Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Komórki podobne do wysp trzustkowych pochodzące z przeszczepu komórek przewodowych szczurom

465 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68066

⸱

1 sierpnia 2025

 , 
1Department of Physiology, Ankara Medipol University Faculty of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Komórki podobne do wysp trzustkowych pochodzące z komórek przewodowych wykazują potencjał w leczeniu cukrzycy poprzez obniżenie poziomu glukozy we krwi i zwiększenie produkcji insuliny u szczurów z cukrzycą. Niemniej jednak nadal istnieją wyzwania związane z zapewnieniem wystarczającego funkcjonowania komórek, obrony immunologicznej i bezpieczeństwa. Konieczne są dodatkowe badania w celu zwiększenia zdolności terapeutycznych tych substancji.

Streszczenie

Wykorzystanie komórek podobnych do wysp trzustkowych pochodzących z komórek przewodowych pojawiło się jako potencjalne podejście do leczenia cukrzycy typu 1. Pacjenci z cukrzycą mają niewystarczającą syntezę insuliny w organizmie z powodu autoimmunologicznego niszczenia komórek beta trzustki odpowiedzialnych za wytwarzanie insuliny. W tym kontekście celem przeszczepu komórek wysp trzustkowych jest przywrócenie pacjentom zdolności do wytwarzania insuliny. Jednak przeszkody, takie jak niewystarczające pozyskiwanie komórek wysp trzustkowych z trzustki dawcy i reakcje immunologiczne, utrudniają szerokie zastosowanie tej metody terapii. W określonych okolicznościach komórki przewodowe trzustki mają zdolność przekształcania się w komórki produkujące insulinę. Komórki te mogą być hodowane w kontrolowanym środowisku i przekształcane w komórki podobne do wysp trzustkowych, które mają zdolność uwalniania insuliny, dzięki czemu nadają się do przeszczepu. Ta innowacyjna strategia oferuje potencjał do zatrzymania postępu cukrzycy typu 1 i zmniejszenia zależności od zastrzyków insuliny. W tym badaniu komórki podobne do wysp trzustkowych pochodzące z komórek przewodowych zostały przeszczepione do wątroby przez żyłę wrotną wątroby u szczurów z cukrzycą wywołaną streptozotocyną. Po przeszczepie zauważyliśmy znaczne obniżenie poziomu glukozy we krwi szczurów, począwszy od 5 dnia, które utrzymywało się przez 15 dni. Ponadto dootrzewnowy test tolerancji glukozy (IPGTT) wykazał, że szczury z cukrzycą, którym przeszczepiono komórki przypominające wyspy trzustkowe, wytwarzały znacznie więcej insuliny niż grupa kontrolna. Wyniki te sugerują, że komórki przypominające wyspy trzustkowe pochodzące z komórek przewodowych mogą być obiecującym podejściem terapeutycznym w cukrzycy. Do głównych przeszkód w tej dziedzinie badań należy osiągnięcie wystarczającej zdolności funkcjonalnej komórek, ochrona ich przed układem odpornościowym oraz zapewnienie ich bezpieczeństwa dla zastosowania terapeutycznego. Przyszłe badania mają potencjał, aby dostarczyć kluczowych informacji na temat optymalizacji wykorzystania tych komórek w warunkach terapeutycznych, z naciskiem na zwiększenie zarówno skuteczności, jak i bezpieczeństwa.

Wprowadzenie

Cukrzyca typu 1 to uporczywe zaburzenie autoimmunologiczne charakteryzujące się niszczeniem komórek beta w trzustce, które produkują insulinę. Obecne metody leczenia obejmują głównie długoterminową insulinoterapię, która, choć skutecznie kontroluje poziom glukozy we krwi, nie zapewnia lekarstwa na chorobę ani nie zatrzymuje jej postępu1. Badania nad alternatywnymi terapiami cukrzycy typu 1 są motywowane potrzebą opracowania bardziej skutecznych alternatyw niż obecny nacisk na leczenie insuliną. W związku z tym prowadzone są trwające badania, koncentrujące się na alternatywnych metodach leczenia, takich jak przeszczep komórek wysp trzustkowych, który ma na celu przywrócenie wrodzonej zdolności organizmu do wytwarzania insuliny. Mimo to fakt, że komórki wysp trzustkowych dawcy są trudne do zdobycia i istnieje ryzyko odrzucenia immunologicznego, utrudnił powszechne stosowanie tego leczenia. W rezultacie, społeczność naukowa staje się coraz bardziej zainteresowana znalezieniem alternatywnych źródeł komórek produkujących insulinę1,2,3.

Ta metoda ma na celu wykorzystanie potencjału regeneracyjnego tych komórek do ustanowienia trwałego zaopatrzenia komórek wydzielających insulinę4. Badania in vitro wykazały zdolność tych komórek przewodowych do przekształcania się w funkcjonalne komórki podobne do beta, zdolne do wydzielania insuliny w odpowiedzi na stymulację glukozą5. Ten kierunek badań jest szczególnie istotny, biorąc pod uwagę niekorzystne wyniki związane z konwencjonalnym przeszczepem wysp trzustkowych ze względu na skomplikowane reakcje immunologiczne. Liczne badania wskazują, że komórki pochodzące z przewodów nie tylko mają wewnętrzną zdolność do wytwarzania insuliny, ale mogą również wykazywać cechy, które mogą promować tolerancję immunologiczną, łagodząc w ten sposób niektóre wyzwania związane z tradycyjnymi technikami transplantacji5,6,7,8. Komórki te mogą być hodowane poza organizmem, przekształcane w komórki przypominające wyspy trzustkowe, które mogą uwalniać insulinę, a następnie wszczepiane osobom z cukrzycą. Badania przedkliniczne, które obejmowały eksperymenty na szczurach z cukrzycą wywołaną streptozotocyną, wykazały, że przeszczepienie tych komórek może skutecznie obniżyć poziom glukozy we krwi i zwiększyć wydzielanie insuliny9.

Nasze podejście skupiało się na przyspieszeniu procesu różnicowania i poprawie funkcjonalności komórek produkujących insulinę poprzez wzbogacenie standardowej pożywki do hodowli komórkowych o Insulinę-Transferynę-Selen (ITS)10,11,12, Isoxazole 9 (ISX-9)13,14, oraz GLP-115. Uważa się, że czynniki te są niezbędne w ułatwianiu różnicowania trzustki i zwiększaniu wydzielania insuliny. Integracja tych komponentów miała na celu bardziej efektywne uzyskanie funkcjonalnych komórek przypominających wyspy trzustkowe, zapewniając ich zdolność do wytwarzania i uwalniania insuliny w odpowiedzi na stymulację glukozy9,10,11,12,13,14.

W przeszczepach wysp trzustkowych, odrzucenie immunologiczne stanowi istotną przeszkodę w osiąganiu pomyślnych wyników. Allogeniczne przeszczepione wyspy trzustkowe są podatne na atak immunologiczny, wymagają terapii immunosupresyjnej w celu uniknięcia odrzucenia16,17. Udział komórek przewodowych trzustki w odrzuceniu immunologicznym podczas przeszczepu wysp trzustkowych stanowi rozwijającą się dziedzinę badań. Uważa się, że komórki przewodowe mogą mieć właściwości, które mogą zmniejszać odrzucenie immunologiczne, co zwiększyłoby szanse na przeżycie i prawidłowe funkcjonowanie przeszczepionych wysp trzustkowych. Ilieva i wsp. wykazali, że wyspy trzustkowe hodowane wspólnie z komórkami przewodowymi wykazywały zmniejszoną martwicę ośrodka i apoptozę, co wskazuje na działanie ochronne przed uszkodzeniami o podłożu immunologicznym. Efekt ten może być pośredniczony przez czynniki takie jak insulinopodobny czynnik wzrostu 2 (IGF-2) wydzielany przez komórki przewodowe, jak zauważyli Marín-Cañas i in. (2019)18. Efekt ochronny jest niezbędny, ponieważ odrzucenie immunologiczne stanowi poważne wyzwanie dla powodzenia przeszczepu wysp trzustkowych, zwłaszcza w cukrzycy typu 1. Komórki przewodowe w przeszczepach wysp trzustkowych są związane ze zwiększoną funkcją przeszczepu i przeżywalnością, co prawdopodobnie można przypisać ich zdolności do wydzielania czynników immunomodulujących, które łagodzą odpowiedź immunologiczną19.

