Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek Müllera siatkówki od szczurów Sprague-Dawley (SD)

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68129

⸱

17 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Sichuan Province Ophthalmopathy Prevention & Cure and Visual Function Protection with TCM Laboratory, Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Retinal Image Technology and Chronic Vascular Disease Prevention & Control and Collaborative Innovation Center, Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Ophthalmology, Ziyang Hospital of Traditional Chinese Medicine, 5Department of Ophthalmology, Ineye Hospital of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół izolacji pierwotnych komórek Müllera siatkówki od noworodków szczurów Sprague-Dawley (SD). Procedura obejmuje wyłuszczenie gałek ocznych, wypreparowanie tkanki siatkówki, ekstrakcję i identyfikację komórek oraz kluczowe kwestie dotyczące późniejszej hodowli komórek.

Streszczenie

Komórki Müllera siatkówki (RMC) odgrywają kluczową rolę w dostarczaniu wsparcia strukturalnego i regulowaniu różnych funkcji w siatkówce. Jako podstawowy składnik mikrośrodowiska siatkówki, RMC pełnią kilka ważnych funkcji. Dzięki licznym kanałom jonowym, ligandom, receptorom, transporterom transbłonowym i układom enzymatycznym komórki te przyczyniają się do wydzielania neuroprzekaźników i czynników troficznych, regulują metabolizm siatkówki i utrzymują homeostazę wodno-jonową. Warto zauważyć, że RMC zostały niedawno zidentyfikowane jako znaczące źródło endogennych regeneracyjnych komórek macierzystych siatkówki, oferując nowe cele terapeutyczne w leczeniu chorób zwyrodnieniowych siatkówki. Dlatego badanie RMC jest niezbędne do zrozumienia patologicznych mechanizmów leżących u podstaw zaburzeń siatkówki. Badanie to systematycznie ustanawia znormalizowany protokół eksperymentalny, który obejmuje trawienie trypsyny i oczyszczanie pierwotnych RMC, obserwację morfologiczną przy użyciu odwróconej mikroskopii optycznej oraz barwienie hematoksyliną i eozyną (HE), identyfikację specyficznych białek poprzez barwienie immunofluorescencyjne oraz analizę czystości komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten służy jako cenne odniesienie zarówno dla badań podstawowych, jak i zastosowań klinicznych związanych z RMC, wspierając badanie ich mechanizmów w chorobach siatkówki i przyspieszając rozwój strategii terapeutycznych.

Wprowadzenie

Komórki glejowe Müllera siatkówki (RMC), dominujący makroglej w siatkówce, tworzą rdzeń jednostki nerwowo-naczyniowej siatkówki1,2. Obejmując prawie całą grubość siatkówki, RMC otaczają prawie wszystkie neurony siatkówki i mikrokrążenie. Ich procesy rozciągają się w górę do wewnętrznej błony ograniczającej (ILM), tworząc wierzchołkowe stopy końcowe, i w dół do zewnętrznej błony ograniczającej (OLM), gdzie rozwijają wyspecjalizowane mikrokosmki3. Ta unikalna architektura umożliwia RMC funkcjonowanie jako podstawowe rusztowanie strukturalne dla organizacji siatkówki4,5.

RMC są wzbogacone o kanały jonowe, ligandy, receptory, transportery transbłonowe i enzymy6, i uczestniczą w metabolizmie glukozy w siatkówce poprzez glikolizę7. Kanały jonowe potasu (Kir2.1, Kir4.1) i białka kanału wodnego (AQP4, AQP9, AQP11) wspólnie regulują homeostazę jonów i wody przez błonę komórkową, utrzymując równowagę fizjologiczną siatkówki7. Dodatkowo RMC absorbują i usuwają neuroprzekaźniki uwalniane przez neurony, w tym glutaminian, kwas γ-aminomasłowy (GABA) i glicynę7,8.

