Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie transferu energii rezonansu Förstera w żywych komórkach metabolicznie regulowanej dynamiki aktywacji Akt w komórkach HepG2

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68075

⸱

23 maja 2025

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biocomplexity and Engineering Biology, School of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 2Futian Biomedical Innovation R&D Center, The Chinese University of Hong Kong, 3Ciechanover Institute of Precision and Regenerative Medicine, School of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Immunology and Microbiology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology, 5Department of Biology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology, 6Department of Computer Science and IT, University of Southern Punjab

W tym artykule

Podsumowanie

W tym miejscu przedstawiamy protokół ilościowego określenia czasoprzestrzennej dynamiki aktywacji i fosforylacji Akt w żywych komórkach HepG2. Obrazowanie metodą rezonansowego transferu energii metodą Förster (FRET) jest potężnym narzędziem, które dostarcza cennych informacji na temat szlaków sygnalizacji insuliny i regulacji metabolicznej w komórkach nowotworowych.

Streszczenie

Metabolicznie regulowana aktywacja Akt jest krytycznym węzłem w kaskadzie sygnalizacji insuliny i dostarcza cennych informacji na temat związku między cukrzycą a rakiem. Aby precyzyjnie określić ilościowo aktywność Akt w komórkach HepG2, opracowaliśmy solidny, powtarzalny protokół wykorzystujący rezonansowy transfer energii Förster (FRET) z genetycznie kodowanymi bioczujnikami specyficznymi dla Akt. Protokół ten przedstawia szczegółowe kroki hodowli komórek, przygotowania naczynia do obrazowania i transfekcji komórek HepG2 w celu ekspresji bioczujników opartych na FRET, a także szczegółowe wytyczne dotyczące konfiguracji sprzętu i oprogramowania laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Wyniki wykazały unikalne wzorce sygnalizacji insulinowej w komórkach HepG2, które wykazują nieodwracalny przełącznik charakteryzujący się konstytutywną aktywacją Akt z określonym progiem włączenia, ale bez progu wyłączenia. W przeciwieństwie do tego, myotubes wyświetlają odwracalny przełącznik. Utrzymująca się aktywacja Akt w komórkach HepG2 sugeruje mechanizmy leżące u podstaw insulinooporności i rozregulowania metabolicznego w komórkach wątroby, z szerszymi implikacjami dla zrozumienia progresji zaburzeń metabolicznych i raka. Protokół ten stanowi cenną podstawę do badania szlaków sygnałowych i zachowań komórkowych związanych z Aktem w różnych kontekstach chorobowych.

Wprowadzenie

Cukrzyca stanowi poważne globalne wyzwanie zdrowotne, charakteryzujące się insulinoopornością i upośledzoną homeostazą glukozy1. Kompleksowe zrozumienie szlaków sygnałowych insuliny ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia patofizjologii tej choroby, ponieważ insulina odgrywa kluczową rolę w metabolizmie glukozy, wzroście komórek i przeżyciu2. Liczne badania wykazały, że sygnalizacja insulinowa znacząco wpływa na różne nowotwory, łącząc insulinooporność z progresją guza i złymi wynikami leczeniapacjentów 3,4,5,6. Komórki HepG2, powszechnie stosowana linia komórkowa raka wątrobowokomórkowego, służą jako cenny model do badania insulinooporności i zależności między dysregulacją metaboliczną a rozwojem raka7. Tradycyjnie, naukowcy postrzegali reakcje na insulinę jako stopniowane; Jednak ostatnie badania wykazały, że poszczególne komórki mogą wykazywać odpowiedzi bistabilne, wykazując istotne przejścia między brakiem odpowiedzi a pełną odpowiedzią występującą przy określonych progach stężenia insuliny 8,9.

Obrazowanie rezonansowego transferu energii metodą Förstera (FRET) jest potężnym narzędziem do badania czasoprzestrzennego rozkładu biomolekuł w żywych komórkach10. Wydobywając informacje z dynamiki molekularnej, FRET zapewnia wgląd w procesy takie jak aktywacja Akt w czasie rzeczywistym, co czyni go nieocenioną techniką do badania żywych komórek11,12. Ta metoda obrazowania okazała się niezbędna w badaniu dynamiki komórek, szczególnie w chorobach metabolicznych i nowotworach, gdzie precyzyjne interakcje molekularne mają kluczowe znaczenie13. FRET umożliwia również monitorowanie interakcji molekularnych w czasie rzeczywistym, rzucając światło na mechanizmy, takie jak insulinooporność i progresja nowotworu14,15. Bioczujniki FRET mają kluczowe znaczenie w badaniach nad rakiem w badaniu mikrośrodowisk guza, oporności na leki i zaburzeń metabolicznych16. Metody wykrywania FRET, takie jak emisja uczulona (SE), wybielanie akceptorowe (AB), mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) i spektroskopia, oferują wyraźne korzyści w ilościowym określaniu interakcji molekularnych17. SE mierzy transfer energii między fluoroforami donorowymi i akceptorowymi, co skutkuje mierzalnym przesunięciem widm emisyjnych, które koreluje z bliskością oddziałujących biomolekuł18. AB wykorzystuje selektywne fotowybielanie fluoroforu akceptorowego i śledzi zmiany we fluorescencji donora, co pozwala naukowcom ocenić kinetykę interakcji i odległości19. FLIM ocenia szybkość zaniku fluorescencji fluoroforu donorowego, na który bezpośredni wpływ ma wydajność FRET, aby zapewnić precyzyjne pomiary interakcji molekularnych w nanoskali20.