Pomimo obiecujących postępów, niektóre przeszkody muszą zostać rozwiązane, aby zagwarantować skuteczność operacyjną i bezpieczeństwo tych terapii opartych na komórkach do użytku klinicznego. Konieczne jest sprawdzenie, czy indukowane komórki wykazują właściwości funkcjonalne porównywalne z natywnymi komórkami beta oraz ustanowienie skutecznych technik ochrony tych komórek przed atakami układu odpornościowego, aby zapewnić ich przedłużone przeżycie i funkcjonalność20,21. Wraz z postępem w tej dziedzinie badań, kompleksowa wiedza i rozwiązanie tych przeszkód będą niezbędne do wykorzystania potencjału komórek wytwarzających insulinę pochodzących z komórek przewodowych w leczeniu cukrzycy typu 122,23,24.

To badanie ma na celu ocenę in vivo skuteczności komórek przewodowych pochodzących z wysp trzustkowych, opracowanych w optymalnych warunkach, w celu przywrócenia kontroli glikemii w modelu szczura cukrzycowego wywołanego streptozotocyną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejsze badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zaleceniami ARRIVE, co zapewniło, że projekt, realizacja i raportowanie badań spełniały wysokie standardy w zakresie dobrostanu zwierząt i rzetelności eksperymentalnej (https://arriveguidelines.org). Uniwersytet Ankara Medipol uzyskał zatwierdzenie komisji etyki (AMUHADYEK-12- 09.05.2025) oraz zezwolenie instytucjonalne. Wszystkie metody zostały wykonane zgodnie z obowiązującymi wytycznymi i przepisami. Podjęto wszelkie środki w celu zminimalizowania cierpienia zwierząt oraz wykorzystania minimalnej liczby zwierząt niezbędnej do osiągnięcia celów naukowych.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Roztwór enzymu: Przygotować roztwór kolagenazy z 50 mg proszkowej kolagenazy typu V z Clostridium histolyticum. Przygotować 50 mL roztworu, łącząc kolagenazę z HBSS (zawierającym Ca-Mg), aby uzyskać stężenie 1 mg/mL. Zużyć 7 mL roztworu na jedną próbkę, a pozostałą część przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Zalecane stężenie kolagenazy wynosi 1 mg/1 mL. Przed pobraniem do strzykawek kolagenaza musi zostać zmieszana z wcześniej przygotowanym roztworem HBSS do stężenia 1 mg/mL.
  2. Roztwór do płukania 1: Odmierzyć 62,5 mL z 500 mL HBSS bez czerwieni fenolowej. Do pozostałego HBSS bardzo ostrożnie dodać 50 mL FBS. Dodać 5 mL penicyliny/streptomycyny (P/S), 5 mL L-glutaminy (L-Gln) oraz 2,5 mL 1 M HEPES. Doprowadzić objętość do 500 mL.
    UWAGA: Po dodaniu czerwieni fenolowej końcowy skład objętościowy to 88% HBSS, 10% FBS, 1% P/S i 1% l-Gln. Aby zapobiec pienieniu i zapewnić dokładność, należy ostrożnie dodawać płodową surowicę bydlęcą etapami.
  3. Pożywka hodowlana dla komórek i roztwór do płukania 2: Odmierzyć 62,5 mL z 500 mL pożywki Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI z L-Gln). Zachować ostrożność podczas stopniowego dodawania 50 mL FBS do pozostałego RPMI, aby zapobiec spienieniu. Dodać 2,5 mL 1 M HEPES, 5 mL P/S oraz 5 mL L-Gln. Upewnić się, że całkowita objętość wynosi 500 mL. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Roztwory gradientu gęstości: Przygotować końcowe roztwory gęstości poprzez rozcieńczenie roztworu o gęstości 1100 mg/mL roztworem HBSS w celu uzyskania pośredniego zakresu gęstości 1062-1096 mg/mL. Aby zapewnić dokładność, należy zweryfikować gęstość każdego przygotowanego roztworu za pomocą densytometru. Jako wzorzec należy użyć roztworu o stężeniu 1077. Po uzyskaniu pożądanych stężeń (1062-1096 mg/mL) przelać roztwory do szczelnych pojemników i przechowywać w ciemnym miejscu w temperaturze 4 °C w celu zachowania ich stabilności.
  5. Przygotować 0,4% roztwór błękitu trypanu. Rozwój komórek jest wspomagany przez roztwór soli fosforanowo-buforowanej (PBS) o pH 7,4.
  6. Pożywka do wzrostu hodowli komórkowych: Połączyć po 43,4 mL pożywki Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) oraz pożywki Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM-low glucose). Dodać 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 1% insuliny-transferyny-selenu (ITS), 1% L-glutaminy (L-Gln), 1% penicyliny-streptomycyny (P/S) oraz 0,2 mL 1 M HEPES. Dopełnić końcową objętość do 100 mL. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  7. Pożywka do różnicowania hodowli komórkowych: Do 43,4 mL RPMI dodać 43,4 mL DMEM-low glucose. Do mieszaniny dodać 10% FCS, 1% insuliny-transferyny-selenu (ITS), 1% L-Gln, 1% P/S oraz 0,2 mL 1 M HEPES. Ponadto do pożywki do różnicowania dodać 1 µL izoksazolu 9 (ISX-9) rozpuszczonego w 4 mL etanolu. Na koniec do pożywki do hodowli komórkowych dodać 24 µL roztworu glukagonopodobnego peptydu 1 (GLP-1) o stężeniu 50 nM.
    UWAGA: ISX-9 i GLP-1 dodaje się na świeżo wyłącznie podczas wymiany pożywki; są one przygotowywane wcześniej. Świeże przygotowanie jest wymagane dla każdego materiału hodowlanego.
  8. Roztwór dytyzonu (DTZ): Rozpuścić 100 mg dytyzonu w 20 mL dimetylosulfotlenku (DMSO) i dobrze wymieszać. Do otrzymanego roztworu dodać 30 mL HBSS i mieszać do uzyskania jednorodnej mieszaniny. Przefiltrować roztwór przez filtry 0,2 lub 0,4 µm. Do przefiltrowanego roztworu dodać 50 mL HBSS. Oznaczyć roztwór datą przygotowania. Po całkowitym rozpuszczeniu substancji stałych przepuścić roztwór przez urządzenie filtrujące 0,4 µm. Przelać przefiltrowany roztwór do probówek 2 mL i użyć natychmiast po rozmrożeniu. Przechowywać przygotowany roztwór w temperaturze -20 °C.
  9. Roztwór Krebsa: Do pojemnika o objętości 250 mL dodać 1,68 g chlorku sodu (dla 115 mM), 0,50 g wodorowęglanu sodu (dla 24 mM), 0,09 g chlorku potasu (dla 5 mM), 0,05 g chlorku magnezu (dla 1 mM), 0,09 g chlorku wapnia (dla 2,5 mM) oraz 0,25 g albuminy surowicy bydlęcej (dla 0,1%). Dodać 6,25 mL 1 M HEPES. Doprowadzić objętość do 250 mL poprzez dodanie wody dejonizowanej i mieszać do pełnego połączenia składników. Dostosować pH do zakresu od 7,3 do 7,5, używając 1 M NaOH lub 1 M HCl. Przefiltrować przez filtr 0,22 µm. Przechowywać roztwory w temperaturze pokojowej. Roztwory przed użyciem ogrzać w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C.
  10. Roztwór o wysokim stężeniu glukozy: Odmierzyć i dodać 149,1 mg D-(+)-glukozy do probówki. Do probówki dodać 50 mL roztworu Krebsa i dokładnie wymieszać poprzez wstrząsanie. Przefiltrować przez filtr 0,22 µm.
  11. Roztwór o niskim stężeniu glukozy: Połączyć 1 mL 16,7 mM roztworu o wysokim stężeniu glukozy z 9 mL roztworu Krebsa.

