Method Article

Uproszczone podejście do proteomiki opartej na spektrometrii mas z wykorzystaniem wybranych regionów tkanek

DOI:

10.3791/68076

⸱

April 18th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Science, School of Medicine, CHA University, 2Department of Proteomic Research, CHA Future Medicine Research Institute, 3Department of Pathology, Seoul National University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj tworzymy metodę proteomiczną opartą na spektrometrii mas, używając izolowanych obszarów zainteresowania w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawkach tkanki. Protokół ten służy do analizy proteomu z określonych obszarów tkanek w zarchiwizowanych odcinkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteomika oparta na spektrometrii mas (MS) umożliwia kompleksową analizę proteomu w szerokim zakresie próbek biologicznych, w tym komórek, tkanek i płynów ustrojowych. Utrwalone formaliną i zatopione w parafinie (FFPE) skrawki tkanek, powszechnie używane do długoterminowej archiwizacji, stały się cennymi zasobami do badań proteomicznych. Oprócz korzyści związanych z przechowywaniem, naukowcy mogą izolować obszary zainteresowania (ROI) od normalnych regionów tkanek dzięki współpracy z patologami. Pomimo tego potencjału, nadal brakuje uproszczonego podejścia do eksperymentów proteomicznych obejmującego izolację ROI, przygotowanie próbek proteomicznych i analizę stwardnienia rozsianego. W tym protokole przedstawiono zintegrowany przepływ pracy, który łączy makrodysekcję ROI, przygotowanie próbki oparte na pułapkowaniu zawiesiny i wysokoprzepustową analizę MS. Dzięki takiemu podejściu ROI tkanek FFPE pacjentów, składających się z łagodnych surowiczych nowotworów torbielowatych (SCN) i przedrakowych wewnątrzprzewodowych brodawkowatych nowotworów śluzowych (IPMN) zdiagnozowanych przez patologów, zostały makrorozcięte, zebrane i przeanalizowane, co dało wysokie pokrycie proteomem. Co więcej, udało się zidentyfikować różnice molekularne między dwoma odrębnymi nowotworami torbielowatymi trzustki, wykazując w ten sposób możliwość zastosowania tego podejścia do postępów w badaniach proteomicznych z tkankami FFPE.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przez dziesięciolecia, chirurgicznie wycinane tkanki ludzkie były archiwizowane jako bloki utrwalone formaliną, zatopione w parafinie (FFPE). Te bloki tkankowe początkowo zachowują trójwymiarową (3D) strukturę zatopioną w parafinie. Tkanki są następnie cięte za pomocą mikrotomów, montowane na szkiełkach i barwione - zwykle hematoksyliną i eozyną (HE) lub immunohistochemią (IHC) - w celu ułatwienia diagnozy histopatologicznej przez doświadczonych patologów1,2. Tkanki FFPE oferują wyraźne korzyści w zakresie długotrwałego przechowywania ze względu na sieciowanie białek indukowane przez formalinę, która zatrzymuje aktywność enzymatyczną i proteolityczną3. Ze względu na to, że ułatwiają one konstruowanie dużych, dobrze zarchiwizowanych zestawów próbek, tkanki FFPE są uważane za kamień węgielny dla odkrywania biomarkerów w różnych dziedzinach, w tym genomiki4,5,6,7.

Jednak ich zastosowanie w proteomice opartej na chromatografii cieczowej i spektrometrii mas (LC-MS) historycznie stanowiło wyzwanie. Kluczowym ograniczeniem jest indukowane formaliną sieciowanie białek, które zakłóca trawienie tryptyczne -- krytyczny krok w globalnej analizie proteomu8. Co więcej, niewielka ilość białka możliwa do odzyskania ze szkiełek tkankowych często sprawia, że konwencjonalne metody przygotowania próbek są nieodpowiednie. Pomimo tych wyzwań postępy wykazały, że wiązania krzyżowe białek można odwrócić poprzez długotrwałą obróbkę w wysokiej temperaturze9,10,11. Jednocześnie metody przygotowania próbek zoptymalizowane pod kątem próbek białek o małej ilości rozszerzyły zastosowanie tkanek FFPE w badaniach proteomicznych12,13,14,15.

