Artykuł metodologiczny

Ortotopowy przeszczep kończyn przednich szczura

DOI:

10.3791/68050

⸱

22 lipca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departent of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Microsurgery and Preclinical Research Core, Comprehensive Transplant Center, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 3Department of Surgery, University of Pennsylvania, 4Department of Plastic Surgery, Campus Charité Mitte | Campus Virchow-Klinikum, Charité – Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin and Berlin Institute of Health, 5Berlin Institute of Health, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 6Department of Visceral, Transplant, and Thoracic Surgery, Medical University of Innsbruck

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół, który demonstruje mikrochirurgiczną wykonalność przeszczepu kończyn przednich u szczurów. Model ten może służyć jako ważna platforma translacyjna dla badań VCA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unaczyniona allotransplantacja kompozytowa (VCA) polega na przeszczepianiu wielu typów tkanek - w tym skóry, mięśni, kości i nerwów - oferując obiecującą opcję rekonstrukcyjną dla pacjentów z ciężkimi urazami lub zniekształceniami. Pomimo swojego potencjału transformacyjnego, VCA napotkał poważne wyzwania, takie jak odrzucenie przeszczepu, przewlekłe powikłania immunosupresji i zawiłości odzyskiwania nerwowo-mięśniowego.

Wykorzystujemy model kończyn przednich szczura jako opłacalną i anatomicznie istotną platformę, aby sprostać tym wyzwaniom. Kończyna przednia szczura ściśle odzwierciedla anatomię kończyn ludzkich, co zwiększa wpływ translacyjny naszych odkryć. Wcześniejsze badania potwierdziły, że model ten umożliwia wiarygodny i powtarzalny pomiar sprawności funkcjonalnej, ustanawiając go tym samym jako kluczowe narzędzie do oceny trajektorii odrzucania przeszczepów kończyn przednich.

Ponadto, model oferuje cenną okazję do odkrywania innowacyjnych podejść terapeutycznych i służy jako dobra platforma translacyjna dla nowych technik konserwacji. Poprzez dalsze badania tego modelu dążymy do pogłębienia naszej wiedzy na temat mechanizmów stojących za odrzucaniem przeszczepu i regeneracją nerwowo-mięśniową. Ostatecznie prace te mają na celu utorowanie drogi do poprawy wyników klinicznych VCA, rozwiązując zarówno obecne ograniczenia, jak i przyszłe wyzwania w medycynie transplantacyjnej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) to zmieniająca życie procedura rekonstrukcji poważnych wad tkanek. VCA odnosi się do przeszczepu tkanki złożonej składającej się ze skóry, mięśni, kości, tkanki łącznej, naczyń krwionośnych i nerwów. Dalsze udoskonalanie i eksploracja technik VCA przyniosłoby ogromne korzyści pacjentom cierpiącym na urazowe urazy lub zniekształcenia1. Jednak jego szersze zastosowanie jest utrudnione przez ciągłe przeszkody, takie jak odrzucenie przeszczepu, powikłania związane z długotrwałą immunosupresją, regeneracja nerwowo-mięśniowa i logistyka okołotransplantacyjna.

Model kończyn przednich szczura stał się preferowanym wyborem do badań VCA ze względu na jego opłacalność i bliskie podobieństwo do ludzkich cech anatomicznych i nerwowo-mięśniowych2,3. Nasze wcześniejsze prace wykazały, że model ten zapewnia niezawodny i powtarzalny sposób oceny behawioralnego odzyskiwania funkcjonalnego4. W tym badaniu przedstawiamy szczegółowy przewodnik krok po kroku po podstawowych technikach mikrochirurgicznych wymaganych dla tego modelu.

W miarę rozwoju badań nad VCA, model kończyn przednich szczura pozwoli na mechanistyczne badanie procesu odrzucania, regeneracji nerwów i odzyskiwania funkcji nerwowo-mięśniowej. Naukowcy mogą badać nowe techniki konserwacji, oceniać skuteczność metod perfuzji maszynowej i testować nowe terapie immunomodulujące, które mogą pomóc w zmniejszeniu obecnej zależności od długoterminowej immunosupresji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zabiegi chirurgiczne zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa (RA18M74) zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez National Institutes of Health i American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care.

