Opracowanie mysiego modelu łuszczycy za pomocą imikwimodu

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy wysoce skuteczny i stabilny mysi model łuszczycy, który powstał dzięki zastosowaniu imikwimodu. Dodatkowo szczegółowo opisujemy metodologie stosowane do oceny nasilenia łuszczycy.

Streszczenie

Łuszczyca jest powszechną, przewlekłą, nawracającą i zapalną chorobą skóry, charakteryzującą się zgrubiałym naciekiem skóry, łuskami i rumieniem. Patogeneza choroby jest bardzo złożona i obejmuje wzajemne oddziaływanie różnych czynników, takich jak genetyka, odporność i czynniki środowiskowe. Aby zbadać mechanizmy leżące u podstaw łuszczycy, naukowcy opracowali wiele zwierzęcych modeli choroby. Jednak zmienność metodologii stanowi wyzwanie dla konsekwentnego konstruowania tych modeli. W tym badaniu ustaliliśmy i kompleksowo oceniliśmy wysoce wydajny i stabilny model myszy łuszczycy przy użyciu imikwimodu (IMQ). Do ustalenia mysiego modelu łuszczycy wykorzystano 8-tygodniowe samice myszy C57BL / 6J klasy SPF. Po tygodniu aklimatyzacji wykluczono myszy z podrażnioną lub uszkodzoną skórą w depilowanych miejscach. Począwszy od drugiego dnia, 5% krem IMQ (62,5 mg/d) był nakładany codziennie na depilowane okolice szyi i pleców przez siedem kolejnych dni. Podczas eksperymentu prowadzono codzienne pomiary masy ciała, fotografię skóry, scoring skóry oraz obserwacje behawioralne. Po eksperymencie wykonano oznaczenie indeksu śledziony, analizę histologiczną skóry, detekcję cytokin w surowicy i detekcję poziomu mRNA skóry. Wyniki wykazały, że myszy w grupie IMQ rozwinęły typowe objawy podobne do łuszczycy, w tym rumień, łuski i zgrubienie skóry, którym towarzyszyło zwiększone drapanie, utrata masy ciała, podwyższony wskaźnik śledziony i zwiększona grubość skóry. I znaczące zmiany w poziomach TNF-α, IL-23 i IL-17A w surowicy, a także w poziomach mRNA IL-23, IL-17A, IL-17F i IFN-γ w skórze. Poziom cytokin w surowicy (TNF-α, IL-23, IL-17A) i ekspresja mRNA skóry markerów prozapalnych (IL-23, IL-17A, IL-17F, IFN-γ) były znacznie podwyższone. W przeciwieństwie do tego, grupa kontrolna nie wykazywała takich zmian. Optymalizując czas trwania indukcji IMQ i standaryzując protokół podawania, przy jednoczesnym dynamicznym monitorowaniu zmian skórnych, badanie to ma na celu zapewnienie ustandaryzowanych ram dla naukowców do konstruowania wiarygodnych modeli łuszczycy.

Wprowadzenie

Łuszczyca jest powszechną, przewlekłą, nawracającą i zapalną ogólnoustrojową chorobą skóry, przy czym łuszczyca plackowata jest najbardziej dominującą manifestacją kliniczną¹. Jego cechy kliniczne zazwyczaj obejmują naciek skóry, grubość, łuski i rumień², a także może wywoływać różne powikłania, w tym łuszczycowe zapalenie stawów, depresję, zespół metaboliczny i choroby sercowo-naczyniowe¹. Dodatkowo łuszczycy często towarzyszy przewlekły świąd³. Na całym świecie łuszczyca dotyka od 2% do 3% populacji⁴, a częstość jej występowania rośnie. Dlatego stworzenie wiarygodnych modeli zwierzęcych, które ściśle naśladują patologiczne cechy łuszczycy u ludzi, ma kluczowe znaczenie dla odkrycia jej patogenezy i opracowania nowych strategii terapeutycznych.