2. Izolacja trzustki szczurów

  1. Zacznij od kohorty trzech szczurów laboratoryjnych Wistar Albino (samce w wieku 3 miesięcy) o masie ciała od 220 g do 280 g. Znieczul zwierzęta, stosując kombinację ketaminy (35-50 mg/kg) i ksylazyny (5-10 mg/kg). Sprawdź głębokość znieczulenia poprzez brak odruchu cofania łapy. Na oczy nałóż maść weterynaryjną, aby zapobiec ich wysychaniu.
  2. Rozpocznij proces chirurgiczny od wykonania nożyczkami cięcia w linii środkowej brzucha wzdłuż linea alba o długości 3-4 cm (Rysunek 1A). Przeprowadź delikatną manipulację wątrobą, wywierając palcami lekki nacisk fizyczny na klatkę piersiową w celu uniesienia przepony. Wyprowadź wątrobę na zewnątrz i umieść ją na sterylnej gazie dla zapewnienia stabilności.
  3. Przygotuj standaryzowany roztwór kolagenazy w dawce 28 mg/g masy ciała i pobierz 7 mL (około 7 g) do strzykawki dla szczurów o masie od 250 do 300 g. Dostosuj objętość roztworu w zależności od masy ciała każdego zwierzęcia.
  4. Nacinaj przewód trzustkowy. Używając drobnych nożyczek naczyniowych, przetnij przewód w pobliżu wątroby. Aby zidentyfikować przewód, posłuż się orientacją anatomiczną względem trzustki i otaczających naczyń krwionośnych. Dla zapewnienia dokładności wykorzystaj punkty orientacyjne, takie jak pobliskie naczynia krwionośne i cechy tkankowe. Wykonaj w tym miejscu jedno precyzyjne cięcie w celu zamknięcia.
    UWAGA: Nacięcie było minimalne — zbyt małe, aby można je było precyzyjnie zmierzyć — ale wystarczająco szerokie, aby umożliwić wprowadzenie cewnika. Nacięcie pozwala na sprawne i efektywne umieszczenie cewnika, zapewniając minimalną traumatyzację otaczających tkanek.
  5. Wprowadź cewnik z zintegrowaną osłoną do utworzonego otworu w przewodzie (Rysunek 1B). Po prawidłowym umieszczeniu przymocuj cewnik za pomocą zacisku chirurgicznego (np. mikropincety), aby uniknąć jego wysunięcia.
  6. Podaj enzymatyczny roztwór kolagenazy poprzez kontrolowaną infuzję, stopniowo i celowo naciskając tłok strzykawki.
  7. Po napęcznieniu użyj precyzyjnych instrumentów chirurgicznych, aby ostrożnie oddzielić tkankę trzustki od struktur otaczających. Wykonaj wycięcie szybko, stosując precyzyjne i delikatne manewry, aby zminimalizować uszkodzenia tkanek. Natychmiast po usunięciu umieść trzustkę w probówce 50 mL na lodzie, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną.
  8. Cały proces powinien trwać około 60 s dla jednej trzustki25. Ponadto, do momentu napęcznienia wszystkich trzustek, przechowuj kolagenazę oraz usunięte trzustki na lodzie.

Technika chirurgiczna w modelu zwierzęcym; schemat przedstawia procedurę jelitową z użyciem narzędzi chirurgicznych.
Rysunek 1: Obróbka trzustki. (A) Zaklejenie ujścia przewodu trzustkowego do dwunastnicy i (B) inflacja kolagenazą typu 5, skutkująca obrazem trzustki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3 Izolacja komórek przewodowych z tkanki trzustkowej

  1. Po chirurgicznym pobraniu, inkubuj trzustkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 12 min.
  2. Dodaj do probówki 25 mL roztworu płuczącego 1, aby zneutralizować aktywność kolagenazy. Potrząśnij probówką ręcznie, aby wspomóc rozpad tkanki trzustkowej. Wszystkie kolejne procedury wykonuj w sterylnym polu pod laminarnym przepływem powietrza.
  3. Wszystkie pożywki przechowuj w lodzie. Odwiruj próbki przy 4 °C, przy 100 x g przez 1 min, ustawiając hamulec na maksymalną wartość. Odlej supernatant. Do osadu komórkowego dodaj 25 mL roztworu płuczącego 1 i resuspenduj mieszaninę.
  4. Ponownie wykonaj wirowanie i odlej supernatant. Do osadu dodaj 25 mL roztworu płuczącego 1 i resuspenduj. Przefiltruj przetworzoną tkankę trzustkową przez stalowe sito o oczkach 425 µm, aby usunąć wszelkie pozostałości naczyń lub niestrawione fragmenty tkanki.
  5. Po filtracji uzupełnij objętość do 25 mL za pomocą roztworu płuczącego 1. Przeprowadź wirowanie 1x przy 100 x g przez 1 min w temperaturze 4 °C. Usuń supernatant.
  6. Przenieś osad do nowej probówki za pomocą sterylnej plastikowej pipety po dodaniu 50 mL pożywki RPMI. Ponownie odwiruj próbkę przy 100 x g przez 1 min w temperaturze 4 °C. Odlej supernatant i przechowuj osad do dalszych analiz.
    UWAGA: Wszystkie pozostałe kroki wykonano w komorach z laminarnym przepływem powietrza w warunkach sterylnych, odpowiednich dla hodowli komórkowych.
  7. Dodaj do osadu uzyskanego po ostatnim etapie 10 mL roztworu gęstościowego 1.077, a następnie delikatnie rozbij i zhomogenizuj osad, opukując palcem krawędź probówki.
    UWAGA: Zakres gęstości dla izolacji komórek wysepek z otaczającej tkanki trzustkowej wynosi około 1.077, w przeciwieństwie do gęstości pożywki, która wynosi około 1.00126. W związku z tym do tego celu zastosowano roztwór gęstościowy 1.077.
  8. Dodaj 10 mL RPMI i wiruj przy 600 x g przez 12 min w temperaturze 4 °C bez użycia hamulca. Procedura ta spowodowała rozdzielenie zawartości probówek w zależności od gęstości, co doprowadziło do zgromadzenia się komórek wysepek w warstwie znajdującej się bezpośrednio pod warstwą RPMI.
  9. Usuń zarówno komórki wysepek, jak i RPMI. Celem tego etapu było oczyszczenie komórek wysepek, aby ułatwić ich oddzielenie od tkanki trzustkowej, co pozwoliło na uzyskanie czystszego procesu izolacji komórek przewodowych.
  10. Przenieś pozostałą tkankę trzustkową do nowej probówki 50 mL za pomocą pipety. Dodaj do osadu tkankowego 10 mL roztworu gęstościowego 1.096.
  11. Następnie, za pomocą strzykawki, powoli dodaj 10 mL gradientu roztworu gęstościowego 1.062. Zadbaj o utrzymanie homogennego rozkładu składników. Utwórz gradient, nakładając roztwory kolejno od największej do najmniejszej gęstości.
  12. Dodaj na górze 10 mL RPMI. Odwiruj probówki przy 600 x g przez 12 min w temperaturze 4 °C bez hamowania. Po wirowaniu widoczne są różne warstwy gęstości. Komórki przewodowe znajdują się w warstwie środkowej, poniżej warstwy RPMI.
  13. Ostrożnie usuń komórki przewodowe za pomocą jednorazowej pipety Pasteura i przełóż je do oddzielnej probówki 50 mL. Dodaj 25 mL roztworu płuczącego 2 i delikatnie wymieszaj zawiesinę, opukując probówkę palcem.
  14. WCwiruj probówkę przy 100 x g przez 1 min i odlej supernatant. Przeprowadź dwie kolejne serie wirowania osadu. Po ostatnim przemyciu dodaj do osadu 2 mL roztworu płuczącego 227.

