Artykuł metodologiczny

Charakterystyka behawioralna napadów wywołanych pentylenotetrazolem: wyjście poza skalę Racine'a

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68112

⸱

8 lipca 2025

 ,  , 
1Brain Institute, Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół wprowadza innowacyjną metodę analizy i wizualizacji zachowań związanych z napadami padaczkowymi wywołanymi pentylenotetrazolem u myszy. Podejście to wykracza poza tradycyjne wyniki Racine'a, zapewniając bardziej wszechstronną ocenę różnorodności i temporalnej dynamiki zachowań ICTAL.

Streszczenie

Szczegółowa charakterystyka behawioralna napadów jest niezbędna w zwierzęcych modelach padaczki. Chociaż istnieją różne protokoły wywoływania napadów, skala Racine'a pozostaje najpowszechniej stosowaną metodą jej kwantyfikacji. Początkowo opracowana w celu oceny postępującej rekrutacji zachowań podczas elektrycznego rozpalania struktur limbicznych, skala stała się od tego czasu standardem w klasyfikacji napadów w różnych modelach o różnej etiologii.

Jednak dokładne badanie zachowania po podaniu pentylenotetrazolu (PTZ), powszechnie stosowanego modelu napadów, ujawnia, że skala Racine'a nie jest w stanie uchwycić pełnego spektrum zmian behawioralnych wywołanych przez tego antagonistę GABA-ergicznego. Po pojedynczym podskórnym wstrzyknięciu dużej dawki PTZ myszy najpierw wykazują zachowania niedrgawkowe, takie jak hipotonia, zmniejszone poruszanie się, zatrzymanie zachowania i drżenie. Są one zastępowane przez zachowania ictal, w tym skurcze, szarpnięcia miokloniczne i napady limbiczne, chociaż tylko te ostatnie są określane ilościowo za pomocą skali Racine'a.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, stosuje się wyrafinowane podejście, które łączy znakowanie wideo ze śledzeniem zwierząt w celu odróżnienia skurczów i mioklonie jako odrębnych ekspresji behawioralnych od napadów limbicznych. Te wczesne zachowania mogą ułatwiać rekrutację struktur limbicznych, ostatecznie wywołując napady limbiczne. Metoda jest prosta do wdrożenia i umożliwia bardziej kompleksową ocenę ostrych napadów padaczkowych wywołanych przez PTZ. Jego użyteczność jest dodatkowo widoczna w protokole rozpalania PTZ, w którym powtarzające się niskie dawki PTZ powodują czasowe zmiany w skurczach, mioklonie i nasileniu napadów limbicznych. Podejście to może przyczynić się do poprawy odtwarzalności w badaniach nad napadami padaczkowymi i padaczką.

Wprowadzenie

Behawioralna charakterystyka napadów padaczkowych jest najczęściej stosowanym odczytem w badaniach nad patofizjologią padaczki i aktywnością napadową i jest szeroko stosowana do badań przesiewowych nowych leków przeciwpadaczkowych 1,2. W większości prac opublikowanych w ciągu ostatnich 50 lat wykorzystano system progresywnej punktacji opracowany przez Ronalda J. Racine'a do opisania nasilenia napadów behawioralnychpodczas rozpalania ciała migdałowatego i hipokampa. Skala Racine'a wykazała silną korelację między zachowaniem a elektrofizjologiczną aktywnością napadową uszczurów3 ikotów4. Klasyfikuje ona behawioralną ekspresję napadu na pięć etapów progresywnych: "(i) ruchy ust i twarzy, (ii) głową, (iii) klonus kończyn przednich, (iv) wychowywanie oraz (v) podnoszenie i upadanie"3. Ze względu na swoją prostotę, łatwość użycia i interpretacji, szybkość punktacji i odtwarzalność, zastosowanie skali Racine'a w badaniach nad padaczką i napadami padaczkowymi stale rośnie nawet w dzisiejszych czasach (ryc. 1).

Yearly citation count graph; shows increasing trend from 1970 to 2024; publication analysis.
Rysunek 1: Liczba rocznych cytowań otrzymanych w badaniu Racine'a z 1972 roku. Zwróć uwagę na stały wzrost liczby cytowań w ciągu ostatnich 50 lat. Wyszukiwanie w Web of Science przeprowadzone 27 listopada 2024 r. ujawniło 6 040 cytowań, a 91 rekordów nie zawierało informacji w polu "rok publikacji". Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Skala została następnie zastosowana do innych zwierzęcych modeli padaczki i napadów padaczkowych, w tym do osób stosujących leki w celu wywołania napadów. Wczesne opisy napadów padaczkowych wywołanych kwasem kainowym5 i stanu padaczkowego (SE)6, a także miejscowego7 i układowego SE8 wywołanego pilokarpiną, wykorzystywały skalę Racine'a do ilościowego określania zarówno napadów indukowanych, jak i spontanicznych. Co ciekawe, leki te nie wywoływały tylko napadów limbicznych, jak zaobserwowano u zwierząt stymulowanych elektrycznie i opisano przez Racine'a, ale wywołały one również inny zestaw zachowań, które były słabo lub rzadziejopisywane.

