Method Article

Dostrajanie trybów kurczliwości i deformacji aktywnych zespołów na bazie aktyny in vitro: od dwuwymiarowych sieci aktywnych do kropli ciekłokrystalicznych

DOI:

10.3791/68127

⸱

July 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biophysical Dynamics, University of Chicago, 2Department of Materials Science & Engineering, Clemson University

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy metody przygotowania quasi-dwuwymiarowych (2D) splątanych, usieciowanych i ciekłokrystalicznych zespołów aktynowych z oczyszczonych białek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Materiały oparte na cytoszkieletach aktynowych są szeroko badane jako modelowe materiały komórkowe do wyjaśnienia fizycznych mechanizmów mechaniki komórki, takich jak regulacja kształtu i wytwarzanie siły, a także intrygujące miękkie materiały polimerowe. W tej metodzie szczegółowo opisujemy tworzenie zespołów na bazie aktyny in vitro przy użyciu oczyszczonego białka do badań mikroskopii fluorescencyjnej. Polimeryzujemy długie włókna aktynowe w komorze próbki i używamy zubożenia polimeru do stłoczenia włókien w dwuwymiarowej (2D) splątanej sieci na powierzchni pasywowanej warstwą środka powierzchniowo czynnego. Dodanie włókien miozyny II mięśni szkieletowych w obecności adenozynotrifosforanu (ATP) indukuje skurcz sieci aktyny. Łącząc filamenty aktynowe z środkiem sieciującym, dostrajamy kurczliwość montażu, przechodząc od materiału, który się wygina, do materiału, który ślizga się w mikroskali. Zmniejszając długość włókien aktynowych poprzez kopolimeryzację aktyny w obecności białka zamykającego, dostrajamy materiał z sieci 2D do ciekłego kryształu. Sieciowanie rozproszonych krótkich filamentów aktynowych powoduje tworzenie się trójwymiarowych (3D) kropelek ciekłokrystalicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktywne materiały biologiczne leżą u podstaw procesów mechanicznych w różnych procesach fizjologicznych, w tym transportu wewnątrzkomórkowego, migracji komórek, regulacji kształtu komórki i generowania siły biologicznej1,2,3. Zespoły in vitro układów cytoszkieletowych, zbudowane z oczyszczonych i zmodyfikowanych składników białkowych samoorganizujących się w buforze, są uznanym narzędziem do charakteryzowania podstawowych procesów biofizycznych i biochemicznych4,5,6,7. Te uproszczone systemy modelowe pozwalają na badanie białek bez złożoności środowisk komórkowych, co pozwala na określenie ról poszczególnych składników. Oprócz wspierania podstawowych badań biologicznych, zespoły cytoszkieletu in vitro są również szeroko rozwijane jako systemy eksperymentalne do badania materiałów ciekłokrystalicznych oraz aktywnych lub niezrównoważonych8,9,10,11,12,13,14,15.

Aktyna jest kluczowym biopolimerem w zespołach cytoszkieletu, regulującym mechanikę i dynamikę komórek poprzez siły motoryczne i napędzane polimeryzacją3,16. Eksperymenty z mikroskopią fluorescencyjną umożliwiają wizualizację zmian strukturalnych sieci aktynowej podczas procesów takich jak skurcz napędzany silnikiem i wiązanie aktyny przez sieciowanie białek. Obrazowanie trójwymiarowych sieci aktynowych w trakcie ich przebudowy przez wbudowane białka motoryczne rzuciło światło na rolę środków sieciujących aktyny w kurczeniu się sieci i tworzeniu wzorców12,17,18,19. Jednak quasi-dwuwymiarowe sieci aktynowe pokonują wyzwania związane z obrazowaniem z wystarczającą rozdzielczością czasoprzestrzenną, aby uchwycić zmiany strukturalne sieci. Dodatkowo, quasi-dwuwymiarowe struktury aktynowe o dużej gęstości są bliższym naśladownictwem zespołów komórkowych, takich jak gęsta kora aktynowa komórki20. Strategie wytwarzania quasi-dwuwymiarowych struktur aktynowych obejmowały przyłączanie białek zarodkujących aktynę do szkiełka nakrywkowego21,22, sprzężenie aktyny z powierzchnią za pomocą cząsteczek łącznikowych10,23,24, tworzenie gęstych wiązek aktyny przyczepionych do koralików na powierzchni szkiełka nakrywkowego25,26oraz stężenie włókien aktynowych na powierzchni szkiełka nakrywkowego za pomocą molekularnych środków tłumiących10,27.

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę tworzenia powtarzalnych modeli zespołów opartych na aktynie i jak je modyfikować, aby przygotować warianty od aktywnych sieci do quasi-2D ciekłych kryształów i kropel nematycznych. Wcześniej używaliśmy podobnych metod do badania powstawania oddzielonych fazowo kropelek ciekłokrystalicznych krótkich włókien aktynowych z dodatkiem środka sieciującego11, zmiany w trybach deformacji sieci aktynowej generowanej przez miozynę II (np. wyboczenie filamentu lub względne przesuwanie) z sieciowaniem i łącznością filamentu28, różnice w siłach generowanych przez miozynę II na wiązkach aktyny o różnych odstępach i zgodności29oraz miozyna II transport30. Zastosowanie białek sieciujących i białek cappingujących aktynę pozwala na systematyczną zmianę długości włókien aktynowych i architektury składania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Białka i znakowanie: Dla celów tego protokołu zakłada się, że badacz zaczyna od zapasów oczyszczonych białek, które są znakowane fluorescencyjnie, gdy jest to właściwe do badań mikroskopii fluorescencyjnej. Białka te można zakupić lub oczyścić i oznaczyć fluorescencyjnie w lab31,32,33,34,35,36,37. W tym protokole wykorzystano zapasy białek, które zostały zamrożone w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C. Białka zazwyczaj można znakować podobnymi metodami. Białko może być oznaczone jako etap oczyszczania lub z zamrożonego wywaru. Rozmrozić zamrożone zapasy białka na lodzie przed przystąpieniem do etykietowania. Poniżej przedstawiono metodę fluorescencyjnego znakowania miozyny II (miozyny) mięśni szkieletowych za pomocą fluoroforu funkcjonalizowanego maleimidem (zaadaptowanego z38).