Patologiczne stany, takie jak retinopatia cukrzycowa7, jaskra9 i barwnikowe zwyrodnienie siatkówki10 mogą uszkadzać RMC, naruszać barierę krew-siatkówka, wywoływać stany zapalne, zwiększać przepuszczalność naczyń krwionośnych i upośledzać funkcję siatkówki. RMC są również rozpoznawane jako utajone wewnętrzne źródła komórek regeneracyjnych siatkówki11,12. U ryb i niektórych RMC mogą dedyferencjonować się na komórki progenitorowe siatkówki, które zastępują neurony utracone w wyniku urazu13. W siatkówkach dorosłych ssaków RMC wyrażają białka markerowe związane z komórkami macierzystymi14,15, co daje im potencjał do różnicowania się w neurony siatkówki i zastępowania uszkodzonych komórek w chorobach zwyrodnieniowych, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem, jaskra i retinopatia cukrzycowa16. Pierwotne RMC ściśle naśladują ich stan in vivo i mają ogromną wartość w badaniu i leczeniu chorób zwyrodnieniowych siatkówki. Jednak literatura zawiera kilka ustalonych metod izolowania i hodowli pierwotnych RMC, szczególnie od nowonarodzonych szczurów Sprague-Dawley (SD).

Ten protokół wykorzystuje 3-5-dniowe noworodkowe szczury SD, bez preferencji płci. W sterylnych warunkach gałki oczne są wyłuszczane, a tkanka siatkówki jest trawiona za pomocą trypsyny. Pierwotne RMC są następnie izolowane przez wirowanie i oczyszczanie w celu późniejszej hodowli i pasażowania. Analiza morfologiczna przy użyciu odwróconej mikroskopii optycznej w połączeniu z barwieniem hematoksyliną i eozyną (H&E) wykazała, że izolowane komórki wykazywały charakterystyczne cechy RMC. Barwienie immunofluorescencyjne potwierdziło ekspresję markerów białkowych specyficznych dla RMC, w tym syntetazy glutaminy (GS), komórkowego białka wiążącego retinaldehyd (CRALBP), wimentyny, akwaporyny-4 (AQP4) i kanału potasowego prostownika wewnętrznego 4.1 (Kir4.1). Analiza cytometrii przepływowej po znakowaniu przeciwciałami GS i CRALBP wykazała czystość komórek na poziomie ≥90%, co spełnia ustalone kryteria dla eksperymentów biologicznych opartych na RMC i zapewnia przydatność do kolejnych badań funkcjonalnych. Podczas procesu eksperymentalnego komórki w czwartym pasażu wykazywały zmniejszone przyleganie do kolby hodowlanej, zmiany morfologiczne i oznaki starzenia, co ostatecznie doprowadziło do śmierci komórki. W związku z tym w kolejnych eksperymentach wykorzystano tylko komórki z pierwszych trzech pasaży.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych i zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu (numer etyki: 2024069). W badaniu wykorzystano pięćdziesiąt szczurów Sprague-Dawley wolnych od swoistych patogenów (SPF) (3-5 dni, płeć nieokreślona, masa ciała 7-10 g). Zwierzęta zostały pozyskane komercyjnie i trzymane w Centrum Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu (nr licencji na użytkowanie obiektu: SYXK [Sichuan] 2024-049) w standardowych warunkach laboratoryjnych. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Izolacja i kultura podstawowych RMC

