Method Article

Wytwarzanie i charakterystyka indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych astrocytów pochodzących z komórek macierzystych, pozbawionych kruchej rybonukleoproteiny przekaźnika X

DOI:

10.3791/68081

⸱

June 6th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Centre for High Impact Neuroscience and Translational Applications, TCG Centres for Research and Education in Science and Technology, 2Centre for Brain Development and Repair, 3National Centre for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research, 4Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół, który ułatwia różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w funkcjonalne astrocyty specyficzne dla przodomózgowia. Umożliwia to badania nad rolą komórek glejowych w patogenezie zaburzeń neurorozwojowych, takich jak zespół łamliwego chromosomu X, oraz modelowanie innych zaburzeń mózgu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zespół łamliwego chromosomu X (FXS), główna dziedziczna przyczyna zaburzeń ze spektrum autyzmu i niepełnosprawności intelektualnej, był intensywnie badany przy użyciu modeli gryzoni. Ostatnio systemy modelowe pochodzące z ludzkich komórek macierzystych zostały również wykorzystane do uzyskania mechanistycznego wglądu w patofizjologię FXS. Jednak badania te koncentrowały się prawie wyłącznie na neuronach. Co więcej, pomimo coraz większej liczby dowodów na kluczową rolę gleju w funkcjonowaniu neuronów w zdrowiu i chorobie, niewiele wiadomo o tym, jak FXS wpływa na ludzkie astrocyty.

Dlatego w tym badaniu udało nam się opracować protokół, który rejestruje kluczowe czasoprzestrzenne kamienie milowe rozwoju mózgu i dostosowuje się również do procesu glejogenezy. Razem daje to użyteczne ramy do badania zaburzeń neurorozwojowych. Po pierwsze, ukształtowaliśmy indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste w linii neuroektodermalnej z podwójnym supresorem matek przeciwko hamowaniu dekapentaplegii (SMAD) i małymi cząsteczkami. Następnie wykorzystaliśmy specyficzne czynniki wzrostu i cytokiny do wygenerowania komórek progenitorowych astrocytów pochodzących od pacjenta (CTRL) i FXS. Leczenie APC neurotroficznym czynnikiem rzęskowym, cytokiną różnicującą, regulowało i prowadziło komórki progenitorowe w kierunku dojrzewania astrocytarnego, dając specyficzne dla gleju fibrylarne astrocyty wykazujące ekspresję białka kwasowego.

Stwierdziliśmy, że te astrocyty są funkcjonalne, o czym świadczą ich reakcje wapniowe na aplikację ATP, i wykazują rozregulowany metabolizm glikolityczny i mitochondrialny w FXS. Podsumowując, odkrycia te stanowią użyteczną platformę eksperymentalną pochodzenia ludzkiego do badania autonomicznych i nieautonomicznych komórek konsekwencji zmian w funkcji astrocytarnej spowodowanych zaburzeniami neurorozwojowymi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zespół łamliwego chromosomu X (FXS), powszechna dziedziczna forma niepełnosprawności intelektualnej i zaburzenia ze spektrum autyzmu (ASD), jest spowodowany brakiem kruchej rybonukleoproteiny przekaźnika X (FMRP) wytwarzanej przez gen łamliwej rybonukleoproteiny X przekaźnika 1 (FMR1) (OMIM: #300624, https://www.omim.org/entry/300624). FMRP odgrywa rolę w regulacji translacji mRNA, tworzeniu i transporcie granulek mRNA oraz regulacji ekspresji genów za pośrednictwem mikroRNA1. Tak więc utrata FMRP wpływa nie tylko na rozwój mózgu, ale także na funkcjonowanie mózgu osoby dorosłej. Zarówno poziomy transkryptu mRNA FMR1, jak i barwienie immunologiczne FMRP w mózgu wykazały wysoką ekspresję neuronalną, a także znaczącą ekspresję w komórkach glejowych2. Jednak zdecydowana większość wcześniejszych badań na zwierzęcych modelach FXS koncentrowała się przede wszystkim na neuronach i aberracjach w ich funkcji. W związku z tym niewiele wiadomo na temat roli gleju w FXS3. Tradycyjnie uważane za komórki "pasywnego wsparcia"4, istnieje coraz więcej dowodów na to, że astrocyty odgrywają kluczową rolę w pośredniczeniu w szerokim zakresie funkcji neuronalnych5,6, w tym promowanie synaptogenezy7, udoskonalanie rozwijających się obwodów neuronowych8 oraz recykling neuroprzekaźników9. Równolegle istnieje coraz więcej dowodów na rolę astrocytów w patogenezie choroby, a wiele schorzeń neurologicznych wiąże się z dysfunkcją astrocytów10.

