Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ustalenie i analiza histologiczna organoidów przełyku modelujących progresję od tkanek prawidłowych do nowotworowych

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68149

⸱

30 maja 2025

 ,  ,  , 
1Department of Etiology and Carcinogenesis, National Cancer Center/National Clinical Research Center/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) and Peking Union Medical College (PUMC), 2Key Laboratory of Cancer Genomic Biology, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) and Peking Union Medical College (PUMC), 3Changping Laboratory, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje tworzenie i analizę histologiczną modeli organoidów przełyku, które reprezentują różne etapy progresji nowotworu. Metoda ta umożliwia naukowcom badanie zmian w morfologii komórek, organizacji przestrzennej i wzorcach ekspresji markerów molekularnych podczas przejścia od tkanek normalnych do nowotworowych.

Streszczenie

Organoidy stały się kluczowym narzędziem do pogłębiania wiedzy na temat nowotworzenia i terapii raka. Generując ludzkie modele organoidowe reprezentujące różne stadia guza i przeprowadzając analizy histologiczne, możliwe jest głębsze zrozumienie zmian w morfologii komórki, architekturze przestrzennej i ekspresji kluczowych markerów molekularnych w miarę postępu guza. W badaniu przedstawiono kompleksowy protokół tworzenia i hodowli organoidów płaskonabłonkowych przełyku. Ponadto protokół określa metody oceny wzorców ekspresji i organizacji przestrzennej krytycznych cząsteczek w organoidach, wykorzystując techniki takie jak utrwalanie, osadzanie i barwienie. Dzięki temu protokołowi zidentyfikowano znaczące zmiany w strukturze przestrzennej komórek nabłonka płaskonabłonkowego przełyku oraz w ekspresji różnych biomarkerów nowotworowych podczas nowotworzenia. Protokół ułatwia budowę i analizę histologiczną organoidów, umożliwiając naukowcom badanie architektury przestrzennej i zmian molekularnych komórek nabłonkowych na różnych etapach nowotworzenia i interwencji terapeutycznej.

Wprowadzenie

Nowotworzenie to złożony, wieloetapowy proces charakteryzujący się postępującymi zmianami molekularnymi i morfologicznymi w komórkach1,2. Rak płaskonabłonkowy przełyku (ESCC), powszechny nowotwór złośliwy o złym rokowaniu3,4, ilustruje ten stopniowy postęp przez cztery odrębne etapy: normalna błona śluzowa, śródnabłonkowa neoplazja o niskim stopniu złośliwości (LGIN), śródnabłonkowa neoplazja wysokiego stopnia (HGIN) i rak inwazyjny5. Na tych etapach komórki nabłonkowe wykazują dynamiczne zmiany we wzorcach ekspresji molekularnej i organizacji przestrzennej, którym towarzyszą systematyczne zmiany w morfologii tkanki w miarę jej przechodzenia ze stanu normalnego do złośliwego6,7. Pomimo postępów w zrozumieniu patogenezy ESCC, brak modeli eksperymentalnych, które wiernie odwzorowywałyby przestrzenne i czasowe aspekty ewolucji nowotworu – umożliwiając jednocześnie systematyczne analizy histologiczne i molekularne – utrudnia głębsze mechanistyczne zrozumienie progresji choroby i rozwoju terapeutycznego.

Chociaż unieśmiertelnione linie komórek nowotworowych 2D wniosły znaczący wkład w zrozumienie onkogenezy, są one z natury ograniczone w odtwarzaniu biologicznej złożoności i patologicznych cech rodzimych nowotworów8. Modele zwierzęce, choć zapewniają kontekst in vivo, często słabo przewidują reakcje ludzi ze względu na różnice specyficzne dla gatunku9. W przeciwieństwie do tego, organoidy pojawiły się jako transformacyjna platforma przedkliniczna, która wiernie zachowuje heterogeniczność, architekturę i funkcjonalność komórek ludzkich tkanek10,11,12,13. Jako modele przedkliniczne, organoidy lepiej oddają charakterystykę nowotworów pierwotnych, umożliwiając szczegółowe badanie kluczowych zdarzeń molekularnych i zmian komórkowych podczas progresji nowotworu14. Na przykład Chen i in. wykorzystali organoidy przełyku pochodzące od pacjentów z różnych etapów ESCC, aby wyjaśnić interakcje nabłonkowo-fibroblastowe, ostatecznie potwierdzając oś sygnalizacyjną ANXA1-FPR2 jako krytyczny czynnik patogenezy ESCC6. Podobnie, Ko i in. wykorzystali genetycznie zmodyfikowane organoidy przełyku do zidentyfikowania kluczowych determinantów genetycznych napędzających inicjację ESCC i unikanie odporności, pokazując, w jaki sposób modele organoidowe mogą skutecznie podsumować cechy choroby i ujawnić nowe cele terapeutyczne15.

