Monitorowanie dynamiki konformacyjnej pojedynczych niemodyfikowanych białek za pomocą plazmonicznej pęsety

Summary

Plazmoniczne pęsety wykorzystują zlokalizowany powierzchniowy rezonans plazmonów w nanostrukturach złota, aby uwięzić pojedyncze nanocząsteczki, w tym białka, w polu optycznym o skali nanometrowej. Zmiany w rozproszonym sygnale ujawniają obecność białka i dynamikę konformacyjną, umożliwiając monitorowanie bez modyfikacji fluoroforu lub wiązania powierzchni.

Abstract

Obecne techniki jednocząsteczkowe do charakteryzowania białek zazwyczaj wymagają etykiet, uwięzi lub użycia nienatywnych warunków roztworu. Takie zmiany mogą zmienić biofizykę białek i zmniejszyć użyteczność pozyskanych danych. Plazmoniczne pęsety to technika wykorzystująca zlokalizowany powierzchniowy rezonans plazmonowy (LSPR) na nanostrukturach złota w celu wzmocnienia pola elektrycznego w ograniczonym obszarze hotspotu. To ulepszenie pola pozwala na wykorzystanie niskich mocy lasera do wychwytywania pojedynczych nanocząstek znacznie mniejszych niż konwencjonalne pęsety optyczne, o średnicy zaledwie kilku nanometrów, takich jak pojedyncze białka. Uwięzienie pojedynczych cząsteczek białka w obszarze hotspotu indukuje zmianę lokalnego współczynnika załamania światła (_białko n >_{n woda}), zmieniając rozpraszanie światła jako produkt polaryzacji cząsteczki, na którą wpływa jej objętość, anizotropia kształtu i współczynnik załamania światła. Fotodioda lawinowa (APD) zbiera kolejne zmiany w rozpraszaniu światła. Zmiany te można następnie przeanalizować w celu określenia zmian w uwięzionej cząsteczce, w tym jej wielkości, globalnej konformacji i dynamiki zmian konformacyjnych w czasie. Włączenie mikrofluidyki do systemu pozwala na kontrolowane zmiany środowiskowe i monitorowanie w czasie rzeczywistym ich późniejszego wpływu na cząsteczkę. W tym protokole demonstrujemy kroki wychwytywania pojedynczych cząsteczek białka, zmiany warunków środowiskowych ich roztworu i monitorowania odpowiadających im zmian konformacyjnych za pomocą systemu plazmonicznej pęsety.

Introduction

Obecne techniki jednocząsteczkowe do badania dynamiki konformacji białek obejmują metody oparte na znakowaniu, takie jak transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET)^1,2, podejścia oparte na tetheringu, takie jak pęseta optyczna^3,4i mikroskopia sił atomowych (AFM)⁵, techniki oparte na interferencjach, takie jak mikroskopia rozpraszania interferencyjnego (iSCAT)⁶, lub techniki oparte na nanofluidyce, takie jak nanopores7^,8^,9. Chociaż te metody mają wiele zalet; Kilka kluczowych ograniczeń uniemożliwia im dostarczenie danych na temat dynamiki konformacji niezmodyfikowanych białek. FRET i pęsety optyczne wymagają znakowania fluoroforem lub przywiązania do powierzchni, co może wpływać na właściwości biofizyczne białek^10,11,12. iSCAT, choć technicznie nie wymaga znakowania, wymaga również interakcji między białkiem a powierzchnią, aby zaobserwować zakłócenia generowane między nimi, które potencjalnie wpływają na właściwości białek. Ponadto, ograniczony stosunkiem sygnału do szumu, iSCAT może wykrywać tylko białka >40 kDa z powodu szumów sprzętu i fluktuacji tła przypominających plamki¹³. Chociaż ten limit rozmiaru można złagodzić za pomocą uczenia maszynowego, komponenty bufora są ograniczone, ponieważ mogą wpływać na właściwości optyczne, powodując zaszumienie danych^13,14. Nanopory charakteryzują się krótkimi czasami translokacji białek przez pory (zwykle w granicach 5 μs), co sprawia, że nie są w stanie wykryć wolniejszej dynamiki konformacji^15,16, chociaż badania nad złagodzeniem tych ograniczeń, takie jak użycie origami DNA w pułapce elektroosmotycznej nanoporowej¹⁷ lub włączenie plazmoniki^18,19,20,21. Dodatkowo, wysokie stężenia soli, zwykle około 1 M, mogą zmniejszyć przydatność danych do pracy in vivo^15,22. Idealna technika jednocząsteczkowa do charakterystyki białek powinna monitorować białka w czasie rzeczywistym i rejestrować dynamikę konformacyjną przez dłuższy czas (tj. milisekundy) bez konieczności modyfikacji warunków białka lub nienatywnego roztworu.

Plazmoniczne pęsety są podobne do konwencjonalnych pincet optycznych, w tym sensie, że wykorzystują światło do zatrzymywania materii. Plazmoniczne pęsety wykorzystują jednak zlokalizowany powierzchniowy rezonans plazmoniczny (LSPR) do wzmocnienia pola elektrycznego o kilka rzędów wielkości, aby wygenerować siłę gradientu wystarczająco silną, aby uwięzić pojedyncze nanocząstki²³. Dodatkowo, uwięziona cząstka odgrywa aktywną rolę w zwiększaniu wytrzymałości pułapki, znanej jako samoindukowane pułapkowanie wsteczne (SIBA) dla struktur nanoaperturowych²⁴. To pułapkowanie SIBA pozwala na wychwytywanie małych cząstek o niskiej mocy (tj. miliwatów) o średnicy zaledwie kilku nanometrów, takich jak białka^25,26,27. Uwięzienie pojedynczych cząsteczek białka w obszarze hotspotu powoduje zmianę lokalnego współczynnika załamania światła (_białko n >_{n woda}), zmieniając rozpraszanie światła w oparciu o polaryzowalność cząsteczki, na którą wpływa objętość białka, anizotropia kształtu i indeks załamania światła²⁸. Następnie fotodioda lawinowa (APD) wykrywa te informacje, aby monitorować kolejne zmiany w rozpraszaniu światła. Co więcej, plazmoniczne pęsety umożliwiają monitorowanie uwięzionych białek w czasie rzeczywistym bez znakowania, uwięzi i trudnych warunków roztworu przez długi czas (tj. od minut do godzin)^29, spełniając kryteria idealnej techniki pojedynczej cząsteczki dla białek. Wykorzystując strukturę podwójnej nanodziury (DNH), plazmoniczne nanotpęsety wykazały swoją zdolność do wychwytywania różnych białek i wyjaśniania z nich kluczowych informacji, w tym przejść konformacyjnych²⁹, kinetyka demontażu³⁰, krajobrazy energetyczne³¹, śledzenie dyfuzji³² oraz wiązanie ligandów^33,34. Oprócz struktur DNH, wykazano, że alternatywne geometrie struktur zatrzymują cząstki o małych rozmiarach^35,36. W niniejszym protokole przedstawiono podstawowe kroki konfiguracji i uruchomienia plazmonicznej pęsety ze zintegrowanym systemem mikroprzepływowym. Mamy nadzieję, że ten protokół przyczyni się do zwiększenia dostępności i zrozumienia plazmonicznej pęsety dla badaczy, szczególnie tych zajmujących się biologią strukturalną i biofizyką.

Protocol

UWAGA: Proszę przeczytać wszystkie odpowiednie karty charakterystyki (SDS) dla wszystkich używanych chemikaliów i przestrzegać wszystkich odpowiednich praktyk bezpieczeństwa, a także nosić środki ochrony osobistej (okulary ochronne lasera, fartuchy laboratoryjne, rękawice) zgodnie z wymaganiami.

1. Budowa konfiguracji plazmonicznej pęsety

UWAGA: Konfiguracja optyczna jest oparta na zestawie Modular Optical Tweezers System (OTKB) wykorzystującym inny laser i APD (patrz Tabela Materiałów). Używaj wyłącznie sprzętu optycznego na odpowiednim stole optycznym, aby zmniejszyć wpływ wibracji zewnętrznych na system. Laser w zestawie miał długość fali 976 nm, ale szczytowa długość fali rezonansowej dla rezonansu klinowego struktur DNH wynosi około 740-760 nm³³. Wybraliśmy laser NIR (852 nm), ponieważ jest on bliski piku rezonansowego, indukuje LSPR, a także ma lepszą wydajność wykrywania przez APD na bazie krzemu. Lasery o dłuższych długościach fal ²⁰ lub krótszych¹⁸ długości fal zostały użyte do wychwytywania biomolekuł.

1. Ustaw laser w uchwycie lasera fotodiodowego i wprowadź go do kolimatora, który prowadzi do skolimowanej wiązki laserowej o szerokości 1,7 mm dla naszej konfiguracji.
2. Dodaj płytkę półfalową do ścieżki światła, aby dostosować polaryzację. Wyreguluj za pomocą polaryzatora Glan-Taylor, aby upewnić się, że polaryzacja pionowa (polaryzacja S) ma najwyższe natężenie światła.
   UWAGA: Użycie prawidłowej polaryzacji jest niezbędne, aby zapewnić maksymalne wzmocnienie pola elektrycznego ze struktur DNH, ponieważ są one zależne od polaryzacji.
3. Skoncentruj światło przez konfigurację ekspandera wiązki składającą się z soczewki płasko-wklęsłej (f = -50 mm), a następnie soczewki płasko-wypukłej (f = 150 mm), aby zwiększyć szerokość wiązki do około 5 mm, aby wypełnić pełny tylny otwór dolnego obiektywu.
4. Użyj lustra dichroicznego (krótkie przejście 805 nm), aby odbić laser w żądane miejsce. Skonfiguruj kamerę (CCD) za nim.
5. Przekieruj światło na dolny obiektyw (100x/1.25 NA) i ustaw górny obiektyw (4x/0.1 NA) na odległość konfokalną, aby zebrać przechodzące światło.
6. Dodaj kolejne zwierciadło dichroiczne (krótkie przepustowe 805 nm), aby odbić światło laserowe w kierunku APD przez płasko-wypukłą soczewkę umieszczoną na jej ogniskowej, aby skupić światło w APD. Dodaj źródło światła białego (WLS) za lustrem dichroicznym, aby mogło przejść z powrotem przez konfigurację i dotrzeć do kamery. Rysunek 1 pokazuje schemat w pełni zmontowanej plazmonicznej pęsety.

Rysunek 1: Konfiguracja plazmonicznej pęsety. Schemat przedstawia pełną ścieżkę optyczną konfiguracji plazmonicznej pęsety. Wiązka laserowa o długości fali 852 nm (czerwona) przechodzi przez kolimator i płytkę półfalową, a następnie jest rozszerzana przez ekspander wiązki (BE) do ~5,1 mm. Następnie jest on ustawiany na próbce za pomocą obiektywu 100x. Transmitowane światło laserowe jest zbierane przez obiektyw 4x i rejestrowane przez APD z częstotliwością próbkowania 1 MHz. Białe światło z WLS (żółte) przechodzi przez obiektyw 4x, próbkę i obiektyw 100x przed dotarciem do CCD, co zapewnia jasny obraz próbki w polu. Obszary, w których przecinają się obie ścieżki światła, są oznaczone kolorem pomarańczowym. Zdjęcie SEM DNH wykonane pod kątem 20°. Skróty: BE = ekspander wiązki, CCD = urządzenie sprzężone z ładunkiem, DM = zwierciadło dichroiczne, HWP = płyta półfalowa, M = lustro srebrne i WLS = źródło światła białego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Wytwarzanie struktur DNH

