Method Article

Eksperymentalne protokoły badań przesiewowych, immunocytochemia i techniki obrazowania oparte na mikroskopii dla Penium margaritaceum

DOI:

10.3791/68154

⸱

March 28th, 2025

 , 
1Department of Biology and Skidmore Microscopy Imaging Center, Skidmore College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten raport opisuje podstawowe metody używane do hodowli i eksperymentalnego manipulowania jednokomórkową streptophyte alg, Penium margaritaceum. Zapewnia również podstawowe protokoły obrazowania opartego na mikroskopii, w tym znakowanie żywych komórek za pomocą przeciwciał monoklonalnych i innych sond fluorescencyjnych oraz skaningową mikroskopię elektronową.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ściana komórkowa jest pierwszym składnikiem odbioru/transdukcji sygnału dla komórki roślinnej podczas rozwoju i podczas reagowania na środowiskowe stresory abiotyczne i biotyczne. Komórka stale monitoruje integralność swojej ściany komórkowej i moduluje ją w odpowiedzi na stres. Wyjaśnienie specyficznych modulacji strukturalnych i biochemicznych zachodzących w ścianie komórkowej jest trudnym zadaniem, zwłaszcza w przypadku stosowania roślin wielokomórkowych i ich narządów/tkanek. Wynika to z ograniczeń co do tego, co można rozwiązać w pojedynczej komórce, która jest częścią złożonej sieci wielokomórkowej. Jednokomórkowa alga paciorkowa, Penium margaritaceum, została ostatnio wykorzystana w badaniach dynamiki pektyn, plastyczności fenotypowej opartej na ścianie komórkowej i wielu aspektach biologii komórek glonów. Jego prosty fenotyp, wyraźna ściana komórkowa, która ma wiele elementów szczególnie podobnych do ścian komórkowych roślin lądowych, oraz łatwość w badaniach immunocytochemicznych i eksperymentalnych sprawiają, że jest to potężny organizm modelowy w biologii ściany komórkowej roślin. Celem tego badania jest dostarczenie podstawowych technik hodowli, manipulacji eksperymentalnej i badań przesiewowych stosowanych stresorów. Protokoły badań przesiewowych w zakresie immunocytochemii, obrazowania w konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej i obrazowania struktury ściany komórkowej za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Podobnie, wiele z opisanych technik może być modyfikowanych dla szerokiego wachlarza innych badań komórkowych i molekularnych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ściana komórkowa rośliny to złożona sieć polimerowa, która pełni wiele ról w życiu komórki roślinnej1. Integralność ściany komórkowej jest stale monitorowana przez komórkę podczas rozwoju i w odpowiedzi na stres środowiskowy i odpowiednio moduluje się pod względem chemicznym i strukturalnym. Penium margaritaceum to jednokomórkowa zielona alga, która została ostatnio wykorzystana w badaniach glonów Streptophyte (Streptophyta, grupa zielonych alg najbliżej spokrewnionych i przodków roślin lądowych2).

W ciągu ostatnich dwóch dekad P. margaritaceum był ważnym organizmem w badaniach dynamiki ściany komórkowej i macierzy zewnątrzkomórkowej, aktywności systemu endomembranowego, manifestacji kształtu komórki i ewolucji roślin3,4,5,6,7,8,9,10,11. Celem tej pracy jest dostarczenie badaczom zajmującym się ścianą komórkową roślin podstawowych metod hodowli P. margaritaceum, eksperymentalnego manipulowania nią za pomocą technik opartych na mikropłytkach oraz monitorowania struktury jej ściany komórkowej za pomocą znakowania immunocytochemicznego żywych komórek i obrazowania za pomocą technik mikroskopii świetlnej i elektronowej. P. margaritaceum ma wiele podobieństw w biochemii ściany komórkowej do pierwotnych ścian komórkowych roślin lądowych. Opracowaliśmy wiele protokołów, które wykorzystują unikalny jednokomórkowy fenotyp tej algi i zapewniają szybki sposób badania dynamiki ściany komórkowej, która często jest trudna do monitorowania w roślinach wielokomórkowych. Techniki te będą pomocne dla biologów ścian komórkowych roślin, którzy chcą wyjaśnić szczegółową dynamikę ściany komórkowej, zwłaszcza tych zajmujących się pektynami, i posłużą jako punkt wyjścia do badań zajmujących się biologią komórek glonów roślinnych i paciorkowców.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Penium margaritaceum jest uzyskiwane w Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen - Culture Collection of Algae na Uniwersytecie w Getyndze, SAG; szczep #2640.

