznej, należy je błyskawicznie zamrozić przy użyciu suchego lodu lub ciekłego azotu przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C.
- W przypadku spektrometrii mas siatkówka musi zostać odizolowana od wewnętrznego obszaru kuli ziemskiej, a nerw wzrokowy musi zostać odizolowany. Oddziel nerw wzrokowy od gałki ocznej w najbliższym punkcie zewnętrznym. Umieścić nerw w krioprobówce na lodzie przed przeniesieniem do -80 °C.
- Umieść gałkę oka na szalce Petriego pod mikroskopem operacyjnym. Użyj pary zakrzywionych kleszczy, aby przytrzymać oko stabilnie, zanim wykonasz nacięcie na rąbku za pomocą małych mikronożyczek.
- Wydłuż cięcie tak, aby obejmowało cały obwód kuli ziemskiej. Kula ziemska powinna być przecięta na pół, a przednia część może zostać odrzucona.
- Umieść tylną część częścią wewnętrzną do góry i za pomocą cienkiej pęsety okulistycznej usuń cienką kremową chusteczkę. Może się wydawać, że przykleja się do tarczy nerwu wzrokowego. W takim przypadku należy użyć mikronożyczek, aby odciąć siatkówkę od dysku.
UWAGA: Tkankę siatkówki można następnie umieścić w krioprobówce na lodzie przed przeniesieniem do temperatury -80 °C. Tkanki można następnie przenieść do urządzenia do spektrometrii mas w celu oceny.
- W przypadku barwienia immunohistologicznego za pomocą częściowej perfuzji umieść nienaruszone oko na szalce Petriego. Użyj pary zakrzywionych kleszczy, aby przytrzymać oko stabilnie, zanim weźmiesz strzykawkę insulinową z igłą 28 G i włożysz ją w rąbek, z igłą skierowaną w kierunku siatkówki. Powtórz ten krok w kolejnych dwóch punktach wzdłuż rąbka. Nakłucie gałki ziemskiej pomaga zapewnić odpowiednią perfuzję i pomaga w prawidłowym utrwaleniu.
UWAGA: Kula powinna być zamocowana w 4% PFA przez co najmniej 40 minut przed przejściem do wytrząsarki i mieszaniem z niską prędkością przez dodatkowe 20 minut, aby ułatwić ruch płynu. - Po zakończeniu etapu utrwalania usuń PFA i zastąp go PBS. Umieść fiolki na delikatnym wstrząsaniu przez 15 minut, a następnie powtórz ten krok przez drugie 15-minutowe płukanie PBS.
- Po ostatnim cyklu płukania PBS odessać PBS i zastąpić go 30% roztworem sacharozy w PBS, a następnie przechowywać w lodówce przez 24 godziny. Po etapie inkubacji sacharozy osadź tkankę w OCT w celu oceny histologicznej26.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wstępne eksperymenty pilotażowe przeprowadzono na zwierzętach martwych, wykorzystując barwnik wstrzykiwalny (barwnik Evans Blue) oraz tusz do tatuażu (Rysunek 2B), aby zoptymalizować umiejscowienie i rozmiar igły zarówno dla RBI, jak i IVI. Tusz do tatuażu nie był rozcieńczany, natomiast proszek Evans Blue mieszano w PBS, aż płyn stał się nieprzezroczysty. Stwierdzono, że optymalne RBI wykorzystuje igłę 28 G wprowadzoną pod kątem pomiędzy godziną 6 a 7 wzdłuż dolnej krawędzi oczodołu, aż do ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Skomplikowane wyzwania związane z dostarczaniem leków do siatkówki i nerwu wzrokowego, głównie ze względu na nieprzepuszczalną barierę stwarzaną przez BRB, podkreślają znaczenie tego badania 3,4. Badanie technik IVI i RBI nie tylko podkreśla innowacyjne podejścia do pokonywania tych przeszkód, ale także podkreśla szersze implikacje dla opieki okulistycznej i rozwoju terapeutycznego. Odkrycia te pokazują, że zarówno IVI, jak i RBI mogą ułatwić celowane dostarczani...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.