Podczas gdy większość wcześniejszych prac z wykorzystaniem zwierzęcych modeli FXS skupiała się na identyfikacji i walidacji różnych celów molekularnych w neuronach do leczenia FXS, te przedkliniczne wyniki nie zawsze prowadziły do pomyślnych wyników klinicznych. Co więcej, niepowodzenia w ostatnich badaniach klinicznych również podkreślają potrzebę stosowania systemów modelowych opartych na ludziach. Modele zaburzeń neurologicznych oparte na komórkach mózgowych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych oferują potężną strategię wypełniania tej luki między mechanistycznymi spostrzeżeniami z badań na zwierzętach a ograniczonym sukcesem w zakresie wyników klinicznych dla pacjentów. Jednak tylko garstka z tych badań koncentrowała się na astrocytach i to głównie na astrocytach pochodzenia rdzeniowego. To z kolei jest istotne w świetle badań pokazujących, że struktura i funkcja astrocytów różnią się w zależności od regionu mózgu11,12. W związku z tym lepsze zrozumienie zmian wywołanych chorobą w ludzkich astrocytach musi również uwzględniać te specyficzne dla regionu mózgu różnice w astrocytach. Jednak modele zaburzeń neurorozwojowych wykorzystujące astrocyty pochodzące z ludzkich komórek macierzystych, które są specyficzne dla przodomózgowia, pozostają stosunkowo słabo zbadane13. Stąd, aby zacząć zajmować się tymi lukami, opisujemy protokoły generowania astrocytów specyficznych dla przodomózgowia z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) pochodzących od pacjenta przenoszących mutacje FXS; Ponadto pokazujemy, że astrocyty są funkcjonalne i wykazują zmieniony metabolizm.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty z użyciem ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) (Tabela 1) zostały przeprowadzone po uzyskaniu odpowiednich instytucjonalnych zgód regulacyjnych. Rysunek 1A przedstawia kompletny protokół różnicowania hiPSC do dojrzałych astrocytów specyficznych dla przodomózgowia.