Ograniczenia skali Racine'a w celu uchwycenia różnorodności zachowań układu kostnego zostały wcześnie zidentyfikowane przez naukowców korzystających z modeli napadów, w których ognisko napadu leży w innych regionach mózgu niż układ limbiczny. Na przykład Garcia-Cairasco był jednym z pierwszych, którzy zastosowali narzędzia etologiczne do oceny zachowania w napadach audiogennych10, ujawniając złożoność i postęp czasowy zachowań ictal10,11. Niedawno Ivan Soltesz wykorzystał zaawansowaną analizę głębokości wideo i szczegółowe kodowanie czasowe, aby ujawnić "ukryte odciski palców behawioralnych" u elektrycznie zapalonych szczurów12. Opierając się na tych podejściach, wprowadzono nowy system kodowania dla ostrych napadów padaczkowych wywołanych pentylenotetrazolem u myszy.

Pentylenotetrazol (PTZ) prowadzi do napadów padaczkowych poprzez hamowanie neurotransmisji GABA-ergiczne13, co skutkuje zwiększoną pobudliwością neuronów i synchroniczną aktywacją populacji neuronów 14,15. Po podaniu pojedynczej dużej dawki (40-80 mg/kg) ogólnoustrojowego PTZ gryzonie wykazują ograniczoną mobilność, niespecyficzne ruchy wąsów, skurcze całego ciała i szarpnięcia miokloniczne, klonus ustno-twarzowy i łap oraz pełnoobjawowe drgawki limbiczne16. W przeciwieństwie do modeli stanu padaczkowego, nieprawidłowe zachowanie po PTZ trwa do 1 godziny i ustępuje samoistnie 16,17,18. Poprzedni autorzy zaproponowali poprawioną wersję skali Racine'a dla szczurów17 i myszy18. Pomimo ich próby dostarczenia nowych spostrzeżeń na temat różnorodności zachowań ICTAL, ich nowa skala obejmuje jeden lub dwa nowe poziomy, związane z dzikim bieganiem i/lub skakaniem (poziom 6, van Erum i wsp.18) oraz rozszerzeniem tonicznym prowadzącym do zatrzymania oddechu (poziom 7, van Erum i wsp.18).

Protokół ten przedstawia nowe podejście do ilościowego określania i przedstawiania zachowań ictal wywołanych przez PTZ, ze szczególnym uwzględnieniem skurczów i mioklonie. Zachowania te są jednymi z najbardziej rozpowszechnionych po ogólnoustrojowym podawaniu PTZ, ale często są pomijane w badaniach nad napadami padaczkowymi i padaczką. W ten sposób podejście to rozwiązuje krytyczną lukę metodologiczną, zapewniając konkretne kryteria identyfikacji skurczów i mioklonie oraz odróżniając je behawioralnie od napadów limbicznych. Pokazuje to, że skurcze i mioklonie wykazują wyraźną dynamikę czasową zarówno po pojedynczym, jak i wielokrotnym podawaniu PTZ. Ten system kodowania jest łatwy do wdrożenia, integruje nowe parametry nieprawidłowej aktywności z istniejącymi metodologiami i oferuje świeże spojrzenie na mechanizmy generowania napadów. Wreszcie, ta nowa strategia ma potencjał do standaryzacji ilościowej oceny zachowania ICTAL w laboratoriach, zwiększenia odtwarzalności i poszerzenia perspektywy mechanizmów napadów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną Uniwersytetu Federalnego Rio Grande do Norte (Protokół nr 043/2022, numer licencji 307.043/2022). W tym protokole wykorzystano samce myszy C57BL/6 w wieku od 3 do 4 miesięcy, z zalecaną wielkością próby 6-10 zwierząt zgodnie z ustalonymi protokołami indukcji PTZ16.