Podziękowania
Ta praca została częściowo sfinansowana przez Amerykańskie Nagrody Programu Badań nad Wizją W81XWH-15-1-0074 i W81XWH-22-1-0989. Opinie lub twierdzenia zawarte w niniejszym dokumencie są prywatnymi poglądami autorów i nie mogą być interpretowane jako oficjalne lub odzwierciedlające poglądy Departamentu Armii lub Departamentu Obrony. Ten grant badawczy był częściowo wspierany przez Ohio Affiliate of Prevent Blindness Young Investigator Student Fellowship Award for Females Scholars in Vision Research. Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie ze strony Fundacji Rossa. Usługi były wykonywane w ramach OSU Vision Sciences Research Core Program w ramach P30EY032857. Chcielibyśmy podziękować Laboratorium i Zasobom Zwierzęcym Uniwersytetu Stanowego Ohio (ULAR). Ponadto chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Reilly: Michelle Mosko, Emmie Lally, Samowi Duckworthowi i Eve Howard. Chcielibyśmy również podziękować Bongsu Kim za wkład w projekt SALOOT, a także Elizabeth Urbanski i Ryanowi Webbowi. Rysunek 1, rysunek 2A i rysunek 3 zostały utworzone za pomocą BioRender.com.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Anakinra 100 mg/0,67 ml | Sobi | NDC: 66658-0234-07 | |
| Chlorowodorek antypamezolu (Antisedan) 5,0 mg/ml | Zoetis | NADA #141-033 | 107204-8 | |
| Bakteriostatyczny chlorek sodu (0,9%) | Hospira Inc. | NDC: 0409-1966-02 | |
| Rurka kriogeniczna | VWR | 76417-258 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=76417-258 |
| Kleszcze zakrzywione | Fischer Naukowy | 08-953F | |
| cyklosporyna do wstrzykiwań 250 mg/ml | Perrigo | NDC: 00574-0866-10 | |
| cyklosporyna miejscowa, 0,05% (Restasis) | AbbVie (Vizient) | NDC: 00023-9163-30 | |
| Nasadka Cyotube | Thermo Scientific | 3471BLK | https://www.fishersci.com/shop/products/screw-cap-microcentrifuge-tube-caps/14755237?searchHijack=true&searchTerm= nakrętka-mikrowirówka-nasadka-probówka& searchType=Szybki& dopasowanyKotNo=14755237 |
| Evans Niebieski | Sigma-Aldrich | E2129-10G | |
| Włócznie do oczu | Fischer Scientific | NC0972725 | https://www.fishersci.com/shop/products/ultracell-pva-eye-spears-100-p/NC0972725 |
| Kleszcze drobnoziarniste | Fischer Naukowy | 08-953E | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-dissecting-jewelers-microforceps-2/08953E?gclid=Cj0KCQiAkJO8BhCGARIsAM kswyiER9Kanmi3ZMgoXTr82Zg3 g44m1Q6WLftkYfb36hC7pbkwR hVAy3MaAqkLEALw_wcB& ef_id =Cj0KCQiAkJO8BhCGARIsAMks wyiER9Kanmi3ZMgoXTr82Zg3g4 4m1Q6WLftkYfb36hC7pbkwRhV Ay3MaAqkLEALw_wcB:G:s& PPC _id=PLA_goog_2086145680_81 843405274_08953E__38624700 1354_6556597232892883360& ev_chn=sklep& s_kwcid=AL!4428 !3!386247001354!!! g!827721591 040!& _source=1 |
| Cienkie kleszczyki okulistyczne z zębami | Fisher Scientific | 50-253-8287 | https://www.fishersci.com/shop/products/bonn-suturing-forceps-7-5-cm/502538287 |
| Szpatułka płaska | Fischer Naukowy | 14-375-100 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-spoonula-lab-spoon/1437510#?keyword= |
| Sterylizator gorących kulek | Fine Science Tools | 18000-45 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Instrument-Care-Accessories/Sterilization/Hot-Bead-Sterilizers |
| Hypromeloza 0,3% (żel do suchego oka GenTeal Tears) | Alcon Laboratories Inc. | https://www.amazon.com/GenTeal-Tears-Lubricant-Ointment-Night-Time/dp/B01IN5G1L0/ref=sr_1_4?dib=eyJ2IjoiMSJ9.DxYpqjIIBNO TVuPo7jln5xeGazA_YFg0cbt3 kCyC-0ouZARw5qIHYvCM7vB R_vO30OWUEXDZhQmQfLQ9 ySld4mujpzrWjxbsEXLBs5JPhjZ eUPgPY0sHoJA46f9EYULdxiTu BQy5fVA2OB20RV09mbdW8hX 6j8-bXIYTZljPGMo5_GMq9jnJo8< > 3iR35c1THxEiEH2FsvSx7VXup- QK9uCkWwAYrw2v3tyLUCq2JT APPF34nsYqGnSASMgOARU_ 2lVz-kIy-QUEYHGOoIimIWwBY htz33RkFrq7YjtnC2uDbImNiudG zWJv-uUhmJngYjbBGbeWE0VX 7CGPkEokUZrCQ8AI2HeXjSMph gPhMbK88RcHJ63AyH0TiBtS2k1 Xceh-CD26_prJSNxF6Mv5-jgGf9 iLmXvVtKkkSwc-5uYLk7gZHaFC Yj73F_imbmeHYr.4vfu7h4m4Jlfy- qiqmgeAnDHlJTGYV22HJ2w_xD ir0k& dib_tag=se& słowa kluczowe=Gent eal+gel& qid=1736793609& sr=8-4 | |