1. Procedura dawcy (Rysunek 1)

  1. Przeprowadzić indukcję znieczulenia poprzez inhalację izofluranu w stężeniu 5% i utrzymywać na poziomie 1% przez cały zabieg. Rozpocznij zabieg po potwierdzeniu dokładnego poziomu znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi.
  2. Wykonaj nacięcie obwodowe około 1 cm powyżej łokcia. Podziel skórę i odsłoń leżącą pod nią powierzchowną tkankę podskórną, nie uszkadzając jej (Rysunek 1A).
  3. Wypreparuj tkankę podskórną/powięź, kauteryzuj wszystkie powierzchowne naczynia i przetransektuj. Następnie odsłonięty zostanie naramiennik, część mięśnia piersiowego większego i mięsień trójgłowy ramienia.
  4. Tępo rozkrój mięsień piersiowy większy, odsłaniając naczynia ramienne, a także nerw pośrodkowy i łokciowy (Ryc. 1B).
  5. Kauteryzuj żyłę powierzchowną na mięśniu naramiennym i przechodź proksymalnie, a następnie przeciąć mięsień naramienny prostopadle do orientacji włókien mięśniowych. Następnie rozkrój i przeciąć mięsień piersiowy większy i mniejszy, odsłaniając tętnicę pachową, żyłę i nerw. (Rysunek 1C).
  6. Przeciąć nerw środkowy, łokciowy i promieniowy na ich bliższym końcu (zaraz po rozszczepieniu), zachowując jak największą długość.
  7. Wypreparuj i uwolnij tętnicę ramienną i żyłę.
  8. Przeciąć mięsień dwugłowy ramienia, mięsień trójgłowy ramienia i mięsień najszerszy grzbietu. Upewnij się, że kość ramienna jest odpowiednio odsłonięta po zakończeniu sekcji.
  9. Użyj kleszczyków rongeur, aby przeciąć kość dystalną do guzowatości naramiennej kości ramiennej.
  10. Delikatnie sprawdź światło tętnicy i żyły ramiennej (Rysunek 1C). Przepłucz przeszczep 6 ml heparynizowanej soli fizjologicznej.
  11. Zamontuj mankiet poliimidowy odpowiednio na tętnicy ramiennej i żyle (Rysunek 1D).
  12. Owinąć przeszczep wilgotną gazą bawełnianą i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  13. Poddać eutanazji szczura dawcy poprzez przedawkowanie wziewnego środka znieczulającego (izofluranu). Gdy całkowicie przestaniesz reagować na szczypanie palca u nogi, wykonaj torakotomię i wytnij serce.

2. Procedura odbioru (Rysunek 2)

  1. Przeprowadzić indukcję znieczulenia poprzez inhalację izofluranu w stężeniu 5% i utrzymywać na poziomie 1% przez cały zabieg. Potwierdź stan znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi.
  2. Wykonaj nacięcie obwodowe około 1-2 cm powyżej łokcia.
  3. Wypreparuj naczynia podskórne i kauteryzuj większe naczynia, aby odsłonić mięsień naramienny, część mięśnia piersiowego większego i mięsień trójgłowy ramienia.
  4. Wykonaj rozwarstwienie poniżej mięśnia piersiowego większego, aby odsłonić naczynia ramienne, a także nerw pośrodkowy i łokciowy.
  5. Przeciąć mięsień naramienny i część mięśnia piersiowego większego i mniejszego na ich dystalnym końcu, odsłaniając naczynia ramienne, nerwy pośrodkowe i łokciowe (Ryc. 2A).
  6. Wypreparuj i przeciąć nerw pośrodkowy i łokciowy na ich dystalnym końcu. Podwiązywać wszystkie gałęzie naczyniowe (Rysunek 2B).
  7. Przeciąć mięsień dwugłowy ramienia, mięsień trójgłowy ramienia i mięsień najszerszy grzbietu, aby odsłonić kość ramienną. Ostrożnie kauteryzować wszelkie krwawienia z przeciętych mięśni.
  8. Przeciąć kość ramienną w guzowatości naramiennej. Użyj wosku kostnego, aby uszczelnić jamę szpiku.
  9. Użyj pręta śródszpikowego, aby ponownie połączyć jamę szpiku kostnego dawcy i biorcy, a następnie użyj wosku kostnego, aby uszczelnić połączenie. Zszyj mięsień trójgłowy ramienia szwem wchłanialnym 6-0, tworząc w ten sposób platformę do zespolenia naczynia.
  10. Wykonaj neurorrhaphy epiperineurial z przerwanym szwem 10-0 nerwu promieniowego.
  11. Wykonać zespolenie naczyniowe przy użyciu techniki mankietu bez szwów (Rysunek 2C).
  12. Wykonaj neurorrhaphy epiperineurial z przerwanymi szwami 10-0, aby ponownie połączyć nerw pośrodkowy i łokciowy (Ryc. 2D).
  13. Ponownie połącz mięsień naramienny i mięsień piersiowy większy za pomocą przerywanych szwów.
  14. Zamknij ranę niewchłanialnym szwem 4-0.
  15. Pod koniec operacji należy podać podskórnie ciepłą, sterylną sól fizjologiczną w ilości 2% masy ciała.
  16. Obserwuj zwierzę przez co najmniej 4 godziny pod lampą rozgrzewającą w celu odzyskania sprawności. Zwróć go do pomieszczenia dla zwierząt, gdy jest przytomny, może się wyprostować, wykazywać skoordynowane ruchy i samodzielnie zdobywać wodę i pożywienie.