Jedną z istotnych zalet korzystania z preparatów tkankowych FFPE w proteomice jest ich zdolność do umożliwienia analizy specyficznej dla regionu. Szkiełka FFPE zazwyczaj zawierają zarówno zmiany chorobowe, jak i przylegającą normalną tkankę (ANT). Bezkrytyczna analiza całej tkanki grozi mylącymi wynikami z powodu mieszanych sygnatur molekularnych. W przeciwieństwie do tego, izolowanie i analizowanie regionów zainteresowania (ROI) - zmian chorobowych w porównaniu z ANT - umożliwia bardziej precyzyjną charakterystykę cech molekularnych specyficznych dla regionów patologicznych. W związku z tym podejścia oparte na FFPE stają się coraz bardziej popularne w badaniach proteomicznych16,17,18,19,20. Pomimo ich rosnącego zastosowania, usprawniony przepływ pracy, który krok po kroku opisuje cały eksperyment proteomiczny, nadal pozostaje rzadkością. W szczególności nie opublikowano protokołu opartego na wideo.

W tym badaniu stworzono solidny przepływ pracy proteomiki oparty na LC-MS, dostosowany do dokładnego profilowania zmian molekularnych w regionach specyficznych dla zmian. Korzystając z tkanek FFPE zdiagnozowanych przez dwóch patologów, makropreparowato, zebrano i przeanalizowano ROI z łagodnych surowiczych nowotworów torbielowatych (SCN) i przedrakowych wewnątrzprzewodowych brodawkowatych nowotworów śluzowych (IPMN). Protokół obejmuje makrodysekcję ROI, przygotowanie próbki oparte na pułapce zawiesinowej zoptymalizowane pod kątem minimalnych nakładów białka oraz wąską analizę akwizycji niezależnej od danych (DIA)-MS. Metoda ta umożliwiła identyfikację ponad 9 000 białek z obszarów tkanek o powierzchni około 1 cm², rozszyfrowując odrębne sygnatury proteomiczne związane z SCN i IPMN.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zrecenzowane i zatwierdzone przez Institutional Review Board of Seoul National University Hospital (IRB No. 1904-114-1028). Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Pobieranie antygenu tkankowego FFPE do przygotowania próbki proteomicznej

UWAGA: Upewnij się, że skalpele i wszystkie materiały, takie jak używana rurka, są sterylne, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Protokoły tego badania mogą być dostosowane do dowolnej tkanki FFPE z niewielkimi modyfikacjami w oparciu o konfigurację laboratoryjną.

  1. Wytnij 10-μm skrawki tkanki FFPE z całych bloków tkanek FFPE i umieść je na szkiełkach podstawowych.
    UWAGA: W tym badaniu do przygotowania próbki proteomicznej wykorzystano ludzką tkankę FFPE torbieli trzustki (dwa różne typy tkanki torbielowatej - SCN i IPMN).
  2. Usunąć wosk parafinowy z tkanki FFPE (odparafinować) dwoma płukaniami w ksylenie z zachowaniem ostrożności: jedno przez 5 minut, a drugie przez 2 minuty.
  3. Ponownie nawodnić tkankę poprzez seryjne płukanie stopniowaną mieszaniną etanolu: po 3 minuty w 100%, 85%, 70% i 50% etanolu, a następnie spłukać w wodzie dejonizowanej.
    UWAGA: Upewnij się, że ksylen i etanol są przenoszone w okapie oparów chemicznych.

2. Ekstrakcja białek tkankowych FFPE

  1. Przygotuj szkiełko tkankowe barwione HE lub IHC, na którym patolodzy wskazują ROI.
  2. Umieść niebarwione szkiełko tkankowe i szkiełko z barwioną tkanką tylnymi stronami do siebie, wyrównując je ze sobą. Upewnij się, że zwrot z inwestycji jest obserwowany przez szklane szkiełko.
  3. Usuń nieinteresujące obszary tkanek za pomocą skalpela.
    UWAGA: Jeśli sąsiednie normalne tkanki powinny być analizowane, zbierz je do innych probówek.
  4. Zeskrob ROI tkanek do środka szkiełka za pomocą skalpela i przenieś je do czystych probówek o niskiej zawartości białka o pojemności 1,5 ml.
  5. Dodać 180 μl buforu do lizy dodecylosiarczanu sodu (SDS) (5 % SDS, 2 mM tris (2-karboksetylo)fosfiny) [TCEP], 300 mM pH 8,5 Tris-HCl w wodzie dejonizowanej) do każdej probówki.
    UWAGA: Upewnij się, że objętość buforu do lizy jest wystarczająca do rozpuszczenia tkanki podczas sonikacji i zawieszenia wyekstrahowanych białek. Niewystarczający bufor może prowadzić do niepełnej lizy tkanek, podczas gdy nadmiar buforu może rozcieńczyć lizat białkowy.
  6. Wykonaj sonizację sondy przy amplitudzie 20%, stosując 10 cykli po 5 s włączania i 5 s wyłączania.
  7. Inkubować próbki w temperaturze 100 °C przez 3,5 godziny z 1 000 x g.
    UWAGA: Podczas inkubacji należy wykonywać sonikację próbek wodą przez 1 minutę co godzinę w celu efektywnej ekstrakcji białka.
  8. Po inkubacji schłodzić próbkę w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut. Odwirować próbki o masie 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia resztek tkankowych od supernatantu.
  9. Zebrać supernatant do czystej, oznakowanej probówki i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