1. Przygotowanie areny obserwacyjnej

  1. Użyj kwadratowej lub okrągłej areny o powierzchni co najmniej 10 x 10 cm i wysokości ściany 30 cm. Upewnij się, że arena jest dobrze oświetlona. W razie potrzeby użyj oświetlenia podczerwonego, aby zagwarantować akwizycję nasyconego obrazu (rysunek 2A).
  2. Umieść co najmniej jedną kamerę wideo nad areną, z widokiem z góry na całą podłogę areny i co najmniej 10 cm ściany (aby uchwycić zachowanie podczas chowu bez przycinania głowy myszy, Rysunek 2B).
  3. W razie potrzeby umieść drugą kamerę wideo z widokiem areny z przodu. W takim przypadku upewnij się, że jedna ze ścian areny jest przezroczysta.
  4. Upewnij się, że temperatura (21-24 °C) i wilgotność (50-70%) odpowiadają warunkom panującym w pomieszczeniu dla zwierząt, monitorując je za pomocą termohigrometru i dostosowując w razie potrzeby.
  5. Umieść niezbędną ściółkę, aby przykryć dno areny i upewnij się, że zwierzę jest widoczne z tła. Spraw, aby woda i granulki żywności były swobodnie dostępne przez cały czas trwania eksperymentu.
  6. Eksperymenty należy rozpocząć najlepiej na początku fazy świetlnej (np. między 7:00 a 10:00). Utrzymuj stałe oświetlenie w pomieszczeniu eksperymentalnym (900-1,100 luksów) z 12/12-godzinnym cyklem światła/ciemności, przy włączonym świetle o 6 rano. Użyj luksomierza, aby sprawdzić warunki oświetleniowe w pobliżu areny nagrywania, zapewniając jednolitą jakość nagrywania wideo.
  7. Podłącz kamerę do urządzenia rejestrującego wideo, aby uzyskać wideo z co najmniej 24 klatkami na sekundę (fps).

2. Przygotowanie roztworu PTZ

UWAGA: Zachowania ictal (tj. skurcze) mogą być wywołane dawkami zaczynającymi się od 40 mg/kg. Napady limbiczne obserwuje się po podaniu 60 mg/kg mc. i większych dawek. Drgawki toniczne związane z zatrzymaniem oddechu i zgonem są często obserwowane po podaniu dawki 80 mg/kg mc. lub większej. W protokole rozpałki zastosowano dawkę 40 mg/kg.

Dawka może się różnić w zależności od szczepu myszy. Zaleca się przeprowadzenie eksperymentu pilotażowego w celu określenia dawki PTZ, która najlepiej odpowiada pytanemu pytaniu.

  1. Podawać myszom 10 ml / kg w zastrzykach ogólnoustrojowych. Dlatego proszek PTZ należy rozpuścić w wodzie dejonizowanej, aby osiągnąć końcowe stężenie 4 lub 6 mg/ml (odpowiednio dla dawek 40 i 60 mg/kg).
    UWAGA: Aby zmniejszyć zmienność, należy przygotować pojedynczy roztwór PTZ dla całej partii eksperymentalnej.

3. Administrowanie PTZ

  1. Przed umieszczeniem zwierzęcia na arenie zmierz jego masę ciała za pomocą wagi.
  2. Obliczyć objętość roztworu PTZ niezbędną dla każdego zwierzęcia na podstawie jego masy ciała.
    UWAGA: W przypadku dawki 60 mg/kg mc. i masy ciała 30 g należy wstrzyknąć zwierzęciu 0,3 ml roztworu PTZ o stężeniu 6 mg/mL.
  3. Rejestruj zachowanie przez co najmniej 1 godzinę przed wstrzyknięciem PTZ.
    UWAGA: Ten okres przyzwyczajenia zmniejsza poruszanie się i niepokój wywołany nowością, podczas gdy może być również wykorzystany do wyodrębnienia podstawowej aktywności.
  4. PTZ podawać dootrzewnowo (i.p.) lub podskórnie (s.c.)15,16. W celu podania podparcia należy zabezpieczyć zwierzę jedną ręką, delikatnie ściskając skórę między łopatkami (ryc. 2C).
  5. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml dołączonej do igły o sile 26 1/2 G, wprowadzić igłę do przestrzeni podskórnej, równolegle do orientacji ciała i powoli wstrzykiwać roztwór do przestrzeni podskórnej. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy delikatnie usunąć igłę, przytrzymując skórę przy wyjściu igły, aby uniknąć rozlania roztworu z powodu ucisku w jamie ustnej (Ryc. 2C).
    UWAGA: Nie wolno wykonywać wstrzyknięć zbyt szybko, ponieważ szybkie gromadzenie się roztworu może prowadzić do rozlania z miejsca wstrzyknięcia lub wycieku po wyjęciu igły.
  6. Zanotuj wszelkie wycieki, ponieważ wpłynie to na ekspresję zachowań ictal. Należy rozważyć możliwość natychmiastowego wstrzyknięcia dodatkowych 50 μl tego samego roztworu PTZ.
  7. Umieść zwierzę z powrotem na arenie na 1 godzinę ciągłego nagrywania wideo.
  8. Godzinę po wstrzyknięciu PTZ (lub dłużej) zatrzymaj nagrania i skopiuj plik do postprocessingu (śledzenie wideo i kodowanie behawioralne).