1. Umieść 5 nm Ti, a następnie 100 nm Au na płytce ze stopionej krzemionki o grubości 550 μm, używając odparowania wiązką elektronów, jak opisano wcześniej^29,33. Wafel pokroić w kostkę na próbki o wymiarach 1 cm x 1 cm gotowe do użycia.
   UWAGA: Wybrano parowanie wiązką elektronów, ponieważ wytwarza ono warstwę złota o niskiej chropowatości powierzchni, tworząc wysokiej jakości struktury DNH o wysokiej skuteczności zatrzymywania³⁷.
2. Weź czystą próbkę złotej folii i zamontuj ją w zestawie wiązki jonów skupionej pod skaningowym mikroskopem elektronowym (SEM-FIB) w temperaturze pokojowej przy użyciu źródła jonów galu.
3. Upewnij się, że nanoapertury FIB są wyrównane z SEM, aby wytworzyć DNH w dokładnych pozycjach.
4. Utwórz pole znacznika za pomocą wiązki jonów o wysokim natężeniu prądu (np. 100 pA). Znacznik ten będzie służył jako przewodnik referencyjny do zlokalizowania pozycji struktur DNH w konfiguracji optycznej.
5. Aby utworzyć strukturę DNH, dwa okręgi o odległości od środka do środka 200 nm i średnicy 160 nm są połączone prostokątem (3 nm x 40 nm). W przypadku wielkości szczeliny około 20-30 nm, wytrawianie krąży ze współczynnikiem dawki 0,09, podczas gdy dawka prostokątna wynosi od 0,300 do 0,350 przy użyciu energii sondy 30 kV i prądu wiązki 1 pA.
   UWAGA: Zastosowany SEM-FIB ma rozdzielczość 3 nm przy tej energii sondy, co pozwala na niezawodne wytwarzanie DNH z przerwami o rozmiarach 20-30 nm. Nie używalibyśmy niższej rozdzielczości, ponieważ spowoduje to większe rozmiary przerw, zmniejszając skuteczność wychwytywania DNH. Jeśli FIB jest niewykonalny, alternatywną metodą wytwarzania struktur DNH jest użycie litografii nanosfery polistyrenowej³⁸. Ze względu na wysoką precyzję wymaganą do wytwarzania struktur DNH, ta sama receptura może nie wytwarzać tego samego rozmiaru szczeliny między zastosowaniami SEM-FIB. Zmienić dawkę i wysokość prostokąta (0,280–0,350 dawki i wysokość od 2 do 4 nm) i zmierzyć wielkość przerwy, dążąc do około 20 nm.

3. Powlekanie próbek DNH

1. Użyj pojemnika odpornego na rozpuszczalniki, takiego jak naczynie krystalizujące wykonane ze szkła borokrzemianowego 3.3 i dodaj 20 ml etanolu.
   UWAGA: Etanol jest wysoce łatwopalny i drażniący. Używać tylko w dygestorium. Przechowywać w chłodnym, dobrze wentylowanym miejscu. Uchwyt w rękawiczkach i fartuchu laboratoryjnym.
2. Odważyć 32 mg tiolu eteru metylowego poli(glikolu etylenowego) (PEG-tiol; średnia masa cząsteczkowa 800 g/mol) i wymieszać z etanolem, upewniając się, że cały PEG-tiol rozpuścił się, tworząc roztwór o stężeniu około 2 mM, aby zmaksymalizować gęstość monowarstwy³⁹.
   UWAGA: PEG-tiol jest substancją drażniącą; obchodź się z nim przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej.
3. Dodaj chipy próbki zawierające nanostruktury do mieszaniny za pomocą prostej pęsety, przykryj i inkubuj przez noc (~16 godzin) w temperaturze pokojowej, aby PEG-tiol utworzył samoorganizującą się monowarstwę na powierzchni złota.
4. Po inkubacji przepłukać próbki, przytrzymując je prostą pęsetą nad odpowiednim pojemnikiem w dygestorium. Użyj butelki ze spryskiwaczem, aby dokładnie spryskać etanol z każdej strony. Całkowicie wysuszyć za pomocą pistoletu pneumatycznego przed późniejszym przechowywaniem lub montażem w plazmonicznym pęsetie.
   UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C, aby wydłużyć ich żywotność, ponieważ z czasem mogą ulec degradacji.

4. Montaż próbki pokrytej PEG w komorze przepływowej

1. Umieść pokrytą próbkę w wydrukowanej w 3D komórce przepływowej (wydrukowanej przez drukarkę Form 2 z przezroczystą żywicą V4) za pomocą prostej pęsety ze złotą warstwą skierowaną do góry (patrz rysunek uzupełniający 1, aby zapoznać się z kluczowymi parametrami i wartościami w naszym projekcie komory przepływowej).
2. Odklej jedną stronę przezroczystej plastikowej osłony dwustronnej taśmy PET za pomocą prostej pęsety i umieść ją na próbce i komorze przepływowej, upewniając się, że nanostruktury i otwory wlotowe/wylotowe w komorze przepływowej pozostają odkryte. Delikatnie dociśnij krawędzie taśmy zaokrągloną pęsetą, aby upewnić się, że prawidłowo przylega do komory przepływowej i próbki.
3. Odklej drugą stronę taśmy i delikatnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe (grubość 0,17 mm) na próbce za pomocą zaokrąglonej pęsety. Delikatnie dociśnij krawędzie szkiełka nakrywkowego zaokrągloną pęsetą, aby upewnić się, że prawidłowo przylega. W ten sposób powstaje kanał cieczowy (wysokość = 50 μm, objętość = 3,5 μl) w komorze przepływowej.
   UWAGA: Nie należy dociskać szkiełka nakrywkowego do miejsca, w którym znajdują się nanostruktury, ponieważ mogą one ulec uszkodzeniu. Jeśli szkiełko nakrywkowe jest brudne, przed montażem umyj je etanolem i osusz pistoletem pneumatycznym.
4. Wymieszaj równe części A i B powielających roztworów silikonu w stosunku 1:1 (lub zgodnie z instrukcją producenta) na szkiełku mikroskopowym za pomocą małej końcówki do pipety.
5. Wypełnij szczeliny między szkiełkiem nakrywkowym a komorą przepływową zmieszanym silikonem powielającym, delikatnie wciskając go pod szkiełko nakrywkowe. Przytrzymaj kuwetę przepływową do góry nogami i ostrożnie umieść duplikat silikonu wokół wewnętrznej ścianki otworu, zanim użyjesz końcówki pipety, aby delikatnie przesunąć ją na widoczne krawędzie stopionej krzemionki pod spodem próbki (patrz rysunek uzupełniający 2).
6. Pozostaw do wyschnięcia ze złotą warstwą skierowaną do góry, aż powielający się silikon całkowicie stwardnieje, zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Należy uważać, aby silikon nie pokrył nanostruktur po nałożeniu na spód próbki. Należy uważać, aby nie wciskać duplikującego silikonu pod szkiełko nakrywkowe, ponieważ może on dostać się do otworów wlotowych/wylotowych komory przepływowej lub nanostruktur, co może być trudne do wyczyszczenia (rysunek uzupełniający 3).

5. Podłączanie systemu mikroprzepływowego

UWAGA: Upewnij się, że system ma czyste przewody. W tym przypadku rurki PTFE o małej średnicy: średnica wewnętrzna 0,18 mm i rurki PTFE o średnicy wewnętrznej o dużej średnicy: 0,8 mm, ale będą działać inne wartości ID.