1. Przygotuj fluorescencyjnie znakowaną miozynę

  1. Zacznij od ~2 ml miozyny w stężeniu 5-10 mg/mL.
    UWAGA: W tym protokole użyto miozyny II mięśni szkieletowych oczyszczonej z mięśnia kurczaka przy użyciu opublikowanych metod35. Miozyna jest przechowywana w buforze do przechowywania miozyny (25 mM KPO4, 0,6 M KCl, 10 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 1 mM ditiotreitol (DTT), pH 6,6), albo bezpośrednio po oczyszczeniu, albo z zamrożonego bulionu. Ważne jest, aby miozyna była zawsze zimna, aby zapobiec utracie aktywności motorycznej.
  2. Dodać DTT do rozmrożonego roztworu miozyny do końcowego stężenia 10 mM. Użyj roztworu podstawowego 1 M DTT, aby ograniczyć objętość.
    UWAGA: DTT redukuje grupę tiolową cysteiny w białku miozyny, przygotowując je do reakcji z maleimidem do znakowania.
  3. Aby zapobiec zakłóceniom w reakcji etykietowania, należy usunąć naziemną telewizję cyfrową przez dializę przez noc w temperaturze 50 mM HEPES, 500 mM KCl, 1 mM EDTA, pH 7,6, w temperaturze 4 °C.
  4. Po dializie odwirować roztwór miozyny o sile 100 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut, aby rozdrobnić wszelkie kruszywa. Zebrać supernatant.
  5. Oznaczyć stężenie miozyny w supernatancie za pomocą spektrofotometru. Oszacuj stężenie miozyny za pomocą współczynnika ekstynkcji przy 280 nm wynoszącego ~148 000 M-1 cm-1 dla miozyny mięśni szkieletowych38. Ten współczynnik ekstynkcji zakłada, że "monomer" składa się z jednego ciężkiego łańcucha, jednego niezbędnego łańcucha lekkiego i jednego regulatorowego łańcucha lekkiego.
  6. Przygotować fluorofor do reakcji znakowania przez ponowne zawieszenie sproszkowanego fluoroforu w suchym dimetylosulfotlenku (DMSO) do stężenia 5 mM fluoroforu.
    UWAGA: Każdy fluorofor z grupą reaktywną maleimidu powinien działać. Zastosowano maleimid Alexa 647. DMSO jest higroskopijny i gromadzi wodę. "Suchy" DMSO odnosi się do DMSO, który był przechowywany w środowisku, aby zapobiec gromadzeniu się wody. Aby upewnić się, że rozpuszczalnik jest suchy DMSO, do tego etapu użyto świeżo otwartej ampułki DMSO. Nie umieszczaj roztworów DMSO na lodzie. DMSO ma temperaturę topnienia 19 °C, więc musi mieć temperaturę pokojową (lub nieco wyższą), aby pipetować39.
    UWAGA: DMSO może przebić rękawice, dlatego dobrą praktyką jest noszenie podwójnych rękawic nitrylowych i dbanie o to, aby nie dopuścić do rozlania.
  7. Aby przygotować miozynę do dodania fluoroforu, na krótko zdejmij roztwór miozyny z lodu i pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej (RT).
    UWAGA: Nie pozostawiaj miozyny w RT dłużej niż to konieczne. Wykonaj ten krok po zawieszeniu fluoroforu w DMSO.
  8. Gdy tylko roztwór miozyny znajdzie się w pobliżu RT, dodaj roztwór fluoroforu do miozyny i szybko wymieszaj, tak aby stosunek molowy fluoroforu do miozyny wynosił 5:1. Umieść roztwór miozyny na lodzie, gdy tylko zostanie zmieszany z fluoroforem.
  9. Inkubować na lodzie przez 1 godzinę, chronić przed światłem, a następnie zatrzymać reakcję poprzez dodanie DTT do stężenia 1 mM. Użyj zapasów DTT o wielkości 1 m, aby zminimalizować dodawany wolumen.
  10. Usuń nieprzereagowane fluorofory. Użyj jednej z dwóch metod opisanych poniżej:
    1. Opcja 1:
      1. Polimeryzować miozynę, powoli rozcieńczając ją do buforu F (10 mM Imidazolu, 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM EGTA, 4 mM ATP, pH 7,5). Jest to około 10-krotne rozcieńczenie, w zależności od objętości barwnika dodanego w kroku 1.8.
      2. Inkubować na lodzie przez 20 minut. Wirować przy 8 000 x g w wirówce z chłodzeniem w temperaturze 4 °C przez 10 minut, aby uzyskać granulki.
      3. Odrzucić supernatant zawierający wolny barwnik i ponownie zawiesić/zdepolimeryzować miozynę za pomocą buforu do przechowywania miozyny (od kroku 1). Aby usunąć pozostały barwnik, dializować do 5 mM kwasu 2-[4-(2-sulfoetylo)piperazyno-1-ylo]etanosulfonowego (PIPES), 0,45 M KCl, pH 7,0 (>100-krotny nadmiar objętości) trzy razy przez 15 minut każdy, używając kubka do dializy o napięciu 10 kD.
    2. Opcja 2:
      1. Użyj kolumny odsalającej do wymiany buforu na 5 mM PIPES, 0,45 M KCl, pH 7,0, ze standardowym protokołem producenta kolumny.
  11. Oszacować stosunek fluoroforu do białka, mierząc stężenie miozyny i fluoroforu za pomocą spektrofotometru, stosując współczynniki ekstynkcji dla miozyny przy 280 nm i dla fluoroforu podane przez producenta. Typowy jest stosunek 2-4.
    UWAGA: Znakowana miozyna jest teraz gotowa do błyskawicznego zamrażania podwielokrotności w ciekłym azocie. Podwielokrotności są przechowywane w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.