Mouse tracking setup in behavioral experiment; diagrams show maze, monitoring system, data analysis.
Rysunek 2: Konfiguracja eksperymentalna i procedura wstrzykiwania. (A) Cztery przezroczyste kwadratowe areny z kamerami z widokiem z góry na dół umieszczonymi nad środkiem zostały użyte do rejestrowania zachowań i śledzenia pozycji zwierząt przed i po podaniu PTZ. (B) Migawka jednego reprezentatywnego nagrania wideo uzyskanego przy użyciu konfiguracji opisanej w punkcie A. (C) Przykład wstrzyknięcia podskórnego PTZ. Igłę umieszcza się między łopatkami zwierzęcia w przestrzeni podskórnej. (D) Schematyczne przedstawienie pozyskiwania i analiz danych behawioralnych wykorzystanych w niniejszym badaniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Dobrostan zwierząt

  1. Usuń i poddaj eutanazji zwierzęta, jeśli napad trwa dłużej niż 5 minut, aby zapobiec śmierci komórek i uszkodzeniu tkanki mózgowej, szczególnie podczas protokołów wielokrotnych wstrzyknięć.
  2. Codziennie monitorować masę ciała zwierząt przez cały okres doświadczalny.
  3. Monitoruj ogólny stan zwierząt, w tym przyjmowanie pokarmu, poruszanie się, postawę, pielęgnację oraz oznaki bólu lub niepokoju.
  4. W razie potrzeby należy zastosować leczenie przeciwzapalne (ibuprofen, 5 mg/kg) i przeciwbólowe. W razie potrzeby zapewnij dodatkowe jedzenie lub wodę.
  5. Usuń zwierzęta, jeśli wykazują utratę masy ciała większą niż 20%, której nie można odzyskać w ciągu 2 dni od indywidualnej suplementacji, zmiany w naskórku lub jakiekolwiek oznaki przewlekłego bólu lub dyskomfortu niereagującego na leczenie farmakologiczne.
  6. Poddać eutanazji wszystkie zwierzęta zgodnie z międzynarodowymi i instytucjonalnymi wytycznymi etycznymi.