1. Utrzymanie i rozbudowa hiPSC

  1. Na dzień przed posiewem iPSC pokryć 6-dołkowe naczynie rozcieńczonym w stosunku 1:60 Matrigelem (macierz zewnątrzkomórkowa [ECM]) w Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (DMEM/F12) i przechowywać w temperaturze 2-8 °C.
    UWAGA: Unikaj przechowywania naczyń pokrytych Matrigelem przez >5 dni w temperaturze 2-8 °C, ponieważ może to z czasem spowodować degradację białek w ECM. Aby uniknąć wysuszenia naczynia, posmaruj co najmniej 1 ml rozcieńczonego Matrigelu w proporcji 1:60 na jeden dołek naczynia 6-dołkowego i równomiernie rozprowadź na naczyniu. W przypadku stosowania tego samego dnia należy przechowywać płytkę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę.
  2. W dniu hodowli hiPSC usunąć materiał powlekający i dodać 1 ml kompletnej pożywki Essential 8 (pożywka podstawowa E8 z suplementem Essential 8) wraz z inhibitorem ROCK o stężeniu końcowym 1x i przechowywać szalkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed dodaniem hiPSC.
  3. Zawiesić hiPSC w kompletnym podłożu E8 wraz z inhibitorem ROCK w stężeniu końcowym 1x dla lepszego przylegania kolonii.
    UWAGA: Nie należy przygotowywać dużych ilości pożywki hodowlanej. Przygotować maksymalnie przez 3-4 dni i przechowywać w temperaturze 2-8 °C.
  4. Następnego dnia uzupełnij całą pożywkę E8 bez inhibitora ROCK, aż komórki będą zlewać się w 80% (około 4-5 dni).
  5. Gdy osiągną 80% konfluencji, odłącz kolonie enzymatycznie.
    1. Aby przejść przez iPSC, należy usunąć zużyte podłoże z naczynia i dodać 1 ml do studzienki wstępnie podgrzanej (37 °C) mieszaniny kolagenazy (2 mg/ml) i dyspazy (1 mg/ml) w stosunku 1:1 i inkubować w temperaturze 37 °C przez ponad 20-30 minut, aby umożliwić podniesienie się kolonii iPSC.
      UWAGA: Nie pozostawiaj naczyń w temperaturze 37 °C na dłużej niż 20-30 minut; Po tym okresie kolonie rozpadną się, a komórki umrą.
  6. Kiedy kolonie zaczną się podnosić, wyjmij szalki z inkubatora i zneutralizuj aktywność enzymu, dodając 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.
  7. Zeskrobać kolonie za pomocą DPBS i zebrać zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety serologicznej o szerokim otworze 10 ml.
  8. Delikatnie rozcierać zawiesinę 2-3 razy, aby rozbić kolonie za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i pozwolić koloniom się uspokoić.
    UWAGA: Nie przekształcaj kolonii w pojedyncze komórki; Może to spowodować, że komórki nie będą przylegać do naczynia i spowodować większą śmierć komórek. Co więcej, nie zostawiaj ich jako wielkich kolonii; Doprowadzi to później do bardziej zróżnicowanych kolonii.
  9. Gdy kolonie osiądą (około po 2 minutach), odessać mieszaninę enzymów DPBS, pozostawiając około 1 ml w probówce.
  10. Dodaj 2 ml DPBS do probówki, wymieszaj kolonie, stukając i pozwól im się osadzić. Powtórz to 2x, aby usunąć wszystkie resztki enzymu z kolonii. Usunąć jak najwięcej supernatantu po drugim płukaniu, ponownie zawiesić kolonie w 1 ml kompletnego podłoża E8 i umieścić na płytce w świeżo przygotowanym naczyniu, jak wspomniano w krokach 1.2-1.3.
  11. Alternatywnie, kriokonserwuj część kolonii przy użyciu 10% dimetylosulfotlenku (DMSO) jako roztworu krioprotektantu do przyszłej ekspansji i wykorzystania.
    1. Przygotować podłoże do krioprezerwacji na świeżo, mieszając 90% kompletnego podłoża E8 i 10% DMSO jako roztwór krioprotektantu i umieścić w temperaturze 2-8 °C do momentu użycia.
  12. Aby przeprowadzić krioprezerwację, wykonaj kroki 1.5-1.10.
  13. W kroku 1.10, po 2przemyciu, pozwól koloniom osiąść i usuń supernatant. Do kolonii dodać 1 ml świeżo przygotowanej zimnej pożywki do kriokonserwacji i przenieść do kriowialików.
    UWAGA: Po dodaniu pożywki do krioprezerwacji do kolonii należy szybko przenieść zawartość do kriowialiów. Opóźnienie może skutkować niższym wskaźnikiem odrodzenia, ponieważ DMSO jest krioprotektantem, który może uszkadzać komórki.
  14. Natychmiast przenieś kriowiale do krioboxa i przechowuj przez noc w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
  15. Następnego dnia przenieś wszystkie kriowia do zbiornika z ciekłym azotem (zbiornik LN2) do wykorzystania w przyszłości.
    UWAGA: hiPSC powinny być rutynowo kariotypowane przy użyciu pasm G (rysunek uzupełniający S1) pod kątem wszelkich nieprawidłowości, scharakteryzowane za pomocą immunocytochemii pod kątem pluripotencji (Figura 1B) i testowane na obecność mykoplazmy.
    1. Aby scharakteryzować hiPSC za pomocą immunocytochemii, należy ułożyć kolonie na pokrytych matrycą, autoklawowanych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 13 mm pokrytych Matrigelem w skali 1:60. Gdy osiągną 40% zlewu, przemyj komórki PBS-T (PBS-0,1% Tween 20), utrwal 4% paraformaldehydem przez 10 minut, przepuszczaj 0,3% Triton X-100 w PBS przez 10 minut i blokuj 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez 1 godzinę, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.
    2. Po zablokowaniu inkubować kultury z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez 1 godzinę, a następnie przemywać 3x PBS-T przez 5 minut każda, a następnie odpowiednie przeciwciała drugorzędowe (tabela materiałów) w ciemności przez 1 godzinę.
    3. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych z podłożem montażowym i uzyskaj obrazy za pomocą konfokalnego skanowania laserowego przy 405 nm, 488 nm, 561 nm i 633 nm. Przechwytuj obrazy w rozdzielczości 512 x 512 pikseli; ustawić rozmiar kroku Z na 0,5 μm z 1 przewiewną jednostką średnicy otworka.