Obecna metodologia rozwiązuje istotne problemy w modelowaniu raka przełyku, ustanawiając powtarzalny protokół generowania wieloetapowych organoidów ESCC, które odzwierciedlają histologiczny postęp od normalnego nabłonka do raka inwazyjnego. System ten integruje zoptymalizowane warunki hodowli przy użyciu pożywki kondycjonowanej L-WRN w celu utrzymania pnia nabłonka, w połączeniu ze znormalizowanymi protokołami przetwarzania histologicznego i analizy immunofluorescencji multipleksowej (mIF), zapewniając idealną platformę do podłużnej analizy zmian przestrzennych i molekularnych podczas nowotworzenia. W porównaniu z alternatywnymi technikami, takimi jak hodowle 2D, ta platforma organoidowa w unikalny sposób zachowuje architekturę tkanki, umożliwiając wizualizację przestrzennie zorganizowanych markerów molekularnych, w tym białka immunologicznego punktu kontrolnego PD-L1 (CD274), które pośredniczy w unikaniu odporności guza poprzez hamowanie odpowiedzi limfocytów T16,17,18oraz marker proliferacji Ki-67. Protokół umożliwia organoidom normalne przechodzenie tkanek przełykowych i przedrakowych, pomagając naukowcom zbudować ciągły model organoidów od normalnej tkanki do nowotworu19. Umożliwiając szczegółową analizę zmian przestrzennych i molekularnych podczas nowotworzenia, protokół ten oferuje naukowcom potężne narzędzie do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw rozwoju i progresji raka, co może prowadzić do ulepszenia strategii terapeutycznych.

Ta metodologia jest szczególnie odpowiednia dla badaczy badających kancerogenezę nabłonka, interakcje mikrośrodowiska guza lub reakcje terapeutyczne w ESCC i pokrewnych nowotworach płaskonabłonkowych. Jego modułowa konstrukcja umożliwia adaptację do badania innych markerów molekularnych lub szlaków sygnałowych, pod warunkiem, że zostaną włączone odpowiednie etapy walidacji. Oferując ustandaryzowaną, ale elastyczną platformę, protokół ten ma na celu postęp w badaniach przedklinicznych w biologii nowotworów i przyspieszenie przełożenia mechanistycznych spostrzeżeń na terapie celowane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board of the Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (Zatwierdzenia nr 20/069–2265, 22/221-3423 i 23/305-4047). Próbki tkanki przełyku uzyskano od pacjentów poddawanych zabiegom chirurgicznym lub wczesnym badaniom przesiewowym w kierunku raka płaskonabłonkowego przełyku (ESCC) w Szpitalu Onkologicznym Chińskiej Akademii Nauk Medycznych w latach 2021-2024 w celu ustalenia ludzkich organoidów przełyku. Żaden z pacjentów włączonych do tego badania nie otrzymał chemioterapii ani radioterapii przed pobraniem próbki. Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich uczestników, a odpowiednie informacje kliniczne uzyskano z dokumentacji medycznej. Pełna lista odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu znajduje się w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie organoidów nabłonka przełyku