1. Utrzymanie kultur

  1. Utrzymuj glony w płynnym podłożu Woods Hole (WH12), które można również uzupełnić ekstraktem wodnym z gleby (tj. 40 ml na litr podłoża). Utrzymuj kultury w temperaturze 20-25 °C w cyklu 16 h: 8 h światło: ciemność z 3,5 klux (74 μmol fotonów/m2/s) chłodnego białego światła fluorescencyjnego.
  2. Przygotowuj subkultury co tydzień i używaj kultur komórkowych, gdy mają 10-14 dni. Kultury penisa będą żywotne przez 6 miesięcy i mogą być używane do zakładania subkultur w tym czasie. Glony będą również rosły na 1%-2% zestalonym agarze WHM.
  3. W celu rutynowej synchronizacji cyklu komórkowego umieść komórki z 10-14-dniowych kultur w ciemności na 2-6 tygodni w temperaturze 20-25 °C. Po tym czasie przemyć komórki świeżym WHM (patrz poniżej) i kulturą, jak opisano powyżej.

2. Znakowanie ściany komórkowej przeciwciałami monoklonalnymi

UWAGA: P. margaritaceum jest pokryty pierwotną ścianą komórkową, która ma wiele takich samych składników, jakie można znaleźć w pierwotnych ścianach komórkowych roślin lądowych11. Wiele przeciwciał monoklonalnych (mAb) podniesionych przeciwko epitopom ściany komórkowej roślin lądowych rozpoznaje składniki ściany komórkowej P. margaritaceum. Źródłem tych przeciwciał jest Centrum Badań nad Złożonymi Węglowodanami Uniwersytetu Georgia (ccrc@uga.edu) lub Kerafast (kerafast.com). Po znakowaniu ściany komórkowej żywych komórek pierwszorzędowymi mAb specyficznymi dla epitopów ściany komórkowej i przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem (np. FITC, TRITC), komórki można umieścić z powrotem w hodowli bez wpływu na zdrowie komórki lub odkładanie się ściany komórkowej. Fluorescencyjne znakowanie ściany komórkowej pozostaje w nieskończoność, a nowo wydzielana ściana komórkowa przedstawia się jako ciemne (tj. nieznakowane) strefy, które można zmierzyć w celu określenia szybkości ekspansji komórki i / lub ponownie znakować za pomocą mAb lub innych sond.