2. Opcjonalnie: Procedura usuwania nieaktywnej miozyny

UWAGA: Miozyna może być używana bezpośrednio z rozmrożonej porcji w eksperymentach, ale pewna część miozyny będzie nieaktywna. Poniższa procedura opisuje, jak usunąć nieaktywną miozynę. Jest to krok opcjonalny, ale może mieć kluczowe znaczenie dla odtwarzalności. Podwielokrotności miozyny stosuje się przez około 3 dni po rozmrożeniu, przechowując je w temperaturze 4 °C lub na lodzie.

  1. Polimeryzacja nieznakowanej, stabilizowanej falloidyną aktyny:
    1. Wymieszać 10 μl 10x buforu F, 1 μl 100 mM ATP i ddH2O tak, aby końcowa objętość (łącznie z aktyną w kroku 2.1.2) wynosiła 100 μl w probówce do mikrowirówki.
    2. Dodać monomer aktyny do końcowego stężenia 20 μM i wymieszać pipetą.
    3. Aby ustabilizować filamenty aktynowe, dodaj falloidynę do końcowego stężenia 6,7 μM, używając zapasu 100 μM falloidyny w metanolu i pipetuj mieszankę.
      UWAGA: Faloidyna jest toksyną40. Unikaj rozlania i zanieczyszczeń.
    4. Inkubować na lodzie przez 20 minut, aby umożliwić polimeryzację aktyny. Po polimeryzacji aktynę należy przechowywać w temperaturze 4 °C do przyszłego odkręcenia.
  2. Pipetą wymieszać 10 μl aktyny stabilizowanej falloidyną, 3 μl 10x buforu F, 0,3 μl 100 mM ATP, 6 μL 2 M KCl i ddH2O do końcowej objętości 30 μL (w tym objętość związaną z dodaniem miozyny w następnym kroku) w probówce mikrowirówkowej na lodzie.
  3. Dodaj dimeryczną znakowaną miozynę z przygotowanego bulionu do pożądanego stężenia, utrzymując molowy stosunek miozyny do aktyny ≤ 1:6.
  4. Otrzymany roztwór odwirować na zimno (4 °C) o stężeniu 100 000 x g przez 30 minut. Nieaktywna miozyna zwiąże się z włóknami aktyny i pozostanie związana. Nieaktywne włókna miozyny i aktyny utworzą osad podczas wirowania.
  5. Usunąć supernatant (zawierający aktywną miozynę) i przechowywać go w temperaturze 4 °C do wykorzystania w doświadczeniach.
  6. Oszacować stężenie miozyny przy użyciu tej samej metody spektrofotometrycznej do pomiaru stężenia miozyny po znakowaniu.
    UWAGA: Przy stężeniach białka i ATP, które pozostają w supernatancie, pik absorbancji 280 nm jest przesłonięty przez pik absorbancji ATP 260 nm, więc pomiar stężenia poprzez absorbancję związaną z fluoroforem lub pomiar fluorescencji względnej jest dokładniejszy.

3. Przygotuj roztwór środka powierzchniowo czynnego

UWAGA: Roztwór środka powierzchniowo czynnego można również zakupić wstępnie zmieszany i gotowy do użycia.

  1. Zacznij od czystej szklanej fiolki. Wypłucz fiolkę w wodzie i etanolu, aby usunąć potencjalne zanieczyszczenia z oleju, który jest rozpuszczalnikiem środka powierzchniowo czynnego. Używać fiolek ze szkła borokrzemianowego z nakrętką wyłożoną politetrafluoroetylenem (PTFE).
  2. Pobrać 5-20 mg fluorosurfaktantu za pomocą końcówki pipety i umieścić w pobliżu dna szklanej fiolki. Odmierz ilość środka powierzchniowo czynnego wagowo za pomocą wagi z dokładnością submiligramową.
  3. Odmierzyć pipetę odpowiedniej objętości oleju fluorowanego do uzyskania roztworu o stężeniu 2% wag. i zamknąć fiolkę.
    UWAGA: Olej jest lotny, dlatego zamknij fiolkę natychmiast po odmierzeniu.
  4. Wiruj z niską prędkością, aby wymieszać.
    UWAGA: Roztwór można teraz przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni. Wiek i jakość środka powierzchniowo czynnego mogą wpływać zarówno na stłoczenie, jak i wygląd aktyny. Aktyna, która wydaje się nakrapiana, przylega do powierzchni lub nie tłoczy się na powierzchni, może wskazywać, że konieczny jest świeży roztwór środka powierzchniowo czynnego. Przechowywanie w atmosferze azotu może wydłużyć okres przydatności do spożycia.

4. Przygotuj komorę na próbkę (Trzy opcje)

UWAGA: Ta sekcja przedstawia procedurę konstruowania trzech standardowych komór na próbki używanych do przygotowywania próbek do mikroskopii. Poniższe dwie sekcje obejmują przygotowanie właściwej próbki i pasywację komory próbki w celu załadowania próbki.