  1. Przygotowanie elementów eksperymentalnych
    1. Przed użyciem sterylizuj następujące przedmioty w świetle ultrafioletowym przez co najmniej 30 minut na czystej ławce: kolby hodowlane T25, probówki i stojaki wirówkowe, pipety i stojaki, pojemniki na odpady płynne, zapalniczki, lampy alkoholowe i markery.
    2. Przed użyciem wysterylizuj w autoklawie następujące przedmioty: końcówki do pipet o pojemności 1 ml, płytkę do gięcia, szklane szalki Petriego z pokrywkami, zakrzywioną pęsetę, nylonową siatkę 45 μm (300 oczek), pęsetę zębatą, pęsetę bezzębną i mikrorogówki.
  2. Przygotowanie środowiskowe: Zdezynfekować otoczenie i stół operacyjny do sekcji gałki ocznej światłem ultrafioletowym przez ponad 30 minut. Spryskać alkoholem ręce eksperymentatora za każdym razem przed wejściem i po opuszczeniu czystej ławki. Ustawić inkubator na 37 °C i 5% CO2 . Spryskaj ręce eksperymentatora alkoholem przed i po otwarciu inkubatora.
  3. Przygotowanie roztworu: Przygotuj roztwór D-Hanka, sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco's Eagle (DMEM o wysokiej zawartości glukozy), płodową surowicę bydlęcą (FBS, inaktywowaną termicznie), roztwór penicyliny/streptomycyny (100x) i 0,25% roztwór trypsyny-EDTA.
    UWAGA: Przed użyciem podgrzej DMEM i FBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    1. Przygotować roztwory D-Hanka i PBS zawierające 1% penicyliny/streptomycyny, dodając 100 μl roztworu penicyliny/streptomycyny do 10 ml roztworu odpowiednio D-Hanka lub PBS.
    2. Przygotować kompletną pożywkę hodowlaną, dodając 100 μl roztworu penicyliny/streptomycyny i 2 ml FBS do 10 ml DMEM.
      UWAGA: Przygotuj roztwory na czystym stole laboratoryjnym i użyj ich natychmiast, jeśli to możliwe. Przechowywać kompletną pożywkę hodowlaną w temperaturze 4 °C i ogrzać do temperatury 37 °C przed każdym użyciem. Wyrzucić, jeśli jest przechowywany dłużej niż tydzień.
  4. Usuwanie oczu
    1. Eutanazja noworodków z SD przez zwichnięcie szyjki macicy (bez uduszenia CO2) na wysterylizowanym stole warsztatowym zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami. Zanurz ciała w 75% alkoholu na 5 minut w celu dezynfekcji, a następnie przenieś do sterylnego zakrzywionego naczynia.
    2. Wlej roztwór D-Hanka do dwóch szklanych naczyń hodowlanych o średnicy 10 cm.
    3. Użyj pęsety zębatej, aby otworzyć powiekę wzdłuż szpary powiekowej, aby odsłonić gałkę oczną.
    4. Użyj bezzębnej pęsety trzymanej otwartej i równoległej do szpary powiekowej, aby docisnąć oczodół. Po dotarciu do nerwu wzrokowego i odsłonięciu gałki ocznej zamknij pęsetę, aby podnieść i usunąć gałkę oczną.
    5. Umieść gałkę oczną w szklanym naczyniu hodowlanym z roztworem D-Hanka, przepłucz je i przenieś do innego naczynia ze świeżym roztworem D-Hanka.
      UWAGA: Upewnij się, że gałka oczna pozostaje nienaruszona. Idealnie byłoby, gdyby część nerwu wzrokowego pozostała przyczepiona, aby ułatwić separację tkanki siatkówki.