Korzystając z technik FRET, niedawno wykazaliśmy bistabilną odpowiedź insulinową w miotubach pochodzących z C2C12 8,9,21,22,23,24. Odrębne progi włączania i wyłączania aktywacji Akt, jak odkryliśmy, sugerują, że stopniowana odpowiedź na dawkę insuliny w całym ciele przeczy złożoności subkomórkowej kaskady sygnalizacyjnej, począwszy od bodźca insulinowego, który kończy się odpowiedzią "wszystko albo nic" na poziomie pojedynczej komórki 21,22,23,24. Aby przetestować obecność bistabilności w innych typach komórek, stymulowaliśmy komórki HepG2 insuliną i rejestrowaliśmy ich odpowiedź za pomocą obrazowania pojedynczych komórek FRET. Stymulowaliśmy komórki HepG2 o różnych stężeniach insuliny i monitorowaliśmy aktywność Akt na poziomie pojedynczej komórki za pomocą biosensora Akt. Bioczujnik Akt składa się ze wzmocnionego białka fluorescencyjnego cyjanu (ECFP)25 jako fluoroforu dawcy i najjaśniejszego wariantu białka żółtej fluorescencji (YPet)26 jako fluoroforu akceptorowego, połączonych łącznikiem Eevee zawierającym sekwencję peptydową SGRPRTTTFADSCKP. Peptyd ten działa jako substrat dla fosforylowanego Akt (pAkt), zoptymalizowanego z ludzkiej kinazy syntazy glikogenu 3β (GSK3β). W stanie nieufosforylowanym przestrzenna separacja między fluoroforami donorowymi i akceptorowymi przekracza promień Förstera, co hamuje transfer energii. Po stymulacji insuliną dochodzi do fosforylacji Akt, która prowadzi do fosforylacji SGRPRTTTFADSCKP. Proces ten indukuje zmianę konformacyjną, która przenosi donor i akceptor w promień Förstera, umożliwiając FRET27. W rezultacie intensywność sygnału FRET koreluje z ilością fosforylowanych cząsteczek Akt i umożliwia ilościowe określanie w czasie rzeczywistym odpowiedzi komórkowych za pośrednictwem insuliny.

Protokół ten, początkowo opracowany do badania sygnalizacji insuliny w miotubkach pochodzących z C2C12, został z powodzeniem zastosowany do komórek HepG2 i wykorzystany na różnych platformach sprzętowych i programowych, demonstrując w ten sposób jego zastosowanie, zdolność adaptacji i wszechstronność. Komórki HepG2 wykazują konstytutywną aktywność Akt, co czyni je idealnym modelem in vitro do badania specyficznej dla wątroby sygnalizacji insuliny i procesów metabolicznych. Kluczowe cechy protokołu są opisane krok po kroku w sekcji protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Przegląd kroków eksperymentalnych zaangażowanych w obrazowanie żywych komórek metodą FRET w celu monitorowania fosforylacji Akt w pojedynczych komórkach HepG2 przedstawiono na Rysunku 1.

1. Pozyskiwanie, propagacja i oczyszczanie plazmidów

UWAGA: W tej sekcji przedstawiono kluczowe etapy pozyskiwania, amplifikacji i oczyszczania plazmidu niezbędnego do analizy FRET w pojedynczych komórkach.

  1. Wykorzystać plazmid pEevee-iAkt-NES-YPet (Rysunek 2A).
    UWAGA: Plazmid został udostępniony przez Prof. Kazuhiro Aoki z National Institute for Basic Biology (NIBB), Japonia. Mapy plazmidów dla biosensorów FRET wykorzystywanych do monitorowania Akt oraz ich odpowiednie kontrole przedstawiono na Rysunku 2. Plazmidy pEevee-iAkt-NES-ECFP (donor; Rysunek 2B) oraz pEevee-iAkt-NES-Ypet (akceptor; Rysunek 2C) są stosowane jako kontrole kalibracyjne podczas eksperymentów FRET9.
    UWAGA: Rysunek 3 przedstawia budowę i mechanizm działania wewnątrzmolekularnego biosensora FRET.
  2. W celu namnożenia plazmidu przeprowadzić transformację bakteryjną z wykorzystaniem chemicznie kompetentnych komórek E. coli (patrz Tabela materiałów). Przenieść transformowane komórki na agar Luria-Bertani (LB) zawierający 100 µg/mL ampicyliny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia wybrać kolonię oporną na ampicylinę i hodować ją w bulionie LB z dodatkiem 100 µg/mL ampicyliny w celu amplifikacji plazmidu.
  3. W celu oczyszczenia plazmidowego DNA użyć dostępnego komercyjnie zestawu do oczyszczania DNA plazmidowego (patrz Tabela materiałów), aby uzyskać wysoką czystość i wydajność. Ocenić jakość DNA, mierząc stosunki absorbancji (A260/A280 oraz A260/A230) przy użyciu spektrofotometru (patrz Tabela materiałów). Za optymalne uznaje się wartości w zakresach 1,8-2,0 oraz 2,0-2,2. Zweryfikować integralność plazmidu za pomocą elektroforezy w żelu agarozy, aby upewnić się, że nadaje się on do transfekcji.

2. Procedura hodowli komórkowej

UWAGA: Wszystkie procedury hodowli komórkowej należy przeprowadzać wdymażowej komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby utrzymać sterylne środowisko i zapobiec kontaminacji. Schemat hodowli komórek HepG2 przedstawiono na Rysunku 4. Pożywka kompletna dla komórek HepG2 składa się z Minimum Essential Medium (MEM), 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% nieistotnych aminokwasów (NEAA), 1 mM pirogronianu sodu, suplementu 2 mM L-glutaminy, 100 U/mL penicyliny-streptomycyny oraz 2,5 µg/mL roztworu antybiotyku i antymykotyku (patrz Tabela materiałów, Tabela 1).