3. Kwantyfikacja białka w lizacie tkankowym FFPE

UWAGA: Większość etapów oznaczania ilościowego białka kwasem bicynkowym opiera się na instrukcjach producenta z niewielkimi modyfikacjami. Zaleca się, aby odczynniki były przygotowywane zgodnie z wytycznymi producenta.

  1. Przygotować wzorce albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o różnym stężeniu, seryjnie rozcieńczając roztwór podstawowy (2 mg/ml BSA). W razie potrzeby rozcieńczyć próbki o współczynniku rozcieńczenia 20 lub 40.
  2. Przygotować wodę dejonizowaną jako ślepą próbę i bufor do lizy SDS jako kontrolę próbki.
  3. Odpipetować 9 μl wzorców, ślepą próbę, próbkę kontrolną i próbki do środka dołka mikropłytki.
  4. Dodać 4 μl roztworu odczynnika zgodności do próbki w każdym dołku.
  5. Przykryj talerz i mieszaj na wytrząsarce talerzowej na średnich obrotach przez 1 min. Następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  6. Dodać 260 μl odczynnika roboczego BCA do każdego dołka, a następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  7. Schłodzić talerz w temperaturze RT przez 3 minuty.
  8. Zmierzyć absorbancję studzienek przy 562 nm na czytniku płytkowym.
  9. Odjąć wartość absorbancji 562 nm ślepej próby od absorbancji wszystkich próbek i próbki kontrolnej.
  10. Następnie odjąć wartość absorbancji 562 nm dla próbki kontrolnej odjętej metodą ślepej próby od wartości wszystkich próbek.
  11. Wykreślić krzywą wzorcową i użyć jej do określenia stężenia białka w każdej próbce.
    UWAGA: Upewnij się, że szacunkowe 200-250 μg białek zostało wyekstrahowane z trzech szklanych szkiełek tkanek FFPE, każde o przybliżonej powierzchni 1 cm2.

4. Wytrącanie białka acetonem

UWAGA: Upewnij się, że do wytrącania acetonu i trawienia białek opartego na pułapkowaniu zawiesiny używane jest łącznie 100-300 μg.

  1. Umieścić próbkę białka (odpowiadającą 100-300 μg) w probówce kompatybilnej z acetonem.
  2. Dodać do probówki aceton o temperaturze -20 °C w objętości pięciokrotnie większej niż objętość próbki.
  3. Inkubować mieszaninę w temperaturze -20 °C przez 18 godzin.
  4. Odwirować probówkę o sile 16 000 x g przez 15 minut.
  5. Ostrożnie usunąć sklarat nad osadem, nie naruszając osadu białkowego.
  6. Dodać 500 μl acetonu o temperaturze -20 °C i powtórzyć czynności 4.4-4.5.
  7. Wysuszyć próbkę na powietrzu.

5. Trawienie białek oparte na pułapkach zawiesinowych

UWAGA: Procedura trawienia białek oparta na filtrze zatrzymującym zawiesinę została zaadaptowana z instrukcji producenta z niewielkimi modyfikacjami.