2. Generowanie i charakterystyka astrocytarnych komórek progenitorowych (APC)

  1. Enzymatycznie podnieść hiPSC, jak wspomniano w krokach 1.5-1.10 i umieścić je na nieprzylegającym naczyniu do hodowli zawiesiny (100 mm) z chemicznie zdefiniowanym podłożem14 zawierającym 50% zmodyfikowanej pożywki Dulbecco firmy Iscove (IMDM), 50% mieszanki składników odżywczych F-12 szynki (F12), 5 mg/ml BSA, 1% chemicznie zdefiniowanego koncentratu lipidowego (CD-Lipid), 450 μM monotioglicerolu, 7 μg/ml insuliny, 15 μg/ml transferyny, 1% penicylina-streptomycyna uzupełniona mitogenami modelującymi przodomózgowie: N-acetylocysteiną (1 mM), LDN 193189 (0,1 μM) i SB431542 (10 μM) przez 7 dni.
    UWAGA: Inhibitory małocząsteczkowe SB431542 i LDN-193189 (LDN) są inhibitorami białka morfogenetycznego kości i transformujących szlaki sygnałowe czynnika wzrostu-beta.
    Od tego momentu podłoże było uzupełniane raz na 2 dni lub zgodnie z protokołem poniedziałek/środa/piątek.
  2. Umieść zawiesinę komórek na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 40 obr./min przez 7 dni w warunkach normoksyjnych, aby wspomóc rozwój kortykosfery (Rysunek 1A).
  3. W 8 dniu przenieś kortykosferę do pożywki proliferacyjnej komórek zawierającej Advanced DMEM/F12 z 1% antybiotyko-antybiotykiem, 1% suplementem N2, 1% substytutem glutaminy, 0,1% suplementem B27 i 2,5 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) przez 7 dni.
  4. Indukuj kulki w celu specyfikacji glejowej, poddając je pożywce wzbogacającej glej zawierającej Advanced DMEM / F12 z 1% antybiotykiem przeciwgrzybiczym, 1% N2, 1% substytutem glutaminy, 0,1% suplementem B27, 20 ng / ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), bFGF-H (20 ng / ml bFGF-5 mg / ml heparyny) przez 2 tygodnie, aby uzyskać wczesne glejosfery (Figura 1A).
  5. W celu dojrzewania wczesnych glejów należy zastąpić bFGF-H czynnikiem hamującym białaczkę o stężeniu 20 ng / ml (LIF) i utrzymywać kulki przez 4 tygodnie.
  6. Po 4 tygodniach w pożywce dojrzewającej utrzymuj kulki w pożywce do wzbogacania gleju przez dłuższy czas. Aby zapobiec agregacji i utracie żywotności, co 2 tygodnie mechanicznie siekaj glejosfery za pomocą sterylnego ostrza przemysłowego i zastąp całe podłoże DNazą I, aby usunąć fragmenty DNA powstałe w wyniku siekania.
  7. Dysocjuj glejosfery na monowarstwy APC za pomocą zestawu do dysocjacji papainy i płytki na naczyniu adherentnym poddanym hodowli komórkowej z rozcieńczeniem powłoki Matrigel w stosunku 1:80.
  8. Rozmnażaj APC w pożywce do wzbogacania gleju aż do 80% zlewania i enzymatycznie pasuj je za pomocą pożywki do oddzielania komórek enzymatycznych (patrz tabela materiałów).
  9. Do przejścia:
    1. Usuń zużyte media i zbierz je w stożkowej tubie. Do komórek dodaj pożywkę enzymatyczną do oddzielania komórek i odczekaj 1-2 minuty. Gdy komórki zaczną się odłączać, dodaj zużytą pożywkę, aby zneutralizować aktywność enzymu.
    2. Zebrać zawiesinę komórek i odwirować przy 800 x ɡ przez 2 minuty.
    3. Odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki w pożywce do wzbogacania gleju i umieścić około 1 x 106 komórek / studzienkę na 6-dołkowym naczyniu pokrytym Matrigelem w proporcji 1:80.
  10. Do krioprezerwacji:
    1. Ponownie zawiesić komórki w zimnej mieszaninie 90% pożywki proliferacyjnej kortykosfery (bez bFGF) i 10% krioprotektantu. Przenieś zawieszone komórki do kriowialiów.
    2. Natychmiast przenieś kriowiale do krioboxa i przechowuj przez noc w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
    3. Następnego dnia przenieś wszystkie kriowia do zbiornika z ciekłym azotem (zbiornik LN2) do wykorzystania w przyszłości.
      UWAGA: APC były kriokonserwowane przy użyciu 10% DMSO aż do przejścia numer 6.
  11. Scharakteryzuj zdysocjowane APC przez barwienie immunologiczne (jak wspomniano w krokach 1.15.1-1.15.3) za pomocą wimentyny i markerów czynnika jądrowego IA (NFIA) (Rysunek 1C, D) (patrz tabela materiałów dla rozcieńczeń).
  12. Aby potwierdzić regionalną specyficzność APC pochodzącego z hiPSC, przetestuj komórki pod kątem markera przodomózgowia, takiego jak ludzki widelec G1 (hFOXG1) (dodatni) i marker tyłomózgowia, taki jak ludzki Homeobox B4 (hHOXB4) (ujemny) za pomocą qPCR w czasie rzeczywistym (Rysunek 1E,F).
    UWAGA: Sekwencje starterów użyte w tych eksperymentach zostały wymienione w Tabeli Uzupełniającej S1.