4. Izolacja i hodowla komórek przewodowych

  1. Zaszczepione zebrane komórki przenieś do kolby T25 i dodaj 5 mL podgrzanych wcześniej płynów do hodowli komórkowej. Inkubator utrzymuj przy 5% CO2 i 37 °C.
    UWAGA: Stabilność temperatury fizjologicznej jest kluczowa dla prawidłowej hodowli komórkowej, dlatego wszystkie roztwory podgrzewano do około 37 °C przed użyciem.
  2. Po 24 godzinach ostrożnie odessaj medium. Przepłucz komórki dwukrotnie roztworem płuczącym 2. Dodaj świeże medium do hodowli komórkowej i wprowadź kolbę z powrotem do inkubatora. Komórki, które przylgnęły do powierzchni kolby, nazwano komórkami przewodowymi.
  3. Wymieniaj medium wzrostowe co 3 dni. Jeśli kolor medium zmienia się bardzo szybko, oznacza to utratę składników odżywczych i wzrost kwasowości, co wskazuje na konieczność częstszej wymiany medium.
  4. Przeprowadzaj pasażowanie komórek, gdy osiągną one w kolbach 80% konfluencji. Przepłucz 2x 1-2 mL PBS i usuń nadmiar mediów.
  5. Dodaj 2 mL roztworu do dysocjacji enzymatycznej (bez czerwieni fenolowej), aby rozpocząć proces rozkładu enzymatycznego i oddzielić komórki od powierzchni kolby.
  6. Inkubuj przez 2-3 min i oceń stopień odrywania się komórek pod mikroskopem z obiektywem 10x. Jeśli komórki pozostają częściowo przytwierdzone, inkubuj ponownie w 37 °C przez dodatkowe 2 min.
  7. Po całkowitym oddzieleniu komórek od powierzchni kolby przerwij trawienie enzymatyczne, dodając około 8 mL medium wzrostowego, co stanowi 4-krotność objętości roztworu do dysocjacji enzymatycznej. Delikatnie opukaj ścianki kolby.
    UWAGA: Opukiwanie, które wspomaga oddzielanie komórek, skraca całkowity czas inkubacji i zapobiega uszkodzeniu błon komórkowych przez enzymy, które mogłoby wystąpić przy długotrwałym kontakcie z roztworem do dysocjacji enzymatycznej.
  8. Po dodaniu mediów do hodowli komórkowej przenieś zawiesinę komórkową do probówek 15 mL i wiruj przy 150 x g przez 10 min w 25 °C z ustawieniem łagodnego hamowania (prędkość hamowania 9), aby otrzymać pellet komórkowy.
  9. Odlej nadsącz. Resuspenduj pellet komórkowy w 6-8 mL roztworu płuczącego 2. Powtórz wirowanie zgodnie z powyższym opisem. Odlej nadsącz. Procedurę powtórzono, aby zapewnić całkowite usunięcie roztworu do dysocjacji enzymatycznej.
  10. Za pomocą delikatnego pipetowania resuspenduj pellet w 5 mL świeżego medium do hodowli komórkowej, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórkową. Na tym etapie przeprowadź liczenie komórek.
  11. Zmieszaj 10 µL zawiesiny komórkowej z 10 µL błękitu trypanu i policz komórki za pomocą hemosytometru.
  12. Wysiej 1 × 106 komórek na kolbę T25, korzystając z policzonej zawiesiny.
    UWAGA: Na tym etapie większość komórek została zidentyfikowana jako komórki przewodowe. Do każdej kolby wysiano odpowiednią liczbę komórek na podstawie wykonanego liczenia. Zgodnie z obserwacjami eksperymentalnymi, komórki przenoszono do dwóch różnych kolb T25 po osiągnięciu optymalnego poziomu konfluencji w jednej kolbie. Zrobiono to w celu utrzymania wysokiej wydajności proliferacji. Metoda ta pozwoliła na skuteczne wyizolowanie komórek przewodowych z tkanki trzustki szczura. Po udanej separacji komórki przygotowano do dalszych eksperymentów zgodnie z planem badania.
  13. Kontynuuj hodowlę do pasażu 4. Pasażuj komórki w razie potrzeby, aby utrzymać optymalne warunki wzrostu.
    UWAGA: Od pasażu 4 zaobserwowano wyraźny wzrost liczby komórek między 3. a 9. dniem. Ponieważ zdolność komórek do podziałów zazwyczaj spada po większej liczbie cykli, metoda ta zapewniła dostępność odpowiedniej liczby żywych komórek. Po osiągnięciu odpowiedniej liczby komórki przewodowe zaczęły przekształcać się w komórki przypominające wyspy. Według naszych ustaleń komórki między etapami 3 a 6 wykazują najszybsze tempo proliferacji. Pasaż 4 wykazuje szczególnie zauważalny wzrost liczby komórek przewodowych. Jednak po pasażu 6 odnotowano spadek zdolności proliferacyjnych. Protokół został zmodyfikowany na podstawie tych wyników, aby uzyskać odpowiednią liczbę komórek przy zachowaniu ich żywotności i funkcjonalności28.

5. Różnicowanie komórek przewodowych w klastry przypominające wyspy

  1. Zebrać komórki przewodowe w 4. pasażu, stosując standardową procedurę pasażowania. Przemyć dwukrotnie 1–2 ml PBS w celu usunięcia pozostałości pożywki oraz nieprzylegających komórek.
  2. Do kolby dodać 2 ml roztworu do dysocjacji enzymatycznej (bez czerwieni fenolowej). Inkubować w 37 °C przez 2–3 minuty, monitorując proces pod mikroskopem z 10-krotnym powiększeniem.
  3. Jeśli komórki pozostaną przytwierdzone, inkubować przez kolejne 2 minuty. Przerwać reakcję enzymatyczną, dodając 8 ml pożywki do hodowli komórek.
  4. Przenieś zawiesinę do probówki o pojemności 15 ml i wiruj z prędkością 150 × g przez 10 minut w temperaturze 25 °Cz ustawieniem 9 dla przyspieszania i zwalniania.
  5. Odlać supernatant. Resuspendować osad w 6–8 ml roztworu piorącego 2. Odwirować i odlać supernatant.
  6. Resuspender końcowy osad w 5 ml świeżej pożywki. Policzyć komórki zgodnie z wcześniejszym opisem.
  7. Zasiać 1 × 105 komórek na dołek w płytce sześciodołkowej, dodając 3 ml pożywki na dołek. Inkubować przy 37 °C, 5% CO22.
  8. Wymieniać pożywkę co 3 dni przez pierwsze 7 dni. Dostosować częstotliwość wymiany, jeśli kolor pożywki zmienia się szybko.
  9. Po 7 dniach stopniowo przejść na pożywkę różnicującą. Kontynuować hodowlę przez łącznie 15 dni (7 dni wzrostu + 8 dni różnicowania). Wymieniać pożywkę co 2 dni podczas różnicowania.
  10. W 8. dniu rozpocząć fazę różnicowania. Po 4 dniach komórki przemyć dwukrotnie buforem PBS i dodać 500 µL roztwór do dysocjacji enzymatycznej
  11. Inkubować przez 2–3 min, przerywając reakcję poprzez dodanie 2 ml pożywki wzrostowej. Centryfugować przy 150 x g przez 10 min w temperaturze 25 °CResuspender i ponownie wysiać 1 x 105 liczba komórek na studnię w płytkach 6-studzienkowych.
  12. W 15. dniu należy przeprowadzić pełną analizę mikroskopową w celu dokładnej charakterystyki i potwierdzenia utworzenia agregatów komórkowych przypominających wysepki.24.

6. Oznaczanie stężenia cynku w zróżnicowanych komórkach przewodowych za pomocą ditiżonu

  1. Rozmrozić i doprowadzić do temperatury pokojowej roztwór DTZ przechowywany w −20 °C. Dodać 3-4 krople roztworu DTZ do każdej studni z komórkami różnicowanymi przez 15 dni. Obserwować pod mikroskopem. Zidentyfikować komórki produkujące insulinę po czerwonym barwieniu28(Rysunek 2).

Analiza mikroskopowa agregacji komórek; obrazy A-D pokazują różną gęstość skupisk komórkowych, barwienie chromatyczne.
Rysunek 2: Obrazy mikroskopowe komórek przewodzikowych przypominających wysepki.Obrazy w (A) 11. dniu hodowli (20x), (B) 13. dniu hodowli (20x), (C, D) 15. dniu hodowli (20x). Komórki zwizualizowano po barwieniu ditiizonem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

7. Test stymulacji glukozą

  1. Zasiać 1 x 104 liczba skupisk przypominających wysepki na studzienkę w płytce 24-dołkowej z 1 ml pożywki różnicującej na studzienkę.
  2. W 15. dniu stymulować komórki glukozą. Usunąć obecną pożywkę i dodać 1 ml roztworu o niskiej zawartości glukozy (1,67 mM). Inkubować przez 1 h w 37 °C.
  3. Należy zebrać pożywkę i przenieść ją do probówek o pojemności 2 ml. Dodać 1 ml roztworu wysokiego stężenia glukozy (16,7 mM). Inkubować przez 1 h. Zebrać pożywkę do analizy. Pożywkę hodowli komórkowej należy zbierać w odstępach 1 h od momentu dodania różnych roztworów glukozy.
  4. Należy przeprowadzić test ELISA dla insuliny zgodnie z instrukcjami producenta. Po wyjęciu z foliowej zapakowania należy odczekać, aż mikropłytka osiągnie temperaturę pokojową przed rozpoczęciem procedury ELISA.
  5. Dodaj 10 µL odczynnika do studzienek z próbkami, kontrolami i wzorcami. Dodać 75 µL roztworu koniugatu roboczego. Uszczelnić płytkę i inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem (700–900 obr./min).
  6. Przemyć studzienki 6x za pomocą 350 µL buforu do przemywania. Dodać 100 µL substratu 3,3′,5,5-tetrametylobenzydyny (TMB) na dołek. Płytki należy szczelnie zamknąć i inkubować przez 15 min w ciemności przy wstrząsaniu (700-900 obr./min) w temperaturze pokojowej.
  7. Dodać 100 µL roztworu stopującego na dołek i wymieszaj, delikatnie potrząsając płytką, aby przerwać reakcję. Usuń pęcherzyki powietrza i odczytaj absorbancję przy 450 nm. Pomiar należy przeprowadzić w ciągu 30 min od dodania roztworu stopującego.27.