  1. Opcja 1: Flowcell
    UWAGA: Prosta cela przepływowa jest standardowym sposobem wytwarzania próbek mikroskopowych w wielu laboratoriach. W przypadku tego protokołu jest on szczególnie odpowiedni dla próbek zamkniętych w kroplach emulsji. Uzyskanie dużych, płaskich pól widzenia przy powłoce powierzchniowej środka powierzchniowo czynnego opisanej w niniejszym protokole może być trudne, dlatego w przypadku próbek 2D opcje 2 i 3 są często bardziej powtarzalne. Geometria kanału może również powodować nierównomierne mieszanie składników dodawanych w późniejszym czasie, takich jak miozyna.
    1. Umieść 2 kawałki taśmy dwustronnej równolegle do siebie na całej szerokości szkiełka mikroskopowego, aby utworzyć granice kanału komory przepływowej. Kanał utworzony między dwoma kawałkami taśmy powinien mieć około 2 mm szerokości.
      UWAGA: Mniejsze kanały zapobiegają utknięciu emulsji w początkowej części kanału. Aby uzyskać dobre uszczelnienie, użyj kawałków taśmy nieco dłuższych niż szerokość szklanego suwaka i przytnij po skonstruowaniu komory przepływowej.
    2. Umieść szkiełko nakrywkowe na kanale taśmy. Upewnij się, że szkiełko nakrywkowe jest prostopadłe do szkiełka mikroskopowego. W tym celu należy użyć szkiełka nakrywkowego o wymiarach 30 mm x 40 mm, ponieważ zapewnia on niewielki zwis po umieszczeniu na szkiełku.
    3. Aby uzyskać dobre uszczelnienie i wyeliminować kieszenie powietrzne między taśmą a szkiełkiem nakrywkowym, dociśnij obszar szkiełka nakrywkowego, który styka się z taśmą dwustronną.
      UWAGA: Uważaj, aby nie złamać szkiełka nakrywkowego podczas dociskania wokół krawędzi. Pocieranie obszaru zaokrąglonym przedmiotem, takim jak koniec zaślepionego markera, dobrze sprawdza się w celu dociśnięcia taśmy.
    4. Za pomocą żyletki odetnij nadmiar taśmy ze szkiełka mikroskopowego i szkiełka nakrywkowego, tak aby jedyna widoczna taśma znajdowała się w kanale próbki.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas wykonywania tego kroku, ponieważ łatwo jest przypadkowo złamać szkiełko nakrywkowe podczas próby usunięcia taśmy.
  2. Opcja 2: Butla na nieobrobionym szkiełku nakrywkowym
    UWAGA: Ta opcja jest odpowiednia dla próbek płaskich 2D. Jest wygodny do dodawania składników w różnych momentach podczas eksperymentów mikroskopowych. Ta komora na próbki nie powinna być używana do emulsji, które mają krem, a nie osad, co utrudnia obrazowanie.
    1. Opłucz szkiełko nakrywkowe i szklany cylinder do klonowania wodą, etanolem i wodą. Suszyć na powietrzu.
    2. Używając cienkiej warstwy 5-minutowej żywicy epoksydowej, przyklej szklany cylinder do klonowania do szkiełka nakrywkowego.
      UWAGA: Pomocne jest przyłożenie siły do cylindra podczas wysychania żywicy epoksydowej poprzez umieszczenie czystego przedmiotu na cylindrze. Dobrze sprawdzi się mała pokrywka na szalkę Petriego lub pudełko na szkiełko nakrywkowe.
  3. Opcja 3: Butla na szkiełku nakrywkowym pokrytym silanem
    UWAGA: Ta opcja w sposób powtarzalny powoduje powstanie dużego, płaskiego obszaru w środku komory i zmniejsza przepływ objętościowy próbki. Aby to osiągnąć, stworzono region hydrofobowy, który jest otoczony regionem hydrofilowym na szkiełku nakrywkowym, w wyniku czego otrzymujemy końcową próbkę, która ma sieć aktynową w pasywowanym, ograniczonym obszarze, w którym aktyna jest zakotwiczona w regionach hydrofilowych na krawędzi komory. Ta komora na próbki nie powinna być używana do emulsji, które w buforze składają się raczej w postaci kremu niż osadu, co utrudnia obrazowanie.
    1. Przygotuj szkiełka nakrywkowe z powłoką silanową, aby uczynić je hydrofobowymi.
      1. Załaduj czyste szklane szkiełka nakrywkowe do stojaka ze stali nierdzewnej. W razie potrzeby wstępnie oczyścić szkło przez sonikację w detergencie lub etanolu.
      2. W szklanym naczyniu do barwienia rozcieńczyć trimetoksy(oktylo)silan do 2% roztworu izopropanolu.
      3. Zanurz szkiełka nakrywkowe w roztworze na 10 minut.
      4. Aby spłukać, zastąp roztwór wodą. Podnieś i ponownie zanurz stojaki na szkiełka nakrywkowe sześć razy. Powtórz ten proces jeszcze cztery razy, wymieniając wodę pomiędzy nimi.
      5. Przykryj stojaki folią aluminiową, aby chronić szkiełka nakrywkowe przed kurzem i wysusz je w temperaturze 25-30 °C.
    2. Umieść szkiełko nakrywkowe nasączone oktylosilanem na dnie szklanej szalki Petriego lub innego otwartego szklanego pojemnika, który będzie pasował do środka czyszczącego ozonem ultrafioletowym (UV).
    3. Za pomocą kleszczy umieść kwadrat PTFE o wymiarach 2 mm x 2 mm (wycięty z arkusza) na szkiełku nakrywkowym, który będzie działał jako maska do następnego zabiegu ozonowania promieniowaniem UV.
    4. Szkiełko nakrywkowe należy traktować ozonem UV przez 10 minut. Proces ten sprawia, że szkło jest hydrofilowe w odsłoniętych obszarach, które nie są pokryte maską PTFE.
    5. Ostrożnie wyjmij naczynie, nie naruszając szkiełka nakrywkowego ani kwadratu z PTFE. Przyklej szklany cylinder do klonowania do szkiełka nakrywkowego za pomocą 5-minutowej żywicy epoksydowej. Upewnij się, że cylinder otacza kwadrat PTFE, który można usunąć kleszczami po wyschnięciu żywicy epoksydowej.
      UWAGA: Kwadrat PTFE może być ponownie wykorzystany w przyszłych eksperymentach.

5. Montaż sieci aktynowej

UWAGA: Poniższe informacje dotyczą przygotowania próbki o objętości 50 μL. W przypadku próbek cylindrycznych większa objętość może zmniejszyć wpływ menisku i zwiększyć stabilność próbki.