3. Długoterminowe postępowanie po przeszczepie

  1. Codziennie monitoruj zwierzęta pod kątem oznak bólu i niepokoju, jak zdefiniowano poniżej.
    1. Sprawdź, czy nie ma anoreksji, na którą wskazuje brak kału w klatce.
    2. Sprawdź, czy zwierzę nie pije wody, co prowadzi do odwodnienia objawiającego się zwinięciem skóry.
    3. Sprawdź, czy zwierzę jest zgarbione, nie chce się ruszać, faworyzuje kończynę lub pilnuje miejsca nacięcia.
    4. Sprawdź, czy zwierzę nie dba o pielęgnację, odbijając się w potarganej lub brudnej sierści.
    5. Sprawdź, czy zwierzę nadmiernie liże/drapie się. Sprawdź, czy w miejscu nacięcia nie ma zaczerwienienia i obrzęku oraz samookaleczenia.
    6. Sprawdź, czy nie ma agresywnego zachowania, zwłaszcza podczas próby podniesienia zwierzęcia.
    7. Sprawdź, czy zwierzę dyszy, ma trudności z oddychaniem i ma czerwono-brązową wydzielinę z nosa/oczu.
    8. Sprawdź, czy nie ma sepsy.
  2. Zdejmij szwy po 14 dniach od operacji.
  3. Drugą dawkę buprenorfiny SR należy podać (dawka dla szczurów: 1,0 mg/kg mc. podp.c.) w 2. dobie pooperacyjnej (POD2; 48 godzin po podaniu dawki początkowej).
  4. Rozpocznij cotygodniową ocenę funkcjonalną w 4 tygodniu po przeszczepie.
    1. Krótko, w znieczuleniu ogólnym, unieruchomić przednią kończynę zwierzęcia pod kątem 90°. Umieść dwie elektrody igłowe w odległości 1 mm od siebie pod pachą w pobliżu wprowadzenia mięśnia piersiowego większego na kość ramienną.
    2. Stymulować przezskórnie nerw pośrodkowy bliższym pod napięciem 10 V, aby wywołać maksymalny skurcz tężcowy zginaczy.
    3. Gdy pełne zgięcie cyfrowe utworzy uścisk, umieść metalową pętlę połączoną z miernikiem siły na dłoni i zabezpiecz ją w zgiętych palcach. Następnie pociągnij miernik siły, aż uchwyt zostanie utracony, rejestrując maksymalną siłę (w niutonach).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeżywalność przeszczepu może być monitorowana i określana za pomocą obserwacji makroskopowej. Reprezentatywne zdjęcia zarówno krótkoterminowej (POD7), jak i długoterminowej obserwacji (POD120) są pokazane w Rysunek 3. Przeszczep mógł się zregenerować bez widocznych oznak martwicy. Dane dotyczące przeżycia są pokazane w Rysunek 4. Zarówno próbki skóry, jak i mięśni są pobierane w wyznaczonym punkcie końcowym. Reprezentatywne obrazy histologiczne są pokazane w R...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ortotopowy przeszczep kończyn przednich u szczurów jest powszechnie stosowanym modelem w eksperymentalnym przeszczepie rekonstrukcyjnym, ponieważ nie tylko zawiera unaczynione tkanki kompozytowe, ale także pozwala na ocenę powrotu do sprawności. Konwencjonalna technika szycia zespolenia naczyniowego jest bardzo złożona i wymaga zaawansowanych umiejętności mikrochirurgicznych, które wymagają lat szkolenia mikrochirurgicznego. Aby znacznie skrócić czas i koszty, w tym zmodyfikowanym modelu kończyny przedniej szczura zastos...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gerald Brandacher jest doradcą medycznym X-Therma i Ossium Health.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Grant 1R43HL158398 (NIH), 5R44AI145782 (NIH) oraz Maryland stem cell 2020-MSCRFL-5414. Chcemy podziękować naszej kierowniczce laboratorium, Angeli Estevez, za jej wsparcie w tym badaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10-0 Niesterylny mikroszewAROSurgicalTK-107038
4-0 Sharpoint Nylon BlackesuturesA1667N
4-0 Sharpoint Polysyn TaperesuturesG214N
mL strzykawkiMDC2045
6-0 jedwabFisher ScientificNC9742105
ABB-22 V Podwójne mikro naczynieS& T00480
B-1 V Pojedynczy zacisk mikro naczyniaS& T00462
BD Quincke Igły do rdzenia kręgowego405073
Mikroigłowe uchwyty do igieł CastroviejoFST12061-02
Miernik siły Chatilon DFE II AmetekDFE II
Bawełniana końcówkaJH Supply store100252
Drobne nożyczki - węglik wolframuFST14569-09
KleszczeS& TFRS-15 RM-8
Gąbki z gazyFisher Scientific22-362178
Hemostatyki Halsted-MosquitoFST13009-12
HeparynaJHH AptekaNDC 63323-540-05
Cewnik dożylny Radionieprzepuszczalny 24 GSMTH5053
Jubilerzy Bipolarne kleszcze koagulacyjne, stal nierdzewnaASSI103000BPS03
Nożyczki sprężynowe Vannas z okrągłym uchwytemFST15400-12
Kleszcze specjalneS& TFRAS-15 RM-8
Rozszerzacze naczyń - Instrumenty zrównoważoneFST18602-15
5 Seria