8. Transplantacja wysepek oraz komórek przewodowych podobnych do wysepek

  1. Zanurz szczury w narkozie, stosując ketaminę (100 mg/kg) i ksylazynę (10 mg/kg). Odkaź i obłóż pole operacyjne. Wykonaj cięcie w linii środkowej o długości 2-3 cm.
  2. Odsuń jelita i odsłoń żyłę wrotną za pomocą rozwieraczy. Wykonaj wenotomię i wprowadź cewnik uprzednio wypełniony solą fizjologiczną (Rysunek 3A).
  3. Wprowadź 100-500 µL zawiesiny komórkowej do żyły wrotnej. Usuń cewnik i zamknij miejsce wenotomii za pomocą szwów lub kleju. Zamknij jamę brzuszną i monitoruj powrót do sprawności, podając środki przeciwbólowe w razie potrzeby (Rysunek 3B).

Procedura chirurgiczna na wątrobie z żyłą wrotną; eksperyment medyczny; dłonie w rękawiczkach, narzędzia chirurgiczne.
Rycina 3: Transplantacja wysepek i komórek podobnych do wysepek. (A) Sterylny kaniulator dożylny użyty do transplantacji wysepek i komórek podobnych do wysepek. (B) Pobieranie wysepek i komórek podobnych do wysepek do sterylnej strzykawki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

9. Szczury z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ)

  1. Szczury należy głodzić przez 12 h. Podać 45 mg/kg STZ w sposób dostrojewnowy, rozpuszczając go w zimnym buforze cytrynianowym (pH 4.5).
    UWAGA: Głodzenie przez 12 h przed wstrzyknięciem STZ zwiększa ekspresję GLUT2, co ułatwia transport glukozy w beta-komórkach trzustki. Proces ten zwiększa wchłanianie STZ do komórek, prowadząc do większego uszkodzenia beta-komórek. Mechanizm ten sprzyja rozwojowi bardziej znaczącej hiperglikemii i zwiększa skuteczność modelu cukrzycy.
  2. Potwierdzić wystąpienie cukrzycy 48–72 h po wstrzyknięciu, przy poziomie glukozy we krwi >250 mg/dL. Szczury, które osiągnęły wartości glikemii powyżej 250 mg/dL, zakwalifikować jako cukrzycowe i włączyć do eksperymentu29.

10. Przygotowanie wysepek i komórek podobnych do wysepek do transplantacji

  1. Zbierz komórki po 1 min inkubacji z roztworem do dysocjacji enzymatycznej. Zeskrob komórki przylegające do powierzchni. Zastąp roztwór świeżą pożywką i zbierz komórki.
  2. Wiruj przy 300 x g przez 5 min. Resuspenduj osad w 100-150 µL soli fizjologicznej. Wykonaj odliczenie komórek i dostosuj ich liczbę do 1000 IEQ lub 800 wysepek na szczura lub 1 x 105 komórek podobnych do wysepek na szczura.

11. Transplantacja żyły wrotnej

  1. Zanurzyć zwierzęta w narkozie poprzez podskórne wstrzyknięcie ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg).
  2. Zdezynfekować okolicę brzucha zwierzęcia za pomocą roztworu sterylnego (betadyny lub 70% etanolu). Obszar operacyjny przykryć sterylnym polem operacyjnym.
  3. Wykonać cięcie w linii pośrodkowej, o długości około 2-3 cm, aby uzyskać dostęp do jamy brzusznej.
  4. Odsunąć jelita, aby odsłonić wątrobę. Unieruchomić lewy i prawy płat wątroby za pomocą sterylnych rozsetników. Odsłonić powierzchnię brzuszną wątroby w celu zlokalizowania żyły wrotnej.
  5. Wstępnie przepłukać cewnik polietylenowy (PE-10 lub PE-50) roztworem soli fizjologicznej i całkowicie go wypełnić. Użyć kleszczyków mikrochirurgicznych do uchwycenia odgałęzienia żyły wrotnej — zazwyczaj lewego lub prawego odgałęzienia bocznego.
  6. Wyonać niewielką wenotomię (około 1-2 mm). Ostrożnie wprowadzić cewnik w miejsce wenotomii. Aby zapobiec przemieszczeniu, unieruchomić cewnik za pomocą szwu lub kleszczyków, zazwyczaj używając nici chirurgicznej 6-0.
  7. Zweryfikować prawidłowe rozmieszczenie cewnika poprzez stopniowe podawanie sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Przez cewnik stopniowo podać przygotowaną zawiesinę komórek wysepek i komórek przypominających wysepki do żyły wrotnej. Całkowita objętość wynosi 100-500 µL.
  8. Po zakończeniu infuzji usunąć cewnik i użyć sterylnego kleju tkankowego lub szwów wchłanialnych, aby zamknąć miejsce wenotomii.
  9. Przeprowadzić hemostazę. Przywrócić na miejsce wszystkie tkanki otaczające wątrobę i zaszyć mięśnie brzucha za pomocą nici wchłanialnych. Zamknąć skórę szwami lub klamrami.
  10. Utrzymać zwierzę pod obserwacją w ciepłym środowisku. Podać odpowiednie leki przeciwbólowe w celu łagodzenia bólu podczas wybudzania z narkozy (np. buprenorfina 0,1 mg/kg). Obserwować zwierzęta przez 48 h. Sprawdzić pod kątem oznak infekcji, obrzęku w miejscu operacji lub krwawienia30.

12. Monitorowanie poziomu glukozy we krwi

  1. Oceń początkowy poziom glukozy we krwi. Ostrożnie utrzymaj szczura i za pomocą lancetu wykonaj niewielkie nacięcie na końcówce ogona. Delikatnie usuń pierwszą kroplę krwi, używając sterylnego patyczka bawełnianego.
  2. Nanieś drugą kroplę krwi na pasek testowy do pomiaru glukozy i odnotuj bazowy poziom glukozy31.

13. Doustny test tolerancji glukozy dożylnie

UWAGA: Szczury poddaje się doustnemu testowi tolerancji glukozy (IPGTT), aby ocenić wydajność usuwania glukozy z krwiobiegu. Test ten dostarcza informacji na temat metabolizmu glukozy, wrażliwości na insulinę oraz ewentualnego występowania stanów cukrzycowych. Test tolerancji glukozy drogą dosytroniczną wykonano w 15. dobie po transplantacji. Głównym uzasadnieniem wprowadzenia określonego czasu postu przed IPGTT jest stabilizacja podstawowych poziomów glukozy i zapewnienie spójnego stanu metabolicznego. Okres postu sprzyja wyczerpaniu zapasów glikogenu w wątrobie, co umożliwia bardziej wiarygodną ocenę odpowiedzi w teście tolerancji glukozy. Post trwający 6 h redukuje efekty poposiłkowe, podczas gdy post nocny (około 12-16 h) może mieć odmienne skutki, potencjalnie wpływając na wrażliwość na insulinę i metabolizm glukozy.