  1. Przygotować bufor do lizy wychwytujący zawiesinę (5 % SDS, 5 mM TCEP, 50 mM pH 8,5 TEAB w wodzie dejonizowanej).
  2. Dodać 40 μl buforu do probówki z próbką i dokładnie przemieszać, aby rozpuścić wysuszone na powietrzu osadki białkowe.
  3. Inkubować próbkę w temperaturze 100 °C, wytrząsając przy 1 000 x g przez 35 minut.
  4. Dodać 10 μl odczynnika alkilującego (100 mM chloroacetamidu [CAA] w 100 mM pH 8,5 bromku tetraetyloamoniowego [TEAB]) do próbki.
  5. Inkubować w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przy 300 x g przez 1 godzinę.
  6. Ostrożnie przygotuj zakwaszacz (10% kwas trifluorooctowy [TFA] w wodzie dejonizowanej). Upewnij się, że TFA, mocny kwas, jest obchodzony w dygestoriach chemicznych.
  7. Dodać 5 μl zakwaszacza do próbki, aby uzyskać końcowe stężenie 1% TFA (końcowa objętość próbki: 55 μl).
  8. Sprawdź pH próbki za pomocą bibuły pH. Upewnij się, że pH jest mniejsze niż 1.
  9. Dodać 350 μl buforu wiążącego/przemywającego-1 (0,1 M pH 8,5 TEAB w 90% MeOH) do próbki, aby wyłapać białka.
    UWAGA: Unikaj wirowania i wirowania podczas wychwytywania białka (krok 5.9), aby zapobiec utracie próbki. Wystarczająca ilość białka zapewnia tworzenie się widocznych koloidalnych cząstek białkowych o półprzezroczystym wyglądzie.
  10. Umieścić kolumnę wychwytującą zawiesinę w probówce o pojemności 2 ml i przenieść całą próbkę, w tym wszelki nierozpuszczalny materiał, do kolumny wychwytującej zawiesinę.
  11. Odwirować kolumnę przy 4 000 x g przez 50 s w celu uwięzienia białek.
    UWAGA: Upewnij się, że cała próbka przechodzi przez kolumnę; Jeśli nie, powtarzaj wirowanie, aż do całkowitej filtracji.
  12. Dodać 400 μl buforu do przemywania 2 (50 % CHCl3/50 % MeOH) do kolumny, odwirować przy 4000 x g przez 50 s i odrzucić przepływ.
  13. Powtórz krok 5.12 trzy razy.
  14. Dodać 400 μl buforu-1, odwirować przy 4000 x g przez 50 s i odrzucić przepływ
    15. .
  15. Powtórz krok 5.14 trzy razy.
  16. Wirować przy 4000 x g przez 1,25 minuty, aby zapewnić cały przepływ buforu-1.
  17. Przenieść kolumnę wychwytującą zawiesinę do nowej probówki z próbką w celu roztwarzania enzymatycznego.
  18. Dodać 125 μl buforu wytrawiającego (0,16 μg/μL trypsyny/Lys-C w 50 mM pH 8,5 TEAB) do kolumny zatrzymującej zawiesinę i przykryć ją, aby zapobiec parowaniu.
    UWAGA: Stosunek trypsyny/Lys-C powinien wynosić 1:10 (waga/waga). Zapewnij minimum 10 μg trypsyny/Lys-C dla skutecznego trawienia.
  19. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 18 godzin bez wytrząsania.
  20. Przygotować następujące elucyjne: bufor-1 (50 mM pH 8,5 TEAB w wodzie dejonizowanej), bufor-2 (0,2 % FA w wodzie dejonizowanej) i bufor-3 (50 % acetonitrylu [ACN] w wodzie dejonizowanej).
  21. Dodać 80 μl buforu elucyjnego-1 do kolumny zatrzymującej zawiesinę i odwirować przy 4000 x g przez 1,25 min.
  22. Powtórzyć krok 5.20 z 80 μl buforu elucyjnego-2 i buforu-3.
  23. Zbierz eluowane peptydy i przenieś je do czystej, nowej probówki.

6. Kwantyfikacja peptydów

UWAGA: Większość etapów ilościowego testu peptydowego kolorymetrycznego jest zaadaptowana z instrukcji producenta z niewielkimi modyfikacjami. Zaleca się, aby odczynniki były przygotowywane zgodnie z wytycznymi producenta.