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schneeberger, S., et al. First forearm transplantation: outcome at 3 years. Am J Transplant. 7 (7), 1753-1762 (2007).
  2. Heinzel, J. C., et al. Evaluation of functional recovery in rats after median nerve resection and autograft repair using computerized gait analysis. Front Neurosci. 14, 593545(2020).
  3. Vela, F. J., et al. Animal models used to study direct peripheral nerve repair: a systematic review. Neural Regen Res. 15 (3), 491-502 (2020).
  4. Kern, B., et al. A novel rodent orthotopic forelimb transplantation model that allows for reliable assessment of functional recovery resulting from nerve regeneration. Am J Transplant. 17 (3), 622-634 (2017).
  5. Sarhane, K. A., et al. Defining the relative impact of muscle versus Schwann cell denervation on functional recovery after delayed nerve repair. Exp Neurol. 339, 113650(2021).
  6. Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. (92), e50753(2014).
  7. Furtmuller, G. J., et al. Orthotopic hind limb transplantation in the mouse. J Vis Exp. (108), e53483(2016).
  8. Pendexter, C. A., et al. Development of a rat forelimb vascularized composite allograft (VCA) perfusion protocol. PLoS One. 18 (1), e0266207(2023).
  9. Amin, K. R., et al. Randomized preclinical study of machine perfusion in vascularized composite allografts. Br J Surg. 108 (5), 574-582 (2021).
  10. Rezaei, M., et al. Ex vivo normothermic perfusion of human upper limbs. Transplantation. 106 (8), 1638-1646 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Naczyniowa transplantacja z o onamodel przedniej ko czyny szczuraodrzucanie przeszczepuregeneracja nerwowo mi niowaprzewlek a immunosupresjapowr t funkcjitransplantacja ko czynymedycyna transplantacyjnatransplantacja tkanek
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły