Artykuł metodologiczny

Edycja epigenomu CRISPR w komórkach ludzkich przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i dostarczania nukleofekcji mRNA

DOI:

10.3791/68089

⸱

30 maja 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, 2Chan Zuckerberg Biohub - San Francisco

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje metody edycji epigenomu opartej na CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) w ludzkich liniach komórkowych przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i nukleofekcji mRNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epigenetyka odnosi się do chemicznych modyfikacji białek histonowych i DNA, które mogą regulować ekspresję genów. Ludzki epigenom zmienia się dynamicznie podczas różnicowania i starzenia się komórek, a wiele chorób jest związanych z nieprawidłowymi wzorcami epigenomu. Ostatnie postępy w dziedzinie CRISPR doprowadziły do opracowania programowalnych narzędzi do edycji modyfikacji epigenetycznych w docelowych loci genomowych, umożliwiając precyzyjne przepisywanie modyfikacji epigenetycznych w komórkach ludzkich. Edytorzy epigenomu oparci na CRISPR polegają na katalitycznie martwym Cas9 w połączeniu z modyfikatorami epigenetycznymi, które ostatecznie skutkują zaprogramowaną represją lub aktywacją docelowych genów w genomach ssaków. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod edycji genomu, edycja epigenomu nie wymaga pęknięć DNA ani zmian w sekwencji ludzkiego genomu, a zatem służy jako bezpieczniejsza alternatywa dla kontroli ekspresji genów. W tym protokole zwracamy uwagę na dwie różne metody przeprowadzania edycji epigenomu za pośrednictwem dCas9 w ludzkich liniach komórkowych przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i nukleofekcji mRNA kodujących edytory epigenomu CRISPR. Demonstrujemy programowalną edycję epigenomu w celu przejściowego tłumienia genów za pomocą interferencji CRISPR (CRISPRi) oraz trwałego wyciszania genów na wiele tygodni za pomocą CRISPRoff, fuzji dCas9 z domeną KRAB i kompleksem metylotransferazy DNA de novo. Zapewniamy również wskazówki dotyczące metod ilościowych do pomiaru udanej edycji epigenomu genów docelowych oraz kluczowych kwestii dotyczących tego, jakiego narzędzia do edycji epigenomu użyć, w zależności od kryteriów eksperymentalnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż zawartość genomu każdej komórki w naszym ciele jest prawie identyczna, profil transkrypcyjny każdego typu komórki znacznie się różni. Modyfikacje epigenetyczne DNA i białek histonowych są kluczowymi regulatorami ekspresji transkrypcyjnej. Aktywna transkrypcyjnie euchromatyna charakteryzuje się wyraźnymi znakami epigenetycznymi w porównaniu ze zwartą, nieaktywną transkrypcyjnie heterochromatyną. Na przykład regiony heterochromatyczne są definiowane przez represyjne modyfikacje histonów, w tym trimetylację na lizynie 9 histonu 3 (H3K9me3), trimetylację na lizynie 27 histonu H3 (H3K27me3) i metylację DNA na cytozynach obok guaniny (CpG) w promotorach genów1. Regiony genomowe aktywnej ekspresji genów są zazwyczaj definiowane przez acetylację histonów i trimetylację na lizynie 4 histonu 3 (H3K4me3)1.

Rewolucja CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) wygenerowała bogactwo narzędzi, które umożliwiają programowaną zmianę sekwencji genomowych. Technologia CRISPR opiera się na prokariotycznym mechanizmie obronnym zdolnym do rozszczepiania kwasów nukleinowych w programowalnych sekwencjach docelowych. Nukleazy CRISPR2,3,4, base editors5,6, and prime editors7,8 mogą zmienić sekwencję DNA genomów ssaków poprzez cięcie DNA i naprawę tych pęknięć. Chociaż strategie te są skuteczne, mogą powodować pęknięcia DNA w miejscach poza celem9,10 i wielkoskalowe genomowe mutacje strukturalne11,12,13,14,15. Alternatywne narzędzia oparte na CRISPR umożliwiają łatwą modulację aktywacji i represji genów bez zmiany leżącej u ich podstaw sekwencji DNA. Narzędzia te wykorzystują Cas9 (dCas9) z niedoborem nukleazy, umożliwiając wiązanie DNA w miejscach docelowych dyktowanych przez sekwencję sgRNA, w połączeniu z białkami efektorowymi, które zmieniają krajobraz chromatyny16,17,18. Białka efektorowe, takie jak epigenetyczne pisarze, czytelnicy i gumki, mogą być bezpośrednio połączone z dCas9 lub rekrutowane przez rusztowanie peptydowe połączone z dCas9, takie jak SunTag, lub rusztowanie RNA na sgRNA, takie jak system MS2-MCP16,17,18. Przykłady programowalnych narzędzi do kontroli transkrypcji obejmują aktywację CRISPR (CRISPRa)19,20,21 i zakłócenia CRISPR (CRISPRi)22,23. CRISPRa działa poprzez bezpośrednią rekrutację maszynerii transkrypcyjnej, zwiększając docelową ekspresję genów transkrypcyjnych19. W przeciwieństwie do tego, CRISPRi hamuje transkrypcję, ustanawiając H3K9me3, represyjny znak epigenetyczny 22.

Postępy w edycji epigenomu umożliwiły szerokie zastosowanie tych narzędzi w różnych dziedzinach nauki. Fuzje różnych domen efektorowych i białek poszerzyły zestaw narzędzi dostępnych edytorów epigenomu18,24,25,26,27,28,29,30. Dodatkowo, edytory epigenomu są używane do rozszyfrowywania ról modyfikacji epigenetycznych31,32,33,34,35,36, effectors37,38,39 i mutacje efektorowe28,40,41 w regulacji genów. W szczególności CRISPRi i CRISPRa są używane w funkcjonalnych badaniach genomicznych dla różnych procesów biologicznych, w tym przeżycia komórek42 i cell fate43,44,45,46,47. Co więcej, edycja epigenomu ma potencjał terapeutyczny dla inżynierii komórkowej ex vivo i terapii in vivo18.