1. Ustaw pompę strzykawkową i podłącz ją do 3/2-drogowego zaworu elektromagnetycznego za pomocą dużej rurki PTFE. Podłączyć jeden port zaworu do pojemnika buforowego, a drugi do cewki podtrzymującej o objętości około 1 ml, wykonanej z dużej rurki wewnętrznej, aby zapobiec cofaniu się do strzykawki.
   UWAGA: Zawór 3/2 może być sterowany za pomocą sterownika zaworu, który określa, czy roztwór jest podawany/pobierany z pojemnika buforowego, czy z cewki podtrzymującej.
2. Podłącz cewkę podtrzymującą do środkowego zaworu obrotowego dwukierunkowego zaworu mikroprzepływowego 12/1. Podłącz pojemniki do roztworów, używając małych rurek ID dla rzadkich lub cennych próbek i dużych rurek ID dla pozostałych. Używać jednego zaworu tylko do zaparzania do pojemnika na odpady, a drugiego tylko do wlewu do komory przepływowej; użyj małego rurki ID do zaworu infuzyjnego komory przepływowej.
3. Podłącz duże rurki o średnicy wewnętrznej od wyjścia komory przepływowej do pojemnika na odpady. Rysunek 2 przedstawia schemat w pełni połączonego systemu mikroprzepływowego.
   UWAGA: Rurki PTFE o małej średnicy wewnętrznej są preferowane do wlotu komory przepływowej i do zaworów, które będą używane do infuzji białek ze względu na mniejszą objętość, w której próbka pozostanie w przewodach. Rurki PTFE o dużej średnicy wewnętrznej są preferowane w przypadku tańszych lub bardziej obfitych materiałów, takich jak. Staraj się używać minimalnej ilości przewodów, aby jeszcze bardziej zmniejszyć tę martwą objętość.

Rysunek 2: System mikroprzepływowy. Schemat przedstawia układ mikroprzepływowy. Pompa strzykawkowa zaparza lub pobiera roztwory przez jeden port zaworu 3/2-drogowego, pojemnik z roztworem lub cewkę podtrzymującą. Roztwory podłączone do zaworu 12/1 zawsze przechodzą przez cewkę podtrzymującą po wyjęciu, a następnie mogą być podawane przez żądany kanał. Wlew do kanału wlotowego podłączonego do komory przepływowej spowoduje wypchnięcie roztworu z komory przepływowej do pojemnika na odpady. Grube i cienkie rurki reprezentują duże i małe rurki ID z protokołu. Czarne zaślepki na zaworze 12/1 reprezentują uszczelnione kanały. Kierunki przepływu są oznaczone czarnymi strzałkami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Przygotowanie systemu mikroprzepływowego

1. Załaduj interfejs użytkownika systemu mikrofluidyki na komputerze i sprawdź, czy komponenty są prawidłowo podłączone. Wybierz ikonę odtwarzania obok przewodu i dystrybutora, aby otworzyć odpowiedni interfejs użytkownika. Aby ominąć zawór 3/2-drogowy, przekręć port 1 na przewodzie.
2. Upewnij się, że zawory, które będą używane w systemie, zostały oczyszczone przez wlew izopropanolu (IPA), a następnie wielokrotnie umyj rurki wybranym buforem () lub wodą destylowaną w celu usunięcia powietrza i IPA z systemu. Infuzję można wykonać, wybierając żądany zawór na interfejsie użytkownika dystrybutora i uruchamiając pompę strzykawkową, wybierając zaparzanie/pobieranie oraz wybierając żądaną objętość i natężenie przepływu (np. 0,5 ml objętości i 0,2 ml/min natężenie przepływu).
   UWAGA: Nie wlewaj IPA do komórek przepływowych, ponieważ spowoduje to degradację ogniwa i kleju, co może prowadzić do wycieków.

7. Montaż komory przepływowej w plazmonicznym pęsetie i sprawdzanie szczelności

1. Przymocuj rurki wlotowe i wylotowe do odpowiedniej części komory przepływowej przed umieszczeniem ich na czystej chusteczce ze złotą warstwą skierowaną do góry.
2. Wlej bufor do komory przepływowej o wysokim natężeniu przepływu (~0,3 ml/min) i sprawdź, czy płyn przemieszcza się po próbce w komorze przepływowej i czy nie widać płynu na zewnątrz lub na spodzie komory przepływowej. Można stosować wyższe natężenia przepływu, pod warunkiem, że nie dojdzie do wycieku. Jeśli próbka przecieka, odmontuj ją i zamontuj ponownie.
3. Dodaj 1-2 krople olejku immersyjnego na obiektyw 100x przed umieszczeniem komórki przepływowej w plazmonicznym stoliku pęsety ze złotą warstwą skierowaną w dół. Umieść metalowe klipsy na magnesach komory przepływowej i zablokuj scenę, aby utrzymać ją na miejscu.
   UWAGA: Obiektywny olej jest drażniący, stanowi zagrożenie dla zdrowia i jest toksyczny dla organizmów wodnych, należy obchodzić się z nim wyłącznie w rękawiczkach.

8. Lokalizowanie nanostruktur na próbce

1. Włącz źródło białego światła. Otwórz oprogramowanie aparatu i zwiększ wzmocnienie i czas naświetlania, aż nanostruktury będą widoczne. Włącz laser ze stosunkowo dużą mocą lasera i ręcznie wyreguluj oś z, aż plamka lasera będzie widoczna. Priorytetem jest wydłużenie czasu ekspozycji i zysku, a nie zwiększanie mocy lasera, aby znaleźć plamkę lasera.
   UWAGA: Lasery stanowią poważne potencjalne zagrożenie dla użytkowników. Upewnij się, że używane są odpowiednie środki ochrony osobistej, takie jak laserowe okulary ochronne o wystarczającej gęstości optycznej w wymaganym zakresie długości fal.
2. Włącz sterownik piezoelektryczny i wybierz odpowiednie ustawienia dla portu COM i maksymalnego napięcia. Ustaw wartości osi x, y i z na połowę maksymalnego napięcia, aby umożliwić dobry zakres ustawienia stolika we wszystkich kierunkach.
   UWAGA: Port COM sterownika piezoelektrycznego można znaleźć i zmienić w menedżerze urządzeń w zakładce porty.
3. Przesuń plamkę lasera do nałożenia na jeden z DNH za pomocą pokręteł osi x, y i z głównego stopnia. Upewnij się, że APD jest włączony, a następnie delikatnie zamknij obudowę do plazmonicznej pęsety.
   UWAGA: Użycie narzędzia do znakowania w oprogramowaniu aparatu, jeśli jest dostępne, pomoże przesunąć plamkę lasera nad nanostrukturą. Ustaw marker na środku plamki lasera i wyłącz laser, ale pozostaw włączone źródło białego światła, aby umożliwić łatwiejsze wyrównanie z nanostrukturą. APD może być przesycony i uszkodzony, jeśli dotrze do niego zbyt dużo światła laserowego. Upewnij się, że próbka znajduje się na drodze ścieżki lasera i stopniowo zwiększaj moc lasera, aby upewnić się, że nasycenie nie zostanie osiągnięte. Filtry o neutralnej gęstości (ND) można umieścić przed APD, aby w razie potrzeby zredukować docierające do niego światło.