  5. Rozwarstwienie siatkówki
    1. Przygotuj wysterylizowane puste naczynie hodowlane z pokrywką i wyreguluj mikroskop.
    2. Umieścić szklane naczynie hodowlane z kroku 1.4.5 pod mikroskopem. Użyj zakrzywionych mikrokleszczyków okulistycznych, aby delikatnie przymocować obszar między rogówką a nerwem wzrokowym, aby odsłonić rogówkę.
    3. Przebij połączenie rogówkowo-twardówkowe za pomocą mikro nożyczek rogówkowych. Przeciąć wzdłuż rąbka w okrężnik, a następnie wykonać symetryczne nacięcia twardówki o długości około 2 mm. Zwolnij kleszcze i ponownie zaciśnij na styku nerwu wzrokowego i twardówki.
    4. Użyj drugich kleszczy, aby delikatnie uciskać w pobliżu korzenia nerwu wzrokowego, kierując nacisk w kierunku interfejsu rogówka-nerw wzrokowy. Kiedy pojawi się tkanka soczewki, usuń ją ostrożnie i kontynuuj uciskanie, aż pojawi się tkanka siatkówki.
      UWAGA: Ostrożnie zdejmij soczewkę, aby uniknąć przypadkowego ekstrakcji tkanki siatkówki.
    5. Przenieś oddzieloną tkankę siatkówki do innego sterylnego naczynia hodowlanego za pomocą kleszczy. Przykryj naczynie, spryskaj je alkoholem i połóż na czystej ławce.
  6. Ekstrakcja pierwotnych RMC
    1. Włącz przełącznik wentylacji czystej ławki.
    2. Otwórz pokrywę naczynia do hodowli. Użyj pipety z końcówką o pojemności 1 ml, aby pipetować tkankę siatkówki w górę i w dół około 15 razy, aby rozbić ją na małe kawałki. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    3. Wyjmij naczynie hodowlane z inkubatora i umieść je na czystej ławce. Dodać 2 ml kompletnego podłoża i delikatnie odpipetować, aby zatrzymać trawienie.
      UWAGA: Użyj podwójnej objętości trypsyny, aby zakończyć trawienie. Na przykład, jeśli użyto 1 ml trypsyny, zakończ 2 ml kompletnej pożywki.
    4. Przefiltruj zawiesinę komórek przez nylonowe sito o oczkach 300 do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Umyć naczynie przygotowanym PBS i zebrać pozostałą zawiesinę.
    5. Odwirować probówkę o sile 878 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Odessać i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w 2 ml kompletnej pożywki i ponownie odwirować przy 878 x g przez 5 minut w celu oczyszczenia komórek.
    6. Po odwirowaniu odrzucić supernatant. Zawiesić komórki w 2 ml kompletnego podłoża. Dodać wcześniej 3 ml kompletnej pożywki do każdej kolby T25, a następnie dodać 1 ml zawiesiny komórek. Potrząsnąć kolbą na krzyż i umieścić ją w inkubatorze.
    7. Pierwszą zmianę podłoża należy wykonać po 48 godzinach inkubacji. Wyjąć kolbę z inkubatora i umieścić ją na czystej ławce. Wyrzuć zużytą pożywkę i umyj powierzchnię przylegającą do komórek trzykrotnie 1 ml PBS.
      1. Dodać 5 ml świeżej, kompletnej pożywki. Kontynuuj zmianę pożywki co drugi dzień, aż zbieg komórek przekroczy 90%, a następnie kontynuuj subkulturę.