Tutaj opisujemy metody zastosowania dwóch edytorów epigenomu opartych na dCas9 do programowalnej represji transkrypcji w ludzkich liniach komórkowych: CRISPRi22 i CRISPRoff48. CRISPRi to fuzja dCas9 z represyjną domeną KRAB z białka palca cynkowego, takiego jak ZNF10 (KOX1) i ZIM322,23. Gdy CRISPRi jest ukierunkowany na określony promotor genu, domena KRAB rekrutuje autora H3K9me3, SETDB1, do tłumienia docelowego genu (Figura 1A). Gdy CRISPRi ulega przejściowej ekspresji, ustalony H3K9me3 w locus docelowym nie jest utrzymywany, a ekspresja genu jest przywracana w czasie32,48. Aby przeprowadzić stabilne knockdowny za pomocą CRISPRi, takie jak w zastosowaniach genomiki funkcjonalnej, niezbędna jest konstytutywna ekspresja CRISPRi w komórkach wraz z sgRNA. Niedawno CRISPRoff został zaprojektowany do programowania dziedzicznej edycji epigenomu48. CRISPRoff to fuzja pojedynczego białka dCas9 z domeną KRAB i kompleksem metylotransferazy DNA de novo, DNMT3A i DNMT3L. Przejściowy impuls CRISPRoff w komórkach ludzkich programuje depozycję H3K9me3 i metylację DNA w docelowych genach, co prowadzi do długotrwałej represji genów docelowych poprzez utrzymanie metylacji DNA i H3K9me3 (Rysunek 1B)48. Co więcej, edycje epigenomu można odwrócić. Na przykład gen, który jest stabilnie wyciszony przez CRISPRoff, może być reaktywowany przez TET1-dCas9, który może enzymatycznie usunąć znaczniki metylacji DNA w docelowych loci49.

Ten protokół szczegółowo opisuje dwie metody dostarczania przejściowej ekspresji edytorów epigenomu: transfekcję plazmidowego DNA i nukleofekcję mRNA. Dodatkowo opisujemy, jak wykorzystać cytometrię przepływową do oceny skuteczności edycji epigenomu w dwóch endogennych genach, CLTA i CD55. Metody te mogą być adaptowane i stosowane do innych eksperymentów edycji epigenomu przy użyciu dodatkowych edytorów lub mogą być używane do celowania w różne geny.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat mechanizmu edycji epigenomu CRISPRi i CRISPRoff oraz przepływu pracy. (A) Schematy liniowe edytora transgenu sgRNA i epigenomu CRISPRi. Dodanie CRISPRi i sgRNA pozwala na dodanie represyjnego znacznika histonowego H3K9me3 w celu wyciszenia docelowego locus. Najwyższy poziom wyciszenia osiąga się wcześnie po dodaniu CRISPRi, a cel genu jest na ogół reaktywowany po kilku pasażach. (B) Schematy liniowe transgenu sgRNA i edytora epigenomu CRISPRoff. Dodanie CRISPRoff do komórek ukierunkowanych na gen będący przedmiotem zainteresowania prowadzi do dodania represyjnego H3K9me3 wraz z metylacją DNA w miejscach CpG w celu wyciszenia genu docelowego. Wyciszenie przez CRISPRoff jest dziedziczne - wysoki poziom wyciszenia jest osiągany na początku transfekcji i utrzymuje się przez wiele podziałów komórkowych. (C) Przegląd osi czasu edycji epigenomu metodą transfekcji. W dniu 0 komórki są platerowane do transfekcji. W dniu 1 plazmid edytora i przewodnika może zostać wprowadzony do komórek poprzez transfekcję. W dniu 3 komórki zostaną ocenione pod kątem ekspresji BFP za pomocą cytometrii przepływowej. Procent BFP jest używany jako czynnik normalizujący do określenia końcowej skuteczności wyciszania eksperymentu dla każdego stanu. Od 6 dnia komórki są analizowane pod kątem wyciszenia reportera będącego przedmiotem zainteresowania, ponieważ najwyższy poziom wyciszenia zostanie osiągnięty w tym dniu. (D) Przegląd metody transfekcji, w której edytor epigenomu i plazmidy sgRNA są dodawane do komórek w sposób kroplowy. (E) Przegląd osi czasu edycji epigenomu za pomocą metod nukleofekcji. W tym protokole mRNA to nukleofekcja do komórek w dniu 0. Komórki są oceniane pod kątem wyciszenia w 3 dniu po nukleofekcji za pomocą analizy cytometrii przepływowej. (F) Przegląd protokołu nukleofekcji. Odpowiednie ilości komórek i mRNA miesza się i dodaje do kuwet nukleofektorowych. Jeśli sgRNA zostanie wprowadzony przez nukleofekcję, można go również dodać do tej mieszaniny. Kuwety są umieszczane w nukleofektorze, a odpowiednie kody impulsów są używane do wprowadzenia mRNA do komórek. Po nukleofekcji komórki są platerowane i pasażowane do analizy w późniejszych dniach. (G) Porównanie strategii transfekcji plazmidu i nukleofekcji mRNA do edycji epigenomu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Plik uzupełniający 1 zawiera szczegóły dotyczące projektowania sgRNA, klonowania i generowania linii komórkowych naszych reprezentatywnych danych. Sekcja reprezentatywnych wyników zawiera również szczegółowe sugestie dotyczące kontroli.

1. Transfekcja plazmidów wyrażających edytor epigenomu do komórek HEK293T

UWAGA: Ten protokół opisuje dostarczanie plazmidów kodujących CRISPR do komórek HEK293T. Zmodyfikowaliśmy komórki tak, aby wyrażały sgRNA (Addgene 217306) ukierunkowane na region promotorowy CLTA, nieistotnego genu, który jest endogennie znakowany GFP. Limfocyty CLTA-GFP HEK 293T pochodzą z poprzedniego badania50. W tym przykładzie edytory epigenomu są połączone bezpośrednio z białkiem niebieskiej fluorescencji (BFP), co pozwala nam określić ilościowo wydajność transfekcji i zapewnia dokładną ocenę warunków eksperymentalnych. Skuteczność tego podejścia wykazano poprzez wyciszenie CLTA-GFP, które można zmierzyć ilościowo na poziomie białka w pojedynczych komórkach za pomocą cytometrii przepływowej.

  1. Hodowla komórkowa
    1. Utrzymuj HEK293T komórki w DMEM o wysokim poziomie glukozy z 10% FBS i 1x Penicylina-Streptomycyna-Glutamina. Komórki należy przechodzić przez komórki co 2-3 dni, upewniając się, że pozostają w zbiegu 60%-70%.
      UWAGA: Aby zapewnić optymalną wydajność transfekcji, kluczowe znaczenie ma utrzymanie konfluencji komórek poniżej 70%, którą można codziennie monitorować pod mikroskopem.
  2. Dzień 0: Wysiewanie komórek HEK293T do transfekcji
    1. Dzień przed transfekcją policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek, używając barwienia żywym/martwym błękitem trypanowym i wysiewu ~1,5 x 104 żywych komórek na studzienkę na 96-dołkowej płytce. Utrzymuj końcową objętość każdego dołka na poziomie 200 μl. Komórki powinny osiągnąć 60%-70% konfluencji następnego dnia.
      UWAGA: Można to również efektywnie wykonać na płytkach 24- lub 6-dołkowych. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z liczbą komórek i ilością DNA do transfekcji.
  3. Dzień 1: Transfekcja plazmidów CRISPRoff i CRISPRi do komórek HEK29T
    1. Podwielokrotność 150 ng plazmidu edytora epigenomu (Addgene 167981) dla każdej studzienki w 3 μl całkowitej objętości. Te rozcieńczenia plazmidu można przygotować w probówkach paskowych do PCR.
      UWAGA: Jeśli edytor epigenomu i plazmid sgRNA są jednocześnie transfekowane, zalecamy wypróbowanie stosunku molowego 5:4 plazmidów editor:sgRNA. Być może konieczne będzie zoptymalizowanie proporcji w celu uzyskania najwyższej wydajności edycji epigenomu.
    2. Podgrzej odczynnik do transfekcji i minimalną niezbędną pożywkę do temperatury pokojowej około 30-60 minut przed transfekcją. Zmieszać 0,6 μl odczynnika do transfekcji i 20 μl minimalnej niezbędnej pożywki na studzienkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min.
      UWAGA: W przypadku wykonywania wielu transfekcji można przygotować główną mieszankę odczynnika do transfekcji i minimalnej ilości niezbędnego podłoża.
    3. Dodać 20,6 μl odczynnika do transfekcji i minimalną niezbędną mieszaninę pożywki do każdej probówki z paskiem PCR zawierającej 3 μl plazmidowego DNA. Odstawić w temperaturze pokojowej na 15 minut.
    4. Powoli dodawaj mieszaninę do płytki z wysianymi komórkami i delikatnie postukaj w płytkę, aby rozproszyć mieszankę. Uwzględnij kontrolę nietransfekowaną, aby zapewnić właściwą linię bazową do porównania w dalszych analizach.
      UWAGA: Podczas dodawania mieszaniny transfekcji do wysiewanych komórek ważne jest, aby robić to kroplami i delikatnie, aby zminimalizować zakłócenia, ponieważ może to niekorzystnie wpłynąć na wydajność transfekcji.
  4. Dzień 2: Sprawdź powodzenie transfekcji
    1. Zbadaj komórki pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu, aby określić, czy są BFP dodatnie, ponieważ wskazuje to na udaną transfekcję. Upewnij się, że komórki nie są zakłócone podczas procesu obserwacji.
  5. Dzień 3: Podziel 96-dołkową płytkę i oceń skuteczność transfekcji za pomocą znacznika BFP
    UWAGA: Udana transfekcja powinna dać co najmniej 30% komórek jako BFP dodatnie. Jednak w przypadku dCas9, CRISPRi i CRISPRoff zwykle wykrywamy ponad 60% komórek BFP dodatnich dwa dni po transfekcji. Wydajność transfekcji jest ujemnie skorelowana z rozmiarem plazmidu, więc różne edytory epigenomu mogą dawać różne wydajności transfekcji.
    1. Podgrzej trypsynę i DMEM z 10% FBS i 1x Penicylina-Streptomycyna-Glutamina do temperatury pokojowej przez około 30-60 minut przed użyciem.
    2. Odessać pożywkę z dołków; należy uważać, aby nie usunąć komórek przyczepionych do dna. Dodaj 50 μl trypsyny do dołka. Inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Nie jest niczym niezwykłym obserwowanie niektórych pływających komórek, zwłaszcza po transfekcji za pomocą CRISPRoff. Przypuszczamy, że ta śmierć komórki jest spowodowana toksycznością nadekspresji DNMT3A-3L.
    3. Hamuj trypsynę, dodając 150 μl kompletnego DMEM na studzienkę. Pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić komórki i podzielić komórki w celu zbiegu w 5 dniu (~20 μl mieszaniny komórek w 200 μl pożywki z 96-dołkowej płytki).
    4. Użyj 50 μl zawieszonych komórek do cytometrii przepływowej, aby ocenić skuteczność transfekcji.

2. Jądro mRNA edytora epigenomu do komórek K-562

UWAGA: Ta sekcja szczegółowo opisuje proces nukleofekcji mRNA CRISPRoff do komórek K-562. Dla uproszczenia wstępnie zaprojektowaliśmy komórki K-562 tak, aby konstytutywnie wyrażały sgRNA, które celuje w promotor endogennego genu CD55 (Addgene 217306). Dostarczanie mRNA CRISPRoff bezpośrednio do komórek może potencjalnie zmniejszyć toksyczność komórkową, która towarzyszy podejścium opartym na plazmidowym DNA, przy jednoczesnym osiągnięciu podobnej skuteczności wyciszania genów. Dodatkowo, nukleofekcja może być wykorzystana do wprowadzenia konstruktów edytora epigenomu w liniach komórkowych, które są trudne do skutecznej transfekcji, takich jak K-562.

  1. Hodowla komórkowa
    1. Przed nukleofekcją utrzymuj komórki K-562 w kolbie z RPMI z 10% FBS i 1x Penicylina-Streptomycyna-Glutamina. Codziennie przechodź przez komórki, upewniając się, że pozostają w konfluencji 60%-70%.
    2. W dniu nukleofekcji rozmrozić i delikatnie odwirować mRNA CRISPRoff w sterylnej probówce mikrowirówkowej bez RNaz i przechowywać mRNA na lodzie. Użyj 2 μg mRNA na 2,0 x 105 komórek w każdym dołku nukleokuwetu paskowego. Upewnij się, że objętość mRNA nie przekracza 10% całkowitej objętości nukleofekcji (22 μL).
      UWAGA: Nukleofekcję można również wykonać w większych kuwetach z większą liczbą komórek i mRNA. Sugerujemy skalowanie ilości mRNA proporcjonalnie do liczby komórek, które będziesz dodawać. Na przykład, wykonując nukleofekcję w dużej kuwecie na komórkach 1 x 106, sugerujemy użycie 10 μg mRNA, o całkowitej objętości jądra 100 μL. Dodatkowo dawkę mRNA można zoptymalizować, aby zapewnić wysoką skuteczność edycji. Często używamy 2-5 μg edytora mRNA na każde 2,0 x 105 komórek, aby uzyskać skuteczne wyniki. Wolne nukleotydy, które nie zostały włączone podczas syntezy mRNA, należy usunąć przed kwantyfikacją.
    3. Przygotować roztwór nukleofekcji zgodnie z instrukcjami producenta i ogrzać do temperatury pokojowej przez 15 minut przed nukleofekcją.
      UWAGA: Roztwór nukleofektora może być różny lub wymagać optymalizacji dla różnych typów komórek.
    4. Zbierz i policz komórki K-562 za pomocą automatycznego licznika komórek z barwieniem żywym/martwym błękitem trypanowym. Do nukleofekcji w kuwecie paskowej, podwielokrotność ~2,0 x 105 komórek na próbkę do sterylnej probówki mikrowirówkowej.
    5. Odwirować komórki o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odrzucić supernatant. Przemyć komórki 1x PBS o temperaturze pokojowej 500 x g przez 5 minut, a następnie wyrzucić supernatant.
    6. Obliczyć ilość roztworu nukleofektora do ponownego zawieszenia komórek, odejmując objętość mRNA od 22 μl. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej ilości roztworu nukleofektora.
    7. Dodaj roztwór komórkowy do 2 μg mRNA CRISPRoff (objętość określona w kroku 2.1.2) i przenieś roztwór do kuwety, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków, ponieważ może to zagrozić wydajności nukleofekcji. Delikatnie postukaj w nukleokuwetę, aby upewnić się, że komórki znajdują się na dole.
    8. Nucleofekt komórek za pomocą systemu 4D-Nucleofector z odpowiednim kodem impulsowym. Kod FF-120 jest zalecany dla komórek K-562.
      UWAGA: Może być konieczne zoptymalizowanie kodu impulsu dla różnych typów komórek. Skonsultuj się z producentem, jeśli potrzebna jest dodatkowa optymalizacja.
    9. Po nukleofekcji dodać 80 μl pożywki RPMI do każdej małej pożywki nukleokulowej i pozostawić komórki w temperaturze 37 °C na 15 minut.
    10. Przenieść zawiesinę komórkową do studzienki 24-dołkowej płytki zawierającej 400 μl wstępnie podgrzanej pożywki RPMI (małego nukleokuluwetu).
      UWAGA: Po nukleofekcji komórki są szczególnie delikatne i powinny być delikatnie przenoszone z nukleokuwety do dołków hodowlanych.
    11. Po 2 dniu po nukleofekcji: postępuj zgodnie z protokołem barwienia markerem powierzchniowym przeciwciałem CD55, jak opisano w punkcie 3 i zmierz fluorescencję CD55 APC na cytometrze przepływowym, aby ocenić skuteczność edycji epigenomu.
      UWAGA: Aby stwierdzić powodzenie nukleofekcji, zalecamy wykonanie nukleofekcji z mRNA GFP lub mCherry. Dwa dni po nukleofekcji wykonaj cytometrię przepływową tych komórek, aby potwierdzić udaną nukleofekcję. Na ogół wykrywamy od 90% do 100% tych komórek wykazujących ekspresję GFP lub mCherry. Alternatywą jest wykonanie nukleofekcji za pomocą mRNA CRISPRi, o którym wiadomo, że skutecznie wycisza wiele docelowych genów. Podczas wykonywania cytometrii przepływowej w 2 dniu, próbki poddane działaniu CRISPRi powinny wykazywać wyciszenie genu docelowego w ponad 90% komórek.

3. Barwienie markerów powierzchniowych

UWAGA: Ta sekcja szczegółowo opisuje poziomy białka CD55 po edycji epigenomu w komórkach K-562. Określamy ilościowo spadek ekspresji CD55 w pojedynczych komórkach za pomocą barwienia przeciwciałami i cytometrii przepływowej (patrz sekcja 4 poniżej) w celu oceny skuteczności knockdownu za pośrednictwem CRISPRoff. Dodatkowe techniki, w tym ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją lub western blot, mogą być również wykorzystane do potwierdzenia poziomu knockdownu zarówno na poziomie transkryptu, jak i białka.

  1. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i dodaj około 5,0 x 105 do 1,0 x 106 komórek do probówki mikrowirówkowej i odwiruj komórki przy 500 x g przez 5 min.
    UWAGA: Do barwienia można użyć więcej lub mniej komórek, jednak stężenie przeciwciał może wymagać odpowiedniego skalowania.
  2. Wyrzucić supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu, dodać 500 μl PBS i delikatnie zawiesić osad
    3. .
  3. Ponownie odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i dodać przeciwciało o pożądanym stężeniu rozcieńczonym w PBS. Do barwienia CD55 użyj 1 μl oczyszczonego anty-ludzkiego CD55 (0,5 mg / ml zapasu) w 49 μl PBS.
  4. Delikatnie odpipetować komórki i pozostawić je do inkubacji przez 25 minut w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej. Po inkubacji ponownie wirować komórki w masie 500 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.
  5. Zawiesić osad z 500 μl PBS, aby zmyć nadmiar przeciwciał. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant PBS. Zawiesić w 100 μl do 200 μl świeżego PBS i dodać do 96-dołkowej płytki w celu analizy metodą cytometrii przepływowej.

4. Cytometria przepływowa

UWAGA: Ten protokół jest napisany do korzystania z analizatora komórek BD FACSymphony A1. Specyfika może się różnić w zależności od używanego cytometru przepływowego. Sugerujemy zapoznanie się z instrukcją obsługi używanej maszyny w celu uzyskania szczegółowych informacji.

  1. Przed włączeniem cytometrii należy sprawdzić, czy pojemnik na odpady nie jest pełny i czy jest dużo płynu w osłonce. Włącz główny wyłącznik zasilania (zielony), który znajduje się w pobliżu płynu osłonowego.
  2. Włączyć czytnik tabliczek za pomocą przełącznika wstecznego. Następnie włącz maszynę za pomocą zielonego przycisku po prawej stronie i upewnij się, że maszyna jest ustawiona na funkcję 96-dołkowego czytnika płytek.
  3. Włącz komputer i zaloguj się. Otwórz oprogramowanie i zaloguj się przy użyciu swojej nazwy użytkownika i hasła.
  4. Skonfiguruj eksperyment. Utwórz nowy eksperyment, wybierając pozycję Eksperymentuj > Nowy eksperyment. Zmień nazwę eksperymentu, klikając dwukrotnie bieżącą nazwę.
  5. Dodaj płytę, klikając przycisk Eksperymentuj > Nowa płyta. Wybierz format studni, który ma być używany. Aby dodać konkretne studnie do uruchomienia, kliknij lokalizację studni na tabliczce, a następnie kliknij niebieską strzykawkę (studnia powinna być teraz podświetlona na niebiesko). W razie potrzeby wybierz wiele dołków w tym samym czasie, aby je dodać.
  6. Dodaj określone nazwy do każdej studzienki, klikając prawym przyciskiem myszy Próbka po prawej stronie wyświetlacza płytki. Następnie wybierz pozycję Układ eksperymentalny. Spowoduje to otwarcie strony z listą wszystkich wybranych studni. Aby zmienić nazwy studni, kliknij raz i wpisz żądaną nazwę. Po zakończeniu kliknij przycisk OK.
  7. Dodaj wykresy i odpowiednie bramki do eksperymentu w arkuszu globalnym. Zalecamy najpierw wykreślenie obszaru rozproszenia do przodu (FSC-A) w porównaniu z obszarem rozproszenia bocznego (SSC-A). Następnie utwórz dowolną bramkę dla aktywnych komórek, aby później ją udoskonalić, klikając narzędzie Wielokąt.
  8. Kliknij prawym przyciskiem myszy tę bramę i kliknij polecenie Przejdźcie do szczegółów. Spowoduje to utworzenie nowego wykresu wyświetlającego tylko komórki z tej bramki aktywnej komórki.
  9. Zmień oś tego nowego wykresu na FSC-A vs wysokość rozproszenia do przodu (FSC-H) i utwórz bramkę dla pojedynczych komórek.
    1. Jeśli konstytutywnie ulega ekspresji sgRNA w komórkach, a lentiwirus koduje również białko fluorescencyjne, należy zagłębić się w tę pojedynczą bramę komórkową i przeprowadzić dalsze bramkowanie w celu ekspresji tego białka jako wskaźnika ekspresji sgRNA (przykład: PE-CF594-A vs FSC-A).
  10. Na końcowej bramce konfiguracji (zarówno dla pojedynczych komórek, jak i dla komórek wykazujących ekspresję sgRNA) kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Przejdźcie do szczegółów. Utwórz bramkę do oznaczania ekspresji genu reporterowego (przykład: BB515-A vs FSC-A).
    1. Jeśli używasz transfekowanych komórek i masz metodę oznaczania wydajności transfekcji, taką jak wyrażenie BFP, kliknij prawym przyciskiem myszy wykres wyrażenia reporterowego i kliknij Duplikuj. Zmień osie na BV421-A vs FSC-A. Utwórz dowolną bramkę dla komórek BFP-dodatnich.
  11. Usuń wszystkie parametry, które nie są używane, na karcie Parametry wyświetlacza cytometru.
  12. Aby skonfigurować urządzenie i przygotować je do pracy, kliknij przycisk Uruchom na panelu sterowania cytometru przepływowego. Przycisk powinien być zielony. W oprogramowaniu przejdź do HTS w górnym panelu, a następnie Prime. Po zakończeniu dodaj talerz, upewniając się, że jest dobrze umieszczony w urządzeniu, a pokrywa jest ZDJĘTA.
  13. Aby uruchomić, wybierz wszystkie źródła do uruchomienia i upewnij się, że kontrolki są odpowiednio ustawione. Wybierz dobrze, klikając dwukrotnie, zmień objętość próbki na 10 μl i kliknij Uzyskaj dane na pulpicie akwizycji. Spowoduje to uruchomienie próbki, ale nie spowoduje zapisania danych. Gdy ta próbka jest uruchomiona, dostosuj napięcie lasera zgodnie z potrzebami. Dodatkowo zmień gates.
    UWAGA: Zalecamy przeprowadzenie próbki, która jest ujemna dla wszystkich mierzonych kolorów i jednej, która jest dodatnia dla wszystkich kolorów, aby upewnić się, że parametry lasera i bramkowanie są dobre.
  14. Po sprawdzeniu ustawień lasera kliknij Próbki w panelu płyt i sprawdź, czy wartości bieżące są ustawione zgodnie z potrzebami.
  15. Kliknij przycisk Uruchom blachę, aby uruchomić go na pulpicie nawigacyjnym akwizycji i zarejestrować dane ze wszystkich odwiertów. Po zakończeniu wyczyść maszynę, wyjmując płytkę.
  16. Do nowej 96-dołkowej płytki dodaj 10% wybielacza do czterech górnych rzędów iH2Odo czterech dołków poniżej. Przejdź do HTS > czyszczenia. Po zakończeniu zamknij program i wyłącz przyciski w odwrotnej kolejności, w jakiej były włączone zielony przycisk boczny > czytnika tabliczek > zielony przełącznik przez marnotrawstwo.
  17. Dodaj 20% wybielacza do 96-dołkowej płytki z komórkami i wyrzuć.