9. Optymalne dopasowanie lasera do pożądanej nanostruktury

1. Otwórz oprogramowanie powiązane z nagraniem APD, takie jak domowy interfejs użytkownika Labview, i ustaw częstotliwość odcięcia na 1 kHz. Nazwij i ustaw żądaną ścieżkę pliku oraz format nazewnictwa plików, które zostaną zapisane.
2. Wyłącz źródło białego światła i ponownie włącz laser. Ustaw odpowiednią moc lasera (np. ~20 mW) i użyj piezoelektrycznych elementów sterujących, aby wyregulować osie x, y i z, aż sygnał APD będzie tak wysoki, jak to możliwe, unikając nasycenia APD i przy minimalnym odchyleniu standardowym (S.D.) śladu.
   UWAGA: APD będzie prawdopodobnie miał optymalny zakres czułości dla transmisji (patrz instrukcja produktu), który jest idealny do pozostawania, np. 1000-2000 mV. Filtry ND mogą być używane do utrzymywania transmisji w okolicach tego zakresu. Główną kwestią jest to, aby transmisja nie znajdowała się blisko punktu nasycenia APD, ponieważ pułapkowanie może zwiększyć transmisję do limitu nasycenia, prowadząc do utraty danych.

10. Wprowadzanie białek do komórki przepływowej

1. Wyłącz laser, aby zachować żywotność nanostruktur i uruchom jednostkę sterującą pompy strzykawkowej oraz interfejs użytkownika dystrybutora, aby ustawić zawór i pobrać żądaną ilość białka (np. 30 μL). W przypadku pobierania za pomocą rurki o małej średnicy wewnętrznej, niższe natężenie przepływu pomaga zapewnić pobranie wszystkich roztworów (~0,01 - 0,1 ml / min). W razie potrzeby można zastosować wyższe natężenia przepływu, aby skrócić czas oczekiwania.
   UWAGA: Optymalna objętość białka do użycia zależy od tego, jak wartościowe jest białko i co eksperyment ma nadzieję osiągnąć. Typowe stężenie białka, którego używamy, wynosi 1 μM, a podwielokrotna objętość to 100 μL. Jeśli próbka białka jest obfita, można zastosować wyższe stężenia, aby skrócić średni czas odłowu. Jeśli jednak stężenia są zbyt wysokie, wzrośnie ryzyko uwięzienia dwóch takich samych białek w nanostrukturze. Jeśli eksperyment wymaga infuzji innego liganda/białka po wyłapaniu początkowego białka, preferowana może być mniejsza porcja objętości, aby zminimalizować straty i czas potrzebny do zaparzenia następnego roztworu. Upewnij się, że rurki pozostają zanurzone w roztworze, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do systemu. Należy zachować szczególną ostrożność w przypadku porcji białka, jeśli rurka nie sięga dna pojemnika lub roztwór jest nadmiernie pobrany.
2. Korzystając z interfejsu użytkownika mikrofluidyki, wlej roztwór białkowy z podobną szybkością przepływu do szybkości pobierania (~0,01 - 0,1 ml/min). Pozostawić do infuzji z tą szybkością, aż roztwór białka dotrze do komory przepływowej, a następnie zmniejszyć szybkość przepływu do ≤0,001 ml/min. Sprawdź objętość i czas na pompie strzykawkowej, aby upewnić się, że są zgodne z oczekiwaną objętością (np. 1 minuta dla 1 ml objętości przy 1 ml/min).
   UWAGA: Wymaganą do tego objętość można obliczyć na podstawie objętości rurki od układu mikroprzepływowego do komory przepływowej. Jeśli długość i średnica rurki są znane, można skorzystać z kalkulatora online objętości butli. Szybkość infuzji można dostosować zgodnie z potrzebami, np. >0,001 ml/min w przypadku infuzji białkowej, aby skrócić średni czas oczekiwania na pułapkę. Zaleca się jednak ostrożność, ponieważ jeśli natężenie przepływu jest zbyt wysokie, może to zapobiec przedostawaniu się białek do nanostruktury.

11. Zbieranie danych

1. Podczas gdy roztwór białka jest podawany do komory przepływowej, rozpocznij rejestrację danych sygnału APD. W razie potrzeby dostosuj osie x, y i z, korzystając z interfejsu użytkownika kontrolera piezoelektrycznego, ponieważ system prawdopodobnie będzie z czasem dryfował. Idealne ślady zalewkowania mają spójny ogólny wzorzec zgodny ze śladem w Rysunek 3.
2. Po zaobserwowaniu dużej zmiany w transmisji i S.D., podobnej do przykładowego śladu pułapki, zanotuj czas, w którym to nastąpi dla przyszłego sortowania danych (Zobacz Rysunek 4B na przykład).
   UWAGA: Dryfowanie w systemie może prowadzić do zmian w transmisji i wzrostu S.D., czasami dość nagle, co można pomylić z pułapką białkową. Upewnij się, że skok sygnału wyświetla ten sam wzór, co wzorcowa pułapka i że w momencie skoku nie występowały żadne zakłócenia zewnętrzne, takie jak dryf wyrównania lub głośne dźwięki wychwytywane przez system.
3. Jeśli białko musi zostać uwolnione w ramach eksperymentu, wyłącz laser na ~5 s i włącz go ponownie. Ślad powinien charakteryzować się dużą zmianą w transmisji i znacznie niższym S.D., co wskazuje na powrót do stanu wyjściowego.
   UWAGA: Jeśli nie zaobserwuje się dużej zmiany w transmisji i/lub S.D. lub zaobserwuje się podobny ślad uwięzionego białka, białko prawdopodobnie przyklei się do powierzchni próbki (patrz Rysunek 5B, na przykład).