5. Instalacja, konfiguracja i użytkowanie oprogramowania

  1. Do analizy opisanej w tym badaniu użyj MouseLabTrack19 i Solomon Coder. Pobierz je i postępuj zgodnie z procedurą instalacji (patrz Plik uzupełniający 1 i Plik uzupełniający 2).
    UWAGA: Podczas gdy MouseLabTrack działa w ramach MATLAB, Solomon Coder jest plikiem wykonywalnym dla systemu operacyjnego Windows. Oba programy są open source.
  2. Kliknij Solomon w menu Start systemu Windows lub wyszukaj Solomon Coder i otwórz oprogramowanie.
    1. Jeśli plik konfiguracyjny jest dostępny (patrz Plik uzupełniający 3), przejdź do punktu menu Plik | Załaduj konfigurację. Na ekranie zostaną załadowane predefiniowane ustawienia.
    2. Jeśli żaden plik konfiguracyjny nie jest dostępny,
      1. Kliknij prawym przyciskiem myszy wolny obszar, aby utworzyć nowy przycisk. Kliknij prawym przyciskiem myszy nowo utworzony przycisk, aby otworzyć ekran konfiguracji .
      2. W polu Nazwa przycisku zmień nazwę przycisku, aby reprezentował żądane zachowanie.
      3. W polu Kolor tarczy przycisku wybierz kolor.
      4. W polu Kategorie zmień nazwę Domyślne na Zachowania (będzie to nazwa kolumny).
      5. W polu Skrót klawiszowy przypisz klawiatury, aby oznaczyć zachowanie podczas analizy wideo (np. "1").
      6. (Opcjonalnie) Zaznacz pole powyżej skrótu, jeśli zdarzenie jest natychmiastowe, co oznacza, że zarejestruje pojedyncze zdarzenie po naciśnięciu i zwolnieniu. Jeśli ta opcja nie jest zaznaczona, zachowanie pozostanie zarejestrowane do momentu zwolnienia klucza.
    3. Aby otworzyć film, przejdź do punktu menu Plik | Otwórz aplikację Wideo.
    4. Naciśnij przycisk Odtwórz , aby rozpocząć wideo.
    5. W miarę obserwowania zachowań kliknij lewym przyciskiem myszy lub naciśnij przypisany klawiatury, aby je oznaczyć.
    6. Aby zapisać dane jako plik z wartościami rozdzielanymi przecinkami (.csv), przejdź do punktu menu Analizuj | Zapisz dane wyjściowe jako. Aby zapisać arkusz kodowania Solomon (.arch), przejdź do Plik | Zapisz arkusz kodowania.
  3. Aby otworzyć i załadować MouseLabTracker.
    1. Otwórz MATLAB, w konsoli wpisz 'main()' i naciśnij Enter.
    2. Aby załadować wideo, kliknij przycisk otwierania. Po załadowaniu na sąsiednim ekranie pojawi się film z zielonym tłem i zwierzęciem w kolorze białym.
    3. Określ przedział czasu, który ma być analizowany w filmie. Kliknij przycisk Uruchom , aby ustawić początek analizy. Kliknij przycisk Koniec , aby ustawić koniec analizy.
      UWAGA: Jeśli nie ustawiono interwału, oprogramowanie analizuje cały obraz.
    4. Aby skonfigurować ustawienia śledzenia, przejdź do zakładki Ustawienia śledzenia .
      1. Wybierz opcję Ciemne obiekty / Jasne tło , aby wskazać, że zwierzę jest ciemniejsze niż tło.
      2. Aby dostosować liczbę zwierząt, przejdź do sekcji Tematy i zmień liczbę na 1.
      3. Aby dostosować parametry wykrywania, zmień ustawienie parametru Threshold (Próg ) tak, aby wartości promienia mieściły się w zakresie od 30 do 40.