  1. Szybko rozmrozić zamrożone komórki HepG2, umieszczając fiolkę w termomikserze lub kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C aż do całkowitego rozmrożenia.
  2. Przenieść rozmrożone komórki do probówki stożkowej o pojemności 15 mL zawierającej 10 mL kompletnej pożywki wzrostowej (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Przed użyciem wstępnie podgrzać kompletną pożywkę wzrostową do 37 °C, aby zminimalizować szok termiczny komórek.
  3. Wirować probówkę przy 200 x g przez 5 min w celu osadzenia komórek.
  4. Ostrożnie odessać supernatant za pomocą końcówki do pipety o szerokim wlocie, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
  5. Resuspendować osad w 10 mL świeżej kompletnej pożywki wzrostowej.
  6. Przenieść zawiesinę komórkową do kolby do hodowli tkanek o powierzchni 75 cm².
  7. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C w atmosferze nawilżonej z dodatkiem 5% CO2.
    UWAGA: Obserwować komórki przez kolejne 24-48 h w celu potwierdzenia przytwierdzenia i oceny regeneracji. Nie niepokoić komórek przez co najmniej 4 h, aby zapewnić prawidłowe przytwierdzenie przed wymianą pożywki. Unikać częstego otwierania inkubatora podczas pierwszych 4 h, ponieważ może to zakłócić przytwierdzanie komórek. Należy przestrzegać instytucjonalnych protokołów bezpieczeństwa biologicznego i stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej (ŚOI), aby utrzymać bezpieczne środowisko pracy podczas wszystkich procedur hodowli komórkowej. Przeprowadzać subkulturę komórek HepG2, gdy osiągną one 70%-80% konfluencji, aby utrzymać optymalne warunki wzrostu i zapobiec przeludnieniu, które może wpłynąć na żywotność i potencjał wzrostu komórek.
  8. W celu subkultury odessać pożywkę i raz przepłukać komórki 5 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).
  9. Dodać 1 mL 0,25% trypsyny, aby pokryć monowarstwę komórek (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Upewnić się, że trypsyna została wstępnie podgrzana do 37 °C dla optymalnej aktywności. Nie doprowadzić do nadmiernej trypsynizacji komórek, ponieważ może to obniżyć ich żywotność. Monitorować komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić ich odklejenie.
  10. Inkubować w temperaturze 37 °C przez około 5 min.
  11. Gdy komórki się odkleją, dodać 2 mL kompletnej pożywki, aby zneutralizować trypsynę, i zebrać komórki za pomocą pipetowania.
  12. Delikatnie pipetować zawiesinę komórkową, aby rozbić skupiska i uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.
  13. Dodać 3 mL kompletnej pożywki do każdej nowej kolby, a następnie przenieść komórki do każdej kolby w stosunku rozcieńczenia 1:2.
    UWAGA: W przypadku wczesnych pasaży rozdzielać komórki w rozcieńczeniu 1:2. Po 4-5 pasażach można stosować rozcieńczenia 1:4 lub 1:5, w zależności od potrzeb.
  14. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze nawilżonej z dodatkiem 5% CO2.
    UWAGA: Sprawdzić komórki po 24 h, aby potwierdzić przytwierdzenie i ocenić regenerację.
  15. W rutynowej hodowli wymieniać pożywkę co 2-3 dni lub wcześniej, jeśli wskaźnik pH zmieni kolor z różowego na żółty, co wskazuje na zakwaszenie.
    UWAGA: Nie dopuścić do zbyt dużego zakwaszenia pożywki, ponieważ może to zaszkodzić komórkom.
  16. Regularnie sprawdzać morfologię komórek pod mikroskopem, aby zapewnić ich prawidłowy stan.
    UWAGA: Do krótkoterminowego przechowywania zamrozić komórki HepG2 w temperaturze -80 °C; do długoterminowego przechowywania przechowywać w ciekłym azocie. Skład pożywki do zamrażania użytej w tym eksperymencie opisano w (Tabela 2).

3. Powlekanie naczyń obrazowych poli-L-lizyną

  1. Użyć 1 mL roztworu Poly-L-Lysine o stężeniu 0,1 mg/mL na każdą szalkę do obrazowania, aby pokryć całą powierzchnię (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Dostosować stężenie Poly-L-Lysine do wymagań konkretnego typu komórek.
  2. Delikatnie kołysać szalką, aby uzyskać jednolitą powłokę na powierzchni hodowlanej.
    UWAGA: Przez cały proces należy zachować warunki sterylne, aby zapobiec kontaminacji.
  3. Inkubować szalki przez noc w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Odssać nadmiar roztworu Poly-L-Lysine z szalek za pomocą pipety.
  5. Przepłukać powierzchnię trzy razy PBS, pozostawiając roztwór na 5 min za każdym razem (patrz Tabela materiałów). Całkowicie usunąć niezwiązaną Poly-L-Lysine z szalki do obrazowania, aby zapobiec hamowaniu wzrostu komórek. Płukać płytki delikatnie, aby uniknąć zarysowania lub uszkodzenia szklanego dna.
  6. Suszyć powlekone szalki do obrazowania na powietrzu w temperaturze 37 °C przez co najmniej 3 h.
  7. Użyć powlekonych szalek do obrazowania niezwłocznie lub przechowywać je w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.

4. Transfekcja komórek HepG2

UWAGA: Metoda transfekcji HepG2 została przedstawiona na Rysunku 5.