  1. Usuń 5 ml aktywnie rosnącej płynnej kultury komórkowej (w wieku 10-14 dni) i umieść ją w plastikowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować na wirówce stołowej przy 1 000 x g przez 1 min.
  2. Odlewać i wyrzucać supernatant. Zawiesić osad w 5 ml świeżego WHM. Umieść szczelnie nakrętkę i energicznie potrząsaj probówką przez 10 sekund, aby ponownie zawiesić osad i usunąć wszelkie zewnątrzkomórkowe substancje polimerowe lub EPS z powierzchni ściany komórkowej.
  3. Wirować przy 1 000 x g przez 1 min. Powtórzyć krok 2.2 i odwirować. Zawiesić osad w 1 ml świeżego WHM i przenieść 200 μl porcji zawiesiny komórek do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  4. Zakryć probówki i odwirować w mikrowirówce o sile 1 000 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 400 μl świeżego WHM.
  5. Do zawiesiny dodać 20 μl mAb (np. JIM5, mAb szczura o swoistości dla homogalakturonanu estryfikowanego metylem; końcowe rozcieńczenie wynosi 1:20 z WHM). Zwirować probówkę, zawinąć ją w folię aluminiową i umieścić na rotatorze laboratoryjnym na 90 minut. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy wymieszać probówkę 2 razy podczas 90-minutowego etapu inkubacji.
  6. Odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 1 000 x g przez 1 minutę. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl świeżego WHM. Zakryj rurkę i wiruj zawiesinę komórek przez 10 sekund.
  7. Powtórz krok 2.6 2x. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad w 400 μl WHM i 8 μl koziego środka przeciw szczurom TRITC lub FITC (rozcieńczonego w stosunku 1/75 z WHM). Zawiń probówkę w folię aluminiową i umieść ją na rotatorze laboratoryjnym na 90 minut.
  8. Powtórz kroki 2.6 i 2.7. Ponownie zawiesić granulkę w 100 μl pożywki wzrostowej, zakryć probówkę i zawinąć ją w folię aluminiową, aż będzie gotowa do obrazu.
    UWAGA: Można również zastosować inkubację komórek w WHM zawierających czynnik blokujący, taki jak mleko instant bez tłuszczu z goździków (1%) lub albumina surowicy bydlęcej (1%) przed inkubacją w mAb, ale z naszego doświadczenia wynika, że nie wpływa to na jakość lub intensywność. Penium nie rozszerza swojej ściany komórkowej ani nie wytwarza dużych ilości EPS w ciemności. Wyznakowane przeciwciało pozostaje nienaruszone przez co najmniej 3-4 dni. Dzięki temu obrazowanie nie musi być wykonywane od razu. Można tu zastosować inne przeciwciała monoklonalne, ale konieczne będzie zbadanie stężeń. W przypadku chemicznych i fizycznych badań przesiewowych można oznaczyć kilka ml zawiesiny komórkowej, przechowywać w ciemności przez kilka dni i stosować w badaniach na mikropłytkach. Komórki mogą być również znakowane przeciwciałem pierwszorzędowym tylko przed leczeniem, a następnie przeciwciałem drugorzędowym.

3. Pomiar ściany komórkowej i szybkości ekspansji komórki w czasie

  1. Weź 1 ml komórek znakowanych JIM5-TRITC i umieść 1 ml WHM w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odwirować przy 1 000 g przez 1 minutę i odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 250 μl WHM i odwirować, aby wymieszać komórki.
  2. Do każdego dołka na 12-dołkowej szalce Petriego dodaj 1 ml WHM. W tym czasie do każdej studzienki można dodać określone inhibitory i regulatory wzrostu. W niniejszej pracy przedstawiono efekty zwiększenia poziomu wapnia podczas inkubacji.
  3. Pobrać 30 μl znakowanej zawiesiny komórkowej (krok 1) i dodać do każdej studzienki mikropłytki. Delikatnie zakręć talerzem, aby wymieszać. Uszczelnij przezroczystą folią.
  4. Hodowla jak wyżej (krok 1.1) przez 24 godziny, 48 godzin lub 72 godziny. W określonych momentach usuń 250 ml zawiesiny komórek z każdej studzienki i umieść ją w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 μl.
  5. Wirować przy 1 000 x g przez 1 min. Usunąć supernatant. Zawiesić osad w 50 μl pożywki wzrostowej i odwirować.
  6. Umieścić 15 μl kropli zawiesiny komórek na szkiełku podstawowym i przykryć szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 x 22 (grubość 1,5). Obserwuj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu filtra TRITC przy 10x -20x.
  7. Uchwyć obrazy co najmniej 50-100 komórek. Dla każdej komórki zmierz i zapisz całkowitą długość komórki oraz długość ciemnej strefy (tj. nowej ściany wytworzonej podczas inkubacji po znakowaniu).
  8. Określić średni % nowych ścian komórkowych w hodowli. Powtórz dla komórek pobranych po 48 godzinach i 72 godzinach, aby uzyskać informacje na temat rozszerzania się ściany komórkowej w czasie.
    UWAGA: Kroki 3.5-3.8 dają gęstą zawiesinę komórek, która pozwala na obrazowanie wielu komórek w jednym polu widzenia. To sprawia, że pomiar ręczny jest znacznie wygodniejszy. Wiele programów do kamer zapewnia wygodny i/lub automatyczny pomiar wymiarów komórek, które mogą być używane z tą algą. Można również zebrać komórki i oznaczyć je jak powyżej za pomocą JIM5, ale zastąpić antyszczurzy FITC jako przeciwciało drugorzędowe. Za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM) można obrazować komórki zarówno z filtrami FITC, jak i TRITC. Sygnały fluorescencyjne można następnie przypisać do różnych pseudokolorów. Pozwala to również na rozróżnienie struktury nowej ściany komórkowej wytwarzanej podczas różnych zabiegów (znakowanej JIM5-FITC) w porównaniu ze ścianami komórkowymi znakowanymi wstępnie (znakowanymi JIM5-TRITC).