| ibudilast | Millipore Sigma | I0157-10MG | |
| 0,5 ml z igłą Micro-Fine IV o rozmiarze 28 | Becton, Dickinson and Company (BD) | 14-826-79 | |
| Izofluran | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | |
| Ketamina | Covetrus | NDC: 11695-0703-1 | |
| Long Evans Rat | Charles River Laboratories International, Inc. | ||
| https://www.criver.com/products-services/find-model/long-evans-rat?region=3611 Nożyczki majonezowe | Mikroskopia elektronowa Nauki | 72968-03 | |
| Średnie mikronożyczki | Amazon | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z168866#product-documentation | |
| Średnie hemostataty proste lub wkrętaki igłowe | Sigma-Aldrich | Z168866-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z168866#product-documentation |
| Needle 33 G z końcówką typu 4 o długości 10 mm i kącie 15 stopni | Hamilton | 7803-05 | |
| paraformaldehyd 4 w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (4% PFA) | Termo Fischer | J61899. | |
| szalka Petriego | Millipore Sigma | P5606-400EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5606?utm_source=google&utm_medium= cpc& utm_campaign=8674694095 & utm_content=105162454052& _source=1& gclid=Cj0KCQiA kJO8BhCGARIsAMkswygXXfgY ABr7EfLtf4tvuLS0E8A4SxX4XM NJQDaI80Yi4FO-iahCsPcaAp9E EALw_wcB |
| sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p3813 |
| Jod powidonu (betadyna) 5% | Alcon Laboratories Inc. | NDC: 0065-0411-30 | |
| Wytrząsarka model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| Nożyczki do małych przysłon | Sigma-Aldrich | Z265977-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z265977& |
| małe mikronożyczki | Fisher Scientific | 17-456-004 | https://www.fishersci.com/shop/products/self-opening-scissors-2/17456004?keyword=true |
| Sprague Dawley Rat | Charles River Laboratories International, Inc. | SAS 400 | https://emodels.criver.com/product/400 |
| Sacharoza | Millipore Sigma | 57-50-1 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/substance/sucrose3423057501 |
| strzykawka 10 & mikro; L (Model 701 RN) | Hamilton | 80330 | |
| (tusz do tatuażu Intenze True Black 1 uncja) | Amazon | https://www.amazon.com/Intenze-Tattoo-Ink-True-Black/dp/B01GW747L2 | |
| kwas tauroursodeoksycholowy (TUDCA) | Milipore Sigma | 580549-1GM | |
| Chlorowodorek tetrakainy Roztwór okulistyczny 0,5% | Bausch & Lomb Inc. | NDC: 68682-920-64 | |
| Ksylazyna (Rompun) 100 mg/ml | Dechra | NADA #047-956 | |
Bibliografia
- Nguyen, D. D., Lai, J. -Y. Advancing the stimuli response of polymer-based drug delivery systems for ocular disease treatment. Polym Chem. 11 (44), 6988-7008 (2020).
- Tsai, C. -H., et al. Ocular drug delivery: Role of degradable polymeric nanocarriers for ophthalmic application. Int J Mol Sci. 19 (9), ijms19092830(2018).
- Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules (Basel, Switzerland). 24 (8), 24081583(2019).
- Ryan, A. K., Rich, W., Reilly, M. A. Oxidative stress in the brain and retina after traumatic injury. Front Neurosci. 17, 1021152(2023).
- De Matteis, V., Rizzello, L. Noble metals and soft bio-inspired nanoparticles in retinal diseases treatment: A perspective. Cells. 9 (3), 679(2020).
- O'Leary, F., Campbell, M. The blood-retina barrier in health and disease. FEBS J. 290 (4), 878-891 (2023).