5. Analiza danych

UWAGA: Ta metoda opisuje strategie bramkowania i przetwarzania danych w celu ilościowego określenia edycji epigenomu za pomocą cytometrii przepływowej. Strategia bramkowania jest przedstawiona wizualnie wraz z przykładowymi wykresami wygenerowanymi na podstawie analizy danych w Rysunek 2 i Rysunek 3.

  1. Konfiguracja bramkowania FlowJo
    1. Załaduj wszystkie pliki FSC do FlowJo, przeciągając je i upuszczając do nowego arkusza.
    2. Kliknij Wszystkie próbki, aby rozpocząć tworzenie bram. Zapewni to, że bramki będzie można łatwo zastosować do wszystkich próbek.
    3. Otwórz próbkę kontrolną (taką jak nietransfekowana lub niejądro-zanużowana), klikając dwukrotnie ten plik.
    4. Utwórz bramkę dla aktywnych komórek na wykresie FSC-A vs SSC-A za pomocą narzędzia wielokąta. Na liście wszystkich przykładów pod nazwą próbki powinna teraz pojawić się karta Aktywne komórki. Kliknij prawym przyciskiem myszy na tę bramkę i wybierz opcję Kopiuj analizę do grupy, aby zastosować tę bramkę do wszystkich próbek (Rysunek 2A, Rysunek 3A).
    5. Kliknij dwukrotnie bramę Aktywne komórki, aby przejść do szczegółów dynamicznych komórek. Zmień osie na FSC-A vs FSC-H (Rysunek 2B, Rysunek 3B).
    6. Narysuj wielokąt do bramki tylko dla pojedynczych komórek. Zastosuj tę bramkę do wszystkich próbek, jak to zrobiono w sekcji 4 (Rysunek 2B, Rysunek 3B).
      UWAGA: Jeśli konstytutywnie wyraża konstrukt sgRNA za pomocą fluorescencyjnego reportera, wykonaj dalsze bramkowanie tego koloru, tak aby analiza skupiła się tylko na komórkach, które wyrażają sgRNA. Przykładem tego może być stworzenie bramki dla komórek mCherry-dodatnich (PE-CF594-A vs FSC-A), jeśli komórki zawierają sgRNA ze szkieletu pLG1 (Rysunek 2C, Figura 3C).
    7. Kliknij dwukrotnie bramkę ostatniej konfiguracji (pojedyncze komórki lub komórki wyrażające przewodnik).
    8. Jeśli wykonujesz transfekcję plazmidu, a edytor epigenomu koduje fuzję BFP, utwórz bramkę dla komórek dodatnich BFP (przykład: BV421-A vs FSC-A) dla próbek dnia 2 (Rysunek 2D).
    9. Utwórz bramkę dla wyrażenia reporterowego (przykład: BB515-A vs FSC-A do bramki dla komórek ujemnych GFP) i zastosuj tę bramkę do wszystkich próbek (Rysunek 2E, Rysunek 3D).
  2. Analiza transfekcji
    1. Po wykonaniu konfiguracji bramkowania kliknij Edytor tabel w górnym panelu. Przeciągnij populacje do analizy (przykłady: dodatnia wartość BFP, ujemna wartość GFP).
    2. W panelu edytora tabel kliknij przycisk Utwórz tabelę. Skopiuj te dane do arkusza kalkulacyjnego, aby wykonać obliczenia normalizacji.
  3. przetwarzanie danych
    1. Odejmij liczbę komórek reporterowo ujemnych (przykład: GFP ujemny) w próbce kontrolnej od wszystkich innych próbek. Zgłaszający może być w pewnym stopniu wyciszony w tle, co spowoduje usunięcie tego szumu tła z danych.
    2. Wszystkie wartości zostaną znormalizowane do odsetka komórek BFP dodatnich (pomyślnie transfekowanych komórek) zmierzonych w dniu 2. Aby wykonać tę normalizację, weź wartość, podziel przez procent komórek dodatnich BFP w dniu 2 i pomnóż przez 100. To obliczenie daje znormalizowaną wartość wydajności transfekcji edytowanych komórek. Dane są teraz gotowe do wykreślenia. Zalecamy wykresy liniowe w całym przebiegu edycji epigenomu, jak pokazano na Rysunek 2F.
  4. Analiza nukleofekcji
    1. Po wykonaniu konfiguracji bramkowania kliknij Edytor tabel w górnym panelu. Przeciągnij populacje do analizy (przykłady: APC ujemne).
    2. W panelu edytora tabel kliknij przycisk Utwórz tabelę. Skopiuj te dane do edytora arkuszy kalkulacyjnych, aby wykonać obliczenia normalizacji.
  5. przetwarzanie danych
    1. Odejmij liczbę komórek reporterowo ujemnych (przykład: APC ujemny) w próbce kontrolnej od wszystkich innych próbek. Zgłaszający może być w pewnym stopniu wyciszony w tle, co spowoduje usunięcie tego szumu tła z danych. Dane są teraz gotowe do wykreślenia. Zalecamy wykresy liniowe w całym przebiegu czasu edycji epigenomu.
      UWAGA: Statystyki mogą być wykorzystane do ilościowego określenia różnic w wyciszaniu między dwoma różnymi edytorami epigenomu. Zalecamy wykonywanie wszystkich eksperymentów z transfekcją i nukleofekcją w trzech egzemplarzach technicznych w celu przeprowadzenia analiz statystycznych. Przedstawiając wykresy liniowe wyciszania w czasie, wykreśl odchylenie standardowe replik technicznych. Testy t studentów w określonych punktach czasowych mogą być wykonywane w celu porównania wyciszania między dwoma edytorami epigenomu. Próbki powinny być traktowane jako niesparowane z nierówną wariancją.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla wszystkich eksperymentów z edycją epigenomu, odpowiednie kontrole są niezbędne do oceny efektywności edycji epigenomu. Zalecamy stosowanie kontrolnego sgRNA, który nie jest ukierunkowany na żadną sekwencję w ludzkim genomie. Użycie kontroli przewodnika bez kierowania da pewność, że zmiany w loci docelowych są napędzane przez edytor epigenomu kierowany do tego miejsca, a nie tylko przez nadekspresję edytora epigenomu lub niespecyficzne wiązanie. Dodatkowo, w przypadku eksperymentów opartych na genach reporterowych, su...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten wyszczególnia dwie różne metody dostarczania przejściowego dla edytorów epigenomu CRISPR: transfekcję plazmidowego DNA i nukleofekcję mRNA. Obie techniki mają unikalne zalety, wady i ogólne rozważania (rysunek 1F).