  1. Przygotowanie pożywki kondycjonowanej L-WRN
    1. Przygotowanie linii komórkowej L-WRN
      1. Rozmrozić linię komórkową L-WRN (przechowywanie w temperaturze -80 °C) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1-2 minuty. Wymieszać z 5 ml wstępnie podgrzanej podstawowej pożywki hodowlanej (DMEM uzupełniony 10% FBS).
      2. Odwirować mieszaninę przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
      3. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 2-3 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki selekcyjnej (DMEM zawierającej 10% FBS, 0,5 mg/ml higromycyny B i 0,5 mg/ml G-418).
        UWAGA: Podłoże należy przechowywać w temperaturze 4 °C (maksymalne przechowywanie 1 miesiąc).
      4. Przenieść komórki do 10 cm naczynia hodowlanego zawierającego pożywkę selekcyjną. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 .
    2. Pasaż linii komórkowej L-WRN
      1. Dysocjuj zlewające się komórki za pomocą 0,025% trypsyny-EDTA (1-2 min w 37 °C) i podziel w stosunku 1:2.
    3. Odbiór pożywki kondycjonowanej L-WRN
      1. Zastąp pożywkę hodowlaną podstawową pożywką przy 80% zbiegu komórek. Przenieść supernatant do probówki wirówkowej.
      2. Przefiltruj przez membranę 0,22 μm, aby wyeliminować zanieczyszczenia komórkowe. Zebrać filtrat w postaci pożywki kondycjonowanej L-WRN.
        UWAGA: Utrzymuj pożywkę kondycjonowaną L-WRN w temperaturze 4 °C (1 tydzień) lub -80 °C (6 miesięcy).
  2. Preparat z pożywki do hodowli organoidów przełykowych u ludzi (H-EOCM)
    1. Przygotowanie H-EOCM
      1. Zwirować pożywkę kondycjonowaną L-WRN (objętość 1,5 ml) po 4 godzinach równowagi w temperaturze 4 °C.
      2. Połącz Advanced DMEM/F12 z tymi dodatkami, aby stworzyć H-EOCM: 3% pożywki kondycjonowanej L-WRN, 1× Anti-Anti, 1× L-glutaminy, 1× suplementu N2, 1× suplementu B27, 0,15 mM HEPES, 40 ng/ml EGF, 10 μM Y-27632 i 50 μM A83-01.
        UWAGA: H-EOCM należy przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20°C przez sześć miesięcy.
  3. Przygotowanie przedeksperymentalne
    1. Rozmrażać H-EOCM, utrzymując go w temperaturze 4 °C przez 4 godziny.

2. Ustanowienie ludzkiego organoidu przełyku

  1. Przygotowanie materiałów
    1. Rozmrozić matrycę błony podstawnej i H-EOCM w temperaturze 4 °C. Wysterylizuj nożyczki chirurgiczne i pęsetę do następnego eksperymentu.
    2. Wstępnie schłodzić końcówki pipet do temperatury 4 °C. Podgrzej płytkę 24-dołkową do temperatury 37 °C.
  2. Przetwarzanie tkanek i izolacja komórek
    UWAGA: Tkanka nowotworowa ESCC, zmiany dysplastyczne (≤2 cm od brzegu guza) i dopasowana normalna tkanka przełyku (≥5 cm od brzegu guza) pobrano od tych samych osób z ESCC, które przeszły resekcję chirurgiczną. Ponadto wieloetapowe próbki przełyku uzyskano za pomocą programu wczesnego wykrywania i badań przesiewowych ESCC, jak opisano w naszych poprzednich badaniach6,7.
    1. Trzykrotnie oczyścić próbkę buforem do przemywania w temperaturze pokojowej (PBS zawierającym 1×Anti-Anti i 0,15 mM HEPES) w probówkach wirówkowych o pojemności 5 ml.
      UWAGA: Umyj próbki więcej niż trzy razy, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia.
    2. Zmiel tkankę na 1 mm3 fragmenty za pomocą sterylnych nożyczek. Przenieść fragmenty do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
    3. Zawiesić próbkę z 1 ml buforu do wytrawiania i wstrząsać nią w temperaturze 37 °C, 50-100 obr./min, przez 10-20 minut w celu strawienia tkanki.
    4. Odwirować mieszaninę przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    5. Zawiesić osad w 500 μl 0,025% trypsyny-EDTA. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Dodaj 1 ml DMEM uzupełnionego 10% FBS, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną.
    6. Przepuścić zawiesinę przez sterylny filtr o średnicy 70 μm. Zebrać filtrat w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    7. Odwirować filtrat przez 5 minut przy 400 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 100 μl H-EOCM.
  3. Siew organoidów
    1. Określ gęstość komórek, a następnie przygotuj świeżą probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml z 5 000-15 000 komórek w zawiesinie.
    2. Wirować przez 5 minut przy 400 x g w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odsysać supernatant. Delikatnie równomiernie zawiesić komórki w 50-100 μl macierzy błony podstawnej.
      UWAGA: Przechowuj matrycę membrany podstawnej w temperaturze 4 °C, aby uniknąć zestalenia.
    3. Dodaj 50 μl matrycy błony podstawnej z wymieszanymi komórkami do środka każdej 24-dołkowej płytki. Polimeryzować matrycę błony podstawnej w inkubacji w temperaturze 37 °C (czas trwania 30 minut).
    4. Dodać 500 μl wstępnie ogrzanego H-EOCM (37 °C) w celu pokrycia matrycy błony podstawnej. Hodować organoidy w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C.
  4. Wymiana medium
    1. Odessać zużyte podłoże i uzupełnić 500 μl świeżego H-EOCM (podgrzanego do 37 °C).
      UWAGA: H-EOCM należy wymieniać w odstępach 3-dniowych.

3. Pasaż organoidów

  1. Przygotowanie materiałów
    1. Rozmrozić matrycę membrany podstawnej i H-EOCM w temperaturze 4 °C. Wstępnie schłodzić końcówki pipet do temperatury 4 °C. Wstępnie podgrzać płytkę 24-dołkową do temperatury 37 °C.
  2. Trawienie organoidów
    1. Delikatnie wyjmij podłoże H-EOCM. Dodać 500 μl wstępnie schłodzonego buforu pasażowego (Advanced DMEM/F12 zawierającego 1× Anti-Anti i 0,15 mM HEPES, wstępnie schłodzonego do 4 °C) do studzienki, aby stopić matrycę membrany podstawnej.
    2. Połączyć matrycę błony podstawnej z buforem przejściowym w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Przemyć studzienkę 500 μl wstępnie schłodzonego buforu pasażowego i zebrać bufor w celu odzyskania pozostałych organoidów.
    3. Odwirować bufor przez 5 minut przy 400 x g w temperaturze 4 °C. Delikatnie zassać supernatant. Dodać 500 μl rekombinowanej trypsyny do probówki i inkubować do trawienia enzymatycznego (37 °C, 15 min). Wznawianie w odstępach 5-minutowych.
    4. Odwirować przefermentowaną próbkę (400 x g, 5 min, 4 °C). Odrzucić supernatant. Powtórz kroki 3.2.6 i 3.2.7. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl H-EOCM.
  3. Siew organoidów
    1. W przypadku wysiewu organoidów powtórz krok 2.3.

4. Zamrażanie i odzyskiwanie organoidów

  1. Zamrażanie organoidów
    1. W celu przygotowania materiałów powtórz krok 2.1.
    2. W celu wytrawienia organoidów powtórzyć krok 3.2.
    3. Zamrażanie organoidów
      1. Określ gęstość komórek, a następnie przygotuj świeżą probówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml z 10 000 komórek w zawiesinie.
      2. Odwirować próbki o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odessać supernatant.
      3. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 500-1000 μl pożywki do kriokonserwacji. Przenieś do nowej krioprobówki. Zamrozić krioprobówkę w temperaturze -80 °C na 24 godziny. Archiwizacja w systemie przechowywania ciekłego azotu w celu przedłużonej konserwacji.
  2. Rozmrażanie organoidów zamrażających
    1. Aby przygotować materiały, powtórz krok 2.1.
    2. Rozmrażanie organoidów zamrażających
      1. Szybko rozmrozić krioprobówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty. Przenieść zamrożony materiał do 9 ml wstępnie podgrzanej kultury podstawowej (37 °C) i równomiernie zawiesić komórki.
      2. Odwirowywać zawiesinę komórek przez 5 minut przy 400 x g (w temperaturze pokojowej). Ostrożnie odessać supernatant.
    3. Siew organoidów
      1. Aby wysiać organoidy, powtórz krok 2.3.