3. Generowanie i charakterystyka jednorodnej populacji astrocytów specyficznych dla przodomózgowia

  1. Różnicowanie astrocytów od APC
    1. Użyj pożywki do różnicowania astrocytów (ADM) przez 14 dni, aby różnicować APC w astrocyty. Pożywka do różnicowania astrocytów zawiera Neurobasal, 1% antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczy, 1% substytut glutaminy, 1% suplement N2, 0,2% suplement B27, 1% pożywkę dla aminokwasów endogennych (NEAA) i 10 ng/ml rzęskowego czynnika neurotroficznego (CNTF).
    2. Potwierdź tożsamość astrocytarną za pomocą barwienia immunologicznego (jak wspomniano w krokach 1.15.1-1.15.3.) z kwaśnym białkiem fibrylarnym gleju (GFAP) i markerami ekspresji S100β (Rysunek 2A,B).
  2. Synteza białek de novo w APC i astrocytach
    1. Utrzymuj APC i astrocyty przodomózgowia pochodzące z hiPSC na sterylnych, autoklawowanych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 13 mm i wybarwiaj je immunologicznie, jak wspomniano w krokach 1.15.1-1.15.3.
    2. Do syntezy białek de novo należy użyć metody fluorescencyjnego niekanonicznego znakowania aminokwasów (FUNCAT), wyjaśnionej pokrótce w krokach 3.2.3-3.2.6 (Rysunek 3A).
    3. Aby zapewnić niedobór metioniny, należy usunąć pożywkę wzrostową z kultur i zastąpić pożywką wolną od metioniny i cysteiny zmieszaną z 1 mM L-azydohomoalaniną (AHA) przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    4. Przemyć kultury PBS-T, utrwalić 4% paraformaldehydem przez 10 minut, przepuścić 0,3% Triton X-100 w PBS przez 10 minut i zablokować 3% BSA w PBS przez 1 godzinę, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.
    5. Inkubować kultury w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z mieszanką reakcyjną chemii komórek Click i Alkyne Alexa Fluor 647, a następnie przeciwciałami pierwszorzędowymi przez 1 godzinę i odpowiadającymi im przeciwciałami drugorzędowymi (tabela materiałów) przez 1 godzinę (Rysunek 3B).
    6. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych z medium montażowym i użyj ich do dalszej analizy obrazu.
      1. Pozyskiwanie obrazów za pomocą konfokalnego skanowania laserowego przy 405 nm, 488 nm, 561 nm i 633 nm.
      2. Rejestruj obrazy w rozdzielczości 512 x 512 pikseli; ustaw rozmiar kroku Z na 0,5 μm za pomocą 1 przewiewnej jednostki średnicy otworka.
      3. Utrzymuj parametry mikroskopii i obrazowania na stałym poziomie dla wszystkich typów komórek. Przechwytywanie obrazów dla każdej repliki biologicznej w tej samej sesji.
      4. Wykonuj pomiary intensywności za pomocą dowolnego standardowego oprogramowania do analizy obrazu (np. Fidżi lub Imaris). W Imaris użyj modułu SURFACES, aby uzyskać pomiary objętościowe ciał komórkowych dodatnich dla sygnału fluorescencyjnego niekanonicznego znakowania aminokwasów (FUNCAT) z wimentyną (APC) i GFAP (astrocyty) ograniczającymi zakres wokseli (250-350) w celu usunięcia zanieczyszczeń.
        UWAGA: Utrzymuj parametry we wszystkich kontrpróbach biologicznych dla obu typów komórek.
  3. Oscylacyjne fale wapniowe indukowane adenozyno-5′-trifosforanem (ATP)
    1. Płytka astrocytów na szklanym dnie (35 mm) w temperaturze 5 × 103 komórek / naczynie, aby zmierzyć odpowiedź komórkową na ATP.
    2. Pozostaw komórki do przylegania do szklanego dna przez 24 godziny, umyj je 3x HBSS (20 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glukoza, 1 mM MgCl2, pH = 7,3) bez wapnia i inkubuj w pożywce hodowlanej z barwnikiem metrycznym Fura-2AM o stosunku 5 μM i 0,02% Pluronics F127 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Fura-2AM jest substancją chemiczną wrażliwą na światło i temperaturę; przechowywać w temperaturze -20 °C.
    3. Po inkubacji przemyć 2x pożywką hodowlaną i zastąpić 2 mM Ca2+ zawierającym HBSS i zobrazować komórki z prędkością 2 FPS za pomocą obiektywu olejowego 60x (1,35 NA) w odwróconym mikroskopie z kompensacją dryftu ostrości.