Transfekcja plazmidowego DNA prowadzi do solidnej ekspresji edytora epigenomu, a my włączamy fuzję BFP do konstruktów edytora epigenomu, która pozwala na wykrywanie i ilościowe określanie skuteczności transfekcji za pomocą cytometrii przepł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.K.N. jest wynalazcą patentów związanych z technologiami CRISPRoff/on, zgłoszonych przez Regentów Uniwersytetu Kalifornijskiego.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratorium Nuñez, szczególnie Rithu Pattali i Izaiahowi Ornelasowi, za rozwój i optymalizację protokołów opisanych w tym manuskrypcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4D-NucleofectorLonzaAAF-1003
96-dołkowe płytki do hodowli tkankowychCorning3596
96-dołkowa płytka dolna w kształcie litery UCorning351177
APC Przeciwciało anty-ludzkie CD55BioLegend311312
BD FACSymphony A1 Cytometr przepływowyBD Biosciences
BleachWaxie
11003428432 WirówkaEppendorf5425
Countess Automatyczny licznik komórekThermo ScientificCountess 3
Plazmid transfekcji CRISPRoffAddgene 
Diluent 2 Odczynnik hematologiczny do cytometrii przepływowej (płyn osłonkowy)Thermo Scientific23-029-361
DMEM, Termo Scientific o wysokiej zawartości glukozy11965118
DPBSGibco14-190-250
Probówki EppendorfThomas scientific1159M35
FBSAvantor Seradigm89510-186
Lonza Walkersville  Linia komórkowa SF 4D-Nucleofector X Kit LFisher ScientificNC0281111
mMESSAGE mMACHINE™ Zestaw do transkrypcji T7 ULTRAThermo FisherAM1345
Opti-MEMGibco31985070
probówki paskowe do PCRUSA Scientific 1402-4700
Penicylina-Streptomycyna-GlutaminaGibco10378016
plazmid ekspresji pLG1 sgRNAAddgene 
RPMI 1640Gibco22-400-105
Linia komórkowa SF 96-dołkowy Nucleofector®   ZestawLonzaV4SC-2096
Inkubator do hodowli tkankowychPHCbiMCO-170AICUVDL-PA
Odczynnik do transfekcji TransIT-LTIMirusMIR 2306
Trypsyna-EDTA (0,25%)Gibco25200114
167981217306