2. Przekazywanie RMC

UWAGA: Przejście przez komórki, gdy konfluencja przekracza 90%. W tym protokole kultury pierwotne zazwyczaj wymagają pasażowania po 5-6 dniach od izolacji. Czas pierwszego przejścia może się różnić w zależności od gęstości poszycia. Dostosuj gęstość komórek do 4 x 103 komórek/ml i wysiewaj komórki do kolb hodowlanych T25. Gdy konfluencja osiągnie >90% po 3-4 dniach, przystąp do pasażu.

  1. Wyjąć kolbę hodowlaną T25 z inkubatora. Odrzucić pożywkę hodowlaną i przemyć komórki trzykrotnie 1 ml roztworu PBS zawierającego 1% penicyliny/streptomycyny.
  2. Dodać 1 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA do kolby i inkubować przez 1 minutę i 30 s.
  3. Obserwować kolbę pod mikroskopem odwróconym. Gdy komórki wydają się okrągłe, oderwane i zaczynają unosić się na wodzie, wyjmij kolbę z inkubatora. Przenieś go na czystą ławkę i dodaj 2 ml kompletnej pożywki hodowlanej, aby zakończyć trawienie.
  4. Za pomocą pipety odessać zawiesinę komórek. Delikatnie przyłożyć pipetą do ścianki kolby, aby usunąć wszelkie pozostałe przylegające komórki.
  5. Przenieść całą zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Przepłukać ściankę kolby 2 ml PBS zawierającego 1% penicyliny/streptomycyny i dodać do tej samej probówki. Odwirować probówkę o sile 878 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości kompletnego podłoża. Przejdź komórki w stosunku 1:2 lub 1:3 w zależności od potrzeb.
    UWAGA: Użyj komórek w przejściu 2 (P2) do dalszych eksperymentów (Rysunek 1).

3. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)

  1. Przejście nasienne: 2 komórki (P2) na 6-dołkowej płytce zawierającej wstępnie umieszczone sterylne szkiełka nakrywkowe o gęstości 2 x 105 komórek na dołek. Dodać 2 ml kompletnej pożywki hodowlanej do każdej studzienki. Gdy komórki osiągną około 80% konfluencji, wyrzuć pożywkę hodowlaną i delikatnie przepłucz każdą studzienkę dwukrotnie 1 ml PBS.
  2. Dodaj 1 ml 4% utrwalacza paraformaldehydu do każdej studzienki i inkubuj przez 30 minut, aby utrwalić komórki. Wyrzucić utrwalacz i dwukrotnie przemyć komórki 1 ml PBS.
  3. Dodać 1 ml barwnika hematoksylinowego do każdej studzienki i inkubować przez 15 minut. Wyrzucić roztwór barwiący i przepłukać studzienki 2-3 razy 1 ml PBS.
  4. Obserwuj komórki pod mikroskopem. Jeśli plama hematoksylinowa wydaje się zbyt ciemna, użyj 1% alkoholu kwasu solnego, aby odróżnić i usunąć nadmiar barwnika cytoplazmatycznego. Umyj 2-3 razy 1 ml PBS.
  5. Dodaj 1 ml roztworu barwiącego eozynę do każdej studzienki. Obserwuj barwienie pod mikroskopem przez około 30 s lub do momentu uzyskania pożądanej intensywności koloru. Przepłucz studzienki 2-3 razy 1 ml PBS. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach za pomocą neutralnej żywicy.

4. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Nasiona komórek P2 na 6-dołkowej płytce zawierającej wstępnie umieszczone sterylne szkiełka nakrywkowe o gęstości 2 x 105 komórek na basenik. Dodać 2 ml kompletnej pożywki hodowlanej do każdej studzienki.
    1. Gdy komórki osiągną około 80% zbieżności, wyrzuć pożywkę hodowlaną. Usuń szkiełko nakrywkowe i umieść je w słoiku do barwienia. Umyj szkiełko nakrywkowe trzy razy 1 ml PBS, za każdym razem 5 minut.
  2. Dodać około 50 μl roztworu przepuszczalnego (Triton X-100: PBS = 1: 200), aby pokryć komórki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie przemyć trzy razy 1 ml PBS, za każdym razem 5 minut. Dodać około 50 μl 3% roztworu blokującego BSA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  3. Delikatnie wyrzuć roztwór blokujący. Dodać około 200 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego przygotowanego w PBS, aby przykryć szkiełko: AQP4 (1:100), Kir4.1 (1:200), GS (1:200), CRALBP (1:50) lub Vimentin (1:200). Umieścić szkiełko nakrywkowe w wilgotnej komorze i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Umyj szkiełko nakrywkowe trzy razy 1 ml PBS, za każdym razem 5 minut.
  5. Dodać około 200 μl znakowanego FITC koziego przeciwciała anty-króliczego IgG znakowanego FITC17. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 50 minut. Umyj szkiełko nakrywkowe trzy razy 1 ml PBS, za każdym razem 5 minut.
  6. Barwieć jądra DAPI przez 10 minut. Przemyć trzy razy 1 ml PBS, za każdym razem po 5 minut.
  7. Dodaj jedną kroplę środka montażowego zapobiegającego blaknięciu na szkiełko. Zamontuj szkiełko nakrywkowe stroną z komórką do dołu. Uszczelnij i obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym.