    4. Rejestruj reakcje wapnia wywołane przez ATP przez zastosowanie ATP w kąpieli w końcowym stężeniu 5 mM przy 25th s (Rysunek 4A).
    5. Narysuj interesujące obszary wokół każdej komórki za pomocą Fidżi/ImageJ i oblicz stosunek F340/F380 we wszystkich punktach czasowych (Rysunek 4B).
  4. Testy metaboliczne komórek
    UWAGA: Wskaźnik zużycia tlenu (OCR) i wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) żywych komórek zostały zmierzone zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).
    1. Na jeden dzień przed badaniem pozwól astrocytom przylegać do mikropłytki (gęstość wysiewu 1,5 ×10 4) w pożywce CNTF i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    2. Do testu stresu glikolizy:
      1. Zastąp pożywkę do hodowli komórkowej pożywką zasadową uzupełnioną 2 mM glutaminą (pH dostosowaną do 7,4) i inkubuj w komorze niezawierającejCO2 w temperaturze 37 °C przez 1 h.
        UWAGA: pH należy dostosować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
      2. Włóż płytkę wkładu do przyrządu, aby skalibrować czujnik. Po kalibracji zastąp płytkę wkładu płytką do hodowli komórkowej przy końcowym stężeniu następujących składników zestawu: 10 mM glukozy, 1 μM oligomycyny i 50 mM 2-deoksy-glukozy (2-DG) (Rysunek 5A).
      3. Pod koniec badania poddać komórki lizie i oszacować całkowitą zawartość białka.
    3. Do testu stresu mitochondrium:
      1. Zastąpić pożywkę CNTF pożywką zasadową uzupełnioną 2 mM glutaminy, 1 mM pirogronianu, 10 mM glukozy (pH dostosowane do 7,4) w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
      2. Inkubować płytkę w komorze niezawierającejCO2 w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. W międzyczasie włóż płytkę wkładu do przyrządu, aby skalibrować czujnik.
      3. Po kalibracji zastąp płytkę wkładu płytką do hodowli komórkowej o końcowym stężeniu następujących składników zestawu: 1,5 μM oligomycyny, 1 μM cyjanku karbonylu-4 (trifluorometoksy) fenylohydrazonu (FCCP) i 0,5 μM rotenonu/antymycyny A (Rysunek 5C).
      4. Pod koniec badania poddać komórki lizie i oszacować całkowitą zawartość białka.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolonie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) były utrzymywane przy użyciu komercyjnie dostępnego zdefiniowanego podłoża i wybarwione immunologicznie dla markerów pluripotencji, Oct4 i Nanog (Rysunek 1B). FXS i CTRL APC wykazały porównywalne, wysoce wzbogacone proporcje komórek immunopozytywnych dla wimentyny i NFIA (Rysunek 1C, D). Odkryliśmy, że APC pochodzące od zdrowych i FXS hiPSC wykazywały zna...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy metodę generowania ludzkich astrocytów pochodzących z iPSC, które służą jako platforma testowa do charakteryzowania zmian funkcjonalnych wywołanych przez FXS. Te astrocyty są funkcjonalnie zdolne do życia w hodowli i wykazują różne właściwości, o czym świadczy szereg pomiarów przeprowadzonych w niniejszym badaniu. Kluczowym krokiem w tym protokole jest wstępna konwersja iPSC do kortykosfery przy użyciu metody enzymatycznego liftingu. Na tym etapie kluczowe znaczenie ma optymalizacja czasu inkubacj...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Prof. Sumantra Chattarji za fundusze stacjonarne. Dziękujemy prof. Gaiti Hasanowi za dostęp do zestawu do obrazowania wapnia, Central Imaging and Flow Facility-National Centre for Biological Sciences, Padmanabh Singh i Prangya Hota za korektę i sugestie, a także zespołowi Labmate Asia za pomoc w przeprowadzaniu testów Seahorse XF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-TioglycerolSigma-AldrichM6145
Accutase  roztwórSigma-AldrichA6964Pożywka do oddzielania komórek enzymatycznych 
Sól magnezowa adenozyno-5′-trifosforanuSigma-AldrichA9187
Advanced DMEM/F-12ThermoFisher Scientific12634010
Antybiotyk-Przeciwgrzybicza (100x)Suplement ThermoFisher Scientific15240062