      4. Określ kolor zwierzęcia, klikając Kolor i wybierając odpowiedni kolor.
      5. Aby zdefiniować arenę, kliknij Zdefiniuj arenę, a następnie wybierz lewy górny róg areny, a następnie wybierz prawy dolny róg areny.
    5. Aby rozpocząć proces śledzenia, kliknij Śledź. Poczekaj, aż pasek postępu osiągnie 100%.
    6. Po zakończeniu śledzenia zapisz plik wyjściowy analizy, klikając przycisk Zapisz wyniki.

6. Zachowania związane z kodowaniem

  1. Po pierwsze, oznacz czas administrowania PTZ, gdy mysz ponownie pojawi się w klatce wideo po umieszczeniu jej na arenie obserwacyjnej. Ten moment służy jako czas zerowy, służąc jako odniesienie czasowe dla wszystkich innych zachowań, w tym obliczeń opóźnienia.
  2. Obserwuj skurcze i mioklonie kilka minut po wstrzyknięciu PTZ (ryc. 3), a następnie możliwe drgawki limbiczne. Skurcze to krótkie, przemijające i szybkie skurcze mięśni osiowych, w tym obustronne zgięcie ucha, skurcz mięśni pleców, unoszenie ogona (ogon Strauba) i rzadko reakcja na skok z zaskoczenia (ryc. 3A). Koduj spazmy jako dyskretne zdarzenia, kojarząc je z pojedynczą klatką wideo bez czasu trwania.
    UWAGA: Określ ilościowo różnorodność i kombinację różnych części ciała w wyrażaniu skurczów (patrz sekcja Reprezentatywne wyniki).
  3. Aby zakodować mioklonie, obserwuj zdarzenia dłuższe niż 200 ms; Charakteryzują się nagłym, silnym mioklonicznym szarpnięciem obejmującym głowę, szyję i łapy. Może to być związane z drżeniem i utratą postawy ciała (ryc. 3B). Podklasyfikacja obejmuje mioklonie z drżeniem lub z utratą postawy do przodu, w lewo lub w prawo. Czas trwania zwykle waha się od 1 do 2 s. Ze względu na swoją długość, mioklonie wymagają kodowania w wielu jednostkach czasu dla jednego zdarzenia.
  4. Aby zakodować napady limbiczne, obserwuj zdarzenia, które przypominają to opisane przez Racine'a i mogą być zakodowane za pomocą skali Racine'a. Zwykle zaczyna się od zatrzymania zachowania lub zaklęcia wpatrywania się, po którym następują automatyzmy węchowe i smakowe, ruchy ustno-twarzowe, mioklonie kończyn przednich i/lub głowy, wstawanie z upadkiem lub bez, dzikie bieganie lub skakanie oraz napad toniczny z zatrzymaniem oddechu. Użyj zmodyfikowanej skali Racine'a18 , aby podzielić napady limbiczne, które trwają dłużej niż 10-15 s i można je odróżnić od skurczów i mioklonie.
  5. Uwzględnij dodatkowe zajęcia behawioralne oparte na protokole eksperymentalnym, co pozwoli na bardziej kompleksowe badanie przesiewowe zachowań.
  6. Oznacz koniec sesji nagraniowej w jednym przedziale czasowym (1 godzina po wstrzyknięciu PTZ). Jeśli zwierzę umrze po napadzie tonizującym, zidentyfikuj czas zgonu za pomocą znaku końcowego.
    UWAGA: Arkusz kodowania można zapisać w dowolnym momencie procesu kodowania i ponownie otworzyć w oprogramowaniu w razie potrzeby w celu kontynuowania kodowania lub modyfikacji.