  1. Wysiać komórki HepG2 do uprzednio powlekanych naczyń do obrazowania na 24–48 h przed transfekcją, aby zapewnić osiągnięcie konfluencji na poziomie 70%–90%.
  2. Rozmrozić na lodzie odczyn do transfekcji oraz plazmid kodujący biosensor FRET. Dokładnie wymieszać w wirówce typu vortex i krótko odwirować (np. 5 000 x g  przez 5 s) przed użyciem (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Należy upewnić się, że odczyn do transfekcji i plazmid są całkowicie rozmrożone przed użyciem.
    OSTRZEŻENIE: Należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ może to obniżyć efektywność odczynu do transfekcji.
  3. Dodać 8 µg plazmidu kodującego biosensor FRET do buforu reakcyjnego, aby uzyskać końcową objętość 100 µL. Dobrze wymieszać za pomocą vortexa przez 5 s z dużą prędkością (około 3 000–5 000 x g).
    UWAGA: Zawsze należy dodać plazmid do buforu przed dodaniem polimerowego odczynu do transfekcji. Co najmniej 50 µL roztworu musi stanowić bufor reakcyjny (patrz Tabela materiałów).
  4. Dodać 2,4 µL polimeru do transfekcji do probówki zawierającej rozcieńczone DNA plazmidowe. Dobrze wymieszać za pomocą vortexa przez 15 s z dużą prędkością (około 3 000–5 000 × g).
    UWAGA: Zawsze należy stosować 0,3 µL polimeru do transfekcji na każdy 1 µg DNA.
    OSTRZEŻENIE: Należy upewnić się, że polimer do transfekcji jest dokładnie wymieszany z DNA plazmidowym w celu utworzenia jednorodnych kompleksów nanocząsteczkowych.
  5. Inkubować mieszaninę biosensora i polimeru w temperaturze 37 °C przez 15 min, aby umożliwić utworzenie kompleksów nanocząsteczkowych.
    UWAGA: Należy unikać pozostawiania polimeru do transfekcji w roztworze przez ponad 30 min, ponieważ może to obniżyć efektywność transfekcji.
    OSTRZEŻENIE: Należy dokładnie monitorować czas inkubacji, aby zapobiec zbyt długiej inkubacji, co może prowadzić do zmniejszenia efektywności transfekcji.
  6. Odwirować zawartość probówki przez 5 s przy 5 000 x g , aby zebrać osad na dnie, a następnie dodać całe 100 µL roztworu kompleksów nanocząsteczkowych kroplami do pożywki hodowlanej komórek. Delikatnie kołysać płytką w przód i w tył, aby wymieszać.
    UWAGA: Należy upewnić się, że roztwór kompleksów nanocząsteczkowych jest dodawany kroplami, aby równomiernie rozprowadzić go w pożywce hodowlanej komórek.
    OSTRZEŻENIE: Należy unikać gwałtownego kołysania, ponieważ może to spowodować odklejenie się komórek lub nierównomierne rozmieszczenie kompleksów.
  7. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C od 4 h do całej nocy.
    UWAGA: Czas inkubacji można dostosować do potrzeb eksperymentalnych, ale 4 h jest zazwyczaj wystarczające dla efektywnej transfekcji.
    OSTRZEŻENIE: Należy unikać przedłużonej inkubacji (>16 h), ponieważ może to obniżyć żywotność komórek.
  8. Usunąć kompleksy nanocząsteczkowe z komórek poprzez aspirację, zastąpić je 2 mL świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej i przenieść płytkę z powrotem do inkubatora 37 °C do czasu analizy. Szczytowa ekspresja przypada zazwyczaj na 48 h po transfekcji.
  9. Przeanalizować komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym.
    UWAGA: Należy upewnić się, że mikroskop jest odpowiednio skalibrowany do obrazowania fluorescencyjnego w celu uzyskania dokładnych wyników.
    OSTRZEŻENIE: Należy zminimalizować ekspozycję komórek na intensywne światło podczas obrazowania, aby zapobiec fototoksyczności.

5. Głodzenie komórek HepG2

UWAGA: Po zakończeniu etapu transfekcji należy poddać komórki głodzeniu surowiczemu przed stymulacją insuliną i obrazowaniem FRET. Minimalizuje to aktywację szlaku Akt wywołaną insuliną obecną w FBS i zapewnia spójne poziomy bazowe aktywności Akt. Skład pożywki do głodzenia użytej w tym eksperymencie opisano w (Tabeli 3). BSA występuje w formie proszku. Aby przygotować 0,1% (w/v) roztwór, należy rozpuścić 0,1 g BSA w 3 mL DMEM, dokładnie mieszając. Roztwór należy wysterylizować za pomocą filtra 0,45 µm i uzupełnić końcową objętość do 100 mL, dodając DMEM.

  1. Usunąć pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przepłukać naczynia do obrazowania 1x PBS przez 5 min każdego z płukań.
    UWAGA: Dwiet krotne płukanie w PBS pomaga całkowicie usunąć resztkowe serum oraz wszelką insulinę lub czynniki wzrostu, które mogłyby zakłócić przebieg eksperymentu.
  2. Dodać 2 mL pożywki do głodzenia do naczyń do obrazowania (patrz Tabela materiałów). Powoli dodać pożywkę wzdłuż krawędzi naczynia, aby uniknąć oderwania komórek od szklanego dna. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 h.
    UWAGA: 4-godzinna inkubacja jest optymalna dla synchronizacji metabolizmu komórkowego; jednak czas ten można wydłużyć w zależności od potrzeb eksperymentalnych.

6. Obrazowanie żywych komórek HepG2 metodą FRET

UWAGA: Ta sekcja zawiera instrukcje dotyczące obrazowania żywych komórek metodą FRET w celu monitorowania dynamiki czasowo-przestrzennej fosforylacji Akt w pojedynczych komórkach HepG2. Niezbędne jest zoptymalizowanie konfiguracji mikroskopu, procedur postępowania oraz warunków obrazowania dla żywych komórek HepG2, zgodnie z poniższym opisem. Konfiguracja mikroskopu ma kluczowe znaczenie dla optymalizacji warunków obrazowania FRET. Należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi konfiguracji komputera/konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego (CLSM) krok po kroku, aby zapewnić stabilną pracę. Spersonalizowana konfiguracja CLSM do obrazowania FRET przedstawiona jest na (Rysunku 6) .