5. Analiza histologiczna organoidu

  1. Przygotowanie skrawków zatopionych w parafinie
    1. Przygotowanie materiałów
      1. Wysterylizować 50 ml matrycy do zatapiania (roztwór wodny: 2% agar + 2,5% żelatyna) w kolbie o pojemności 250 ml w autoklawie. Podwielokrotność 5 ml do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    2. Mocowanie organoidów
      1. Powtórz kroki 3.2.1-3.2.2. Zawiesić osad z 1 ml buforu pasażowego w świeżej probówce o pojemności 1,5 ml.
      2. Wirować przy 400 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Usunąć supernatant. Zawiesić organoidy w 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C przez co najmniej 6 godzin.
    3. Osadzanie organoidów
      1. Odwirować mieszaninę (400 x g, 5 min, RT). Usunąć supernatant. Dodać 1 ml buforu pasażowego do probówki i ponownie zawiesić wytrącanie.
      2. Odwirować mieszaninę (400 x g, 5 min, RT). Usunąć supernatant.
      3. Umieścić jedną probówkę (15 ml) z pożywką (5 ml) w łaźni wodnej (100 ml, pojemnik 150 ml). Kuchenka mikrofalowa z maksymalną mocą, aż woda zacznie wrzeć.
        UWAGA: Odkręć nakrętkę tubki 15 ml przed podgrzewaniem w kuchence mikrofalowej.
      4. Zawiesić organoidy za pomocą 50 μl żelu do zatapiania w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Schłodzić probówkę do temperatury 4 °C, aż żel całkowicie stwardnieje.
      5. Przenieś zestalony żel do 70% etanolu. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    4. Przygotowanie bloku parafinowego
      1. Odwodnić żel za pomocą serii etanolu (30% → 50% → 70% → 80% → 95% → 100%), 30 minut na stężenie.
      2. Zestalony żel umieścić w przezroczystym ksylenie na 30 minut. Zestalony żel zanurzyć w parafinie i zatopić za pomocą podgrzanej stacji parafinowej.
      3. Pokrój plastry o grubości 4 μm za pomocą mikrotomu. Zamontuj na szkiełkach i susz w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę. Przechowywać w suchych warunkach.
  2. Barwienie immunohistochemiczne (IHC) wycinków organoidów
    1. Deparafinacja i nawilżenie
      1. Podgrzewać plastry w środku do czyszczenia tkanek w temperaturze 65 °C przez 40 minut. Zanurzyć szkiełko w świeżym środku do czyszczenia tkanek w temperaturze pokojowej na 20 minut.
      2. Przetworzyć szkiełka przez szklane tace zawierające etanol: zanurzyć w 100% etanolu na 10 minut i powtórzyć raz, następnie przenieść do 95% etanolu na 5 minut, następnie 85% etanolu na 5 minut, następnie 75% etanolu na 5 minut, a na koniec umieścić w 4% PFA na 10 minut.
      3. Dodaj wysterylizowaną wodę do komory termostabilnej i trzymaj 5 minut na wytrząsarce z prędkością 80 obr./min. Powtórz ten krok dwukrotnie.
    2. Pobieranie antygenu
      1. Dodaj roztwór do pobierania antygenu Tris-EDTA (pH 9,0) do komory termostabilnej, aby zanurzyć szkiełka. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej komorę termostabilną zawierającą szkiełka z maksymalną intensywnością (700 W, 3 min) aż do wrzenia. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej na niskim poziomie mocy (70 W, 15 min) i schładzaj do temperatury pokojowej.
      2. Myć w wodzie destylowanej przez 2 minuty na shakerze z prędkością 80 obr./min. Powtórz dwa razy. Zakreśl położenie organoidów pisakiem histologicznym.
    3. Blokowanie peroksydazy
      1. Upuść roztwór blokujący peroksydazę, aby pokryć obszar próbki. Inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