Mouse behavior analysis during seizures; frames show spasm, myoclonus, limbic seizure stages.
Rycina 3: Migawki zachowań ictal obserwowanych po podaniu PTZ. (A) Jest to reprezentatywny przykład jednego z pierwszych skurczów obserwowanych po wstrzyknięciu PTZ. Wyświetlane są wszystkie klatki (próbkowanie 30 kl./s). Należy pamiętać, że skurcz trwa krócej niż 200 ms i porusza się w kierunku ostroogonowym. W tym przykładzie nie wystąpiło jawne podnoszenie ogona. (B) Reprezentatywny przykład mioklonie związanego z pochylaniem się do przodu. W tym przykładzie mioklonie trwało dłużej niż 1 s, w którym wystąpiło wiele klonów ogona i kończyn przednich. (C) Reprezentatywny przykład napadu limbicznego. Przed etapem 1 Racine'a mysz wykazywała utrzymującą się mioklonie kończyn, w tym utratę postawy ciała. Sekwencja przedstawia wszystkie pięć tradycyjnych etapów konwencjonalnej skali Racine'a. W takim przypadku mysz otrzymałaby wynik 5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

7. Analiza i wizualizacja danych

  1. Oblicz opóźnienie pierwszego wystąpienia każdej z kategorii zachowania (np. Skurcz, mioklonie, napad itp.), odejmując czas wstrzyknięcia PTZ od czasu zarejestrowanego w arkuszu kodowania.
  2. Oblicz czas trwania każdego zdarzenia miokloniego i napadu, a następnie zsumuj je, aby uzyskać całkowity czas trwania dla każdej kategorii.
  3. Oblicz częstotliwość występowania dla każdego zachowania, dzieląc łączną liczbę zdarzeń przez czas trwania nagrania.
  4. Oblicz interwał między zdarzeniami dla każdego zachowania, znajdując różnicę czasu między kolejnymi zdarzeniami.
  5. Zdefiniuj epizody zgodnie z czasowym rozkładem zachowań ictal w każdej sesji nagraniowej, jeśli ma to zastosowanie. Oblicz powyższe parametry dla każdego odcinka.
    UWAGA: Koniec napadów prowadzi do okresu supresji postiktalnego, co oznacza zakończenie epizodu dla tego protokołu. Ponowne pojawienie się zachowań ictal oznacza początek nowego epizodu.
    UWAGA: W przypadku braku napadów należy sklasyfikować sesję nagraniową na podstawie czasowego rozkładu skurczów i mioklonie.
  6. Przetestuj normalność za pomocą testu Shapiro-Wilka dla każdej grupy.
  7. W przypadku porównań parametrycznych między wieloma grupami należy użyć testu jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA). W przypadku sparowanych danych użyj sparowanego testu t lub powtarzanych pomiarów ANOVA, w zależności od struktury danych.
  8. Ustaw istotność statystyczną na wartość p równą < 0,05. Dodatkowo zaokrąglij wartości p poniżej 0,0001 i zgłoś je jako <0,0001.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby ocenić strategię kodowania i jej zdolność do szczegółowego wyszczególniania zachowań podczas napadów wywołanych przez PTZ, najpierw przetestowano trzy dawki PTZ i zaobserwowano ich wpływ na myszy C57BL / 6 (odpowiednio 40, 60 i 80 mg / kg, N = 7, 5 i 5). Wyniki behawioralne zaobserwowane po trzech dawkach PTZ ujawniły wyraźne różnice zależne od dawki po pojedynczym wstrzyknięciu. Zwierzęta leczone PTZ w dawce 40 mg/kg wykazywały skurcze, ale nie wykazywały drgawek limbicznych ani mioklonie. Natomiast zwierzęta leczon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W badaniu tym zastosowano kategoryzację zachowań na podstawie ekspresji motorycznej, aby zapewnić bardziej kompleksowe ramy do analizy dynamiki napadów. Takie podejście umożliwia ilościowe określenie kluczowych parametrów, w tym opóźnienia, czasu trwania i częstotliwości skurczów, mioklonie i napadów limbicznych. Wyniki cotygodniowych zastrzyków PTZ wykazały, że powtarzająca się ekspozycja znacząco zmienia czas i częstotliwość napadów limbicznych, ze znacznym zmniejszeniem opóźnienia do pierwszych skurczów i napadów limb...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Prace te były częściowo wspierane przez Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, granty nr 308110/2020-0 i 316441/2023-6), Fundação de Amparo e Promoção da Ciência, Tecnologia e Inovação do Rio Grande de Norte (FAPERN, numer grantu 042/2022) oraz Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, grant nr #385/2019) oraz Propesq-UFRN (numer grantu PVP18039-2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% roztwór chlorku soduFresenius Kabi Brazylia Sp. z o.o.Zobacz materiał 74MK3168 TGLZamknięty system do podawania dożylnego; roztwór do wstrzykiwań, 250 ml.
Skala analitycznaShimadzu powiedział:ATY224 powiedział:Maksymalny zakres ważenia: 220 g, Minimalna nośność: 10 mg, Dokładność odczytu: 0,1 mg. Nr. seryjny: 1311070096
KameraJortan Jortan powiedział:Jortan-8816AHDKamera CCD na podczerwień, system NTSC, rozdzielczość 2,0 MP, obiektyw 3,6 mm, zasilacz DC 12 V.
Cyfrowy miernik luksaMinipaMLM-1011 powiedział:Mierzy natężenie światła w luksach.
Igła podskórnaDescarpack (Plecak Descarpack)353101Rozmiar 26,5 g.
Myszy--Samce myszy C57BL/6 typu dzikiego. Dwa-trzy miesiące.
PentylenotetrazolSigma-Aldrich (Merck)Zobacz materiał P6500-25GProszek, stymulant OUN. Zakupione: 25 g. Przechowywanie: -25 °C.
Oprogramowanie: MouseLabTracker  Giuliano Vilela-Oprogramowanie open-source, dokument źródłowy: DOI: 10.1016/j.jneumeth.2006.04.005.
Strona: https://neuro.ufrn.br/softwares/mouselabtracker
Oprogramowanie: Solomon CoderAndr&aaostry; s Pé Ter-Oprogramowanie typu open source, v.19.08.02.
Strona:  https://solomon.andraspeter.com/
TermohigrometrHikari powiedział:HK-T240Mierzy temperaturę i wilgotność.