  1. Do probówki mikrowirówkowej dodać 5 μL buforu 10x F, ddH2O niezbędne do doprowadzenia końcowej objętości do 50 μL, 1 μL beta-merkaptoetanolu 25% obj., 1 μL 225 mg/ml glukozy, 1 μL mieszaniny oksydazy glukozowej (135 mg/ml) i katalazy (85 000 jednostek/ml), 1 μl 25 mM ATP i 10 μl 2% wag. 15 centypuazowej metylocelulozy. Dokładnie wymieszać pipetą.
    UWAGA: Beta merkaptoetanol jest toksyną. Unikaj rozlania i zanieczyszczeń. Odczynniki oksydazy glukozowej, katalazy, glukozy i beta-merkaptoetanolu znajdują się w próbce, tworząc system pochłaniania tlenu. Roztwór podstawowy metylocelulozy przygotowuje się przez mieszanie w temperaturze 4 °C i może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni. Metyloceluloza może wytrącać się z roztworu i należy ją ponownie przygotować, jeśli widoczny jest osad lub jeśli stłoczenie aktyny jest słabe.
  2. Opcjonalnie: Dodaj białko sieciujące (0,1-1 białka sieciującego na każdy 1 monomer aktyny). Pipet mix.
    UWAGA: Białka sieciujące można również dodać po polimeryzacji aktyny i pozostawić do wiązania przez 10-20 minut przed dodaniem miozyny. Jest to preferowane w przypadku stężeń środków sieciujących, które są wystarczająco wysokie, aby wiązać włókna aktynowe - wiązki są bardziej równomiernie i powtarzalnie rozmieszczone na granicy faz środek powierzchniowo czynny-woda. Komora próbki cylindra jest podatna na dodanie środka sieciującego po polimeryzacji aktyny.
  3. W razie potrzeby dodaj falloidynę (1 falloidyna na każde 1-3 monomery aktyny). Mieszanie pipet.
  4. W osobnej probówce wymieszać nieznakowaną i znakowaną aktynę tak, aby po dodaniu całej mieszaniny aktyny do próbki o objętości 50 μl całkowite stężenie wynosiło 2,64 μM. Należy zastosować proporcję 1 znakowanego monomeru aktyny na każde 9 nieznakowanych monomerów aktyny. Pipet mix.
    UWAGA: Monomery aktyny zaczną polimeryzować po dodaniu do roztworu próbki. Dodanie aktyny znakowanej i nieznakowanej oddzielnie może spowodować, że aktyna będzie wyglądała na nakrapianą ciemnymi i fluorescencyjnymi obszarami wzdłuż konturu pojedynczego włókna. Zapasy monomerów aktyny są mieszane, aby zapewnić równomiernie oznakowane włókna aktynowe. Oczyszczanie i etykietowanie aktyny jest opisane w31.
  5. Opcjonalnie: Aby wykonać ciekłe kryształy lub inne eksperymenty z użyciem krótkich włókien aktynowych, dodaj białko zamykające do mieszanki aktynowej z kroku 5.4. Dokładna ilość białka cappingowego zależy od aktywnej frakcji białka i długości docelowych włókien aktynowych, ale zazwyczaj około 1-10% mol% białka cappingowego (w odniesieniu do aktyny) jest wystarczające do stworzenia krótkich włókien do eksperymentów ciekłokrystalicznych. Oczyszczanie białka w czasie zamykania jest opisane w36.
  6. Aby rozpocząć polimeryzację aktyny, dodaj mieszaninę aktyny do roztworu buforu F i pipetuj mieszankę.
  7. Pozostaw aktynę do polimeryzacji w probówce mikrowirówki w temperaturze pokojowej, a następnie dodaj ją do komórki próbki po 10-30 minutach.
  8. Opcjonalnie: W przypadku przygotowywania próbki z butli należy pobrać cały roztwór do końcówki pipety, tak aby był gotowy do pipetowania w kroku 7.4 po załadowaniu komory na próbkę cylindra.

6. Opcjonalnie: Przygotuj emulsje

UWAGA: Czasami wygodnie jest przygotować te próbki w emulsjach, które zapewniają ograniczoną komorę na próbki. Emulsje są przygotowywane przy użyciu podobnych odczynników jak Chowdhury i wsp., w wyniku czego powstaje faza ciągła oleju, w której występują wodne krople emulsji za pośrednictwem środka powierzchniowo czynnego 41. W obecności środka zubożającego, takiego jak metyloceluloza, stosowanego w tym protokole, próbki aktyny będą tłoczyć się do wodnego interfejsu tej emulsji. W przypadku próbek, na których opiera się ten protokół, nie widać różnicy między polimeryzacją aktyny przed lub po dodaniu jej do emulsji; Doniesiono jednak, że etap polimeryzacji jest ważny do rozważenia w niektórych eksperymentach enkapsulacji42.

  1. Dodać 3,5 μl olejowego środka powierzchniowo czynnego do probówki mikrowirówkowej. Do tego kroku użyj przezroczystej, jasnej lub przezroczystej probówki do mikrowirówki.
  2. Nie mieszając, dodać 5 μl roztworu aktyny na wierzch warstwy olejowo-powierzchniowo czynnej. Zamknij probówkę mikrowirówki.
  3. Trzymając górną część probówki do mikrowirówki, przesuń dolną krawędź probówki, aby początkowo utworzyć pianę z widocznymi emulsjami. Kontynuuj przesuwanie tubki, aż pianka nie będzie wykazywać żadnych charakterystycznych cech po podświetleniu, wskazując na mikroemulsje.
    UWAGA: Podczas przygotowywania próbki w emulsjach, przed wykonaniem próbki aktyny powinna być gotowa cela przepływowa lub inna komora na próbkę. Szklana komora na próbkę cylindra nie działa dobrze w przypadku emulsji, ponieważ będą one kremować się do interfejsu powietrza, a nie osadzać się na powierzchni szkła nakrywkowego.