      2. Przenieś szkiełka do komory termostabilnej. Prać w PBST (PBS + 0,1% Tween 20) przez 2 minuty przy 80 obr./min. Powtórz dwa razy.
    4. Inkubacja przeciwciał pierwotnych
      1. Delikatnie zetrzyj nadmiar kropelek PBST na szkiełkach.
        UWAGA: Unikaj dotykania organoidów na szkiełkach.
      2. Upuść rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe, aby pokryć obszar organoidu. Inkubować w komorze wilgotnościowej przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub 8-14 godzin w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten krok.
    5. Inkubacja przeciwciał wtórnych
      1. Powtórz krok 5.2.4.1. Upuść rozcieńczone przeciwciało drugorzędowe HRP, aby pokryć obszar organoidu. Inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Powtórz ten krok.
    6. Barwienie DAB (3,3′-diaminozydyna)
      1. Powtórz krok 5.2.4.1. Upuść 1× DAB, aby pokryć obszar organoidów. Inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej, aż kolor zmieni kolor na brązowy.
      2. Zanurz szkiełka w wodzie destylowanej na 5-10 sekund, aby zakończyć zmianę koloru. Powtórz ten krok.
    7. Barwienie hematoksyną
      1. Barwienie w hematoksylinie przez 5-8 min. Różnicowanie w 1% kwasowym alkoholu (1% HCl w 70% alkoholu) przez 5-10 s.
      2. Zanurz szkiełka w wodzie destylowanej na 5-10 s. Powtórz ten krok.
    8. odwodnienie
      1. Przepuść szkiełka przez szklane tace w kolejności sekwencyjnej: zanurz w 75% etanolu na 5 minut, przenieś do 85% etanolu na 5 minut, przenieś do 95% etanolu na 5 minut, a następnie dwa oddzielne zanurzenia w 100% etanolu na 10 minut każde, a na koniec umieść w ksylenie na dwa kolejne 20-minutowe okresy.
    9. Montaż na suwaku
      1. Dodaj ksylen do neutralnej gumy, aż stanie się przezroczysta. Lekko wysuszyć na powietrzu. Następnie upuść gumę z ksylenem, aby pokryć obszar organoidu.
      2. Nałożyć szkiełko nakrywkowe. Zeskanuj i przeanalizuj slajd.
  3. Barwienie immunofluorescencyjne multipleksowe (mIF)
    1. W celu odparafinowania i nawilżenia powtórzyć krok 5.2.1.
    2. W przypadku blokowania peroksydazy powtórzyć krok 5.2.3.
    3. W celu pobrania antygenu powtórzyć krok 5.2.3.
    4. Blokowanie surowicy owczej.
      1. Powtórz krok 5.2.4.1. Dodaj roztwór blokujący surowicę owczą, aby pokryć obszar organoidu. Inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
      2. Myć w PBST przez 2 minuty. Powtórz dwukrotnie.
    5. W przypadku inkubacji przeciwciał pierwotnych powtórzyć krok 5.2.4.
    6. W przypadku inkubacji przeciwciał wtórnych powtórzyć krok 5.2.4.1.
      1. Upuść specyficzny roztwór przeciwciała wtórnego, aby pokryć obszar organoidu. Inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Powtórz krok 5.2.3.2.
        UWAGA: Chroń szkiełka przed światłem od tego kroku do końca eksperymentu.
    7. Barwienie barwnikiem fluorescencyjnym
      1. Powtórz krok 5.3.4.1. Upuść roztwór barwnika fluorescencyjnego, aby pokryć obszar organoidu.
      2. Inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 10-20 minut. Powtórzyć krok 5.2.3.2.
    8. W przypadku barwienia wielokrotnego powtórz kroki 5.3.3-5.3.7.
    9. Barwienie DAPI
      1. Powtórz krok 5.2.4.1. Upuść roztwór DAPI, aby pokryć obszar organoidu. Powtórz krok 5.2.3.2. Następnie powtórz krok 5.3.4.2.
      2. Zanurz szkiełka w wysterylizowanej wodzie na 2 minuty.