  1. Poddać szczury 6-godzinnemu okresowi głodzenia, dopuszczając dostęp wyłącznie do wody w nocy, dbając o to, aby czas głodzenia nie przekroczył 12 h. Zapewnić jednolity okres głodzenia dla wszystkich osobników w celu zmniejszenia zmienności pomiarów glukozy.
  2. Przed podaniem glukozy zważyć szczury. Aby przygotować sterylny roztwór, rozpuścić 20 g glukozy w 100 mL sterylnej soli fizjologicznej.
    UWAGA: Standardowa dawka wynosi zazwyczaj 2 g glukozy/kg masy ciała (2 g/kg). Całkowita podana objętość jest określana przez masę ciała zwierzęcia.
  3. Ocenić bazowe poziomy glukozy we krwi. Przytrzymać szczura i za pomocą lancetu wykonać niewielkie nacięcie na końcu ogona. Delikatnie usunąć pierwszą kroplę krwi za pomocą sterylnego patyczka z watą.
  4. Nanieść drugą kroplę krwi na pasek testowy do glukozy i zapisać bazowy poziom glukozy.
  5. Na podstawie masy ciała szczura podać odpowiednią ilość roztworu glukozy w dawce 2 g/kg.
  6. Przed podaniem roztworu glukozy drogą dosytczynną (IP), delikatnie obchodzić się ze szczurem. Wstrzyknąć glukozę do jamy otrzewnej, a nie do tkanki podskórnej ani do żadnego narządu, upewniając się, że podanie jest prawidłowe.
  7. Po wstrzyknięciu glukozy pobierać próbki krwi w określonych odstępach czasu w celu monitorowania poziomów glukozy. Typowe odstępy czasu to 15, 30, 60, 90 i 120 min po wstrzyknięciu.
  8. W każdym punkcie czasowym pobierać krew poprzez nacięcie żyły ogonowej. Przed każdym pobraniem krwi upewnić się, że ogon został przetarty gazikiem nasączonym alkoholem.
  9. W każdym wyznaczonym punkcie czasowym zmierzyć poziom glukozy i udokumentować go za pomocą glukometru.
  10. Podczas testu monitorować szczury pod kątem jakichkolwiek oznak dyskomfortu lub reakcji niepożądanych. Aby zminimalizować stres zwierząt między pomiarami, zapewnić ciepłe i ciche otoczenie.
  11. Po ostatnim pomiarze glukozy we krwi oczyścić rany na ogonie i zapewnić zwierzętom komfort29.

14. Analiza insuliny metodą ELISA po pobraniu krwi

UWAGA: Kroki zawarte w niniejszym protokole dotyczą pobierania krwi z aorty brzusznej szczura, a następnie zastosowania metody enzymatycznego testu referencyjnego (ELISA) w celu oznaczenia poziomu insuliny.

  1. Zanieś znieczulenie szczurowi przed pobraniem krwi zgodnie z wcześniejszym opisem. Umieść znieczulone zwierzę w pozycji grzbietnej na sterylnej platformie chirurgicznej.
  2. Wygoli obszar brzucha i zdezynfekuj go za pomocą 70% etanolu lub roztworu jodu, aby zapewnić sterylność.
  3. Wykonaj nacięcie w linii środkowej skalpelem, aby przebić warstwy skóry i mięśni i odsłonić jamę brzuszną.
  4. Odsuń jelita, aby uzyskać dostęp do aorty brzusznej znajdującej się w sąsiedztwie kręgosłupa. Używając heparynyzowanej strzykawki, wprowadź igłę do aorty brzusznej pod niewielkim kątem.
  5. Pobierz krew (zazwyczaj 1-3 mL, w zależności od wielkości szczura) do strzykawki. Stosuj stopniowe i jednostajne ssanie, aby uniknąć zapadnięcia się naczyń lub hemolizy krwi.
  6. Przenieś pobraną krew do probówki wirówkowej i przechowywaj w lodzie.
  7. Jeśli zwierzę ma zostać poddane eutanazji po zabiegu, przeprowadź ją zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi etycznymi.
  8. Wirować pobraną krew przy 300 x g przez 10-15 min w temperaturze 4 °C, aby zapewnić oddzielenie osocza lub surowicy. Przenieś supernatant do nowej probówki i przechowuj w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy insuliny.
    UWAGA: Ważne jest unikanie hemolizy podczas pobierania krwi, ponieważ może to wpłynąć na dokładność wyników testu ELISA (Rycina 4)29.

Układ do pobierania krwi z użyciem cewnika i probówki w laboratorium, technika wenpunkcji.
Rysunek 4: Próbki krwi pobrano z żyły ogonowej szczurów do probówek w celu analizy insuliny po zakończeniu eksperymentu w 15. dniu po transplantacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

15. Pomiar insuliny metodą ELISA

  1. Przygotować zestaw do testu ELISA na insulinę zgodnie z instrukcjami producenta. Przed rozpoczęciem analizy należy doprowadzić wszystkie odczynniki, wzorce i próbki do temperatury pokojowej.
  2. Określić wymaganą liczbę dołków na płytce ELISA dla wzorców, kontroli i próbek surowicy szczura.
  3. Przygotować próbki surowicy szczura do analizy, rozcieńczając je zgodnie z protokołem zestawu ELISA, np. w stosunku 1:10 w PBS.
  4. Przygotować wzorce insuliny poprzez rozcieńczenia seryjne w celu wygenerowania krzywej wzorcowej, np. w zakresie od 0 do 10 ng/mL.
  5. Nanieść wzorce, kontrole i rozcieńczone próbki surowicy szczura (zazwyczaj 50-100 µL na dołek) do odpowiednich dołków płytki ELISA. Do każdego dołka nanieść dostarczony z zestawem roztwór przeciwciała detekcyjnego, aby zapewnić równomierny rozkład.
  6. Inkubować płytkę przez określony czas (zazwyczaj 1-2 h) w temperaturze pokojowej lub zgodnie z dostarczonymi instrukcjami.
  7. Po inkubacji upewnić się, że dołki zostały przemyte odpowiednim buforem myjącym, zazwyczaj PBS zawierającym 0,05% Tween-20, w celu usunięcia niezwiązanych substancji. Etap płukania przeprowadzić 3-5 razy zgodnie z instrukcją zestawu, upewniając się, że po każdym myciu całkowicie usunięto pozostałą ciecz.
  8. Nanieść roztwór substratu do każdego dołka. Substrat wejdzie w reakcję z przeciwciałem związanym z enzymem, co spowoduje zmianę barwy; intensywność koloru jest powiązana z ilością insuliny obecnej w próbce. Inkubować płytkę w ciemności przez czas wskazany w instrukcji zestawu, zazwyczaj od 15 do 30 min.
  9. Dodać roztwór stopujący do każdego dołka, aby przerwać reakcję kolorymetryczną. Zmiana barwy ustabilizuje się po dodaniu roztworu stopującego, który zazwyczaj przybiera kolor żółty.
  10. Bezzwłocznie zmierzyć gęstość optyczną (OD) każdego dołka za pomocą czytnika płytek ustawionego na 450 nm (lub zgodnie ze specyfikacją zestawu).
  11. Wygenerować krzywą wzorcową, nanosząc znane stężenia wzorców insuliny w funkcji odpowiadających im wartości gęstości optycznej (OD).
  12. Obliczyć stężenie insuliny w próbkach surowicy szczura, korzystając z krzywej wzorcowej i odpowiadających im wartości OD. Poziom insuliny należy podać w ng/mL lub innych odpowiednich jednostkach29.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analiza w mikroskopii świetlnej