  1. Włącz wyłącznik zdalny, aby zasilić mikroskop, komputer, skaner, moduł laserowy, stół piezoelektryczny oraz źródło światła LED do epifluorescencji. Przed włączeniem upewnij się, że wszystkie komponenty są prawidłowo podłączone, aby uniknąć potencjalnych uszkodzeń.
  2. Przekręć klucz do pozycji ON na module laserowym i naciśnij przyciski, aby aktywować oba lasery wymagane do FRET (linie laserowe 457 nm i 514 nm).
    UWAGA: Upewnij się, że zastosowano odpowiednie filtry i ustawienia w celu uzyskania optymalnych obrazów FRET. Wybór linii laserowej powinien opierać się na profilach wzbudzenia i emisji biosensora.
  3. Włącz listwę zasilającą, aby zasilić komputer i monitor podłączone do mikroskopu.
    UWAGA: Przed włączeniem upewnij się, że wszystkie połączenia są stabilne, aby zapobiec uszkodzeniu sprzętu.
  4. Zaloguj się do systemu Windows i uruchom oprogramowanie mikroskopowe.
  5. Kliknij A1 (Akwizycja), aby zainicjować konfigurację obrazowania. Wybierz odpowiednie konfiguracje optyczne zgodnie z wymaganiami eksperymentu FRET.
  6. Dostosuj moc lasera i czułość detektora w zależności od potrzeb, aby uzyskać optymalne warunki obrazowania. Ostrożnie zainstaluj inkubator na stole mikroskopu i zabezpiecz go śrubami.
    UWAGA: Nie dokręcaj zbyt mocno śrub, aby zapobiec uszkodzeniu inkubatora lub stołu mikroskopu.
  7. Napełnij wewnętrzną kąpiel wodną sterylną wodą dwukrotnie destylowaną (ddH2O). Bezpiecznie zainstaluj górną grzałkę i włącz zasilanie grzałki stołu, grzałki kąpieli oraz grzałki obiektywu (Rysunek 7A).
    UWAGA: Nie napełniaj nadmiernie, aby uniknąć rozlania cieczy do systemu. Upewnij się, że wszystkie grzałki działają prawidłowo, aby utrzymać stałe warunki temperaturowe podczas obrazowania żywych komórek.
  8. Do obrazowania użyj obiektywu imersyjnego 40x (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Specyfikacje techniczne znajdują się na stronie internetowej producenta.
  9. Przetrzyj soczewkę obiektywu papierem do optyki zwilżonym 95% etanolem. Nanieś niewielką kroplę olejku imersyjnego na soczewkę obiektywu (Rysunek 7B). Umieść naczynie do obrazowania zawierające komórki HepG2 na stole mikroskopu i zabezpiecz je uchwytem (Rysunek 7C).
    UWAGA: Upewnij się, że naczynie do obrazowania jest prawidłowo wyrównane i zabezpieczone, aby zapobiec jakimkolwiek przesunięciom podczas obrazowania. Unikaj nacisku na soczewkę, aby nie uszkodzić obiektywu ani szklanego dna naczynia.
  10. Zamknij komorę i inkubuj komórki w komorze dla żywych komórek przez 1-2 h, aby pozwolić im na equilibrację (Rysunek 7D).
  11. Podczas obrazowania poklatkowego w określonych odstępach czasu przerwij proces i delikatnie usuń medium (Rysunek 7E), a następnie dodaj 1 mL świeżo przygotowanego medium z okrezionym stężeniem insuliny (Rysunek 7F, Tabela materiałów).
    UWAGA: Przygotuj roztwór zapasowy insuliny o stężeniu 1 mg/mL, rozpuszczając 1 mg insuliny w 1 mL 10 mM kwasu octowego. Przefiltruj roztwór przez sterylny filtr strzykawkowy 0,2 µm i przechowuj alikwoty w temperaturze −20 °C.
  12. Uruchom okno ND Acquisition z menu File oprogramowania mikroskopowego.
    UWAGA: Konfiguracja ND Acquisition jest pokazana na (Rysunku 8).
  13. Wybierz zakładkę Time , aby ustawić interwał, czas trwania i żądaną liczbę cykli dla obrazowania poklatkowego. Następnie kliknij zakładkę XY i naciśnij przycisk + add, aby wybrać poszczególne komórki HepG2 do obrazowania.
  14. Aby dodać wiele komórek, zlokalizuj odpowiednie komórki, wykonaj skanowanie, precyzyjnie ustaw ostrość i zablokuj funkcję rozproszenia punktu (PSF). Powtórz ten krok dla każdej nowej komórki dodawanej do obrazowania. Przeskanuj wiele komórek w różnych miejscach w naczyniach do obrazowania, aby zidentyfikować różne komórki docelowe do włączenia do analizy.
  15. Kliknij czerwoną ikonę X, aby odznaczyć komórki. Zaznacz pole 'Z', aby ustawić pozycję Z. Po wybraniu wszystkich parametrów wpisz nazwę eksperymentu w polu 'File Name'.
  16. Kliknij Browse , aby wybrać folder docelowy, a następnie zaznacz pole save to file. Naciśnij zakładkę Run now, aby rozpocząć akwizycję ND. Okno akwizycji ND będzie wyświetlać postęp obrazowania poklatkowego w czasie rzeczywistym, w tym czas upływający i pozostały.
  17. Rejestruj pomiary bazowe przez maksymalnie 30 min bez stymulowania komórek insuliną.
  18. Zlokalizuj odpowiednie komórki, użyj przybliżenia/oddalenia, aby ustawić pojedynczą komórkę w ostrości, i wybierz komórki o wysokiej intensywności fluorescencji. Dodawaj komórki pojedynczo, maksymalnie do 6 komórek.
    UWAGA: Ogranicz liczbę komórek, aby zapobiec opóźnieniom w akwizycji obrazów i zawieszaniu się okna podczas obrazowania.
  19. Ustaw czas i częstotliwość obrazowania dla obrazowania poklatkowego. Rozpocznij obrazowanie poklatkowe.
    UWAGA: Przed rozpoczęciem sesji obrazowania upewnij się, że wszystkie parametry, w tym czas ekspozycji i moc lasera, są zoptymalizowane.
  20. Przerwij obrazowanie w regularnych odstępach czasu, delikatnie usuń medium z naczynia z szklanym dnem i dodaj 1 mL medium uzupełnionego o odpowiednie stężenie insuliny.
  21. Wznów akwizycję obrazów. Powtarzaj krok 6.20 zgodnie z potrzebami.
  22. Na koniec eksperymentu kliknij zakładkę Finish, aby zamknąć program. Wykonaj kopię zapasową i bezpiecznie przechowuj pozyskane obrazy do analizy.

7. Analiza danych

  1. Skoryguj wstępnie przetworzone dane z obrazowania FRET w trybie time-lapse dla próbek kontrolnych pod kątem przesłuchów widmowych i autofluorescencji CFP, co pozwoli na uzyskanie skorygowanych wartości FRET oraz precyzyjnej wydajności FRET. Do akwizycji, przetwarzania i analizy obrazów FRET należy użyć oprogramowania do obrazowania, zgodnie z protokołami opisanymi w poprzednich badaniach27,28,29,30 (Rysunek 9).

8. Obliczenia wydajności FRET

  1. Aby określić wydajność FRET, należy pozyskać siedem obrazów komórek (IDA(D), IDD(D), IDA(A), IAA(A), IDD, IAA oraz IDA). Wydajność FRET oblicza się za pomocą następującego wzoru:
    figure-protocol-1
    gdzie FRETCorrected wyznacza się z równania:
    figure-protocol-2
    przy czym d oraz a są zdefiniowane jako:
    figure-protocol-3
    figure-protocol-4
    W tym zapisie IDA, IDD oraz IAA reprezentują obrazy komórek transfektowanych biosensorem. IDA(D)  i IDD(D)) są obrazami kontrolnymi dla samego donora, a IDA(A) i IAA(A) są obrazami kontrolnymi dla samego akceptora.