W dziedzinie badań dermatologicznych, łuszczyca przyciągnęła znaczną uwagę ze względu na swoją złożoną patogenezę, która obejmuje wzajemne oddziaływanie czynników genetycznych, immunologicznych i środowiskowych, co stanowi poważne wyzwanie dla dogłębnych badań¹. Obecne badania wskazują, że początek łuszczycy jest głównie spowodowany przez limfocyty T, które po aktywacji stymulują keratynocyty do nadmiernej proliferacji i zmieniają wydzielanie cytokin podczas procesu ich różnicowania⁵. W tym procesie kluczową rolę odgrywa oś Interleukina (IL)-23/IL-17. IL-23 wspomaga różnicowanie i aktywację komórek Th17, które wytwarzają cytokiny, takie jak IL-17A i IL-17F, odgrywając znaczącą rolę w rozwoju łuszczycy^6,7,8. Obecnie patogeneza łuszczycy obejmuje liczne zmiany molekularne. Obejmują one cytokiny, takie jak czynnik martwicy nowotworu-α (TNF-α), oś IL-23/IL-17, IL-37, wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe, takie jak czynnik jądrowy κB (NF-κB) oraz transdukcja i aktywator transkrypcji sygnału kinazy Janus (JAK-STAT). Ponadto jest ściśle związany z cząsteczkami związanymi z cukrem, cyklem kwasów trikarboksylowych (TCA), aminokwasami, szlakami metabolizmu lipidów, a także epigenetycznymi czynnikami regulacyjnymi, w tym metylacją DNA i modyfikacją histonów. Cele te są ze sobą ściśle powiązane i wzajemnie oddziałują na siebie, wspólnie napędzając początek i postęp łuszczycy⁹.

W obecnych badaniach nad łuszczycą wykorzystuje się różne modele zwierzęce, w tym między innymi modele spontaniczne, modele przeszczepów allogenicznych, modele transgenicznych lub nokautów genowych oraz modele indukowane chemicznie¹⁰. Te modele zwierzęce odgrywają istotną rolę w badaniach nad łuszczycą, a naukowcy wykorzystali wiele gatunków, takich jak myszy, świnki morskie i danio pręgowany, do skonstruowania modeli łuszczycy^11,12,13. Jednak wszystkie te modele mają pewne ograniczenia, w tym złożoność genetyczną, różnice gatunkowe, obawy etyczne i względy kosztowe¹⁴.

Imikwimod (IMQ), jako agonista receptorów Toll-podobnych (TLR), może wywołać stan zapalny skóry i infiltrację komórek odpornościowych, jednocześnie promując proliferację keratynocytów i wzmocnienie naczyń krwionośnych skóry¹³. Badanie wykazało, że miejscowe stosowanie IMQ u ludzi może wywołać łuszczycę¹⁵. Obserwacje kliniczne wykazały również, że IMQ zaostrza objawy łuszczycy u pacjentów⁷. W modelach łuszczycy myszy ciągłe podawanie 5% stężenia IMQ może odtworzyć skórne objawy łuszczycy u ludzi, takie jak rumień i łuski. Ponadto inne objawy ściśle naśladują objawy ludzkiej łuszczycy plackowatej, w tym zmiany naskórka, takie jak rogowacenie i parakeratoza, neoangiogeneza i tak dalej. Mysie modele łuszczycy indukowane przez IMQ są również w stanie symulować przewlekły świąd⁴. Istnieje również naciek komórek zapalnych składających się z limfocytów T, neutrofili i komórek dendrytycznych w modelach myszy łuszczycy^2,16. Zmiany skórne wywołane przez IMQ opierają się głównie na osi TNF-α-IL-23/IL-17, co wskazuje, że mysie modele łuszczycy oparte na IMQ mogą być wykorzystane do dalszego badania łuszczycy u ludzi⁹.

Model myszy z łuszczycą wywołaną IMQ zastosowany w tym badaniu jest odpowiedni dla szczepów myszy, takich jak C57BL/6 i BALB/c, które mają tendencje odpowiednio do Th1 i Th2⁷. Model ten jest stabilny i wysoce wydajny, a jego zaletami są niski koszt, krótki czas trwania eksperymentu, prosta obsługa, wyraźne objawy i wysoki wskaźnik sukcesu. W eksperymencie przedstawiliśmy szczegółowy opis kilku metod stosowanych do monitorowania postępu łuszczycy. Metody te obejmowały ocenę skóry i testy behawioralne. Ponadto przeprowadziliśmy dalszą walidację wyników eksperymentalnych poprzez wykorzystanie analizy histopatologicznej, testu immunoenzymatycznego (ELISA) i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR). Model ten nadaje się nie tylko do badania patogenezy łuszczycy, ale także do przedklinicznej oceny nowych podejść terapeutycznych, co czyni go cennym narzędziem w badaniach.