    10. Montaż na suwaku
      1. Upuść podłoże mocujące zapobiegające blaknięciu, aby pokryć obszar organoidu. Nałożyć szkiełko nakrywkowe.
    11. Pobieraj obrazy cyfrowe za pomocą skanera slajdów i analizuj je.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje pobieranie próbek organoidów oraz analizę histologiczną na różnych etapach tumorigenezy ESCC (Rycina 1). Poprzez pobranie próbek prawidłowej błony śluzowej przełyku, wewnątrznabłonkowej neoplazji niskiego stopnia (LGIN), wewnątrznabłonkowej neoplazji wysokiego stopnia (HGIN) oraz tkanek nowotworowych od pacjentów z ESCC, można stworzyć organoidy reprezentujące różne stadia tumorigenezy. Ponadto przeprowadzono zatopienie tych organoidów w parafinie i ich sekcjonowan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ustalenie i analiza histologiczna organoidów stanowią znaczący postęp w modelowaniu progresji guza. Protokół oferuje znaczące korzyści w porównaniu z istniejącymi metodami badania nowotworzenia20. W przeciwieństwie do tradycyjnych systemów hodowli komórkowych 2D, organoidy utrzymują złożoną trójwymiarową architekturę i niejednorodność komórkową, które lepiej odzwierciedlają warunki in vivo. W porównaniu z modelami zwierzęcymi, organoidy pochodzące z tkanek ludzkich dokładniej reprezentują...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych konfliktów finansowych ani konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują wszystkim pacjentom i lekarzom biorącym udział w badaniach w Szpitalu Onkologicznym, Chińskiej Akademii Nauk Medycznych (CAMS) i Peking Union Medical College (PUMC). Badanie to jest finansowane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82203156 do Południowej Walii), Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2023YFC3503200 do S.Z.) oraz Fundusz Innowacji Nauk Medycznych Chińskiej Akademii Nauk Medycznych (2023-I2M-QJ-002 do S.Z.). Rysunek 1 jest tworzony za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &m; m filtrMerckCat#SLGPR33RB
24-dołkowa płytkaCorningCat#3524
4% ParaformaldehydBeyotimeCat# P0099
70 μ m sterylne sitkoFalconCat#352350
A83-01Tocris BioscienceCat# 2939
Advanced DMEM/F12GibcoCat# 12634028
AgarSolarbioCat# A8190
Anti-Anti (Antibiotic-Antimycotic)GibcoCat# 15240062
B-27 suplementGibcoCat# 17504044
Inkubator CO2Thermo Kot#371GPCN
Kolagenaza IVGibcoCat# 17104019
CryostorSTEMCELLCat# 07930
DMEMCorningCat# 10-013-CV
EGFGibcoCat# PHG0313
Płodowa surowica bydlęcaCell TechnologiesCat# 30070
G-418SigmaCat# A1720
ŻelatynaSolarbioCat# G8061
GlutaMAXGibcoCat# 35050061
MatrigelCorningCat# 354230
Zestaw do barwienia HEBeijing Yili Fine Chemicals Co., LtdNA
HEPESGibcoCat# 15630080
Pióro histologiczneZsbioCat#ZLI-9305
Hygromycyna BSigmaCat# 400050
Zestaw do barwienia immunohistochemicznegoZSGB-BIOPV-8000
L-WRNATCCCRL-3276; RRID:CVCL_DA06
Suplement N-2GibcoCat# 17502048
Neutralna guma ZsbioCat#ZLI-9555
Opal 5-kolorowy ręczny zestaw IHCPANOVUECat# 10144100100
PBSMeilunBioCat#MA0015
Monoklon królika anty-PD-L1CSTCat# 13684; RRID:AB_2687655
Królik Poliklonalny anty-Ki67AbcamCat# ab16667; RRID:AB_302459
Królik Poliklonalny anty-KRT6AProteintechCat# 10590-1-AP; RRID: AB_2134306
Surowica owczaZsbioCat#ZLI-9056
TrypLE ExpressGibcoCat# 12604021
TrypLE-EDTAGibcoCat#15400-054
Skaner obrazu całego slajduHamamatsuCat#C13210
Y-27632Selleck ChemicalsCat# S1049