9. Pozyskiwanie obrazów

  1. IDA : Uzyskać obraz przy wzbudzeniu donora (434 nm) i emisji akceptora (530 nm).
  2. IDD : Uzyskać obraz przy wzbudzeniu donora (434 nm) i emisji donora (477 nm).
  3. IAA : Uzyskać obraz przy wzbudzeniu akceptora (517 nm) i emisji akceptora (530 nm).
  4. IDA(D) oraz IDA(A) : Pozyskać obraz przy użyciu tego samego wzbudzenia i emisji co w przypadku IDA , ale z komórek wykazujących ekspresję odpowiednio tylko donora lub tylko akceptora.
  5. IDD(D) : Pozyskać obraz w tych samych warunkach co IDD dla kontroli z samym donorem.
  6. IAA(A) : Uzyskać obraz w tych samych warunkach co IAA , ale specyficznie dla kontroli z samym akceptorem.

10. Korekcja tła

  1. Uruchom oprogramowanie do analizy obrazów na komputerze. Z górnego paska menu przejdź do menu Plik (File). Z rozwijanej listy opcji wybierz Otwórz (Open) lub Otwórz plik (Open File).
  2. Przejdź do katalogu zawierającego dane obrazowe z serii czasowej (time-lapse). Zlokalizuj obraz z serii czasowej wymagający analizy (np. w formacie nd2).
  3. Wybierz plik i kliknij Otwórz (Open) lub OK, aby załadować go do oprogramowania w celu wyświetlenia i analizy. Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) w obrębie komórki (lub przyjmij całą komórkę jako ROI) i zarejestruj wartość szarości każdego piksela w tym obszarze.
  4. Wybierz obszar wolny od komórek jako tło i oblicz jego średnią wartość szarości. Utwórz obraz skorygowany poprzez odjęcie tej średniej wartości tła od wartości szarości każdego piksela w obrębie ROI komórki.

11. Eliminacja prześwitu (crosstalku) FRET

UWAGA: Nakładanie się widm emisji donora i wzbudzenia akceptora przedstawiono na Rysunku 3B, co ma kluczowe znaczenie dla wydajności FRET i procesu przeniesienia energii. Przecieki widmowe (bleed-through) w obrazowaniu FRET w trybie time-lapse stanowią istotne wyzwanie wynikające z nakładania się widm fluoroforów donora i akceptora, co prowadzi do niedokładnych pomiarów. Przesłuchy (crosstalk) są nieuniknione, ponieważ widma obu fluoroforów, donora i akceptora, w pewnym stopniu na siebie nachodzą (Rysunek 3C, D). Problem ten jest potęgowany przez takie czynniki jak wysokie stężenia fluoroforów oraz niewłaściwa konfiguracja filtrów. Rozwiązanie problemu przecieków widmowych jest niezbędne dla zapewnienia wiarygodności pomiarów FRET.

  1. W celu ograniczenia efektów przenikania sygnału (bleed-through) należy odnieść się do metody opisanej w poprzednim badaniu9.

12. Kwantyfikacja i analiza statystyczna

  1. Przeprowadź analizę statystyczną przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zbadać aktywację Akt w komórkach HepG2, komórki wysiano na uprzednio powlekane szalki do obrazowania i transfekowano biosensorem opartym na metodzie FRET pEevee-iAkt-NES (Rysunek 2A), zaprojektowanym w celu umożliwienia monitorowania fosforylacji Akt w czasie rzeczywistym. Po transfekcji komórki poddano 4-godzinnemu głodzeniu surowiczemu w medium bezsurowiczym, aby zsynchronizować ich stan metaboliczny i zminimalizować podstawową sygnalizację insulinową.

Nastę...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół obrazowania żywych komórek FRET w celu monitorowania fosforylacji Akt w komórkach HepG2 obejmuje kilka kluczowych etapów w celu zapewnienia wiarygodnych i powtarzalnych wyników. Pierwszym krytycznym krokiem jest hodowla komórkowa, która obejmuje rutynową konserwację komórek, powlekanie naczyń obrazowych i wysiewanie komórek. Właściwa powłoka jest niezbędna do przyczepienia komórek podczas eksperymentów z obrazowaniem poklatkowym, ponieważ zapewnia stabilne przyleganie komórek, zapobiega odklejaniu się i minimali...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Prace te były częściowo wspierane przez Fundację Nauk Przyrodniczych w Shenzhen (JCYJ20240813113606009), Strefę Współpracy Shenzhen-Hongkong na rzecz Technologii i Innowacji (HZQB-KCZYB-2020056), Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (32070681), Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2019YFA0906002) oraz Shenzhen Peacock Plan (KQTD2016053117035204).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% trypsyna-EDTAGibco (firma Gibco)Kot#25200-056Użyj lodowatego PBS do mycia komórek
Naczynie do hodowli komórek ze szkła o średnicy 15 mmGNIAZDOKot#801001
2  mL fiolki kriogeniczne NalgeneThermo ScientificKot#5012-0020
5 ml pipet serologicznych pasiastychCorningKot#4487
95% etanoluKermel (powiat Kermelski)Kot#C028005
Mikroskop konfokalny A1 HD25/A1R HD25Nikonhttps://www.nikon.com/Powiększenie: 40×, Przysłona numeryczna (NA): 1.30, Czas przebywania piksela: 2.4 ms, Rozmiar piksela: 1024
AmpicylinySigma-AldrichKot#A9393
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)VWR Nauki przyrodniczeKot#N208-10g
Corning 25  CM2 Prostokątne kolby hodowlaneCorningKot#430639
Hrabina 3 automatyczny licznik komórekThermo Scientifichttp://www.thermofisher.com/#AMQAX2000
Szkiełka komory zliczania komórek hrabinyThermo Scientifichttp://www.thermofisher.com/#C10228
Cyfrowe mieszalniki wiroweThermo Scientifichttps://www.thermofisher.com/
DimetylosulfotlenekSigma-AldrichKot#D2650
Rurki Eppendorf Safe-Lock 1.5  MlEppendorf powiedział:Kot#022363204
Zestaw do wykrywania mykoplazmy EZ-PCRPrzemysł biologicznyKot# 20-700-20
Surowica bydlęca płodu, kwalifikowana, AustraliaGibco (firma Gibco)Kot#10099141
Suplement GlutaMAXGibco (firma Gibco)Kot#35050061
Grafton Pryzmat 9Oprogramowanie GraphPadhttps://www.graphpad.com/
Wirus HepG2Krajowa Kolekcja Uwierzytelnionych Kultur Komórkowych#CSTR:19375.09.3101HUMSCSP510  http://www.cellbank.org.cn/
Olejek immersyjny Typ 37Laboratoria CargilleKot #16237
InsulinaSigma-AldrichKot#I5500-50MGCiepły do 37 stopni; C przed użyciem
Rosół LB (1x)InvitrogenKot#10855001
Minimalna zawartość niezbędnego podłoża (MEM)Gibco (firma Gibco)Kot#11095080Ciepły do 37 stopni; C przed użyciem
mySPIN 12  mini wirówkaThermo Scientifichttps://www.thermofisher.com/
NanoDrop OneThermo Scientifichttps://www.thermofisher.com
Nikon Plan Fluor 40×/1.30 Soczewka olejowaNikonhttps://www.nikon.com/
NIS-Elementy-ARNikonhttps://www.nikon.com/
Aminokwasy endogenne (NEAA) (100x)Gibco (firma Gibco)Kot#11140050
Płytki agarowe One Shot LB InvitrogenKot#A55802
One Shot Stbl3 kompetentny chemicznie E.  ColiInvitrogenKot#C737303
ParafilmPARAFILMKot#B8R05606
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)Gibco (firma Gibco)Kot#10010023
pEevee-iAkt-NES (7,033  bp)Miura et  AL31https://benchling.com/s/seq-q46zFYCfl0swLAun0t28/edit
Penicylina-streptomycynaGibco (firma Gibco)Kot#15070063
Profilaktyka plazmocynyInvivoGenKot#ant-mpp
Bromowodorek poli-L-lizyny Sigma-AldrichKot#P4832
Wanny precyzyjne ogólnego przeznaczeniaThermo Scientifichttps://www.thermofisher.com/
Zestaw do miniprzygotowania wirowania QIAprepQIAGEN powiedział:Kot#27106
SnapGene (Szybki gen)SnapGene firmy Dotmaticshttps://www.snapgene.com
Pirogronian sodu (100 mM)Gibco (firma Gibco)Kot#11360070
Filtr strzykawkowy, 0.22  μ mMiliporyKot#SLGP033RS
Górny inkubator etapowy Tokai HitTOKAI HIThttps://www.tokaihit-livecell.com/stagetopincubator
Ultraczysta woda destylowana wolna od DNaz/RNazInvitrogenKot#10977015
Odczynnik do transfekcji XfectŻyciorys TakaryKot#631317