Protokół

Poniższy protokół wykorzystania zwierząt został sprawdzony i zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki Społecznej i Etyki Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Guangxi (DW20191220-153). Certyfikat zwierzęcia zakupionych myszy to SCXK (Xiang) 2024-0009. W tym badaniu 8-tygodniowe samice myszy C57BL / 6J stopnia SPF zostały losowo podzielone na grupy, z których każda zawierała 6 myszy. Klatka umieszczona jest w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (23 ± 2 °C, 12 godzin cyklu światło/ciemność) ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody. Schemat blokowy eksperymentu jest pokazany w Rysunek 1. Z wyjątkiem tego, że myszy w grupie kontrolnej nie były indukowane kremem IMQ, otrzymywały takie samo leczenie, jak myszy w grupie IMQ pod wszystkimi innymi względami.

1. Przygotowanie zwierząt

1. Rozpocznij modelowanie po przystosowaniu zwierzęcia do środowiska przez tydzień. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy skrupulatnie zdezynfekować stół doświadczalny za pomocą 75% roztworu etanolu.
2. Za pomocą markera wyraźnie zaznacz ogony myszy, zapewniając ich indywidualną identyfikację.
3. Użyj golarki, aby ogolić włosy na szyjach i grzbietach wszystkich myszy na obszarze około 4 cm x 3 cm (dzień 0; Rysunek 2A). Za pomocą bawełnianego wacika nałóż odpowiednią ilość kremu do depilacji na ogoloną skórę i równomiernie go rozprowadź (Rysunek 2B).
4. Po nałożeniu kremu do depilacji należy odczekać około 15 sekund. Krem do depilacji należy pozostawić na powierzchni skóry myszy na optymalne 15-20 sekund. Wytrzyj delikatnie i szybko.
5. Użyj nowego bawełnianego wacika, aby namoczyć go w wodzie i wielokrotnie wycieraj w kierunku od ogona myszy do głowy, aby wyczyścić włosy. Delikatnie osusz miejscową skórę medycznym papierem chłonnym.
6. Zbadaj stan skóry myszy 24 godziny po depilacji i wyklucz te z uszkodzonymi obszarami depilacji.

2. Mysi model łuszczycy wywołanej przez IMQ

1. Upewnij się, że niewielkie uszkodzenia skóry spowodowane goleniem lub depilacją zostały w pełni zregenerowane.
Począwszy od 2 dnia należy stosować krem 5% IMQ w dawce 62,5 mg7.
2. Aby to zrobić, należy wcześniej napełnić całą strzykawkę o pojemności 1 ml kremem IMQ i podać lek myszy zgodnie z objętością odpowiadającą 62,5 mg IMQ dziennie na depilowaną skórę myszy za pomocą łyżki z płaską rączką (Rysunek 2C). Podczas aplikacji upewnij się, że krem IMQ jest rozprowadzony tak równomiernie, jak to możliwe na depilowanym obszarze, a obszar aplikacji jest mniejszy niż obszar depilowany.
3. Po rozsmarowaniu leku umieść mysz w pustej klatce i odczekaj 15 minut. Włóż mysz z powrotem do klatki do karmienia po całkowitym wchłonięciu leku. Aplikację leku należy wykonywać w sposób ciągły przez 7 dni.

3. Analiza masy ciała myszy z łuszczycą

1. Umieść czystą zlewkę na wadze elektronicznej i wytaruj ją. Następnie delikatnie umieść mysz w środku i zanotuj stabilne odczyty wyświetlane na wadze.
2. Od dnia 1 (dzień poprzedzający pierwsze zastosowanie IMQ) waż myszy codziennie do dnia 8. Porównaj wagę każdej myszy z odpowiadającą jej wagą w dniu 1.

4. Charakterystyka skóry myszy z łuszczycą

1. Umieść myszy na białym tle za pomocą linijki. Utrzymuj ciała myszy prosto, nie zmniejszając ich głów ani nie wykonując dużych zamachów (Rysunek 3).
2. Od 1 dnia należy codziennie wykonywać zdjęcie w wysokiej rozdzielczości miejsca podania myszom przy tym samym natężeniu oświetlenia i rejestrować charakterystykę skóry myszy.
3. Podczas każdej sesji zdjęciowej utrzymuj stałą odległość między aparatem a myszami, a także powiększenie aparatu i ustaw linijkę prostopadle do aparatu.