  1. Przygotować serię wzorców, seryjnie rozcieńczając roztwór podstawowy wzorca (1 mg/ml). W razie potrzeby rozcieńczyć próbki, stosując współczynnik rozcieńczenia 4 lub 5.
  2. Przygotować wodę dejonizowaną jako ślepą próbę i mieszaninę buforu elucyjnego-1, buforu-2 i buforu-3 w równych proporcjach jako próbkę kontrolną.
  3. Umieścić 20 μl wzorców, ślepą próbę, próbkę kontrolną i próbki w środku każdej studzienki mikropłytki.
  4. Dodać 180 μl odczynnika roboczego do każdej studzienki i dokładnie wymieszać płytkę na wytrząsarce przez 1 minutę.
  5. Przykryć płytkę i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
  6. Pozostaw płytkę do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
  7. Zmierzyć absorbancję studzienek przy 480 nm za pomocą czytnika płytek.
  8. Odjąć wartość absorbancji 480 nm ślepej próby od wartości absorbancji wszystkich próbek i próbki kontrolnej.
  9. Następnie odjąć wartość absorbancji 480 nm dla próbki kontrolnej odjętej metodą ślepą od wartości wszystkich próbek.
  10. Wykreślić krzywą wzorcową i użyć jej do obliczenia stężenia peptydu dla każdej próbki.

7. Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas

  1. Po ilościowym określeniu peptydów liofilizować 20 μg peptydów.
  2. Ponownie rozpuścić peptydy w 40 μl wodnego buforu (3% ACN w 0,1% wodzie z kwasem mrówkowym [FA]) przez 10 minut w kąpieli dźwiękowej. Wynikowe stężenie peptydu wyniesie 0,5 μg/ μL.
  3. Odwirować próbkę o masie 16 000 x g przez 60 minut i przenieść próbki do fiolek w celu analizy MS.
  4. Wstrzyknąć 2 μl każdej próbki za pomocą automatycznego podajnika próbek systemu nano LC-MS/MS.
  5. Oddziel peptydy na kolumnie z odwróconymi fazami (kolumna 0,075 mm ID x 150 mm, wypełniona materiałem C18 o grubości 3 μm, używając 127-minutowego gradientu 5%-35% acetonitrylu przy 100 nL/min. Zjonizuj peptydy za pomocą źródła jonów w sprayu i przenieś je do spektrometru masowego opartego na orbitrapie.
  6. Analizuj peptydy przy użyciu metody pozyskiwania niezależnej od danych w wąskim zakresie21.
  7. Zastosuj następujące ustawienie parametrów MS: zakres MS m/z: 495-745, docelowa rozdzielczość: 15000, docelowa AGC: 3 x 10E6, maksymalny czas wtrysku: auto, okno MS/MS: zdefiniowane przez użytkownika (plik uzupełniający 1), docelowa rozdzielczość: 45000, docelowa AGC 3 x 10E6, maksymalny czas wtrysku: auto, energia kolizji HCD: 22%, 26%, 30%.
    UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie wstępnej kontroli jakości przyrządu poprzez analizę próbek wzorcowych przed analizą. Użyj oprogramowania do akwizycji danych MS, aby skonfigurować parametry (patrz Tabela materiałów).

8. Analiza danych do wyszukiwania proteomicznego

UWAGA: Do proteomicznego wyszukiwania surowych danych MS, użyto narzędzi open-source do konwersji formatu danych LC-MS i przeprowadzenia wyszukiwania proteomu (patrz Tabela materiałów). Parametry używane do analizy danych są szczegółowo opisane w pliku uzupełniającym 2. Podstawowe instrukcje użytkowania narzędzi typu open source można znaleźć pod linkiem zawartym w Tabeli materiałów.

  1. Zakryj surowe pliki widma MS/MS (*.raw) uzyskane z LC-MS do formatu *.mzML za pomocą oprogramowania typu open source.
  2. Użyj przekonwertowanych na format plików RAW (*.mzML) jako danych wejściowych dla wyszukiwarki typu open source w celu przeprowadzenia wyszukiwania proteomu.
  3. Rozpocznij wyszukiwanie proteomiczne na podstawie parametrów określonych w pliku uzupełniającym 2.

9. Analiza statystyczna

UWAGA: Do analizy statystycznej w celu identyfikacji białek o zróżnicowanej ekspresji, użyto narzędzia open-source do przeprowadzenia analizy jednowymiarowej (np. test t-Studenta; patrz Tabela materiałów). Zaleca się zapoznanie się z podstawowymi instrukcjami użytkowania narzędzia typu open source za pośrednictwem linku podanego w tabeli materiałów.