Bibliografia

  1. GBD 2021 Diabetes Collaborators. Global, regional, and national burden of diabetes from 1990 to 2021, with projections of prevalence to 2050: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. Lancet. 402 (10397), 203-234 (2023).
  2. Li, M., et al. Trends in insulin resistance: insights into mechanisms and therapeutic strategy. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 216(2022).
  3. Poloz, Y., Stambolic, V. Obesity and cancer, a case for insulin signaling. Cell Death Dis. 6 (12), e2037(2015).
  4. Arcidiacono, B., et al. Insulin resistance and cancer risk: an overview of the pathogenetic mechanisms. Exp Diabetes Res. 2012, 789174(2012).
  5. Godsland, I. F. Insulin resistance and hyperinsulinaemia in the development and progression of cancer. Clin Sci (Lond). 118 (5), 315-332 (2009).
  6. Tsugane, S., Inoue, M. Insulin resistance and cancer: epidemiological evidence. Cancer Sci. 101 (5), 1073-1079 (2010).
  7. Yudhani, R. D., et al. In vitro insulin resistance model: A recent update. J Obes. 2023, 1964732(2023).
  8. Akhtar, J., et al. Bistable insulin response: The win-win solution for glycemic control. iScience. 25 (12), 105561(2022).
  9. Akhtar, J., Imran, M., Wang, G. Protocol for live-cell Forster resonance energy transfer imaging to reveal the bistable insulin response of single C2C12-derived myotubes. STAR Protoc. 5 (2), 103109(2024).
  10. Kamino, K., et al. Optimal inference of molecular interaction dynamics in FRET microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (15), e2211807120(2023).
  11. Kraft, A. E., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time visualization of second messengers in living cells. Methods Mol Biol. 1563, 85-90 (2017).
  12. Veeriah, S., et al. High-throughput time-resolved FRET reveals Akt/PKB activation as a poor prognostic marker in breast cancer. Cancer Res. 74 (18), 4983-4995 (2014).
  13. Conway, J. R. W., et al. Monitoring AKT activity and targeting in live tissue and disease contexts using a real-time Akt-FRET biosensor mouse. Sci Adv. 9 (17), eadf9063(2023).
  14. Chandris, P., Giannouli, C. C., Panayotou, G. Imaging approaches for the study of metabolism in real time using genetically encoded reporters. Front Cell Dev Biol. 9, 725114(2021).
  15. Yang, J., et al. Longitudinal FRET imaging of glucose and lactate dynamics and response to therapy in breast cancer cells. Mol Imaging Biol. 24 (1), 144-155 (2022).
  16. Mandrou, E., et al. A reliable system for quantitative G-protein activation imaging in cancer cells. Cells. 13 (13), 1114(2024).
  17. Fang, C., Huang, Y., Zhao, Y. Review of FRET biosensing and its application in biomolecular detection. Am J Transl Res. 15 (2), 694-709 (2023).
  18. Miller, J. N. Fluorescence energy transfer methods in bioanalysis. Analyst. 130 (3), 265-270 (2005).
  19. Verveer, P. J., Rocks, O., Harpur, A. G., Bastiaens, P. I. Imaging protein interactions by FRET microscopy: FRET measurements by acceptor photobleaching. CSH Protoc. 2006 (6), (2006).
  20. Vu, C. Q., Arai, S. Quantitative imaging of genetically encoded fluorescence lifetime biosensors. Biosensors (Basel). 13 (10), 939(2023).
  21. Wang, G. A more holistic view of the logarithmic dose-response curve offers greater insights into insulin response. J Biol Chem. 301 (1), 108037(2025).
  22. Wang, G. Body mass dynamics is determined by the metabolic Ohm's law and adipocyte-autonomous fat mass homeostasis. iScience. 23 (6), 101176(2020).
  23. Wang, G. Raison d'être of insulin resistance: the adjustable threshold hypothesis. J R Soc Interface. 11 (101), 20140892(2014).
  24. Wang, G. Optimal homeostasis necessitates bistable control. J R Soc Interface. 9, 2723(2012).
  25. Heim, R., Tsien, R. Y. Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer. Curr Biol. 6 (2), 178-182 (1996).
  26. Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nat Biotechnol. 23 (3), 355-360 (2005).
  27. Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nat Protoc. 8 (2), 265-281 (2013).
  28. Gordon, G. W., Berry, G., Liang, X. H., Levine, B., Herman, B. Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy. Biophys J. 74 (5), 2702-2713 (1998).
  29. Tron, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis. Biophys J. 45 (5), 939-946 (1984).
  30. Calibration of fluorescence resonance energy transfer in microscopy. , US 6456734 United States Patent and Trademark Office (2002).
  31. Miura, H., Matsuda, M., Aoki, K. Development of a FRET biosensor with high specificity for Akt. Cell Struct Funct. 39 (1), 9-20 (2014).
  32. Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122(2014).