12. Odmontowywanie próbki

1. Po wykonaniu żądanego eksperymentu wyłącz laser, wyjmij komórkę przepływową ze stolika 3-osiowego i odłącz rurkę układu mikroprzepływowego.
2. Umieść kuwetę przepływową na czystej tkance złotą warstwą próbki skierowaną do góry. Za pomocą skalpela ostrożnie odetnij klej pod szklanym szkiełkiem nakrywkowym i delikatnie zdejmij go zaokrągloną pęsetą. Wyrzuć go do wyznaczonego pojemnika na potłuczone szkło.
   UWAGA: Potłuczone szkło i użycie ostrych przedmiotów może spowodować obrażenia. Upewnij się, że noszone są okulary ochronne, rękawice i fartuch laboratoryjny.
3. Przytrzymaj kuwetę przepływową pod kątem, tak aby złota warstwa była nadal skierowana do góry i użyj zaokrąglonej pęsety, aby ostrożnie usunąć klej ze spodu komory przepływowej, aby uwolnić próbkę. Powielanie silikonu pozwala na łatwe usunięcie bez uszkadzania struktur DNH.
4. Za pomocą prostej pęsety podnieś próbkę i dokładnie spłucz IPA, a następnie wodą przed wysuszeniem za pomocą pistoletu pneumatycznego. W przypadku wielokrotnego użytku próbkę należy przechowywać w odpowiednim pojemniku warstwą złota skierowaną do góry.
   UWAGA: Próbki mają zazwyczaj użyteczny okres użytkowania około 1-2 tygodni, jeśli są odpowiednio traktowane, chociaż rozmiar nanostruktur zmienia się w czasie. W przypadku nadmiernego uszkodzenia zmień na nową próbkę do następnego eksperymentu. Uszkodzenia mogą mieć formę zadrapań obecnych na powierzchni złota w pobliżu nanostruktur lub słabej wydajności eksperymentalnej, co wskazuje na degradację nanostruktur²⁹.

13. Przygotowanie systemu do wykorzystania w przyszłości

1. Użyj złożonej chusteczki do soczewek, aby zetrzeć olej z obiektywu w jednym kierunku, podnosząc go i powtarzając z inną czystą częścią chusteczki.
   UWAGA: Obiektywy są podatne na rozmazywanie i zadrapania, co może znacznie pogorszyć wydajność. Podczas czyszczenia zawsze noś rękawiczki i unikaj dotykania materiałów organicznych. Używaj tylko nowej chusteczki do czyszczenia soczewek, aby zapobiec zanieczyszczeniu i czyść w jednym kierunku jednym ruchem. Unikaj pocierania soczewki i czyszczenia chusteczki tam iz powrotem, aby zminimalizować uszkodzenia. Jeśli czyszczenie na sucho jest niewystarczające, nałóż niewielką ilość etanolu na chusteczkę, zetrzyj olej, jak wspomniano wcześniej, i zakończ suchą chusteczką.
2. Jeśli te same roztwory białkowe/buforowe zostaną użyte jako następne, wymiana rurki może nie być konieczna. Jeśli używane są różne roztwory, wymień rurkę, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia poprzednimi roztworami.
   UWAGA: Nie używaj tej samej rurki dłużej niż 1 tydzień, nawet jeśli wykonujesz eksperymenty z tymi samymi roztworami, ponieważ z czasem się zabrudzi.

Results

Po pozyskaniu danych, analiza danych może być przeprowadzona na surowych danych za pomocą kodu MATLAB, aby wygenerować ślady z surowych danych zebranych przez APD. Rysunek 3 przedstawia przykładowy ślad pułapki, w tym linię bazową przed uwięzieniem, zdarzenie pułapki, gdzie obserwuje się dużą zmianę transmisji (ΔT/T₀) i odchylenie standardowe, zanim laser zostanie wyłączony na około 5 sekund przed ponownym włączeniem. Znaczne zmniejszenie odchylenia standardowego i powrót transmisji do poziomów podobnych do wartości wyjściowych wskazuje na uwalnianie białka. Dryf liniowy jest usuwany ze śladu za pomocą funkcji MATLAB detrend.m, a następnie średnia wartość danych jest dodawana z powrotem do śladu detrendowanego. Od czasu do czasu musimy zdetrendować ścieżkę, ponieważ konfiguracja dryfuje w czasie, powodując liniowy spadek transmisji (zobacz szary ślad w Rysunek 3). Niewielkie zmiany w śladach linii bazowej przed i po odłowie wynikają z etapowej korekty w celu optymalizacji linii bazowej przy minimalnym odchyleniu standardowym, co pokazano w Rysunek 4A. Czasami cząsteczki białka są widoczne w śladzie bez zatrzymywania, co nazywa się białkami przechodzącymi. Przepływające białka wyglądają jak gwałtowna zmiana w transmisji, podobna do typowej pułapki (Figura 4B), ale o znacznie krótszym czasie trwania, jak pokazano w Figura 4A. Gęstość widmowa mocy (PSD) przedstawia kolejną analizę w celu potwierdzenia pułapki białek poprzez zapewnienie siły sygnału przy różnych częstotliwościach. Ruchy konformacyjne białek są zwykle obserwowane w zakresie >1 μs za pomocą metod spektroskopii pojedynczych cząsteczek⁴⁰. Rysunek 4C pokazuje, że w porównaniu z wartością bazową, uwięzienie białka prowadzi do wyższej siły sygnału, przynajmniej w zakresie 10 kHz (> 100 μs). Podkreśla to również znaczenie dostosowania etapu do zoptymalizowanej linii bazowej, ponieważ zła linia bazowa może zwiększyć szum przy częstotliwościach od 50 do 500 Hz, czyli w zakresie częstotliwości nałożonym na ruchy konformacyjne białek.