  1. Zaimportuj listę zidentyfikowanych białek (*.txt) do narzędzia typu open source.
  2. Kategoryzuj próbki w grupy. Do badań wyznaczono dwie grupy: SCN i IPMN.
  3. Wykonaj transformację Log2 wartości obfitości, aby dostosować rozkład danych do przybliżonego rozkładu normalnego.
  4. Zastosuj krok filtrowania, aby usunąć białka z brakującymi wartościami. W tym badaniu do włączenia wymagane były co najmniej dwie ważne wartości w każdej grupie.
  5. Imputuj brakujące wartości przy użyciu podejścia opartego na rozkładzie normalnym, aby wygenerować kompleksową listę białek oznaczonych ilościowo do późniejszej analizy jednowymiarowej.
  6. Wykonaj test t Studenta, aby zidentyfikować białka o zróżnicowanej ekspresji między dwiema grupami. W pracy zastosowano poprawkę Benjaminiego-Hochberga na wskaźnik fałszywych wykryć (FDR).
  7. Ekstrahować białka o zróżnicowanej ekspresji spełniające następujące kryteria: Benjamini-Hochberg FDR < 0,05 i |krotna zmiana| ≥ 2.

10. Analiza bioinformatyczna

UWAGA: Komercyjne narzędzie bioinformatyczne zostało użyte do analizy nadreprezentacji (np. analiza ścieżki Ingenuity, patrz Tabela materiałów). Przed użyciem tego narzędzia zaleca się zapoznanie się z instrukcjami producenta.