Bibliografia

  1. Rogawski, M. A., Löscher, W. The neurobiology of antiepileptic drugs. Nat Rev Neurosci. 5 (7), 553-564 (2004).
  2. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  3. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 32 (3), 281-294 (1972).
  4. Delgado, J. M. R., Sevillano, M. Evolution of repeated hippocampal seizures in the cat. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 13 (5), 722-733 (1961).
  5. Lothman, E. W., Collins, R. C. Kainic acid induced limbic seizures: metabolic, behavioral, electroencephalographic and neuropathological correlates. Brain Res. 218 (1-2), 299-318 (1981).
  6. Lévesque, M., Avoli, M. The kainic acid model of temporal lobe epilepsy. Neurosci Biobehav Rev. 37 (10 Pt 2), 2887-2899 (2013).
  7. Castro, O. W., et al. Comparative neuroanatomical and temporal characterization of FluoroJade-positive neurodegeneration after status epilepticus induced by systemic and intrahippocampal pilocarpine in Wistar rats. Brain Res. 1374, 43-55 (2011).
  8. Turski, W. A., et al. Limbic seizures produced by pilocarpine in rats: behavioural, electroencephalographic and neuropathological study. Behav Brain Res. 9 (3), 315-335 (1983).
  9. Leite, J. P., Garcia-Cairasco, N., Cavalheiro, E. A. New insights from the use of pilocarpine and kainate models. Epilepsy Res. 50 (1-2), 93-103 (2002).
  10. Garcia-Cairasco, N., et al. New insights into behavioral evaluation of audiogenic seizures. A comparison of two ethological methods. Behav Brain Res. 48 (1), 49-56 (1992).
  11. Garcia-Cairasco, N., Rossetti, F., Oliveira, J. A. C., Furtado, M. deA. Neuroethological study of status epilepticus induced by systemic pilocarpine in Wistar audiogenic rats (WAR strain). Epilepsy Behav. 5 (4), 455-463 (2004).
  12. Gschwind, T., et al. Hidden behavioral fingerprints in epilepsy. Neuron. 111 (9), 1440-1452.e5 (2023).
  13. Macdonald, R. L., Barker, J. L. Specific antagonism of GABA-mediated postsynaptic inhibition in cultured mammalian spinal cord neurons: a common mode of convulsant action. Neurology. 28 (4), 325-330 (1978).
  14. Dhir, A. Pentylenetetrazol (PTZ) kindling model of epilepsy. Curr Protoc Neurosci. 58 (1), 9.37.1-9.37.12 (2012).
  15. Samokhina, E., Samokhin, A. Neuropathological profile of the pentylenetetrazol (PTZ) kindling model. Int J Neurosci. 128 (11), 1086-1096 (2018).
  16. Shimada, T., Yamagata, K. Pentylenetetrazole-induced kindling mouse model. J Vis Exp. (136), e56573(2018).
  17. Lüttjohann, A., Fabene, P. F., Van Luijtelaar, G. A revised Racine's scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
  18. Van Erum, J., Van Dam, D., De Deyn, P. P. PTZ-induced seizures in mice require a revised Racine scale. Epilepsy Behav. 95, 51-55 (2019).
  19. Tort, A. B. L., et al. A simple webcam-based approach for the measurement of rodent locomotion and other behavioural parameters. J Neurosci Methods. 157 (1), 91-97 (2006).
  20. Gelinas, J. N., Khodagholy, D., Thesen, T., Devinsky, O., Buzsáki, G. Interictal epileptiform discharges induce hippocampal-cortical coupling in temporal lobe epilepsy. Nat Med. 22 (6), 641-648 (2016).
  21. Nizinska, K., et al. Behavioral characteristics as potential biomarkers of the development and phenotype of epilepsy in a rat model of temporal lobe epilepsy. Sci Rep. 11 (1), 8665(2021).
  22. Monteiro, ÁB., et al. Pentylenetetrazole: A review. Neurochem Int. 180, 105841(2024).
  23. Barker-Haliski, M., Steve White, H. Validated animal models for antiseizure drug (ASD) discovery: Advantages and potential pitfalls in ASD screening. Neuropharmacology. 167, 107750(2020).
  24. Santucci, V., et al. EEG effects of IV infusion of pentylenetetrazol in rats: A model for screening and classifying antiepileptic compounds. Psychopharmacology. 87 (3), 337-343 (1985).
  25. Swinyard, E. A., Brown, W. C., Goodman, L. S. Comparative assays of antiepileptic drugs in mice and rats. J Pharmacol Exp Ther. 106 (3), 319-330 (1952).
  26. Krall, R. L., Penry, J. K., White, B. G., Kupferberg, H. J., Swinyard, E. A. Antiepileptic drug development: II. Anticonvulsant drug screening. Epilepsia. 19 (4), 409-428 (1978).
  27. Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
  28. McIntyre, D. C., Poulter, M. O., Gilby, K. Kindling: some old and some new. Epilepsy Res. 50 (1-2), 79-92 (2002).
  29. Yuskaitis, C. J., et al. Factors influencing the acute pentylenetetrazole-induced seizure paradigm and a literature review. Ann Clin Transl Neurol. 8 (7), 1388-1397 (2021).
  30. da Silva, L. F., Pereira, P., Elisabetsky, E. A Neuropharmacological analysis of PTZ-induced kindling in mice. Gen Pharmacol. 31 (1), 47-50 (1998).
  31. Copping, N. A., Adhikari, A., Petkova, S. P., Silverman, J. L. Genetic backgrounds have unique seizure response profiles and behavioral outcomes following convulsant administration. Epilepsy Behav. 101, 106547(2019).
  32. Medina, A. E., Manhães, A. C., Schmidt, S. L. Sex differences in sensitivity to seizures elicited by pentylenetetrazol in mice. Pharmacol Biochem Behav. 68 (3), 591-596 (2001).
  33. Pollo, M. L. M., Gimenes, C., Covolan, L. Male rats are more vulnerable to pentylenetetrazole-kindling model but females have more spatial memory-related deficits. Epilepsy Behav. 129, 108632(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Drgawki wywo ane pentylenetetrazolemnapady limbicznezdarzenia miokloniczneanaliza skurcz wledzenie wideomodele zwierz ce epilepsjikwantyfikacja napad wantagonista GABAergiczny

Powiązane artykuły