Rysunek 3: Pełny ślad pułapki dla pojedynczego białka. Reprezentatywny ślad dla pełnej pułapki, w tym linia podstawowa, wychwytywanie białka i uwalnianie białka. Przeskoki śladu przed i po zalewkowaniu są spowodowane wyrównaniem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Typowe zdarzenia śledzenia. (A) Przykłady wyrównania od złej do dobrej linii bazowej i białka przechodzącego w pobliżu punktu zapalnego. (B) Ślad odłowu przedstawiający proces od linii podstawowej, gdy punkt aktywny DNH jest pusty, do momentu, gdy białko jest uwięzione. (C) Wykres gęstości widmowej mocy (PSD) między dobrymi i złymi liniami bazowymi przedstawionymi w (A) a białkiem uwięzionym w (B). Wyższe wartości PSD wskazują na większy szum przy określonych częstotliwościach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Większość zdarzeń pułapkowania przebiega według tego samego ogólnego schematu, co ślad w Rysunek 3, chociaż podczas eksperymentów mogą wystąpić sporadyczne problemy. W przypadku większości eksperymentów białko powinno być uwalniane ręcznie poprzez wyłączenie lasera po zakończeniu pożądanego eksperymentu. Jednak w niektórych przypadkach białko może opuścić pułapkę bez interwencji, jak pokazano na Rysunek 5A. I odwrotnie, czasami białka mogą pozostać w miejscu pułapki nawet po wyłączeniu lasera, prawdopodobnie z powodu przyklejania się białka do próbki. To przyklejanie się powoduje głośny ślad po wyłączeniu i włączeniu lasera (patrz Rysunek 5B). Prawdopodobieństwo takiego wystąpienia zależy od białka, ponieważ niektóre białka są bardziej podatne na adsorpcję powierzchniową^41,42. Zastosowanie powłoki, takiej jak PEG-tiol, może zmniejszyć ryzyko przywierania białek^39,43. O ile nie jest to pożądane, na przykład w przypadku badania interakcji białko-białko, innym problemem jest podwójne pułapkowanie, w którym drugie białko jest uwięzione po pierwszej pułapce. Charakteryzuje się to kolejnym gwałtownym wzrostem transmisji, podobnym do pierwszej pułapki, oraz zmianą odchylenia standardowego (patrz Rysunek 5C).

Rysunek 5: Przykłady niepożądanych zdarzeń pułapkowania. (A) Niezamierzone uwolnienie białka z hotspotu DNH. (B) Przykład utknięcia białka na powierzchni próbki w gorącym punkcie DNH. (C) Skok śladowy następuje, gdy drugie białko zostaje uwięzione, podczas gdy pierwsze nadal pozostaje w gorącym punkcie DNH. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Reprezentatywny eksperyment przeprowadzony na obciążeniu in situ żelaza do cząsteczki apo-ferrytyny demonstruje użycie plazmonicznej pęsety jako narzędzia do badania dynamiki konformacji białek²⁹. Ferrytyna jest białkiem nośnikowym żelaza, które występuje w dwóch stanach: apo-ferrytyna, która nie zawiera żelaza, i holo-ferrytyna, która jest wypełniona żelazem^44,45. Żelazo żelaziste dostaje się do białka przez 3-krotne kanały, gdzie jest utleniane do żelaza żelazowego i przechowywane w białkowym rdzeniu⁴⁶. Rysunek 6A przedstawia typowy ślad pułapki apo-ferrytyny z roztworem żelaza podawanym przez ponad 20 minut, podczas gdy białko jest uwięzione. Ślady 20 s pobrane wzdłuż całego śladu w punktach b-e dają wgląd w zmiany zachodzące w białku w czasie. W Rysunek 6B, apo-ferrytyna jest uwięziona w standardowym buforze PBS i nie obserwuje się żadnych znaczących zmian w śladzie. Rysunek 6C, D pokazują fluktuacje w S.D śladów, które są spowodowane ładowaniem żelaza do białka przez jego 3-krotne kanały, co skutkuje bardziej dynamicznym stanem (apo-), w którym kanały są otwarte, i bardziej zwartym stanem (holo-) z zamkniętymi kanałami. Po wypełnieniu cząsteczki ferrytyny żelazem, przeszła ona do swojej holoformy, co spowodowało stabilny ślad pułapki, jak pokazano na Rysunek 6E. Funkcje gęstości prawdopodobieństwa (PDF) na rysunkach 6B-E dodatkowo pokazują zmiany, jakim ulega białko pod wpływem różnych warunków roztworu w czasie.

Rysunek 6: Ładowanie żelaza in situ do uwięzionej apoferrytyny. (A) Pełny ślad transmisyjny DNH z uwięzioną cząsteczką apoferrytyny, a następnie wstrzyknięcie roztworu żelaza do miejsca wychwytywania w celu zaobserwowania zmian konformacyjnych ferrytyny związanych z obciążeniem żelazem. (B) 20-sekundowy ślad wychwytywania apoferrytyny uwięzionej przed osiągnięciem gorącego roztworu żelaza. (C, D) Ślady wychwytywania 20-s po wystawieniu cząsteczki apoferrytyny na działanie roztworu żelaza. Niebieskie i fioletowe segmenty oznaczają wyższy i dolny S.D śladu, wskazując odpowiednio na elastyczne i sztywne konformacje ferrytyny. (E) 20-sekundowy ślad wychwytywania po wystawieniu apoferrytyny na działanie roztworu żelaza przez >20 minut. Wykresy funkcji gęstości prawdopodobieństwa (PDF) po prawej stronie pokazują rozkład transmisji i są oznaczone kolorami dla segmentów niebieskiego i fioletowego. Ten rysunek został zmodyfikowany z²⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Próbka złota DNH zamontowana na drukowanej w 3D komorze przepływowej. Próbkę umieszcza się w specjalnej szczelinie i przykleja do komory przepływowej za pomocą dwustronnej taśmy klejącej PET. Kluczowe parametry i związane z nimi pomiary dla naszej konstrukcji komory przepływowej są oznaczone. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Tył komory przepływowej z zamontowaną złotą próbką DNH i opisaną wewnętrzną ścianą. Próbka jest uszczelniana w komorze przepływowej za pomocą powielającego silikonu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Schemat komory przepływowej z zamontowanym złotym DNH z zaznaczonymi otworami wlotowymi i wylotowymi. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Kluczowym krokiem w protokole jest upewnienie się, że komora przepływowa nie przecieka przed umieszczeniem jej w scenie, która powinna być wcześniej przetestowana na zewnątrz uchwytu przy wysokim natężeniu przepływu. Wyciek po zamontowaniu próbki może uszkodzić elementy optyczne, w szczególności dolną soczewkę.

Wyrównanie może z czasem dryfować od optymalnej pozycji podczas eksperymentu, powodując zmienność sygnału ze względu na czułość plazmonicznej pęsety. W takim przypadku należy ponownie wyrównać za pomocą kontrolek piezoelektrycznych do maksymalnej transmisji i minimalnego odchylenia standardowego linii bazowej, ponieważ hałaśliwa linia bazowa obniża jakość danych. Należy zwrócić uwagę na skrupulatne notowanie czasu wyrównywania, aby wyeliminować ryzyko mylenia ingerencji użytkownika w zdarzenie pułapkowania. Jeśli wystąpi poważne dryfowanie, delikatnie wyrównaj stolik, aby zminimalizować ryzyko uwolnienia białka i zanotuj czas regulacji.