  1. Zaimportuj listę funkcji DEP (*.txt) do narzędzia komercyjnego.
  2. Zainicjuj analizę rdzenia, aby przeprowadzić analizę nadreprezentacji.
  3. Eksport znaczących ścieżek kanonicznych wzbogaconych o DEP przy użyciu dokładnego testu Fishera (skorygowana wartość p < 0,05). Zidentyfikuj interesujące Cię ścieżki, które są istotne dla badania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do torbielowatych tkanek trzustkowych FFPE zastosowano sprawdzone przygotowanie próbki proteomicznej opartej na filtrze pułapkowania zawiesiny, w połączeniu z bezznacznikową kwantyfikacją przy użyciu jednokrotnej akwizycji niezależnej od danych. (Rysunek 1). Precyzyjną izolację ROI podczas przetwarzania tkanki FFPE osiągnięto w różnych torbielowatych tkankach FFPE trzustki (Rysunek 2A), co spowodowało uzyskanie powtarzalnych chromatogramów jonów całkowitych między biologicznymi tri...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia szybką i wydajną metodę proteomiczną, która wykorzystuje ROI wyizolowane z skrawków tkanek FFPE zamontowanych na szklanych szkiełkach w celu diagnozy patologicznej. Gdy interwencja chirurgiczna jest korzystna, nowotwory lite, takie jak nowotwory i torbiele, są chirurgicznie wycinane i konserwowane do oceny patologicznej. W celu długotrwałego przechowywania tkanki są utrwalane w formalinie i zatopiane w parafinie (FFPE). Bloki tkankowe FFPE są następnie cięte na grubość 4-10 μm, montowane na szkie...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie figurki w tym artykule zostały stworzone za pomocą BioRender (http://www.biorender.com). Prace te były wspierane przez granty Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) (grant nr RS-2023-00253403 i RS-2024-00454407).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,1% FA w ACN (klasa LC-MS)Fisher ChemicalLS120-212
0,1% FA w wodzie (klasa LC-MS)Fisher ChemicalLS118-4
0,5 M TCEPThermo Scientific77720
10% SDSInvitrogen2679093
1M TEAB (pH 8,5)Sigma-Aldrich102545001
1M Tris-cl (pH 8,5)Wirówka BIOSOLUTIONBTO21
A-14CSatorious167709
Aceton (klasa HPLC)Fisher ScientificA949-4
ACN (klasa HPLC)J.T.Baker9017-88
CHCl3 (klasa HPLC)Thermo Scientific022920.k2
Papier CRADVANTEC70406001
DIA-NN wersja 1.9 Otwarte oprogramowanie https://github.com/vdemichev/DiaNNWyszukiwarka Proteomika 
Czytnik mikropłytek EPOCH2Agilent 
EtanolMERCKK50505283 836
FA (klasa LC-MS)Fisher ChemicalA117-50
Analiza ścieżki pomysłowości (IPA)Narzędzie bioinformatyczneQIAGEN830018
Liofilizator (SRF110R+pułapka na pary)Thermo ScientificSRF-110-115
MeOH (klasa HPLC)MERCKUN1230
Zestaw do oznaczania białek BCA mikropłytek-Kompatybilny ze środkiem redukującymThermo Scientific23252
MSConvert Otwarte oprogramowanie http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtmlOprogramowanie do transformacji danych MS
Orbitrap Exploris 480Thermo ScientificMA10813CKolumna
separacyjna MS PepMAP RSLC C18 Thermo ScientificES903
PerseusSourcehttps://cox-labs.github.io/coxdocs/perseus_instructions.htmlNarzędzie statystyczne
PIERCE chloroacetamid No-Weigh FormatThermoScientific A39270
PIERCE Ilościowy test peptydów kolorymetrycznychThermo Scientific23275
Wytrząsarka do płytek Zielona sonda SSerikerVS-202D
SonikatorVibraCellTMVCX750
Białkowa rurka LoBind 1,5 mlEppendorf22431081
QSP 10 µ L Końcówka do pipetThermo ScientificTLR102RS-Q
QSP 300 µ L Końcówka do pipetyThermo ScientificTLR106RS-Q
SkalpelBard-Parker372615
S-Trap: Szybki uniwersalny MS do przygotowania próbkiPROTIFICO2-mini-40
SureSTART Fiolka 0,2 mlThermo Scientific6pk1655
TFASigma-Aldrich102614284
ThermoMixer CEppendorf5382
Trypsyna/Lys-C (klasa LC-MS)PromegaV5073
Vanquish NEOThermo Scientific8348249LC
Water (klasa HPLC)HoneywellAH365-4
Xcalibur ver 4.7Oprogramowanie do akwizycji danychThermo Scientific30966
XyleneSigma-Aldrich102033629
2106208 Narzędzie statystyczne Open MS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Maldegem, F., et al. Effects of processing delay, formalin fixation, and immunohistochemistry on RNA recovery from formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Diagn Mol Pathol. 17 (1), 51-58 (2008).
  2. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. J Histochem Cytochem. 33 (8), 845-853 (1985).
  3. Fraenkel-Conrat, H., Olcott, H. S. The reaction of formaldehyde with proteins; cross-linking between amino and primary amide or guanidyl groups. J Am Chem Soc. 70 (8), 2673-2684 (1948).
  4. Basyuni, S., et al. Large-scale analysis of whole genome sequencing data from formalin-fixed paraffin-embedded cancer specimens demonstrates preservation of clinical utility. Nat Commun. 15 (1), 7731(2024).
  5. Gracia Villacampa, E., et al. Genome-wide spatial expression profiling in formalin-fixed tissues. Cell Genomics. 1 (3), 100065(2021).
  6. Zhang, X., et al. Characterization of the genomic landscape in large-scale Chinese patients with pancreatic cancer. EBioMedicine. 77, 103897(2022).
  7. Ren, Z., Ordway, B., Lin, P. -H. Archival FFPE blocks: the gift that keeps giving. Innov. 5 (1), 100532(2024).
  8. Magdeldin, S., Yamamoto, T. Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues. Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).
