Method Article

Dostrajanie trybów kurczliwości i deformacji aktywnych zespołów na bazie aktyny in vitro: od dwuwymiarowych sieci aktywnych do kropli ciekłokrystalicznych

DOI:

10.3791/68127

⸱

July 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biophysical Dynamics, University of Chicago, 2Department of Materials Science & Engineering, Clemson University

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops
Posted by JoVE Editors on 8/28/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68127

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy metody przygotowania quasi-dwuwymiarowych (2D) splątanych, usieciowanych i ciekłokrystalicznych zespołów aktynowych z oczyszczonych białek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Materiały oparte na cytoszkieletach aktynowych są szeroko badane jako modelowe materiały komórkowe do wyjaśnienia fizycznych mechanizmów mechaniki komórki, takich jak regulacja kształtu i wytwarzanie siły, a także intrygujące miękkie materiały polimerowe. W tej metodzie szczegółowo opisujemy tworzenie zespołów na bazie aktyny in vitro przy użyciu oczyszczonego białka do badań mikroskopii fluorescencyjnej. Polimeryzujemy długie włókna aktynowe w komorze próbki i używamy zubożenia polimeru do stłoczenia włókien w dwuwymiarowej (2D) splątanej sieci na powierzchni pasywowanej warstwą środka powierzchniowo czynnego. Dodanie włókien miozyny II mięśni szkieletowych w obecności adenozynotrifosforanu (ATP) indukuje skurcz sieci aktyny. Łącząc filamenty aktynowe z środkiem sieciującym, dostrajamy kurczliwość montażu, przechodząc od materiału, który się wygina, do materiału, który ślizga się w mikroskali. Zmniejszając długość włókien aktynowych poprzez kopolimeryzację aktyny w obecności białka zamykającego, dostrajamy materiał z sieci 2D do ciekłego kryształu. Sieciowanie rozproszonych krótkich filamentów aktynowych powoduje tworzenie się trójwymiarowych (3D) kropelek ciekłokrystalicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktywne materiały biologiczne leżą u podstaw procesów mechanicznych w różnych procesach fizjologicznych, w tym transportu wewnątrzkomórkowego, migracji komórek, regulacji kształtu komórki i generowania siły biologicznej1,2,3. Zespoły in vitro układów cytoszkieletowych, zbudowane z oczyszczonych i zmodyfikowanych składników białkowych samoorganizujących się w buforze, są uznanym narzędziem do charakteryzowania podstawowych procesów biofizycznych i biochemicznych4,5,6,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Białka i znakowanie: Dla celów tego protokołu zakłada się, że badacz zaczyna od zapasów oczyszczonych białek, które są znakowane fluorescencyjnie, gdy jest to właściwe do badań mikroskopii fluorescencyjnej. Białka te można zakupić lub oczyścić i oznaczyć fluorescencyjnie w lab31,32,33,34,35,36,37. W tym protokole wykorzystano zapasy białek, które zostały zamrożone w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C. Białka zazwy....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szeroki zakres zespołów aktynowych może być tworzony w systemach modelowych z wykorzystaniem oczyszczonych białek, postępując zgodnie z ogólną strategią opisaną w tych metodach, gdzie aktyna jest polimeryzowana do włókien w obecności białek pomocniczych, które modyfikują architekturę montażu (Rysunek 1). Kiedy aktyna jest polimeryzowana do włókien bez środków sieciujących lub białka zamykającego, tworzy splątane sieci włókien (Rysunek 1A). Dodanie crosslinkera do sieci splątanych p.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje wiele czynników związanych z produkcją powtarzalnych zespołów aktyny. Jednym z najbardziej krytycznych elementów tworzenia powtarzalnych, możliwych do przeanalizowania danych jest powierzchnia szkła nakrywkowego komory próbki. Białka w próbkach aktyny in vitro, zwłaszcza miozyna, są niezwykle lepkie i przylegają do nieobrobionych lub źle obrobionych powierzchni szklanych, sprawiając, że próbka staje się bezużyteczna (ryc. 5A). Omówiliśmy standardowy sposób przygotowania pow.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Toddowi Thorensonowi, Mike'owi Murrellowi, Jennifer Ross, Patrickowi McCallowi i innym członkom laboratoriów Gardel i Kovar (University of Chicago) za użyteczne dyskusje podczas opracowywania metod. M.A.C. i S.R. byli częściowo wspierani przez Clemson University's College of Engineering Computing and Applied Sciences Undergraduate Research Opportunity Grants, a V. J. A. był wspierany przez Clemson Biophysics REU w ramach NSF Award #2349368 z finansowaniem z DBI i Programy EPSCoR. Praca ta była również częściowo wspierana przez program EPSCoR Narodowej Fundacji Nauki w ramach nagrody NSF #OIA-1655740, częściowo przez i częściowo przez program Clemson Creativ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówka do mikrowirówek 0,6 mlFisher Scientific05-408-123