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kimura, H. Histone modifications for human epigenome analysis. Journal of Human Genetics. 58 (7), 439-445 (2013).
  2. Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  3. Esvelt, K. M., Mali, P., Braff, J. L., Moosburner, M., Yaung, S. J., Church, G. M. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature Methods. 10 (11), 1116-1121 (2013).
  4. Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (39), 15644-15649 (2013).
  5. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  6. Gaudelli, N. M., et al. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).
  7. Anzalone, A. V., et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).
  8. Anzalone, A. V., et al. Programmable deletion, replacement, integration and inversion of large DNA sequences with twin prime editing. Nature Biotechnology. 40 (5), 731-740 (2022).
  9. Zhang, X. -H., Tee, L. Y., Wang, X. -G., Huang, Q. -S., Yang, S. -H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4, e264(2015).
  10. Lin, Y., et al. CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences. Nucleic Acids Research. 42 (11), 7473-7485 (2014).
  11. Adikusuma, F., et al. Large deletions induced by Cas9 cleavage. Nature. 560 (7717), E8-E9 (2018).
  12. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
  13. Cullot, G., et al. CRISPR-Cas9 genome editing induces megabase-scale chromosomal truncations. Nature Communications. 10 (1), 1136(2019).
  14. Fiumara, M., et al. Genotoxic effects of base and prime editing in human hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 42 (6), 877-891 (2024).
  15. Tsuchida, C. A., et al. Mitigation of chromosome loss in clinical CRISPR-Cas9-engineered T cells. Cell. 186 (21), 4567-4582.e20 (2023).
  16. Nakamura, M., Gao, Y., Dominguez, A. A., Qi, L. S. CRISPR technologies for precise epigenome editing. Nature Cell Biology. 23 (1), 11-22 (2021).
  17. Villiger, L., Joung, J., Koblan, L., Weissman, J., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S. CRISPR technologies for genome, epigenome and transcriptome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 25 (6), 464-487 (2024).
  18. McCutcheon, S. R., Rohm, D., Iglesias, N., Gersbach, C. A. Epigenome editing technologies for discovery and medicine. Nature Biotechnology. 42 (8), 1199-1217 (2024).
  19. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  20. Maeder, M. L., Linder, S. J., Cascio, V. M., Fu, Y., Ho, Q. H., Joung, J. K. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
  21. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A Protein-Tagging System for Signal Amplification in Gene Expression and Fluorescence Imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
  22. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  23. Alerasool, N., Segal, D., Lee, H., Taipale, M. An efficient KRAB domain for CRISPRi applications in human cells. Nature Methods. 17 (11), 1093-1096 (2020).
  24. Nakamura, M., Gao, Y., Dominguez, A. A., Qi, L. S. CRISPR technologies for precise epigenome editing. Nature Cell Biology. 23 (1), 11-22 (2021).
  25. Tycko, J., et al. High-Throughput Discovery and Characterization of Human Transcriptional Effectors. Cell. 183 (7), 2020-2035.e16 (2020).
  26. Alerasool, N., Leng, H., Lin, Z. -Y., Gingras, A. -C., Taipale, M. Identification and functional characterization of transcriptional activators in human cells. Molecular Cell. 82 (3), 677-695.e7 (2022).
  27. Ludwig, C. H., et al. High-throughput discovery and characterization of viral transcriptional effectors in human cells. Cell Systems. 14 (6), 482-500.e8 (2023).
  28. DelRosso, N., et al. Large-scale mapping and mutagenesis of human transcriptional effector domains. Nature. 616 (7956), 365-372 (2023).
  29. Tycko, J., et al. Development of compact transcriptional effectors using high-throughput measurements in diverse contexts. Nature Biotechnology. , (2024).
  30. Wilson, C. M., et al. Combinatorial effector targeting (COMET) for transcriptional modulation and locus-specific biochemistry. , (2024).
  31. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247.e17 (2016).
  32. Bintu, L., et al. Dynamics of epigenetic regulation at the single-cell level. Science. 351 (6274), 720-724 (2016).
  33. Hilton, I. B., et al. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nature Biotechnology. 33 (5), 510-517 (2015).
  34. Cano-Rodriguez, D., et al. Writing of H3K4Me3 overcomes epigenetic silencing in a sustained but context-dependent manner. Nature Communications. 7 (1), 12284(2016).
  35. O'Geen, H., et al. dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression. Nucleic Acids Research. 45 (17), 9901-9916 (2017).
  36. O'Geen, H., et al. Ezh2-dCas9 and KRAB-dCas9 enable engineering of epigenetic memory in a context-dependent manner. Epigenetics & Chromatin. 12 (1), 26(2019).
  37. Kim, J. -M., et al. Cooperation between SMYD3 and PC4 drives a distinct transcriptional program in cancer cells. Nucleic Acids Research. 43 (18), 8868-8883 (2015).
  38. Kearns, N. A., et al. Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion. Nature Methods. 12 (5), 401-403 (2015).
  39. Li, K., et al. Interrogation of enhancer function by enhancer-targeting CRISPR epigenetic editing. Nature Communications. 11 (1), 485(2020).
  40. Stepper, P., et al. Efficient targeted DNA methylation with chimeric dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L methyltransferase. Nucleic Acids Research. 45 (4), 1703-1713 (2017).
  41. Valbuena, R., et al. Prediction and design of transcriptional repressor domains with large-scale mutational scans and deep learning. , (2024).
  42. Horlbeck, M. A., et al. Compact and highly active next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression and activation. eLife. 5, e19760(2016).
  43. Liu, Y., et al. CRISPR Activation Screens Systematically Identify Factors that Drive Neuronal Fate and Reprogramming. Cell Stem Cell. 23 (5), 758-771.e8 (2018).
  44. Black, J. B., et al. Master Regulators and Cofactors of Human Neuronal Cell Fate Specification Identified by CRISPR Gene Activation Screens. Cell Reports. 33 (9), 108460(2020).
  45. Yang, J., et al. Genome-Scale CRISPRa Screen Identifies Novel Factors for Cellular Reprogramming. Stem Cell Reports. 12 (4), 757-771 (2019).
  46. Chakraborty, S., Ji, H., Kabadi, A. M., Gersbach, C. A., Christoforou, N., Leong, K. W. A CRISPR/Cas9-Based System for Reprogramming Cell Lineage Specification. Stem Cell Reports. 3 (6), 940-947 (2014).
  47. Black, J. B., et al. Targeted Epigenetic Remodeling of Endogenous Loci by CRISPR/Cas9-Based Transcriptional Activators Directly Converts Fibroblasts to Neuronal Cells. Cell Stem Cell. 19 (3), 406-414 (2016).
  48. Nuñez, J. K., et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell. 184 (9), 2503-2519.e17 (2021).
  49. Xu, X., et al. A CRISPR-based approach for targeted DNA demethylation. Cell Discovery. 2 (1), 16009(2016).
  50. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (25), (2016).
  51. Pattali, R. K., Ornelas, I. J., Nguyen, C. D., Xu, D., Divekar, N. S., Nuñez, J. K. CRISPRoff epigenetic editing for programmable gene silencing in human cells without DNA breaks. , (2024).
  52. Moon, H. C., Herschl, M. H., Pawluk, A., Konermann, S., Hsu, P. D. A combinatorial domain screening platform reveals epigenetic effector interactions for transcriptional perturbation. , (2024).
  53. Cappelluti, M. A., et al. Durable and efficient gene silencing in vivo by hit-and-run epigenome editing. Nature. 627 (8003), 416-423 (2024).
  54. Naumann, E. N., et al. rainwide silencing of prion protein by AAV-mediated delivery of an engineered compact epigenetic editor. Science. 384 (6703), ado7082(2024).
  55. Tremblay, F., et al. A potent epigenetic editor targeting human PCSK9 for durable reduction of low-density lipoprotein cholesterol levels. Nature Medicine. 31 (4), 1329-1338 (2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

fuzja dCas9represja gen wsystem CRISPRoffwyciszanie CRISPRicytometria przep ywowaludzkie linie kom rkowemodulacja chromatyny

Powiązane artykuły