4. Obrazowanie poklatkowe ekspansji ściany komórkowej

  1. Oznacz ścianę komórkową za pomocą JIM5-TRITC, jak opisano powyżej (kroki 2.1-2.8). Rozcieńczyć komórki 10x w WHM i dodać kroplę 50 μl komórek na szkiełko nakrywkowe lub szalkę Petriego ze szklanym dnem.
  2. Pozwól komórkom przylegać do szkła przez 2 minuty w ciemności. Delikatnie spłucz komórki, które nie przykleiły się do szkła, za pomocą 1 ml WHM. Użyj mikropipety i ostrożnie dodaj kroplami WHM do szklanki.
  3. Dodaj 30 μl WHM na wierzch komórek przymocowanych do szkła. Dodaj 30 μl ciepłej 4% agarozy/WHM na kropelkę WHM/komórek. Pozwól agarozie ostygnąć do temperatury pokojowej i zestalić się.
  4. W przypadku próbek na szalce Petriego dodaj tyle WHM, aby całkowicie pokryć komórki zanurzone w agarozie. W przypadku komórek na szkiełku nakrywkowym odwróć szkiełko nakrywkowe i delikatnie umieść je na szkiełku wgłębieniowym wypełnionym WHM.
  5. Zamontuj komórki w mikroskopie fluorescencyjnym. Można ustawić oświetlenie zewnętrzne (lampę) lub światło z samego mikroskopu można wykorzystać do dostarczenia energii do wzrostu i ruchu komórek. W mikroskopie Olympus Ix83 lub Ix63 dobrze sprawdza się moc 5-6 V dla lampy trans. Może to wymagać prób i błędów w twoim systemie.
  6. Obraz co 10-30 minut przy użyciu zestawu filtrów TRITC do śledzenia rozszerzania się ściany komórkowej. Dodaj substancje chemiczne/enzymy do WHM użyte w kroku 3.8, jeśli takie istnieją.

5. Obserwacja produkcji zewnątrzkomórkowej substancji polimerowej (EPS)

  1. Przygotowanie komórek: Pobrać 5 ml komórek z 10-14-dniowych kultur i umyć je jak w krokach 1-4 powyżej.
  2. Przygotowanie kulek fluorescencyjnych: Do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml dodaj 1 kroplę (około 100 μl) kulek fluorescencyjnych o wielkości 0,75 μm (Polysphere). Dodaj 1 ml WHM do probówki i energicznie wstrząśnij, aby ponownie zawiesić kulki. Wirować przy 10 000 x g przez 3 min. Usunąć supernatant. Dodaj 1 ml WHM do granulki i wstrząśnij. Wirować przy 10 000 x g przez 3 min. Zawiesić osad w 500 μl WHM.
  3. Przygotowanie dołków: Dodać 1 ml pożywki WHM do dołków płytki 12-dołkowej. Dodaj inhibitory lub regulatory wzrostu do pożądanego stężenia i delikatnie zamieszaj. Dodaj 10 μl roztworu kulek i delikatnie zakręć płytką, aby wymieszać kulki. Dodaj 10 μl umytych komórek do każdego dołka i delikatnie zamieszaj płytkę.
  4. Hodować płytkę komórkową jak powyżej (1.1). Po 24 godzinach delikatnie umieścić płytkę (należy uważać, aby nie wymieszać) na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w filtr FITC. Koraliki przylegają do EPS i odsłaniają wzory uwalniania EPS. Sfotografuj komórki z powiększeniem 4x, 10x lub 20x.