008-FluorosurfaktantRAN Biotechnologies00115081361-6525Alternatywa dla wstępnie zmieszanego roztworu
008-FluoroSurfaktant w HFE7500RAN Biotechnologies008-FluoroSurfaktant-2wtH-50GWstępnie zmieszany roztwór
2-merkaptoetanol (β-merkaptoetanol)Sigma Aldrich63689Numer CAS: 60-24-2
Roztwór podstawowy: 25 mM w wodzie MilliQ, przechowywany w temperaturze 4 & stopni; Kwas
C 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy (HEPES)Sigma AldrichH3375Numer CAS: 7365-45-9
5 min EpoksydDevcon14250
Cytoszkielet aktynowy, Inc.AKL99-A>99% czysty mięsień szkieletowy królika
(alternatywa dla oczyszczania)
Aktyna (znakowana rodaminą)Cytoszkielet, Inc.AR05-AMięśnie szkieletowe królika
(Alternatywnie do oczyszczania)
Adenozyna 5′-trifosforan (ATP)Sigma AldrichA6419Numer CAS: 34369-07-8
Roztwór podstawowy: 25 mM w wodzie MilliQ, przechowywać w temperaturze -20 ° C
Przechowywać w stanie zamrożonym, aby uniknąć hydrolizy
Chlorek wapnia (CaCl2)Sigma AldrichC5670Numer CAS: 10043-52-4
Białko zamykające (mysz)Oczyszczone z nadekspresji w E.coli za pomocą HisTag
Roztwór podstawowy: 20 mM w buforze białkowym ograniczającym w temperaturze -80 & stopni; C
Katalaza z wątroby bydlęcejSigma AldrichC9322Numer CAS: 9001-05-2
Roztwór podstawowy: 85 ku/ml, przechowywać z oksydazą glukozową w temperaturze -20&; C
Szkło osłonoweFisherbrand12544Cborokrzemian, #1,5, 24 mm x 40 mm
Fisherbrand not Fisher Finest
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG8270Numer CAS: 50-99-7
Roztwór podstawowy: 225 mg/ml w wodzie MilliQ, przechowywać w temperaturze -20 ° C
Dithiothreitol (DTT)Sigma Aldrich3860-OPNumer CAS: 3483-12-3
Roztwór podstawowy: 1 M w wodzie MilliQ, przechowywać w temperaturze -20 ° C
Taśma dwustronna3M3136
Alchohol etylowy 200 ProofPHARMCO111000200Numer CAS: 64-17-5
200 proof
Kwas glikolu etylenowego-bis(2-aminoetylo)-N,N,N′,N′-tetraoctowy (EGTA)Sigma AldrichE3889Numer CAS: 67-42-5
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma AldrichE9884Numer CAS: 60-00-4
Oksydaza glukozowaSigma Aldrich345386Numer CAS: 9001-37-0
Roztwór podstawowy: 135 mg/ml w wodzie MilliQ, przechowywać z katalazą w temperaturze -20 &; C
GlycerolSigma Aldrich356352MNumer CAS: 56-81-5
ImidazolFisher BP305-50Numer CAS: 288-32-4
Chlorek magnezu (MgCl2)Odczynniki Fisher BP214Numer CAS: 7786-30-3, 7791-18-6
MetylocelulozaSigma AldrichM0512Numer CAS: 9004-67-5
15 centytypuazowe
szkiełka mikroskopowe Zwykłamikroskopia elektronowa Sciences / Złota pieczęć63710-05  3 "x1", grubość 1 mm
MilliQ woda MilliporeCUFBI001Ultraczysta woda
Novec-7500 Płyn inżynieryjny3M7100134816Alternatywny do wstępnie zmieszanego roztworu
Chlorek potasu (KCl)Sigma AldrichP3911Numer CAS: 7447-40-7
Fosforan potasu (KPO4)Sigma AldrichP3786Numer CAS: 7758-11-4
Aceton do mięśni szkieletowych królika w proszkuPel-Freez Biologicals41995-1Stosowany do oczyszczania aktyny (alternatywa dla zakupu)
Przechowywać około 30 mM w buforze aktyny G w temperaturze -80 & stopni; C
Azydek soduSigma Aldrich71289Numer CAS: 26626-22-8
Tetrametylorodamina-C6-maleimidAnaSpecAS-81445Numer CAS: 174568-68-4 Używany do oczyszczania aktyny (alternatywa dla zakupu)
Przechowywać około 30 mM w buforze aktynowym G w temperaturze -80 stopni C. Używany do etykietowania aktyny (alternatywa do zakupu)
Kwas solny Tris (Tris HCl)Sigma Aldrich648317Numer CAS: 1185-53-1
Kąpiel ultradźwiękowaEmerson Branson 
BioodczynnikiCPX2800H

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marchetti, M. C., et al. Hydrodynamics of soft active matter. Rev Mod Phys. 85 (3), 1143-1189 (2013).
  2. Needleman, D., Dogic, Z. Active matter at the interface between materials science and cell biology. Nat Rev Mater. 2 (9), 17048(2017).
  3. Murrell, M., Oakes, P. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Actin Based AssembliesActin PolymerizationMyosin II FilamentsFluorescence MicroscopyLiquid Crystal DropsCrosslinked Actin NetworksTwo Dimensional NetworksNetwork ContractilityCapping ProteinTime Lapse Imaging

Related Articles