5. Cytometria przepływowa

  1. Dostosuj stężenie komórek do 1,0 x 107 komórek/ml za pomocą buforu barwiącego do cytometrii przepływowej.
  2. Podaniec 100 μl zawiesiny jednokomórkowej do dwóch oddzielnych probówek z próbką na każdy warunek. Oznacz jedną probówkę jako kontrolę ujemną (niebarwioną).
  3. Do każdej probówki dodać 100 μl pożywki przepuszczalnej A (z komercyjnie otrzymanego zestawu, patrz Tabela Materiałów). Delikatnie mieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  4. Do każdej probówki dodać 3 ml wstępnie schłodzonego buforu barwiącego do cytometrii przepływowej. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
  5. Dodać 100 μl pożywki przepuszczalnej B (z otrzymanego w handlu zestawu) do każdej probówki i odwirować do wymieszania. Dodać 0,1 μl przeciwciała CRALBP do wyznaczonych probówek z próbkami i 0,8 μl przeciwciała GS do odpowiednich probówek. Nie dodawać żadnych przeciwciał do probówki z kontrolą ujemną. Inkubować w temperaturze 4 °C w ciemności przez 30–60 minut.
  6. Dodać 3 ml buforu barwiącego do cytometrii przepływowej do każdej probówki. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
  7. Zawiesić każdą probówkę w 100 μl buforu barwiącego do cytometrii przepływowej. Dodać 1 μl koziej anty-króliczej IgG (H&L) sprzężonej z FITC do każdej probówki barwionej CRALBP i 1 μl koziej anty-króliczej probówki anty-króliczej (H&L) sprzężonej z PE do każdej probówki barwionej GS. Nie dodawać żadnych przeciwciał do probówki z kontrolą ujemną. Inkubować w temperaturze 4 °C w ciemności przez 30–60 minut.
  8. Dodać 3 ml buforu barwiącego do cytometrii przepływowej do każdej probówki. Wirować przy 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  9. Zawiesić każdą probówkę w 300 μl buforu barwiącego do cytometrii przepływowej. Natychmiast przystąp do analizy cytometrii przepływowej; alternatywnie, ponownie zawiesić w 500 μl 1%-4% paraformaldehydu, przechowywać w temperaturze 2-8 °C w ciemności i przeanalizować w ciągu 24 godzin.
  10. Analizuj próbki ujemne i dodatnie za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po wysianiu pierwotnych komórek do kolby hodowlanej, kolejne wymiany pożywki oraz pasażowanie pomagają wyeliminować słabo przylegające RMC i usunąć szczątki komórkowe powstałe podczas pasażowania, co prowadzi do wzbogacenia populacji RMC w hodowli. RMC zidentyfikowano na podstawie ich morfologii, wykorzystując odwrócony mikroskop optyczny (Rycina 1) oraz barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) (Rycina 2). W celu obserwacji eks...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół izolowania pierwotnych RMC od noworodków szczurów SD. Protokół obejmuje wszystkie etapy, w tym przygotowania przedeksperymentalne, enukleację gałki ocznej, izolację tkanki siatkówki oraz procedury krok po kroku ekstrakcji RMC, hodowli, pasażu i identyfikacji. Podkreślono w nim również kluczowe kwestie, które należy przestrzegać podczas całego procesu hodowli komórkowej, oferując ustandaryzowane wskazówki techniczne dotyczące powiązanych badań.

Do ekstra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszystkich autorów nie łączy konflikt interesów związany z treścią tego artykułu.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fundusz Fundacji Przyrody Prowincji Sichuan (2023NSFSC0690).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1% Triton X-100SolarbioT8200
0,25% Hyklon trypsyny-EDTA SH30042.01B
1% alkohol kwasu solnegoBIOSYSTEMS3803651E
4% ParaformaldehydSolarbioP1110
45μ m Siatka nylonowa (300 oczek)SolarbioYA0926
Płytka 6-dołkowaServicebioIMC202302001
6 cm Szklana szalkaPetriego Normax5058541
75% AlkoholKESHIGEA004
Akwaporyna-4 (AQP4)Proteintech Group, Inc16473-1-AP
BSAServicebioGC305010
Inkubator do hodowli komórkowychThermoFORMA311
komórkowe białko wiążące retinaldehyd (CRALBP)HUABOIHA721330
WirówkaHunan XiangyiTDZ5-WS
Czysta ławkaZHICHENGZHJH-C12
Nożyczki do rogówkiJinzhongBXGJ
DAPISolarbioG1012
Roztwór D-HankSolarbioH1045
DMEM  pożywka o wysokiej zawartości glukozyGibcoC11995500BT
Surowica bydlęca płodu (FBS)Sbjbio life sciencesBC-SE-FBS01
FIX& TRWAŁA ONDULACJA Medium AMultiSciencesGAS006/2
FIX& PERM Medium BMultiSciencesGAS006/2
bufor do barwienia cytometrii przepływowejMultiSciencesS1001
Fluoromount-G Fluorescencyjne mediamontażowe SourthernBiotech0100-01
Przeciwciało poliklonalne syntetazy glutaminyProteintech Group, IncPTG-11037-2-AP-50ul
Koza 324 Anty-królicza IgG H& L PEBiossbs-0295G-PE
Koza Anti-323 Królik IgG H& L FITCBiossbs-0295G-FITC
Zestaw do barwienia hematoksyliny-eozyny (HE)SolarbioG1120
wysokociśnieniowa maszyna do dezynfekcjiprzyrząd ZEALWAY(xiamen) IncGI80DS
Mikroskop odwróconej fluorescencjiNikon 
Mikroskop z odwróconymi fazami kontrastowymiLeica Prostownik wewnętrzny DMIL
kanał potasowy 4.1 (Kir4.1)Proteintech Group, Inc12503-1-AP
Żywica neutralnaSolarbioG8590-100
Roztwór penicyliny-streptomycyny (100& razy;)HyclonSV30010
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS) (pH 7,2-7,4)SolarbioP1020-500ml
Przeciwciało wtórne (anty-królik kozie znakowane FITC)ServicebioGB22303
Szczury Sprague-Dawley Chengdu Dashuo Zwierzę Doświadczalne Co., Ltd.Licencja produkcyjna nr: SCXK [Sichuan] 2020-0030
T25 Kolbahodowlana Cornning 
Probówki Tornado: 15 mlWHB Probówki Tornado WHB-15-1
: 50mLWHB WHB-50-1
sterylizator do dezynfekcji ultrafioletowejGEMEISIxd06
VimentinAbcamab92547
SMZ1500430639