7. Załaduj komorę na próbkę (komory cylindryczne)

  1. Odmierzyć pipetą 5 μl roztworu środka powierzchniowo czynnego na dno komory szklanego cylindra
    UWAGA: Alternatywnie, próbki można uzyskać poprzez pasywację powierzchni za pomocą podpartej dwuwarstwy lipidowej11,29,30.
  2. Przechyl szkiełko nakrywkowe i powoli obracaj, tak aby powierzchnia szkiełka nakrywkowego i dolny cylinder były pokryte roztworem środka powierzchniowo czynnego.
  3. Usuń nadmiar roztworu oleju i środka powierzchniowo czynnego za pomocą pipety, aby uzyskać jak najcieńszą warstwę oleju, nie dopuszczając do całkowitego odparowania oleju, który jest lotny.
  4. Natychmiast dodać do komory roztwór próbki z kroku 5.7.
  5. Przykryj komorę małym kawałkiem taśmy PTFE, aby zapobiec parowaniu i przepływowi.

8. Alternatywnie: Załaduj komorę próbki (komórkę przepływową)

  1. Aby przygotować się do załadowania komory przepływowej, wymieszaj niewielką ilość 5-minutowej żywicy epoksydowej. Kropla o powierzchni mniejszej niż 0,5cm2 jest zazwyczaj wystarczająca.
  2. Aby umieścić próbkę w komorze przepływowej, należy najpierw odpipetować 1-3 μl roztworu oleju i środka powierzchniowo czynnego do kanału próbki w komorze przepływowej, aby utworzyć mały korek z roztworem, który zwilży kanał.
  3. Natychmiast powoli odpipetować objętość roztworu próbki lub zawiesiny emulsji do wejścia do komory przepływowej w celu napełnienia kanału. Zazwyczaj w przypadku kanału o średnicy około 2 mm objętość wynosi około 8 μl. Wejście to strona, do której dodano roztwór oleju i środka powierzchniowo czynnego.
    1. Jeśli objętość próbki przekracza objętość komory przepływowej, przepuść próbkę przez komorę przepływową, umieszczając niestrzępiącą się chusteczkę lub bibułę filtracyjną na drugim końcu kanału.
    2. Jeśli menisk roztworu oleju i środka powierzchniowo czynnego cofnął się, co spowodowało powstanie szczeliny powietrznej, przed dodaniem próbki należy najpierw przechylić komorę przepływową, aby usunąć szczelinę powietrzną na wejściu.
  4. W razie potrzeby dodać dodatkowy roztwór oleju i środka powierzchniowo czynnego do momentu, gdy powietrze przestanie być widoczne w kanale lub w celu wepchnięcia próbki (szczególnie w przypadku emulsji) głębiej do kanału.
  5. Uszczelnij każdą stronę kanału 5-minutową żywicą epoksydową (zmieszaną tuż przed załadowaniem komory przepływowej).