6. Obrazowanie poklatkowe formacji szlaku EPS

  1. Wykonaj obrazowanie poklatkowe na płytce 12-dołkowej (krok 3.2), jak przygotowano powyżej, lub na pojedynczej szalce Petriego. Wykonaj kroki 1-4. Zamiast hodować komórki w świetle fluorescencyjnym, komórki mogą być hodowane podczas montażu na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym.
  2. Obrazuj komórki co 5-10 minut, aby jak najlepiej uchwycić ruch komórek. Koraliki fluorescencyjne są widoczne przy użyciu zestawu filtrów FITC, ale w przypadku skoncentrowanych kulek należy użyć kanału jasnego pola. Można ustawić oświetlenie zewnętrzne (lampę) lub światło z samego mikroskopu można wykorzystać do dostarczenia energii do wzrostu i ruchu komórek. W mikroskopie Olympus Ix83 dobrze sprawdza się moc 5-6 V dla lampy trans. Może to wymagać prób i błędów w twoim systemie.

7. Korelacyjna analiza strukturalna ściany komórkowej za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)

UWAGA: Zmienione cechy ściany komórkowej obserwowane w żywych komórkach oznaczonych przeciwciałami specyficznymi dla komórki mogą być obrazowane w celu uzyskania szczegółowych cech za pomocą SEM. To podejście korelacyjne pozwala na uzyskanie danych ultrastrukturalnych, które można porównać z danymi fluorescencyjnymi.

  1. Otrzymać 1 ml zawiesiny komórkowej (kontrolnej lub poddanej obróbce doświadczalnej) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 4 000 x g przez 1 min.
  2. Odrzucić supernatant. Zanurz probówkę zawierającą osad w ciekłym azocie lub, jeśli nie jest dostępna, umieść ją w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Zamrożone komórki można przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.
  3. W czasie przetwarzania ściany komórkowej wyjmij probówkę z zamrażarki i pozostaw do rozmrożenia przez 15 minut. Ponownie zawiesić osad w 20 μl WHM i umieścić kroplę gęstej zawiesiny komórkowej na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 45 mm x 50 mm.
  4. Umieść drugie szkiełko nakrywkowe na wierzchu kropli, aby stworzyć kanapkę. Umieść na stole laboratoryjnym i ciągle dociskaj kanapkę, aby rozerwać komórki (np. 30 s).
  5. Ostrożnie oddzielić szklane szkiełka nakrywkowe i umyć pęknięte komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 500 x g przez 1 min.
  6. Odlej sklarowany osad. Pellet powinien być biały lub lekko zielony. Jeśli kolejne obrazowanie wykaże, że wystarczająca liczba komórek nie została rozerwana, powtórz krok 3 z osadem w tym miejscu.
  7. Zawiesić osad zawierający ściany komórkowe w D-H2O i powtórzyć kroki 7.4 i 7.5. Zawiesić osad w 100 μlDH2O i umieścić go w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  8. Zaopatrz się w króciec Cambridge (promień 6 mm lub 8 mm) i przyklej taśmę węglową (EMS) do jego powierzchni. Następnie umieść 5 μl kropli zawieszonego zawiesiny ściany komórkowej (krok 7) na taśmie węglowej. Obserwuj liczbę ścian komórkowych za pomocą mikroskopu preparacyjnego. Jeśli zawiesina jest zbyt gęsta, rozcieńczyć ją D-H2O.
  9. Umieść kikut w przykrytym pojemniku i pozostaw do wyschnięcia (2 godziny do nocy). Napylaj króciec przez 50 s za pomocą tarczy palladowej (można również zastosować inne cele). Obserwuj ogniwa pod napięciem 5 kV, wielkości plamki, w odległości 10 cm od wtórnego detektora elektronów.
    UWAGA: Rozcieńczenie zawiesiny ściany komórkowej przed osadzeniem kropli na taśmie węglowej ograniczy osadzanie się ścian komórkowych na sobie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znakowanie ściany komórkowej P. margaritaceum anty-pektynowymi mAb (np. JIM5) ujawnia sieć włókien i wypustek skompleksowanych z wapniem, które tworzą regularny wzór lub siatkę (Rysunek 1). Pektyna jest odkładana w środku komórki lub przesmyku, gdzie przemieszcza starszą pektynę w kierunku biegunów (Rysunek 2). Znakowanie innym przeciwciałem podobnym do pektyny JIM7 podkreśla początkowe wydzielanie pektyny o wysokiej estryfikacji metylowej w wąskim paśmie na przesmyku (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P. margaritaceum jest organizmem skutecznym w wyjaśnianiu dynamiki rozwoju ściany komórkowej i wydzielania ECM u roślin i glonów paciorkowcowych. Główne atrybuty obejmują jednokomórkowy pokrój i łatwość w utrzymaniu hodowli i eksperymentalnej manipulacji, pierwotną ścianę komórkową z wyraźną zewnętrzną siatką pektynową i innymi polimerami, łatwość znakowania żywych komórek za pomocą mAb skierowanych na ścianę komórkową, które można śledzić na czas dla kolejnych badań rozwojowych i / lub eksperymentalnych oraz pr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zgłasza się konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation (NSF) (grant MCB numer 2129443 dla DD).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 ml mikrocenta. RurkiFisher Scientific01-549-740
12-dołkowa mikropłytkaFisher Scientific50-233-6077
Szkiełka nakrywkowe 22 x 22 mmFisher Scientific12-541-016
Szkiełka nakrywkowe 45x50 cmBrain Research4550-1.5D
AgarSigma AldrichA9414
przeciw szczurom FITCSigma AldrichF6258
przeciw szczurom TRITCSigma AldrichT4280
chlorek wapniaSigma AldrichC4981
Klocki CambbridgeEMS75183-65
Fluoview CLSMEwidentFluoview 1200
JIM5KerafastELD004
JIM7KerafastELD005
MikrowirówkaFisher Scientific13-100-675
MikropipetyBioRad1660499EDU
Penium margaritaceum  Sammlung von Algenkulturen der Universitä t Gö ttingen - Kolekcja Kultur Glonów w Gö ttingen University2640
Zestaw polisferycznyPolysciences18336
SEMThermoFisherQuattro SEM
napylarka napylającaEMSQ150V
Mieszalnik wirowyFisher Scientific02-215-414