B-27 (50x), bez surowicyThermoFisher Scientific17504044
Albuminasurowicy bydlęcejSigma-AldrichA9418
Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowyThermoFisher Scientific11905031
Kolagenaza typu IV, proszekThermoFisher Scientific17104019
Deoksyrybonukleaza IWorthington Biochemical CorporationLK003170
DimetylosulfotlenekSigma-AldrichD2650
Dispase II, proszekThermoFisher Scientific17105041
DPBS, bez wapnia, bez magnezuThermoFisher Scientific14190144
Essential 8 MediumThermoFisher ScientificA1517001
FXS1, FXS2 Instytut Badań Medycznych Coriell GM07072, GM05848Komórki pacjenta FXS
Suplement GlutaMAXThermoFisher Scientific35050061substytut glutaminy
Mieszanka składników odżywczych Ham's F-12ThermoFisher Scientific11765054
Zdrowe komórki kontrolne Centrum Medyczne Cedars-Sinai ND30625zdrowych komórek kontrolnych 
Heparyna sól sodowa z błony śluzowej jelit świńSigma-AldrichH3149
IMDMThermoFisher Scientific12440053
Insulina, ludzkaRoche11376497001
LDN 193189 Stratech ScientificS2618-SEL
Czynnik hamujący białaczkę ludzkiSigma-AldrichL5283
Matrigel  Matryca błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR)Corning354230
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)ThermoFisher Scientific11140050
Mysz FGF-basic (FGF-2/bFGF) Rekombinowane białkoPeprotech450-33
Mr. Frosty Pojemnik do zamrażania ThermoFisherScientific5100-0001Cryobox
N-2 Suplement (100x)ThermoFisher Scientific17502048
N-acetylo-L-cysteinaSigma-AldrichA9165
Pożywka neurobazalnaThermoFisher Scientific21103049
Nunc Biobank i probówki kriogeniczne do hodowli komórkowychThermoFisher Scientific377267
Nunc Hodowla komórkowa 6-dołkowaThermoFisher Scientific140675
System dysocjacji papainyWorthington Biochemical CorporationLK003150
Penicylina-StreptomycynaThermoFisher Scientific15140122
Rekombinowane ludzkie białko CNTF, CF R& D Systems257-NT-010
Rekombinowane ludzkie białko EGF, CFR& D Systems236-EG-01M
Suplement RevitaCell (100x)ThermoFisher ScientificA2644501
SB431542Tocris1614
Seahorse XFe24 Agilent Technologies
Seahorse XF Cell MitoAgilent Technologies103015-100
Zestaw do testów wysiłkowych glikolizy Seahorse XFAgilent Technologies103020-100
Naczynia do hodowli tkankowych-100 cmBiostar LifetechTCD000100
TransferynaRoche10652202001
maszynka do golenia VWR OstrzaVWR International55411-050
przeciwciała 
Przeciwciało pierwszorzędowe<strong>CompanyNumer katalogowyRozcieńczenie
Oct4 (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279Rozcieńczenie: 1:250
Przeciwciało drugorzędowe: kozia anty-mysia IgG, Alexa Fluor 568
NanogR & D SystemsAF1997Rozcieńczenie: 1:100
Przeciwciało drugorzędowe: IgG anty-kozi osła, Alexa Fluor 488
VimentinAbcamAb5733Rozcieńczenie: 1:500
Przeciwciało drugorzędowe: Kozia anty-IgY kurczaka, Alexa Fluor 488
NFIAAbcamAb41851Rozcieńczenie: 1:500
Przeciwciało drugorzędowe: Kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 568
GFAP-cy3SigmaC9205Rozcieńczenie: 1:500
Przeciwciało drugorzędowe: NA
GFAPDAKOZ0334Rozcieńczenie: 1:500
Przeciwciało drugorzędowe: Kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 568
S100 i beta;DAKOIR504Rozcieńczenie: 1:500
Przeciwciało drugorzędowe: przeciwciało anty-królicze IgG, przeciwciało antyjądrowe Alexa Fluor 488
, klon 235-1Merck MilliporeMAB1281Rozcieńczenie: 1:1000
Przeciwciało drugorzędowe: Kozia anty-mysia IgG1, Alexa Fluor 555
Przeciwciała drugorzędowe  Rozcieńczenie
Goat anty-mysie IgG, Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific A110041:1000
Osioł anty-kozi IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110551:1000
Koza anty-Chicken IgY, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110391:1000
Kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific A110111:1000
Kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110341:1000
Kozia anty-mysia IgG1, Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific A211271:1000
Analizator Zestaw do testów wysiłkowych