5. Punktacja skóry

1. Oceń nasilenie łuszczycowego zapalenia skóry u myszy za pomocą zmodyfikowanego wskaźnika obszaru i nasilenia łuszczycy (PASI)¹⁷ codziennie od 1 do 8 dnia. Zatrudnij trzech badaczy przy użyciu metody podwójnie ślepej próby, aby niezależnie ocenić rumień, łuski i grubość skóry w skali od 0 do 4, biorąc średnią arytmetyczną z tych trzech. Aby zapoznać się z zasadami punktacji PASI, sprawdź tabelę 1.
   Wynik PASI = rumień + łuska + grubość

6. Obserwacja behawioralna myszy

1. W tym samym cichym, normalnie oświetlonym otoczeniu o temperaturze pokojowej (jak w kroku 4) umieść każdą mysz w indywidualnym akrylowym pudełku (10 cm x 10 cm) z niewielką ilością wyściółki z kolb kukurydzy na dole.
2. Użyj czarnych przegród, aby oddzielić każde pudełko i zablokować linię wzroku. Po 15-minutowym okresie adaptacji nagrywaj zachowanie zwierząt na wideo przez 1 godzinę.
3. Nagrywaj filmy behawioralne o stałej porze każdego dnia od 1 do 8 dnia. Ustaw obiektyw aparatu prostopadle do akrylowego pudełka i upewnij się, że w pełni rejestruje działania myszy w środku.
4. Rejestruj przypadki, w których mysz podnosi tylną łapę, aby podrapać szyję i plecy, a następnie opuszcza ją jako jedno swędzenie.

7. Pobieranie krwi i mierzenie poziomu cytokin w surowicy za pomocą testu ELISA

1. Szybko usuń gałki oczne myszy za pomocą kleszczy i zbierz krew w 9 dniu.
2. Pozostawić krew w temperaturze 4 °C na 4 godziny. Oddzielić krew za pomocą wirówki niskotemperaturowej o sile 3000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać surowicę i przechowywać ją w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
3. Określ ilościowo poziomy TNF-α, IL-17A i IL-23 w surowicy za pomocą odpowiedniego zestawu ELISA zgodnie z protokołem producenta¹⁸.

8. Pobieranie próbek skóry i śledziony

1. Zgodnie z przepisami odpowiedniej komisji etycznej ds. doświadczeń na zwierzętach, zwichnąć kręgi szyjne myszy do eutanazji po pobraniu krwi w 9 dniu.
2. Po eutanazji należy przeciąć zmiany skórne na grzbietach myszy na dwie części. Zanurz jedną porcję w probówce wirówkowej o pojemności 5 ml z 4% roztworem paraformaldehydu w celu utrwalenia i konserwacji. Oddzielić i zapakować drugą porcję tkanek skóry i przechowywać je w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
3. Użyj wysterylizowanych nożyczek, aby rozciąć skórę wzdłuż linii środkowej brzucha myszy, odsłonić jamę brzuszną oraz znaleźć i całkowicie usunąć śledzionę. Umyj próbki sterylnym solą fizjologiczną, a następnie włóż je do soli fizjologicznej, zważ i zapisz dane.