Bibliografia

  1. Bringmann, A., Pannicke, T., Grosche, J., et al. Müller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
  2. Kugler, E. C., Greenwood, J., MacDonald, R. B. The "neuro-glial-vascular" unit: The role of glia in neurovascular unit formation and dysfunction. Front Cell Dev Biol. 9, 732820(2021).
  3. Reichenbach, A., Bringmann, A. Glia of the human retina. Glia. 68 (4), 768-796 (2020).
  4. Subirada, P. V., Paz, M. C., Ridano, M. E., et al. A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death. Eur J Neurosci. 47 (12), 1429-1443 (2018).
  5. Wang, J., O'Sullivan, M. L., Mukherjee, D., et al. Anatomy and spatial organization of Müller glia in mouse retina. J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).
  6. Beverley, K. M., Pattnaik, B. A. Inward rectifier potassium (Kir) channels in the retina: Living our vision. Am J Physiol Cell Physiol. 323 (3), C772-C782 (2022).
  7. Lai, D., Wu, Y., Shao, C., et al. The role of Müller cells in diabetic macular edema. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (10), 8(2023).
  8. Coughlin, B., Schnabolk, G., Joseph, K., et al. Systemic complement inhibition reduces intraocular inflammation and retinal cell death in murine models of glaucoma. J Neuroinflammation. 16, 212(2019).
  9. Alarcon-Martinez, L., Shiga, Y., Villafranca-Baughman, D., et al. Neurovascular dysfunction in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 97, 101217(2023).
  10. Strong, S., Liew, G., Michaelides, M. Retinitis pigmentosa-associated cystoid macular oedema: Pathogenesis and avenues of intervention. Br J Ophthalmol. 101 (1), 31-37 (2017).
  11. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).
  12. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. J. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).
  13. Norrie, J. L., et al. Latent epigenetic programs in Müller glia contribute to stress and disease response in the retina. Dev Cell. 60 (8), 1199-1216.e7 (2025).
  14. Too, L. K., Gracie, G., Hasic, E. Adult human retinal Müller glia display distinct peripheral and macular expression of CD117 and CD44 stem cell-associated proteins. Acta Histochem. 119 (2), 142-149 (2017).
  15. Bhatia, B., Jayaram, H., Singhal, S. Differences between the neurogenic and proliferative abilities of Müller glia with stem cell characteristics and the ciliary epithelium from the adult human eye. Exp Eye Res. 93 (6), 852-861 (2011).
  16. Grigoryan, E. N. Cell sources for retinal regeneration: Implication for data translation in biomedicine of the eye. Cells. 11 (23), 3755(2022).
  17. Dong, S., Li, X., Chen, Z. MMP28 recruits M2-type tumor-associated macrophages through MAPK/JNK signaling pathway-dependent cytokine secretion to promote the malignant progression of pancreatic cancer. J Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 60(2025).
  18. Vardimon, L., Ben-Dror, I., Havazelet, N. Molecular control of glutamine synthetase expression in the developing retina tissue. Dev Dyn. 196 (4), 276-282 (1993).
  19. Xu, Q. A., Boerkoel, P., Hirsch-Reinshagen, V. Müller cell degeneration and microglial dysfunction in the Alzheimer's retina. Acta Neuropathol Commun. 10 (1), 145(2022).
  20. Bunt-Milam, A. H., Saari, J. C. Immunocytochemical localization of two retinoid-binding proteins in vertebrate retina. J Cell Biol. 97 (3), 703-712 (1983).
  21. Masri, R. A., et al. Immunohistochemistry and spatial density of Müller cells in the human fovea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (2), 46(2025).
  22. Kolesnikov, A. V., Kiser, P. D., Palczewski, K. Function of mammalian M-cones depends on the level of CRALBP in Müller cells. J Gen Physiol. 153 (1), e202012675(2021).
  23. Xue, Y., Shen, S. Q., Jui, J. CRALBP supports the mammalian retinal visual cycle and cone vision. J Clin Invest. 125 (2), 727-738 (2015).
  24. Pereiro, X., Beriain, S., Rodriguez, L. Characteristics of whale Müller glia in primary and immortalized cultures. Front Neurosci. 16, 854278(2022).
  25. Tran, T. L., Bek, T., Holm, L. Aquaporins 6-12 in the human eye. Acta Ophthalmol. 91 (6), 557-563 (2013).
  26. Gusel'nikova, V. V., Korzhevskiy, D. E. NeuN as a neuronal nuclear antigen and neuron differentiation marker. Acta Naturae. 7 (2), 42-47 (2015).
  27. Zeng, Q., Xia, X. B. Study on the differentiation of retinal ganglion cells from rat Müller cells in vitro. Yan Ke Za Zhi. 46 (7), 615-620 (2010).
  28. Backstrom, J. R., et al. Phenotypes of primary retinal macroglia: Implications for purification and culture conditions. Exp Eye Res. 182, 85-92 (2019).
  29. Liu, X., Tang, L., Liu, Y. Mouse Müller cell isolation and culture. Bio Protoc. 7 (15), e2429(2017).
  30. Pereiro, X., et al. Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice Müller glia in order to study retinal diseases. Front Cell Neurosci. 14 (7), (2020).
  31. Wang, M., Ma, W., Zhao, L. Adaptive Müller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. J Neuroinflammation. 8, 173(2011).
  32. Tomaszewski, R., Gad, M. S., Negoita, P. Isolation of primary mouse retinal glial Müller cells. J Vis Exp. (210), e66237(2024).
  33. Li, Q., Cheng, Y., Zhang, S. TRPV4-induced Müller cell gliosis and TNF-α elevation-mediated retinal ganglion cell apoptosis in glaucomatous rats via JAK2/STAT3/NF-κB pathway. J Neuroinflammation. 18 (1), 271(2021).
  34. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  35. Reichenbach, A., Wolburg, H., Richter, W. Membrane ultrastructure preservation and membrane potentials after isolation of rabbit retinal glial (Müller) cells by papain. J Neurosci Methods. 32 (3), 227-233 (1990).
  36. Harstad, H. K., Ringvold, A. Scanning and transmission electron microscopy of Müller cells isolated from rabbit retina. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 223 (1), 29-34 (1985).
  37. Guidry, C. Isolation and characterization of porcine Müller cells. Myofibroblastic dedifferentiation in culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 (5), 740-752 (1996).
  38. Qiu, A. W., Wang, N. Y., Yin, W. J. Retinal Müller cell-released exosomal miR-92a-3p delivers interleukin-17A signal by targeting Notch-1 to promote diabetic retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (1), 1(2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pierwotna hodowla kom rekdysekcja siatk wkitrawienie trypsynszczury Sprague Dawleybarwienie immunofluorescencyjnecytometria przep ywowabarwienie hematoksylin i eozynsyntetaza glutaminymacierzyste kom rki siatk wki
Izolacja i hodowla pierwotnych komórek Müllera siatkówki od szczurów Sprague-Dawley (SD)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.