Podczas badań komórek przewodowych w 14tym dniu analiza pod mikroskopem świetlnym wykazała, że komórki zagregowały i utworzyły strukturę przypominającą wysepkę. Ta zmiana strukturalna wskazuje, że po pewnym czasie komórki przewodowe zmieniają swoje cechy morfologiczne, wchodząc w uporządkowaną organizację i zyskując wygląd przypominający wysepkę. Tendencja komórek do agregacji wynika prawdopodobnie z efektów komunikacji międzykomórkow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie zdolności funkcjonalnej komórek przypominających wyspowe z różnych źródeł wzbudziło znaczne zainteresowanie w badaniach nad cukrzycą. Wstępne analizy wskazują, że komórki te mogą uwalniać insulinę po podniesieniu poziomu glukozy, co sugeruje, że mogą one naśladować funkcje naturalnych wysp trzustkowych. Badacze wykorzystali barwienie ditizonem w celu potwierdzenia podobieństwa fenotypowego komórek przypominających wyspowe do wysp trzustkowych, o czym świadczy charakterystyczne czerwone barwienie obecne w tych kom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor (autorzy) nie zgłosił potencjalnego konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować zespołowi laboratoryjnemu za ich wkład w badanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% Chlorek soduSahar PharmaDo usuwania trzustki i przeszczepu komórek
10 ml pipeta serologiczna - sterylnaCorning4488Do izolacji
Płytka 24-dołkowaCorning353047Dla GSIS 
Pipeta serologiczna 25 ml - sterylnaCorning4489Do izolacji
70% etanolu ISOLAB64-17-5Do dezynfekcji szczurów
betadyna Batikonol  1186Do dezynfekcji szczurów
Biocholl 1077SigmaL6715-BCDo oczyszczania trzustki
Biocoll, Gęstość 1,10 g/mlSigmaL6155-BCDo oczyszczania trzustki
Glukometry i paski testowe do pomiaru glukozyOn Call PlusDo pomiaru stężenia glukozy we krwi
BSASigmaA9418Do przygotowania krebs
CaCl2Sigma57647902Do przygotowania krebsa
Skład cewnika: Cewnik polietylenowy (dożylny wewnątrzcewnikowy)  Bicakcilar24G  i 14GDla trzustki i wątroby 
WirówkaThermoST1R PlusDo izolacji 
Kolagenaza typu V, ≥ 1 jednostki FALGPA/mg ciała stałego,
>125 CDU/mg ciała stałego 		SigmaC9263- 1GDo trawienia trzustki
D-(+)-glukoza Sigma50-99-7Dla GSIS i IPGTT
Dithizone (DTZ)SigmaD5130Do wyznaczania wysepek
DMSOSigmaD8779Do rozwiązywania DTZ
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni (DMEM— niski poziom glukozy) Gibco11885084Do hodowli komórkowych
Probówka EppendorfaISOLABDo mycia komórek
Probówka Falcon (50 ml)ISOLABLB. IS.078.02.009Do izolacji
płodowej surowicy bydlęcej (FBS)SigmaN4637Do izolacji i hodowli trzustki
Cienka igła i materiał do szycia (rozmiar 6-0 lub 7-0)PROLENE Blue 18" Igła P-1 | 8697GDo usuwania trzustki i przeszczepiania komórek
Peptyd glukagonopodobny 1 (GLP-1) Aladynrp174144Do hodowli komórkowych
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS z Ca-Mg) KoziorożecHBSS-1ADo przygotowania enzymatycznego
HBSS bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowejBIOCHROM  L2015Do izolacji trzustki
HEPESLonzaDo hodowli komórkowych
Insulina ElisaAlpco80-INSRT-E01Do badania insuliny elisa
insulina-transferyna-selen (ITS)GibcoITS -GDo hodowli komórkowych
Izoksazol 9 (ISX-9) AladynI304735-10mgDo hodowli komórkowych
KClSigma329820207Do przygotowania krebów
Ketamina HCl 200 mg / mlNexGenDla szczurów anestesia
Komory z przepływem laminarnymLabor IldamBSC-1100IIA2-XDo izolacji i okresu hodowli
LancetyAyset28 GDo pomiaru stężenia glukozy
we krwiL-glutamina Sigma59202cDo izolacji i hodowli trzustki
MgCl2Sigma329759772Do przygotowania czytnika mikropłytek Krebs
Czytnik wielomodowy BioTek SynergyH1 Dodo mikropłytek insuliny elisa
VWR  444-0270Do insuliny elisa
Mikroskop mikrochirurgicznyEMZ-200TR3.9X Do usuwania trzustki i przeszczepiania komórek
Nożyczki i kleszcze mikrochirurgiczneAesculapDo usuwania trzustki i przeszczepu komórek
Millicell Hanging Cell Culture Insert, politereftalan etylenu 8,0 i mikro; m MILIPOREPIEP30R48 Dla GSIS 
NaClSigma7647-14-5Do przygotowania krebów
NaHCO3Sigma144-55-8Do przygotowania krebów
Pipeta Pasteura 3 MlBIOSIGMADo izolacji
penicyliny/streptomycyny SigmaDo izolacji i hodowli trzustki
Roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) BIOCHROM  L1815Do pasażowania komórek
Retraktor (do stabilizacji wątroby i tkanek łącznych)AesculapDo usuwania trzustki i przeszczepu komórek
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI w/L-Gln)KoziorożecRPMI-ADo izolacji i hodowli trzustki
Sterylny Dynarexz bawełnianą końcówkąDo usuwania trzustki i przeszczepu komórek
Sterylna strzykawka (10 ml)Ayset32MM 22GDo reakcji Collegenase
StoperKenkoKK613DDo IPGTT
Streptozotocyna (STZ) Sigma18883-66-4Dla szczurów z cukrzycą
Jednostka filtrująca sterownika strzykawki (GP-0.22 i mikro; m-3 mm)MillexSLGP033RSDo sterylizacji pożywek do hodowli komórkowych
Kolba T25Thermo130189Do hodowli
TrypLE OdczynnikiExpress GibcoDo kąpieli wodnej do pasowania komórek
 Labor IldamALB128Do reakcji collegenase
Ksylazyna 2% w/v Roztwór do wstrzykiwańRompunDo znieczulenia szczurów
wytrząsarki