9. Analizy histologiczne skrawków skóry

1. Usuń tkankę skórną z paraformaldehydu i umieść ją w pudełku do zatapiania.
2. Wykonaj następujące czynności na skórze: Użyj alkoholu gradientowego od 75% do 100% (od niskiego do wysokiego stężenia), z trzema zbiornikami 100% alkoholu. Pozostaw go w każdym zbiorniku na 30 minut w temperaturze pokojowej. Użyj dwóch zbiorników ksylenu. Pozostaw go w każdym zbiorniku na 30 minut w temperaturze pokojowej. Użyć trzech zbiorników wosku parafinowego o temperaturze topnienia 56-58 °C. Pozostaw go w każdym zbiorniku na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
3. Osadź leczoną tkankę skórną: Umieść nasączoną woskiem tkankę skórną pionowo w formie parafinowej. Wlej stopioną parafinę do formy, gdy temperatura zatapiającej się parafiny jest o 5-7 °C wyższa niż temperatura topnienia parafiny. Szybko przenieś go na stół zamrażający, aby szybko schłodzić i zestalić blok wosku.
4. Zamrozić blok wosku do temperatury 0 °C, wyjąć go z pudełka do zatapiania, zamocować na stole zaciskowym krajalnicy i pokroić na grubość 3 μm.
5. Za pomocą pęsety podnieś plastry i zblanszuj je w ciepłej wodzie o temperaturze 45 °C. Przymocuj sekcję do środka gładkiej części szkiełka i zaznacz ołówkiem liczbę patologiczną w oszronionym obszarze. Przechyl szkiełko na chwilę pod kątem 45°, aby wilgoć mogła wypłynąć, a następnie wstaw do piekarnika o temperaturze 62°C i piecz przez 30 minut.
6. Barwienie HE: Umieść plastry w ksylenie na 5 min, następnie w innym zbiorniku z ksylenem na 5 min, w bezwodnym etanolu na 1 min, w 95% etanolu na 1 min, w 85% etanolu na 1 min i w 75% etanolu na 1 min. Płucz wodą z kranu przez 1 min, plamić roztworem hematoksyliny przez 5 min, i zmyć roztwór hematoksyliny pod bieżącą wodą przez 1 min.
7. Moczyć w 1% etanolu kwasu solnego przez 3 s, myć wodą przez 20 s, używać ciepłej wody do powrotu niebieskiego przez 5 min, płukać bieżącą wodą przez 2 min, plamić 0,5% eozyny przez 1 min, moczyć w 95% etanolu przez 2 s, następnie w 95% etanolu przez 2 min, w bezwodnym etanolu przez 4 min, w innym zbiorniku bezwodnego etanolu przez 4 min, w ksylenie przez 4 min, w innym zbiorniku ksylenu przez 4 min, a w ostatnim zbiorniku ksylenu przez 4 min. Po wyschnięciu na powietrzu uszczelnij go neutralną gumą.
8. Obserwuj skrawki pod mikroskopem i losowo rób zdjęcia w trzech pozycjach przy powiększeniu 400. Dla każdego zdjęcia losowo zmierz grubość naskórka w pięciu miejscach za pomocą oprogramowania Image J. Rejestruj i analizuj dane.

10. Pomiar poziomu mRNA IL-17A, IL-17F, IL-23 i IFN-γ w skórze za pomocą RT-qPCR

1. Pobrać tkankę skórną przechowywaną w lodówce w temperaturze -80 °C o masie około 100 mg i wyekstrahować RNA metodą Trizol.
2. Odwrotna transkrypcja do cDNA zgodnie z zestawem do odwrotnej transkrypcji (VAZYME, Chiny).
3. Skonfiguruj system reakcji PCR zgodnie z instrukcją i przeprowadź Real-Time PCR przy użyciu ilościowego przyrządu do fluorescencji PCR zgodnie z określoną procedurą reakcji (Tabela 2) i sekwencją starterów (Tabela 3).
4. Zbieraj ilościowe dane PCR fluorescencji w czasie rzeczywistym, obliczaj i analizuj wyniki za pomocą algorytmu qPCR (metoda 2-ΔΔCt).

Wyniki

Po ciągłym podawaniu IMQ myszy w grupie IMQ wykazywały kliniczne objawy zmian skóry grzbietu przypominające łuszczycę (Rysunek 4), przy czym w obszarze indukowanym przez IMQ występowały typowe objawy rumienia, łusek oraz pogrubienia skóry (Rysunek 5). W przeciwieństwie do nich, grupa kontrolna nie wykazywała żadnych objawów podobnych do tych zaobserwowanych w grupie IMQ. W porównaniu z grupą kontrolną, w grupie IMQ od 3. dnia zaczęły pojawiać się rumień oraz dro...

Dyskusja

Nasze badania wykorzystują IMQ do wywoływania zmian skórnych podobnych do łuszczycy, konstruując w ten sposób model łuszczycy. Model ten może być wykorzystany do badania mechanizmów leżących u podstaw rozwoju łuszczycy i do uzyskania wglądu w rozwój metod leczenia tego schorzenia. W badaniu przeprowadzonym przez van der Fits⁷, przy początkowym podawaniu indukcji IMQ, czas indukcji ustalono na 5 lub 6 dni. Niemniej jednak Jabeen i wsp. zasugerowali, że nasilenie modeli łuszczycy wywołanej przez IMQ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5% imikwimod krem	Sichuan Medshine Pharmaceutical Co.
75% etanol	XUE HUAN	20240401
Waga analityczna	sartorius	SQP
Krem do depilacji	Reckitt Benckiser	20240612 08X
Waga elektroniczna	Yingheng Technology	7915
Bibułka medyczna	JD	20221208
Golarka	HORD shenjian	AUX-C6S
Sterylizowany wacik bawełniany	Beilun River	20230728

40220602