- del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Prog Retin Eye Res. 57, 134-185 (2017).
- Nguyen, D. D., Luo, L. -J., Yang, C. -J., Lai, J. -Y. Highly retina-permeating and long-acting resveratrol/metformin nanotherapeutics for enhanced treatment of macular degeneration. ACS Nano. 17 (1), 168-183 (2023).
- Luo, L. -J., et al. Targeting nanocomposites with anti-oxidative/inflammatory/angiogenic activities for synergistically alleviating macular degeneration. App Mat Today. 24, 101156(2021).
- Naik, S., et al. Small interfering RNAs (siRNAs) based gene silencing strategies for the treatment of glaucoma: Recent advancements and future perspectives. Life Sci. 264, 118712(2021).
- Luo, L. -J., Nguyen, D. D., Lai, J. -Y. Dually functional hollow ceria nanoparticle platform for intraocular drug delivery: A push beyond the limits of static and dynamic ocular barriers toward glaucoma therapy. Biomat. 243, 119961(2020).
- Ghate, D., Brooks, W., McCarey, B. E., Edelhauser, H. F. Pharmacokinetics of intraocular drug delivery by periocular injections using ocular fluorophotometry. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (5), 2230-2237 (2007).
- Soni, V., Pandey, V., Tiwari, R., Asati, S., Tekade, R. K. Chapter 13 - Design and evaluation of ophthalmic delivery formulations. Basic Fund Drug Deliv. , 473-538 (2019).
- Varela-Fernández, R., et al. Drug delivery to the posterior segment of the eye: Biopharmaceutic and pharmacokinetic considerations. Pharmaceutics. 12 (3), 313(2020).
- Chiu, K., Chang, R. C. -C., So, K. -F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), e313(2007).
- Park, I., Park, H. S., Kim, H. K., Chung, W. K., Kim, K. Real-time measurement of intraocular pressure variation during automatic intravitreal injections: An ex-vivo experimental study using porcine eyes. PLOS One. 16 (8), e0256344(2021).
- Cosan, S., et al. Effect of retrobulbar prostaglandin analog injection on orbital fat in rats. Int Ophthal. 43 (12), 4985-4990 (2023).
- Levy, Y., Kremer, I., Shavit, S., Korczyn, A. D. The pupillary effects of retrobulbar injection of botulinum toxin A (oculinum) in albino rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 32 (1), 122-125 (1991).
- Jbara, D., Eiger-Moscovich, M., Didkovsky, E., Keshet, Y., Avisar, I. In vivo effects of prostaglandin analogs application by topical drops or retrobulbar injections on the orbital fat of a rat model. Ocular Imm Inflamm. 31, 1-6 (2022).
- Eftekhari, K., et al. Histologic evidence of orbital inflammation from retrobulbar alcohol and chlorpromazine injection: A clinicopathologic study in human and rat orbits. Ophthal Plastic and Reconstr Surg. 32 (4), 302-304 (2016).
- Bohnert, B. N., et al. Retrobulbar sinus injection of doxorubicin is more efficient than lateral tail vein injection at inducing experimental nephrotic syndrome in mice: A pilot study. Lab Animals. 53 (6), 564-576 (2019).
- Socher, M., Kuntz, J., Sawall, S., Bartling, S., Kachelrieß, M. The retrobulbar sinus is superior to the lateral tail vein for the injection of contrast media in small animal cardiac imaging. Lab Animals. 48 (2), 105-113 (2014).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals. 40 (5), 155-160 (2011).
- Pozyuchenko, K., et al. Investigating animal models of optic neuropathy: An accurate method for optic nerve and chiasm dissection in mice. J Neurosci Methods. 331, 108527(2020).
- Sengupta, P. The laboratory rat: Relating its age with human's. Int J Prevent Med. 4 (6), 624-630 (2013).
- Ryan, A. K., et al. Torsion-Induced Traumatic Optic Neuropathy (TITON): A physiologically relevant animal model of traumatic optic neuropathy. PLOS One. 20 (1), e0312220(2025).
- Bora, K., et al. Assessment of Inner blood-retinal barrier: Animal models and methods. Cells. 12 (20), 2443(2023).
- Vinores, S. A. Breakdown of the blood-retinal barrier. Encyc Eye. , 216-222 (2010).
- Heisler-Taylor, T., et al. Multimodal imaging and functional analysis of the chick NMDA retinal damage model. PLOS One. 16 (9), e0257148(2021).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