Bibliografia

  1. Nichols, G. A., Kimes, T. M., Harp, J. B., Kou, T. D., Brodovicz, K. G. Glycemic Response and Attainment of A1C Goals Following Newly Initiated Insulin Therapy for Type 2 Diabetes. Diabetes Care. 35 (3), 495-497 (2012).
  2. Shapiro, A. M. J., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New Engl J Med. 343 (4), 230-238 (2000).
  3. Barton, F. B., et al. Improvement in Outcomes of Clinical Islet Transplantation: 1999-2010. Diabetes Care. 35 (7), 1436-1445 (2012).
  4. Jacobson, A., et al. Biomedical Risk Factors for Decreased Cognitive Functioning in Type 1 Diabetes: An 18-year Follow-Up of the Diabetes Control and Complications Trial (DCCT) Cohort. Diabetologia. 54 (2), 245-255 (2010).
  5. Rovner, A. J., et al. Development and Validation of the Type 1 Diabetes Nutrition Knowledge Survey. Diabetes Care. 35 (8), 1643-1647 (2012).
  6. Knopp, B., Perumareddi, P. An Atypical Presentation of Type 1 Diabetes. Arch Clin Cases. 8 (3), 46-49 (2021).
  7. Low, J. C., et al. Do Obese Children With Diabetic Ketoacidosis Have Type 1 or Type 2 Diabetes. Primary Care Diabetes. 6 (1), 61-65 (2012).
  8. Xu, X., et al. β cells can be generated from endogenous progenitors in injured adult mouse pancreas. Cell. 132 (2), 197-207 (2008).
  9. Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832(2011).
  10. Kim, B., et al. Differentiation of human labia minora dermis-derived fibroblasts into insulin-producing cells. Exp Mol Med. 44 (1), 26(2012).
  11. Campbell, S. C., et al. Selenium stimulates pancreatic beta-cell gene expression and enhances islet function. FEBS Lett. 582 (15), 2333-2337 (2008).
  12. Shaer, A., Azarpira, N., Vahdati, A., Karimi, M. H., Shariati, S. Differentiation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells Into Insulin-Producing Clusters. Exp Clin Transplantat. 13 (1), 68-75 (2015).
  13. Koh, S. H., et al. Differential Effects of Isoxazole-9 on Neural Stem/Progenitor Cells, Oligodendrocyte Precursor Cells, and Endothelial Progenitor Cells . PLoS One. 10 (9), e0138724(2015).
  14. Tsakmaki, A., Fonseca Pedro, P., Pavlidis, P., Hayee, B., Bewick, G. A. ISX-9 manipulates endocrine progenitor fate revealing conserved intestinal lineages in mouse and human organoids. Mol Metabol. 34, 157-173 (2020).
  15. Khan, S., Sur, S., Newcomb, C. J., Appelt, E. A., Stupp, S. I. Self-assembling glucagon-like peptide 1-mimetic peptide amphiphiles for enhanced activity and proliferation of insulin-secreting cells. Acta Biomaterialia. 8 (5), 1685-1692 (2012).
  16. White, A. M., et al. Engineering Strategies to Improve Islet Transplantation for Type 1 Diabetes Therapy. ACS Biomater Sci Eng. 6 (5), 2543-2562 (2020).
  17. Li, X., Meng, Q., Zhang, L. The Fate of Allogeneic Pancreatic Islets following Intraportal Transplantation: Challenges and Solutions. J Immunol Res. 2018, 1-13 (2018).
  18. Marín-Cañas, S., et al. Pancreatic ductal cells may have a negative effect on human islet transplantation. PLoS One. 14 (7), e0220064(2019).
  19. Webb, M. A., et al. The Impact of Potential Islet Precursor Cells on Islet Autotransplantation Outcomes. Cell Transplant. 22 (6), 1041-1051 (2013).
  20. Vendrame, F., et al. Recurrence of Type 1 Diabetes After Simultaneous Pancreas-Kidney Transplantation, Despite Immunosuppression, Is Associated With Autoantibodies and Pathogenic Autoreactive CD4 T-Cells. Diabetes. 59 (4), 947-957 (2010).
  21. Barron, E., et al. Associations of Type 1 and Type 2 Diabetes With COVID-19-related Mortality in England: A Whole-Population Study. Lancet Diabetes Endocrinol. 8 (10), 813-822 (2020).
  22. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  23. Blum, B., et al. Functional β-cells maturation is marked by an increase in the glucose threshold for insulin secretion and by expression of urocortin3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
  24. Karimi, N., Ozcan, G. B. Rat Ductal Cell-Derived Differentiation into Islet-Like Cells. Methods Mol Biol. , 1-15 (2024).
  25. Dagli Gul, A. S., Fadillioglu, E., Karabulut, I., Yesilyurt, A., Delibasi, T. The effects of oral carvacrol treatment against H2O2-induced injury on isolated pancreas islet cells of rats. Islets. 5 (4), 149-155 (2013).
  26. Noguchi, H., et al. Evaluation of Osmolality of Density Gradient for Human Islet Purification. Cell Transplant. 21 (2-3), 493-500 (2012).
  27. Boyuk, G., Yigit, A. A., Aydogan, I. Co-culture of rat luteal cells with islet cells enhances islet viability and revascularization. In Vitro Cell Dev Biol Animal. 54, 640-647 (2018).
  28. Karimi, N., Boyuk Ozcan, G. Isolation Procedure for Rat Pancreatic Ductal Cells. Methods Mol Biol. , (2024).
  29. Karakose, M., et al. Comparison of the Ovary and Kidney as Sites for Islet Transplantation in Diabetic Rats. Transplant Proc. 48, 2216-2220 (2016).
  30. Gou, W., Cui, W., Cui, Y., Wang, H. Minimizing post-infusion portal vein bleeding during intrahepatic islet transplantation in mice. J Vis Exp. (171), e62530(2021).
  31. Geiger, M. C., et al. Evaluation of Metabolic Control Using a Continuous Subcutaneous Glucose Monitoring System in Patients with Type 1 Diabetes Mellitus who Achieved Insulin Independence after Islet Cell Transplantation. Cell Transplant. 14 (2-3), 77-84 (2005).
  32. Farina, M., et al. 3D Printed Vascularized Device for Subcutaneous Transplantation of Human Islets. Biotechnol J. 12 (9), 1700169(2017).
  33. Biancone, L., et al. Platelet-Activating Factor Synthesis and Response on Pancreatic Islet Endothelial Cells: Relevance for Islet Transplantation. Transplantation. 81 (4), 511-518 (2006).
  34. Lee, Y. S., Lee, C., Choung, J. S., Jung, H. S. Glucagon-Like Peptide 1 Increases Β-Cell Regeneration by Promoting Α- To Β-Cell Transdifferentiation. Diabetes. 67 (12), 2601-2614 (2018).
  35. Akinci, E., Banga, A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Reprogramming of pancreatic exocrine cells towards a beta (β) cell character using Pdx1, Ngn3 and MafA. Biochem J. 442 (3), 539-550 (2012).
  36. Kalwat, M. A., et al. Isoxazole Alters Metabolites and Gene Expression, Decreasing Proliferation and Promoting a Neuroendocrine Phenotype in Β-Cells. Acs Chem Biol. 11 (4), 1128-1136 (2016).
  37. Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
  38. García-Ocaña, A., et al. Transgenic Overexpression of Hepatocyte Growth Factor in the β-Cell Markedly Improves Islet Function and Islet Transplant Outcomes in Mice. Diabetes. 50 (12), 2752-2762 (2001).
  39. Vegas, A. J., et al. Long-term glycemic control using polymer-encapsulated human stem cell-derived beta cells in immune-competent mice. Nat Med. 22 (3), 306-311 (2016).
  40. Zhang, W. J., et al. Evaluation of islets derived from human fetal pancreatic progenitor cells in diabetes treatment. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 141(2013).
  41. El-Kersh, A. O. F. O., El-Akabawy, G., Al-Serwi, R. H. Transplantation of human dental pulp stem cells in streptozotocin-induced diabetic rats. Anat Sci Int. 95 (4), 523-539 (2020).
  42. Lee, D. Y., Park, S. J., Nam, J. H., Byun, Y. Optimal aggregation of dissociated islet cells for functional islet-like cluster. J Biomater Sci Pol Ed. 19 (4), 441-452 (2008).
  43. Brissova, M., et al. Intraislet Endothelial Cells Contribute to Revascularization of Transplanted Pancreatic Islets. Diabetes. 53 (5), 1318-1325 (2004).
  44. Maxwell, K. G., Kim, M. H., Gale, S. E., Millman, J. R. Differential function and maturation of human stem cell-derived islets after transplantation. Stem Cells Transl Med. 11 (3), 322-331 (2022).
  45. Brissova, M., et al. Pancreatic Islet Production of Vascular Endothelial Growth Factor-A Is Essential for Islet Vascularization, Revascularization, and Function. Diabetes. 55 (11), 2974-2985 (2006).
  46. Chow, L. W., Wang, L., Kaufman, D. B., Stupp, S. I. Self-assembling Nanostructures to Deliver Angiogenic Factors to Pancreatic Islets. Biomaterials. 31 (24), 6154-6161 (2010).
  47. Assady, S., et al. Insulin Production by Human Embryonic Stem Cells. Diabetes. 50 (8), 1691-1697 (2001).
  48. Homma, J., Sekine, H., Shimizu, T. Tricultured Cell Sheets Develop into Functional Pancreatic Islet Tissue with a Vascular Network. Tissue Engineering Part A. 29 (7-8), 211-224 (2023).
  49. Loganathan, G., et al. Culture of Impure Human Islet Fractions in the Presence of Alpha-1 Antitrypsin Prevents Insulin Cleavage and Improves Islet Recovery. Transplaxt Proc. 42 (6), 2055-2057 (2010).
  50. Hilderink, J., et al. Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets. J Cell Mol Med. 19 (8), 1836-1846 (2015).
  51. Choi, H., Shinohara, M., Ibuki, M., Nishikawa, M., Sakai, Y. Differentiation of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Endocrine Progenitors to Islet-like Cells Using a Dialysis Suspension Culture System. Cells. 10 (8), 2017(2021).
  52. Ding, Y., Xia, S., Zhang, H., Chen, Q., Niu, B. Loureirin B Activates GLP-1R and Promotes Insulin Secretion in Ins-1 Cells. J Cell Mol Med. 25 (2), 855-866 (2020).
  53. O'Mara, B. A., Liehuaa, L., Ahrén, B. Stromal Derived Factor 1 Alpha (SDF-1a) in a Dual Therapy With the DPP-4 Inhibitor 1 Vildagliptin Does Not Enhance Beta Cell Function but Improves Glucose Clearance After Oral Glucose in Streptozotocin Diabetic Mice. J Chem Biol Ther. 1, 110(2016).
  54. Caporarello, N., Parrino, C., Trischitta, V., Frittitta, L. Insulin Receptor Signaling and Glucagon-Like Peptide 1 Effects on Pancreatic Beta Cells. Plos One. 12 (8), e0181190(2017).
  55. Schwenk, R. W., et al. GLP-1-oestrogen Attenuates Hyperphagia and Protects From Beta Cell Failure in Diabetes-Prone New Zealand Obese (NZO) Mice. Diabetologia. 58 (3), 604-614 (2014).
  56. He, Y., et al. Reversal of Early Diabetic Nephropathy by Islet Transplantation under the Kidney Capsule in a Rat Model. J Diabetes Res. 2016, 1-12 (2016).
  57. Yun, F., Zhaorigen, B., Han, X., Li, X., Yun, S. Islet-Like Cells Induced from Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells with Neonatal Bovine Pancreatic Mesenchymal Exosomes for Treatment of Diabetes Mellitus. Hormone Metabolic Res. 56 (06), 463-470 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cukrzyca typu 1produkcja insulinybeta-komórki trzustkitransplantacja komórek wysepekredukcja glikemiidoustrojna tolerancja glukozyszczury z cukrzycą indukowaną streptozotocynąochrona immunologiczna

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.