Modyfikacje i zmiany w prezentowanej technice mogą być dokonywane w oparciu o konkretne potrzeby eksperymentalne. Na przykład stolik z kontrolowaną temperaturą może pomóc schłodzić/podgrzać próbkę zgodnie z życzeniem, zamiast używać ogrzewania laserowego w celu zwiększenia temperatury^31,33. Inne techniki, na przykład interferometryczna mikroskopia rozpraszania (iSCAT), mogą zapewnić interferencję białka w polu rozpraszania DNH, uzyskując dodatkowy sygnał proporcjonalny do polaryzowalności białka, co jest związane z wielkością cząstek^47,48.

Plazmoniczne pęsety są czysto czasową techniką wykrywania, ponieważ dane są rejestrowane przez APD (detektor jednopikselowy). Technika ta nie dostarcza bezpośrednich informacji na temat zmian strukturalnych białka, takich jak to, które regiony białka są zaangażowane w zmianę konformacyjną lub gdzie ligand lub inne białko może wiązać się z białkiem. Dodatkowo technika ta jest ograniczona do zakresu czasowego >1 μs ze względu na częstotliwość próbkowania karty akwizycji danych (1 MHz). Biorąc pod uwagę częstotliwość Nyquista, gdzie najwyższy możliwy zakres to połowa szybkości akwizycji, w tym przypadku 2 μs w idealnych warunkach.

W tym protokole opisaliśmy proces konfiguracji eksperymentu z plazmoniczną pęsetą w celu uwięzienia pojedynczego białka i monitorowania zmian w jego dynamice konformacyjnej w czasie. Technikę tę można opracować na dowolnym mikroskopie zbudowanym w domu lub komercyjnym. W przeciwieństwie do metod opartych na fluorescencji lub tetheringu, takich jak smFRET i pęseta optyczna, technika ta może wychwytywać białka bez etykiet lub uwięzi i nadal osiągać czułość pojedynczej cząsteczki. Warunki roztworu mogą być zmieniane podczas wychwytywania białka za pomocą systemu mikroprzepływowego, co pozwala na monitorowanie w czasie rzeczywistym wpływu różnych roztworów na białko. Cechy te sprawiają, że plazmoniczne pęsety są obiecującym narzędziem w dziedzinie biofizyki i biodetekcji, szczególnie w przypadku białek, które konwencjonalne techniki mają trudności z zbadaniem w ich rodzimych stanach. Przyszłe zastosowania będą koncentrować się na dekodowaniu dynamiki konformacyjnej bardziej dynamicznych białek, takich jak białka wewnętrznie nieuporządkowane i białka zawierające wewnętrznie nieuporządkowane regiony oraz białka błonowe, których dynamika i równomierna struktura wymykają się obecnym technikom.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Obiektyw (NA = 1,25)	Olympus	PLN100XO	Czysty olej tylko za pomocą chusteczki do czyszczenia soczewek jednym ruchem
12-1 obrotowy dwukierunkowy zawór mikroprzepływowy	Elveflow
3/2-drogowy zawór elektromagnetyczny	Elveflow
4x Obiektyw (NA = 0,1)	Olympus	PLN4XP
Wiatrówka	RS Komponenty	666-6772
Fotodioda lawinowa (APD)	Thorlabs	APD120A/M	Nie przesycić, szerokość pasma 50 MHz, czułość na ładunki elektrostatyczne
Dioda laserowa	Butterfly Thorlabs	FPL852S
Urządzenie sprzężone z ładunkiem (kamera)	Hikrobot	MV-CE200-10UC
Naczynie krystalizujące	VWR	216-0065
Karta akwizycji danych	Instrumenty krajowe	USB-6361	Częstotliwość próbkowania 2 MHz
Taśma dwustronna	Adhesive Research Inc	ARcare92712	Wytnij odpowiedni kształt dla komórki przepływowej za pomocą wycinarki laserowej
Tylko okap	etanol
Kolimator Fibreport	Thorlabs	PAF2-A7B
Szkiełka nakrywkowe do mikroskopu szklanego (grubość 0,17 mm)
Płytka półfalowa	Thorlabs	AHWP10M-980
Ideal-tek 120 mm, stal nierdzewna, pęseta prosta	RS Components	282-7472	Do trzymania próbki i odklejania taśmy dwustronnej
Isopropanol (IPA)			Tylko okap wyciągowy, używaj rękawiczek
Chusteczka do czyszczenia soczewek	Thorlabs	MC-5
Metrosil szybko powielające się części silikonowe A i B	Metrodent	MSILR/1
Szkiełka mikroskopowe (75 mm x 26 mm)
Modułowy system pęset optycznych	Thorlabs	OTKB/M-CUSTOM
Olej do obiektywów	Olympus		Używaj rękawiczek, przechowuj między 2oC-8oC
Montaż lasera fotodiodowego	Thorlabs	CLD1015
Sterownik piezoelektryczny	Thorlabs
Stolik piezoelektryczny	Thorlabs	Nanomax 300
Soczewka planowklęsła (f = -50 mm)	Soczewka płaskowypukła Thorlabs	LC1715-B
(f = 150 mm)	Thorlabs	LA1433-B
Soczewka płaskowypukła (f = 60 mm)	Thorlabs	LA1134-B
Poli(glikol etylenowy) metylowy tiol (PEG-tiol) 800 MW	Sigma Aldrich	729108	Przechowywać między 2oC-8oC
rurka PTFE (ID: 0,18 mm)	Vici Jour	JR-T-6805-M25
Rurka PTFE (ID: 0,8 mm)	Cole-Parmer	WZ-21942-72
SEM-FIB	Belka poprzeczna Zeiss	550	Źródło jonów galu
Krótki przepust lustro dichroiczne 805 nm	Thorlabs	DMSP805
Srebrne lustro	Thorlabs	PF-10-03-P01
Pompa strzykawkowa	Aparat Harvard	70-4511
Weller Erem 120 mm pęseta płaska, zaokrąglona ze stali nierdzewnej	RS Components	176-1150	Do przytrzymywania szkła nakrywkowego i peelingu kleju z komory przepływowej