  33. Rani, K., Sengupta, S. Multi-stimuli programmable FRET based RGB absorbing antennae towards ratiometric temperature, pH and multiple metal ion sensing. Chem Sci. 12 (47), 15533-15542 (2021).
  34. Betolngar, D. B., et al. pH sensitivity of FRET reporters based on cyan and yellow fluorescent proteins. Anal Bioanal Chem. 407 (14), 4183-4193 (2015).
  35. Salonikidis, P. S., et al. An ion-insensitive cAMP biosensor for long term quantitative ratiometric fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurements under variable physiological conditions. J Biol Chem. 286 (26), 23419-23431 (2011).
  36. Youvan, D. C., et al. Calibration of fluorescence resonance energy transfer in microscopy using genetically engineered GFP derivatives on nickel chelating beads. Biotechnol Alia. 3, 1-18 (1997).
  37. Menaesse, A., et al. Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method. Cytometry A. 99 (4), 407-416 (2021).
  38. Batta, A., Hajdu, T., Nagy, P. Improved estimation of the ratio of detection efficiencies of excited acceptors and donors for FRET measurements. Cytometry A. 103 (7), 563-574 (2023).
  39. Coullomb, A., et al. QuanTI-FRET: a framework for quantitative FRET measurements in living cells. Sci Rep. 10 (1), 6504(2020).
  40. Hoppe, A., Christensen, K., Swanson, J. A. Fluorescence resonance energy transfer-based stoichiometry in living cells. Biophys J. 83 (6), 3652-3664 (2002).
  41. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophys J. 86 (6), 3923-3939 (2004).
  42. Hochreiter, B., Kunze, M., Moser, B., Schmid, J. A. Advanced FRET normalization allows quantitative analysis of protein interactions including stoichiometries and relative affinities in living cells. Sci Rep. 9 (1), 8233(2019).
  43. Liu, H., Zhang, F., Mishra, S. K., Zhou, S., Zheng, J. Knowledge-guided fuzzy logic modeling to infer cellular signaling networks from proteomic data. Sci Rep. 6, 35652(2016).
  44. Garrido-Rodriguez, M., Zirngibl, K., Ivanova, O., Lobentanzer, S., Saez-Rodriguez, J. Integrating knowledge and omics to decipher mechanisms via large-scale models of signaling networks. Mol Syst Biol. 18 (7), e11036(2022).
  45. Greenwald, E. C., Polanowska-Grabowska, R. K., Saucerman, J. J. Integrating fluorescent biosensor data using computational models. Methods Mol Biol. 1071, 227-248 (2014).
  46. Zhao, Z., Xia, J. Computational Approaches for Modeling Signal Transduction Networks. Encyclopedia of Bioinformatics and Computational Biology. , Elsevier. Cambridge, MA. (2019).
  47. Wang, G., Krueger, G. R. Computational analysis of mTOR signaling pathway: bifurcation, carcinogenesis, and drug discovery. Anticancer Res. 30 (7), 2683-2688 (2010).
  48. Wang, G. Singularity analysis of the AKT signaling pathway reveals connections between cancer and metabolic diseases. Phys Biol. 7 (4), 046015(2010).
  49. Chedere, A., Hari, K., Kumar, S., Rangarajan, A., Jolly, M. K. Multi-stability and consequent phenotypic plasticity in AMPK-Akt double negative feedback loop in cancer cells. J Clin Med. 10 (3), 472(2021).
  50. Mosca, E., et al. Computational modeling of the metabolic States regulated by the kinase akt. Front Physiol. 3, 418(2012).
  51. Liao, J., Madahar, V., Dang, R., Jiang, L. Quantitative FRET (qFRET) technology for the determination of protein-protein interaction affinity in solution. Molecules. 26 (21), 6339(2021).
  52. Verma, A. K., Noumani, A., Yadav, A. K., Solanki, P. R. FRET based biosensor: Principle applications recent advances and challenges. Diagnostics (Basel). 13 (8), 1375(2023).
  53. Mattheisen, J. M., et al. Application of bioluminescence resonance energy transfer to quantitate cell-surface expression of membrane proteins. Anal Biochem. 684, 115361(2024).
  54. Lionetti, M. C., La Porta, C. A. M. FLIM-FRET investigation of heterogeneous huntingtin aggregation in HeLa cells. Methods Mol Biol. 2551, 595-604 (2023).
  55. Petutschnig, E. K., Pierdzig, L., Mittendorf, J., Niebisch, J. M., Lipka, V. A novel fluorescent protein pair facilitates FLIM-FRET analysis of plant immune receptor interaction under native conditions. J Exp Bot. 75 (3), 746-759 (2024).
  56. Sprenger, J. U., Perera, R. K., Gotz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. J Vis Exp. 66, e4081(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie FRETsygnalizacja insulinowaregulacja metabolicznagenetycznie kodowane biosensorymikroskopia konfokalnatransfekcja kom rekzaburzenia metabolicznesygnalizacja nowotworowa
Obrazowanie transferu energii rezonansu Förstera w żywych komórkach metabolicznie regulowanej dynamiki aktywacji Akt w komórkach HepG2
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.