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Delmer, D., Dixon, R. A., Keegstra, K., Mohnen, D. The plant cell wall-dynamic, strong, and adaptable-is a natural shapeshifter. Plant Cell. 36 (5), 1257-1311 (2024).
  2. Bierenbroodspot, M. J., et al. Phylogeny and evolution of streptophyte algae. Ann Bot. 134 (3), 385-400 (2024).
  3. Domozych, D. S., et al. Endomembrane architecture and dynamics during secretion of the extracellular matrix of the unicellular charophyte, Penium margaritaceum. J Exp Bot. 71 (11), 3323-3339 (2020).
  4. Feng, X., et al. Genomes of multicellular algal sisters to land plants illuminate signaling network evolution. Nat Genet. 56 (5), 1018-1031 (2024).
  5. Jiao, C., et al. The Penium margaritaceum genome: Hallmarks of the origins of land plants. Cell. 181, 1097-1111 (2020).
  6. LoRicco, J. G., et al. The multifunctional roles of the extracellular matrix in the sessile life of the zygnematophyte Penium margaritaceum: stick, glide and cluster. Physiologie Plantarum. 176 (5), e14520(2024).
  7. LoRicco, J. G., et al. Aberrant growth and expansion in Penium margaritaceum triggered by disruption of microtubules and the cell wall. J Exp Bot. erae387, (2024).
  8. LoRicco, J. G., et al. Chemically induced phenotype plasticity in the unicellular zygnematophyte, Penium margaritaceum. Protoplasma. 261 (6), 1233-1249 (2024).
  9. Davis, D. J., et al. Callose deposition is essential for the completion of cytokinesis in the unicellular alga, Penium margaritaceum. J Cell Sci. 133 (19), jcs.249599(2020).
  10. Rydahl, M. G., et al. Penium margaritaceum as a model organism for cell wall analysis of expanding plant cells. Methods Mol Biol. 1242, 1-22 (2015).
  11. Carrillo-Carrasco, V. P., Hernández-García, J., Weijers, D. Electroporation-based delivery of proteins in Penium margaritaceum and other zygnematophycean algae. Physiol Plant. 175 (6), e14121(2023).
  12. Nichols, H. W. Growth media-freshwater. Handbook Phycol Methods. , 16-17 (1973).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Penium MargaritaceumCell Wall StructureImmunocytochemistryConfocal MicroscopyScanning Electron MicroscopyPectin DynamicsCell Wall LabelingAbiotic Stress ResponseMonoclonal Antibody LabelingExtracellular Polymeric Substances

Related Articles