9. Obraz i dodaj miozynę

  1. Zamontuj próbkę na mikroskopie i rozpocznij obrazowanie poklatkowe aktyny za pomocą obiektywu 20x, 40x, 60x lub 100x z zanurzeniem w oleju lub wodzie, aby zapewnić wystarczająco dużą aperturę numeryczną do obrazowania w wysokiej rozdzielczości. W przypadku polimeryzacji w komorze na próbkę należy pozostawić polimeryzację na ~30 minut lub do momentu, gdy nie będzie już widocznego wydłużenia lub ruchu filamentu.
  2. Opcjonalnie: Dodaj narzędzie sieciujące.
  3. Dodaj miozynę za pomocą opcji 1 lub 2 poniżej.
    1. Dodaj miozynę w postaci dimeru pipetowanego na wierzch próbki (nie jest wymagane mieszanie, ponieważ dimer miozyny ulegnie dyfuzji).
    2. Dodaj miozynę w postaci wstępnie spolimeryzowanych włókien. Odpipetować około połowy całkowitej objętości bardzo powoli, aby nie zakłócić stłoczonej aktyny.
      UWAGA: Idealna metoda dla miozyny oprócz uzyskania pożądanej gęstości lub rozmiaru filamentu na powierzchni szkiełka nakrywkowego może się różnić dla różnych architektur aktyny i musi być określona eksperymentalnie.
  4. Rozpocznij obrazowanie poklatkowe.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szeroki zakres zespołów aktynowych może być tworzony w systemach modelowych z wykorzystaniem oczyszczonych białek, postępując zgodnie z ogólną strategią opisaną w tych metodach, gdzie aktyna jest polimeryzowana do włókien w obecności białek pomocniczych, które modyfikują architekturę montażu (Rysunek 1). Kiedy aktyna jest polimeryzowana do włókien bez środków sieciujących lub białka zamykającego, tworzy splątane sieci włókien (Rysunek 1A). Dodanie crosslinkera do sieci splątanych p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje wiele czynników związanych z produkcją powtarzalnych zespołów aktyny. Jednym z najbardziej krytycznych elementów tworzenia powtarzalnych, możliwych do przeanalizowania danych jest powierzchnia szkła nakrywkowego komory próbki. Białka w próbkach aktyny in vitro, zwłaszcza miozyna, są niezwykle lepkie i przylegają do nieobrobionych lub źle obrobionych powierzchni szklanych, sprawiając, że próbka staje się bezużyteczna (ryc. 5A). Omówiliśmy standardowy sposób przygotowania pow...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Toddowi Thorensonowi, Mike'owi Murrellowi, Jennifer Ross, Patrickowi McCallowi i innym członkom laboratoriów Gardel i Kovar (University of Chicago) za użyteczne dyskusje podczas opracowywania metod. M.A.C. i S.R. byli częściowo wspierani przez Clemson University's College of Engineering Computing and Applied Sciences Undergraduate Research Opportunity Grants, a V. J. A. był wspierany przez Clemson Biophysics REU w ramach NSF Award #2349368 z finansowaniem z DBI i Programy EPSCoR. Praca ta była również częściowo wspierana przez program EPSCoR Narodowej Fundacji Nauki w ramach nagrody NSF #OIA-1655740, częściowo przez i częściowo przez program Clemson Creative Inquiry + Undergraduate Research.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówka do mikrowirówek 0,6 mlFisher Scientific05-408-123
008-FluorosurfaktantRAN Biotechnologies00115081361-6525Alternatywa dla wstępnie zmieszanego roztworu
008-FluoroSurfaktant w HFE7500RAN Biotechnologies008-FluoroSurfaktant-2wtH-50GWstępnie zmieszany roztwór
2-merkaptoetanol (β-merkaptoetanol)Sigma Aldrich63689Numer CAS: 60-24-2
Roztwór podstawowy: 25 mM w wodzie MilliQ, przechowywany w temperaturze 4 & stopni; Kwas
C 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy (HEPES)Sigma AldrichH3375Numer CAS: 7365-45-9
5 min EpoksydDevcon14250
Cytoszkielet aktynowy, Inc.AKL99-A>99% czysty mięsień szkieletowy królika
(alternatywa dla oczyszczania)
Aktyna (znakowana rodaminą)Cytoszkielet, Inc.AR05-AMięśnie szkieletowe królika
(Alternatywnie do oczyszczania)
Adenozyna 5′-trifosforan (ATP)Sigma AldrichA6419Numer CAS: 34369-07-8
Roztwór podstawowy: 25 mM w wodzie MilliQ, przechowywać w temperaturze -20 ° C
Przechowywać w stanie zamrożonym, aby uniknąć hydrolizy
Chlorek wapnia (CaCl2)Sigma AldrichC5670Numer CAS: 10043-52-4
Białko zamykające (mysz)Oczyszczone z nadekspresji w E.coli za pomocą HisTag
Roztwór podstawowy: 20 mM w buforze białkowym ograniczającym w temperaturze -80 & stopni; C
Katalaza z wątroby bydlęcejSigma AldrichC9322Numer CAS: 9001-05-2
Roztwór podstawowy: 85 ku/ml, przechowywać z oksydazą glukozową w temperaturze -20&; C
Szkło osłonoweFisherbrand12544Cborokrzemian, #1,5, 24 mm x 40 mm
Fisherbrand not Fisher Finest
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG8270Numer CAS: 50-99-7
Roztwór podstawowy: 225 mg/ml w wodzie MilliQ, przechowywać w temperaturze -20 ° C
Dithiothreitol (DTT)Sigma Aldrich3860-OPNumer CAS: 3483-12-3
Roztwór podstawowy: 1 M w wodzie MilliQ, przechowywać w temperaturze -20 ° C
Taśma dwustronna3M3136
Alchohol etylowy 200 ProofPHARMCO111000200Numer CAS: 64-17-5
200 proof
Kwas glikolu etylenowego-bis(2-aminoetylo)-N,N,N′,N′-tetraoctowy (EGTA)Sigma AldrichE3889Numer CAS: 67-42-5
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma AldrichE9884Numer CAS: 60-00-4
Oksydaza glukozowaSigma Aldrich345386Numer CAS: 9001-37-0
Roztwór podstawowy: 135 mg/ml w wodzie MilliQ, przechowywać z katalazą w temperaturze -20 &; C
GlycerolSigma Aldrich356352MNumer CAS: 56-81-5
ImidazolFisher BP305-50Numer CAS: 288-32-4
Chlorek magnezu (MgCl2)Odczynniki Fisher BP214Numer CAS: 7786-30-3, 7791-18-6
MetylocelulozaSigma AldrichM0512Numer CAS: 9004-67-5
15 centytypuazowe
szkiełka mikroskopowe Zwykłamikroskopia elektronowa Sciences / Złota pieczęć63710-05  3 "x1", grubość 1 mm
MilliQ woda MilliporeCUFBI001Ultraczysta woda
Novec-7500 Płyn inżynieryjny3M7100134816Alternatywny do wstępnie zmieszanego roztworu
Chlorek potasu (KCl)Sigma AldrichP3911Numer CAS: 7447-40-7
Fosforan potasu (KPO4)Sigma AldrichP3786Numer CAS: 7758-11-4
Aceton do mięśni szkieletowych królika w proszkuPel-Freez Biologicals41995-1Stosowany do oczyszczania aktyny (alternatywa dla zakupu)
Przechowywać około 30 mM w buforze aktyny G w temperaturze -80 & stopni; C
Azydek soduSigma Aldrich71289Numer CAS: 26626-22-8
Tetrametylorodamina-C6-maleimidAnaSpecAS-81445Numer CAS: 174568-68-4 Używany do oczyszczania aktyny (alternatywa dla zakupu)
Przechowywać około 30 mM w buforze aktynowym G w temperaturze -80 stopni C. Używany do etykietowania aktyny (alternatywa do zakupu)
Kwas solny Tris (Tris HCl)Sigma Aldrich648317Numer CAS: 1185-53-1
Kąpiel ultradźwiękowaEmerson Branson 
BioodczynnikiCPX2800H