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Molecular of fragile X syndrome: A twenty-year perspective. Annu Rev Pathol. 7, 219-245 (2012).
  2. Wang, H., et al. Developmentally-programmed FMRP expression in oligodendrocytes: A potential role of FMRP in regulating translation in oligodendroglia progenitors. Hum Mol Genet. 13 (1), 79-89 (2004).
  3. Pacey, L. K. K., Doering, L. C. Developmental expression of FMRP in the astrocyte lineage: Implications for fragile X syndrome. Glia. 55 (15), 1601-1609 (2007).
  4. Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
  5. Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
  6. Khakh, B. S., McCarthy, K. D. Astrocyte calcium signaling: From observations to functions and the challenges therein. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (4), a020404(2015).
  7. Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
  8. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  9. Rothstein, J. D., et al. Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate. Neuron. 16 (3), 675-686 (1996).
  10. Almad, A., Maragakis, N. J. A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease. Nat Rev Neurol. 14 (6), 351-362 (2018).
  11. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: An underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 20 (5), 588-594 (2010).
  12. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14 (5), 311-321 (2013).
  13. Bradley, R. A., et al. Regionally specified human pluripotent stem cell-derived astrocytes exhibit different molecular signatures and functional properties. Development. 146 (13), dev170910(2019).
  14. Das Sharma, S., et al. Astrocytes mediate cell non-autonomous correction of aberrant firing in human FXS neurons. Cell Rep. 42 (4), 112344(2023).
  15. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  16. Hu, X., et al. The JAK/STAT signaling pathway: from bench to clinic. Sig Transduct Target Ther. 6, 402(2021).
  17. Baser, A., et al. Onset of differentiation is post-transcriptionally controlled in adult neural stem cells. Nature. 566 (7742), 100-104 (2019).
  18. Pal, R., Bhattacharya, A. Modelling protein synthesis as a biomarker in fragile x syndrome patient-derived cells. Brain Sci. 9 (3), 1-12 (2019).
  19. Gross, C., Bassell, G. J. Excess protein synthesis in FXS patient lymphoblastoid cells can be rescued with a p110β-selective inhibitor. J Mol Med. 18 (3), 336-345 (2012).
  20. Kumari, D., et al. Identification of fragile X syndrome specific molecular markers in human fibroblasts: A useful model to test the efficacy of therapeutic drugs. Hum Mutat. 35 (12), 1485-1494 (2014).
  21. Jacquemont, S., et al. Protein synthesis levels are increased in a subset of individuals with fragile X syndrome. Hum Mol Genet. 27 (12), 2039-2051 (2018).
  22. Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24 (39), 8606-8620 (2004).
  23. Schmunk, G., Boubion, B. J., Smith, I. F., Parker, I., Gargus, J. J. Shared functional defect in IP3R-mediated calcium signaling in diverse monogenic autism syndromes. Transl Psychiatry. 5 (9), e643-e710 (2015).
  24. Peteri, U. K., et al. Generation of the human pluripotent stem-cell-derived astrocyte model with forebrain identity. Brain Sci. 11 (2), 209(2021).
  25. Alvarez-Mora, M. I., et al. Impaired mitochondrial function and dynamics in the pathogenesis of FXTAS. Mol Neurobiol. 54 (9), 6896-6902 (2017).
  26. Giulivi, C., et al. Mitochondrial dysfunction in autism. JAMA. 304 (21), 2389-2396 (2010).
  27. Anitha, A., et al. Brain region-specific altered expression and association of mitochondria-related genes in autism. Mol Autism. 3 (1), 12(2012).
  28. Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Front Neurosci. 11, 737(2018).
  29. Yao, J., et al. Mitochondrial bioenergetic deficit precedes Alzheimer's pathology in female mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (34), 14670-14675 (2009).
  30. Sonntag, K. C., et al. Late-onset Alzheimer's disease is associated with inherent changes in bioenergetics profiles. Sci Rep. 7 (1), 14038(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fragile X SyndromeInduced Pluripotent Stem CellsAstrocyte Progenitor CellsAstrocyte DifferentiationGlial Enrichment MediumCalcium ImagingGlycolytic MetabolismMitochondrial RespirationImmunostaining MarkersNeurodevelopmental Disorders

Related Articles