  9. Soni, R. K. Protocol for deep proteomic profiling of formalin-fixed paraffin-embedded specimens using a spectral library-free approach. STAR Protoc. 4 (3), 102381(2023).
  10. Gustafsson, O. J. R., Arentz, G., Hoffmann, P. Proteomic developments in the analysis of formalin-fixed tissue. Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics. 1854 (6), 559-580 (2015).
  11. O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
  12. Ye, X., et al. Integrated proteomics sample preparation and fractionation: method development and applications. TrAC Trends Anal Chem. 120, 115667(2019).
  13. Nwosu, A. J., et al. In-depth mass spectrometry-based proteomics of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues with a spatial resolution of 50-200 µm. J Proteome Res. 21 (9), 2237-2245 (2022).
  14. Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. J Pathol. 251 (1), 100-112 (2020).
  15. Makhmut, A., et al. A framework for ultra-low-input spatial tissue proteomics. Cell Syst. 14 (11), 1002-1014.e5 (2023).
  16. Shin, D., et al. Identification of TUBB2A by quantitative proteomic analysis as a novel biomarker for the prediction of distant metastatic breast cancer. Clin Proteomics. 17 (1), 16(2020).
  17. Lee, H., et al. Dual oxidase 2 (DUOX2) as a proteomic biomarker for predicting treatment response to chemoradiation therapy for locally advanced rectal cancer: using high-throughput proteomic analysis and machine learning algorithm. Int J Mol Sci. 23 (21), 12923(2022).
  18. Tüshaus, J., et al. Towards routine proteome profiling of FFPE tissue: insights from a 1,220-case pan-cancer study. EMBO J. 44 (1), 304-329 (2024).
  19. Schweizer, L., et al. Quantitative multiorgan proteomics of fatal COVID-19 uncovers tissue-specific effects beyond inflammation. EMBO Mol Med. 15 (9), e17459(2023).
  20. Kobayashi, G., et al. Proteomic profiling of FFPE specimens: discovery of HNRNPA2/B1 and STT3B as biomarkers for determining formalin fixation durations. J Proteomics. 301, 105196(2024).
  21. Kawashima, Y., et al. Single-shot 10k proteome approach: over 10,000 protein identifications by data-independent acquisition-based single-shot proteomics with ion mobility spectrometry. J Proteome Res. 21 (6), 1418-1427 (2022).
  22. Li, W., et al. Identification and prognostic analysis of biomarkers to predict the progression of pancreatic cancer patients. Mol Med. 28 (1), 43(2022).
  23. Martinelli, P., et al. GATA6 regulates EMT and tumour dissemination, and is a marker of response to adjuvant chemotherapy in pancreatic cancer. Gut. 66 (9), 1665-1676 (2017).
  24. Racu, M. -L., et al. Smad4 positive pancreatic ductal adenocarcinomas are associated with better outcomes in patients receiving FOLFIRINOX-based neoadjuvant therapy. Cancers. 15 (15), 3765(2023).
  25. Roy, L. D., et al. MUC1 enhances invasiveness of pancreatic cancer cells by inducing epithelial to mesenchymal transition. Oncogene. 30 (12), 1449-1459 (2011).
  26. Shi, H., Tsang, Y., Yang, Y. Identification of CEACAM5 as a stemness-related inhibitory immune checkpoint in pancreatic cancer. BMC Cancer. 22 (1), 1291(2022).
  27. Waters, A. M., Der, C. J. KRAS: the critical driver and therapeutic target for pancreatic cancer. Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (9), a031435(2018).
  28. Yao, H., et al. Glypican-3 and KRT19 are markers associating with metastasis and poor prognosis of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Biomark. 17 (4), 397-404 (2016).
  29. Zhan, L., Chen, L., Chen, Z. Knockdown of FUT3 disrupts the proliferation, migration, tumorigenesis and TGFβ induced EMT in pancreatic cancer cells. Oncol Lett. 16 (1), 924-930 (2018).
  30. Frohlich, K., Furrer, R., Schori, C., Handschin, C., Schmidt, A. Robust, precise, and deep proteome profiling using a small mass range and narrow window data-independent-acquisition scheme. J Proteome Res. 23 (3), 1028-1038 (2024).
  31. Li, K. W., Gonzalez-Lozano, M. A., Koopmans, F., Smit, A. B. Recent developments in data independent acquisition (DIA) mass spectrometry: application of quantitative analysis of the brain proteome. Front Mol Neurosci. 13, 564446(2020).
  32. Searle, B. C., et al. Chromatogram libraries improve peptide detection and quantification by data independent acquisition mass spectrometry. Nat Commun. 9 (1), 5128(2018).
  33. Prakash, J., Shaked, Y. The interplay between extracellular matrix remodeling and cancer therapeutics. Cancer Discov. 14 (8), 1375-1388 (2024).
  34. Perez, V. M., Kearney, J. F., Yeh, J. J. The PDAC extracellular matrix: a review of the ECM protein composition, tumor cell interaction, and therapeutic strategies. Front Oncol. 11, 751311(2021).
  35. Ferrara, B., et al. The extracellular matrix in pancreatic cancer: description of a complex network and promising therapeutic options. Cancers. 13 (17), 4442(2021).
  36. Weniger, M., Honselmann, K. C., Liss, A. S. The extracellular matrix and pancreatic cancer: a complex relationship. Cancers. 10 (9), 316(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mass Spectrometry ProteomicsFFPE TissueRegion Of InterestSuspension TrappingProtein DigestionPancreatic NeoplasmsData Independent AcquisitionPeptide QuantificationLiquid ChromatographyBioinformatics Analysis

Related Articles