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marchetti, M. C., et al. Hydrodynamics of soft active matter. Rev Mod Phys. 85 (3), 1143-1189 (2013).
  2. Needleman, D., Dogic, Z. Active matter at the interface between materials science and cell biology. Nat Rev Mater. 2 (9), 17048(2017).
  3. Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (8), 486-498 (2015).
  4. Cáceres, R., Abou-Ghali, M., Plastino, J. Reconstituting the actin cytoskeleton at or near surfaces in vitro. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1853 (11), 3006-3014 (2015).
  5. Burla, F., Mulla, Y., Vos, B. E., Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. From mechanical resilience to active material properties in biopolymer networks. Nat Rev Phys. 1 (4), 249-263 (2019).
  6. Bezanilla, M., Gladfelter, A. S., Kovar, D. R., Lee, W. -L. Cytoskeletal dynamics: a view from the membrane. J Cell Biol. 209 (3), 329-337 (2015).
  7. Alfaro-Aco, R., Petry, S. Building the microtubule cytoskeleton piece by piece. J Biol Chem. 290 (28), 17154-17162 (2015).
  8. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  9. Foster, P. J., Fürthauer, S., Shelley, M. J., Needleman, D. J. Active contraction of microtubule networks. eLife. 4, e10837(2015).
  10. Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (51), 20820-20825 (2012).
  11. Weirich, K. L., et al. Liquid behavior of cross-linked actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (9), 2131-2136 (2017).
  12. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nat Phys. 9 (9), 591-597 (2013).
  13. Keber, F. C., et al. Topology and dynamics of active nematic vesicles. Science. 345 (6201), 1135-1139 (2014).
  14. Zhang, R., Kumar, N., Ross, J. L., Gardel, M. L., De Pablo, J. J. Interplay of structure, elasticity, and dynamics in actin-based nematic materials. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (2), E124-E133 (2018).
  15. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar patterns of driven filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  16. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol Rev. 94 (1), 235-263 (2014).
  17. Bendix, P. M., et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophys J. 94 (8), 3126-3136 (2008).
  18. Köhler, S., Schaller, V., Bausch, A. R. Structure formation in active networks. Nat Mater. 10 (6), 462-468 (2011).
  19. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
  20. Svitkina, T. M. Actin cell cortex: structure and molecular organization. Trends Cell Biol. 30 (7), 556-565 (2020).
  21. Reymann, A. -C., et al. Actin network architecture can determine myosin motor activity. Science. 336 (6086), 1310-1314 (2012).
  22. Reymann, A. -C., et al. Nucleation geometry governs ordered actin network structures. Nat Mater. 9 (10), 827-832 (2010).
  23. Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments. eLife. 2, e00116(2013).
  24. Liebe, N. L., et al. Bioinspired membrane interfaces: controlling actomyosin architecture and contractility. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (9), 11586-11598 (2023).
  25. Thoresen, T., Lenz, M., Gardel, M. L. Thick filament length and isoform composition determine self-organized contractile units in actomyosin bundles. Biophys J. 104 (3), 655-665 (2013).
  26. Stachowiak, M. R., et al. Self-organization of myosin II in reconstituted actomyosin bundles. Biophys J. 103 (6), 1265-1274 (2012).
  27. Winkelman, J. D., Bilancia, C. G., Peifer, M., Kovar, D. R. Ena/VASP enabled is a highly processive actin polymerase tailored to self-assemble parallel-bundled F-actin networks with fascin. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 4121-4126 (2014).
  28. Stam, S., et al. Filament rigidity and connectivity tune the deformation modes of active biopolymer networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (47), E10037-E10045 (2017).
  29. Weirich, K. L., Stam, S., Munro, E., Gardel, M. L. Actin bundle architecture and mechanics regulate myosin II force generation. Biophys J. 120 (10), 1957-1970 (2021).
  30. Scholz, M., Weirich, K. L., Gardel, M. L., Dinner, A. R. Tuning molecular motor transport through cytoskeletal filament network organization. J Soft Mat. 16 (8), 2135-2140 (2020).
  31. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. J Biol Chem. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  32. Li, Y., et al. The F-actin bundler αactinin Ain1 is tailored for ring assembly and constriction during cytokinesis in fission yeast. Mol Biol Cell. 27 (11), 1821-1833 (2016).
  33. Skau, C. T., Kovar, D. R. Fimbrin and tropomyosin competition regulates endocytosis and cytokinesis kinetics in fission yeast. Curr Biol. 20 (16), 1415-1422 (2010).
  34. Vignjevic, D., et al. Role of fascin in filopodial protrusion. J Cell Biol. 174 (6), 863-875 (2006).
  35. Margossian, S. S., Lowey, S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle. Methods Enzymol. 85, 55-71 (1982).
  36. Palmgren, S., Ojala, P. J., Wear, M. A., Cooper, J. A., Lappalainen, P. Interactions with PIP2, ADPactin monomers, and capping protein regulate the activity and localization of yeast twinfilin. J Cell Biol. 155 (2), 251-260 (2001).
  37. Craig, S. W., Lancashire, C. L., Cooper, J. A. Preparation of smooth muscle alphaactinin. Methods Enzymol. 85, 316-321 (1982).
  38. Verkhovsky, A. B., Borisy, G. G. Nonsarcomeric mode of myosin II organization in the fibroblast lamellum. J Cell Biol. 123 (3), 637-652 (1993).
  39. LeBel, R. G., Goring, D. A. I. Density, viscosity, refractive index, and hygroscopicity of mixtures of water and dimethyl sulfoxide. J Chem Eng Data. 7 (1), 100-101 (1962).
  40. Lengsfeld, A. M., Lowt, I., Wielandt, T., Dancker, P., Hasselbach, W. Interaction of phalloidin with actin. Proc Natl Acad Sci U S A. 31, 846(1974).
  41. Chowdhury, M. S., et al. Dendronized fluorosurfactant for highly stable waterinfluorinated oil emulsions with minimal interdroplet transfer of small molecules. Nat Commun. 10 (1), 4546(2019).
  42. Alvarado, J., Mulder, B. M., Koenderink, G. H. Alignment of nematic and bundled semiflexible polymers in cellsized confinement. J Soft Mat. 10 (14), 2354-2364 (2014).
  43. Weirich, K. L., Israelachvili, J. N., Fygenson, D. K. Bilayer edges catalyze supported lipid bilayer formation. Biophys J. 98 (1), 85-92 (2010).
  44. Tan, A. J., et al. Topological chaos in active nematics. Nat Phys. 15 (10), 1033-1039 (2019).
  45. Nasirimarekani, V., Strübing, T., Vilfan, A., Guido, I. Tuning the properties of active microtubule networks by depletion forces. Langmuir. 37 (26), 7919-7927 (2021).
  46. Heymann, E. Studies on solgel transformations: I. the inverse solgel transformation of methylcellulose in water. Trans Faraday Soc. 31, 846(1935).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops
Posted by JoVE Editors on 8/28/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68127

Tags

Actin Based AssembliesActin PolymerizationMyosin II FilamentsFluorescence MicroscopyLiquid Crystal DropsCrosslinked Actin NetworksTwo Dimensional NetworksNetwork ContractilityCapping ProteinTime Lapse Imaging

Related Articles