Bibliografia

  1. Zhang, S., et al. Tumor initiation and early tumorigenesis: Molecular mechanisms and interventional targets. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 149(2024).
  2. Sánchez-Danés, A., Blanpain, C. Deciphering the cells of origin of squamous cell carcinomas. Nat Rev Cancer. 18 (9), 549-561 (2018).
  3. Abnet, C. C., Arnold, M., Wei, W. -Q. Epidemiology of esophageal squamous cell carcinoma. Gastroenterology. 154 (2), 360-373 (2018).
  4. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  5. Lin, D. -C., Wang, M. -R., Koeffler, H. P. Genomic and epigenomic aberrations in esophageal squamous cell carcinoma and implications for patients. Gastroenterology. 154 (2), 374-389 (2018).
  6. Chen, Y., et al. Epithelial cells activate fibroblasts to promote esophageal cancer development. Cancer Cell. 41 (5), 903-918.e8 (2023).
  7. Chang, J., et al. Genomic alterations driving precancerous to cancerous lesions in esophageal cancer development. Cancer Cell. 41 (12), 2038-2050.e5 (2023).
  8. Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nat Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
  9. Loewa, A., Feng, J. J., Hedtrich, S. Human disease models in drug development. Nat Rev Bioeng. 1 (8), 545-559 (2023).
  10. Tang, X. -Y., et al. Human organoids in basic research and clinical applications. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 168(2022).
  11. Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine. J Hematol Oncol. 15 (1), 58(2022).
  12. Yan, H. H. N., Chan, A. S., Lai, F. P. -L., Leung, S. Y. Organoid cultures for cancer modeling. Cell Stem Cell. 30 (7), 917-937 (2023).
  13. Jiang, Y., et al. Establishing mouse and human oral esophageal organoids to investigate the tumor immune response. Dis Model Mech. 17 (1), dmm050319(2024).
  14. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  15. Ko, K. -P., et al. Key genetic determinants driving esophageal squamous cell carcinoma initiation and immune evasion. Gastroenterology. 165 (3), 613-628.e20 (2023).
  16. Kornepati, A. V. R., Vadlamudi, R. K., Curiel, T. J. Programmed death ligand 1 signals in cancer cells. Nat Rev Cancer. 22 (3), 174-189 (2022).
  17. Jiang, X., et al. Role of the tumor microenvironment in PD-L1/PD-1-mediated tumor immune escape. Mol Cancer. 18 (1), 10(2019).
  18. Magré, L., et al. Emerging organoid-immune co-culture models for cancer research: From oncoimmunology to personalized immunotherapies. J Immunother Cancer. 11 (5), e006290(2023).
  19. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  20. Fujii, M., Sekine, S., Sato, T. Decoding the basis of histological variation in human cancer. Nat Rev Cancer. 24 (2), 141-158 (2024).
  21. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
  22. Tong, L., et al. Patient-derived organoids in precision cancer medicine. Med. 5 (11), 1351-1377 (2024).
  23. Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer Res. 81 (12), 3149-3155 (2021).
  24. Sun, C. -P., Lan, H. -R., Fang, X. -L., Yang, X. -Y., Jin, K. -T. Organoid models for precision cancer immunotherapy. Front Immunol. 13, 770465(2022).
  25. Kobayashi, H., et al. The origin and contribution of cancer-associated fibroblasts in colorectal carcinogenesis. Gastroenterology. 162 (3), 890-906 (2022).
  26. Du, L., et al. Targeting stemness of cancer stem cells to fight colorectal cancers. Semin Cancer Biol. 82, 150-161 (2022).
  27. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  28. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  29. Lau, H. C. H., Kranenburg, O., Xiao, H., Yu, J. Organoid models of gastrointestinal cancers in basic and translational research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (4), 203-222 (2020).
  30. Han, X., et al. Landscape of human organoids: Ideal model in clinics and research. The Innovation. 5 (3), 100620(2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Modelowanie tumorigenzyhodowla organoid wmultipleksowa immunofluorescencjamacierz b ony podstawnejrak p askonab onkowybiomarkery nowotworowearchitektura przestrzennakom rki nab onkowe
Ustalenie i analiza histologiczna organoidów przełyku modelujących progresję od tkanek prawidłowych do nowotworowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.