Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe pól soczewicy pod kątem obecności więdnięcia Fusarium i zgnilizny korzeni w Turcji w klimacie lądowym

864 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68156

⸱

11 kwietnia 2025

 ,  ,  , 
1Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Yozgat Bozok University, 2Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, University of Tokat Gaziosmanpaşa, 3Department of Field Crops, Faculty of Agriculture, Yozgat Bozok University

W tym artykule

Podsumowanie

Badanie przeprowadzone w prowincji Yozgat wykazało, że czynniki biotyczne, takie jak choroby grzybowe, takie jak więdnięcie i zgnilizna korzeni, ograniczają produkcję soczewicy. Izolaty Fusarium znaleziono w 95,4% próbek, co sugeruje okresowe badania lokalne i regularne monitorowanie w celu zrównoważonego rozwoju technologii i skutecznych strategii kontroli.

Streszczenie

Soczewica jest ważną rośliną strączkową o samopylnym uprawie roślin strączkowych. Jego produkcja jest ograniczona przez różne czynniki biotyczne, zwłaszcza czynniki grzybowe powodujące kompleks więdnięcia i zgnilizny korzeni. Badanie miało na celu zrozumienie regionalnej epidemiologii i etiologii fitopatogennych czynników grzybowych w celu opracowania strategii zwalczania przenoszonych przez glebę Fusarium spp. W badaniu tym zbadano 83 miejsca siewu soczewicy w prowincji Yozgat pod kątem chorób więdnięcia, zgnilizny korzeni i koron wywoływanych przez pospolite gatunki Fusarium w latach 2022 i 2023. Zebrano rośliny soczewicy z objawami w celu izolacji i identyfikacji grzybów. Izolaty Fusarium pogrupowano według morfologii kolonii i hodowano na pożywce PDA. Ponadto genomowe DNA uzyskane z izolatów Fusarium przeanalizowano za pomocą PCR i porównano z innymi izolatami Fusarium zarejestrowanymi w NCBI GenBank. Pokrewieństwo genetyczne między izolatami Fusarium określono przy użyciu metody maksymalnej oszczędności (MP) w programie Mega 11. Wyniki, średnia zapadalność i nasilenie chorób więdnięcia i zgnilizny korzeni w prowincji Yozgat wynoszą odpowiednio 16,9% i 38,6%. Izolaty Fusarium znaleziono w 95,4% próbek. Jednorodność sekwencji nukleotydów wynosiła od 99,5% do 100% wśród izolatów F. oxysporum, F. culmorum, F. graminearum, F. acuminatum i F. solani, a najbardziej izolowanym gatunkiem był F. oxysporum. Dendrogram MP izolatów Fusarium został podzielony na dwie główne gałęzie, pierwsza gałąź obejmowała wszystkie izolaty F. solani. Druga główna gałąź obejmowała inne gatunki Fusarium wyizolowane w niniejszym badaniu oraz w NCBI GenBank. Badanie sugeruje okresowe badania lokalne w celu określenia częstotliwości więdnięcia Fusarium w celu zahamowania soczewicy. Zdecydowanie zaleca się terminowe tłumienie uszkodzeń spowodowanych przez Fusarium w celu kontrolowania choroby i zachowania systemu produkcji soczewicy.

Wprowadzenie

Soczewica (Lens culinaris Medik.), mała jadalna roślina strączkowa należąca do rodziny bobowatych (Fabaceae), to samopylna, chłodna roślina o liściach przypominających igły i białych do jasnofioletowych lub ciemnofioletowych kwiatach1. Został udomowiony przez ludzi około 10 000 lat temu w mezopotamskiej części Żyznego Półksiężyca i szybko rozprzestrzenił się na Nowy Świat, w tym do basenu Morza Śródziemnego i Azji Środkowej, a później został naturalizowany do Americas2. Światowy obszar uprawy soczewicy wynosi około 5,5 miliona hektarów, a produkcja wynosi 6,6 miliona ton3. Turcja zajmuje 4.miejsce pod względem produkcji soczewicy po Kanadzie, Indiach i Australii. Uprawa soczewicy w Turcji jest bardzo ważna i odpowiada za 6,7% światowej produkcji. Całkowita produkcja soczewicy w Turcji wynosi 474 000 ton i jest produkowana w co najmniej 40 prowincjach4. Około 89,5% produkcji soczewicy w Turcji stanowi soczewica czerwona i zielona, która stanowi 10,5% upraw ozimych w regionie południowo-wschodniej Anatolii. Reszta upraw jest uprawiana jako rośliny letnie. Prowincje Yozgat (39,5%), Konya (23,7%), Kırşehir (16,3%), Çorum (7,6%) i Ankara (2,9%) w dużej mierze przyczyniają się do produkcji zielonej soczewicy4. Produkcja soczewicy może być ograniczona przez biotyczne i abiotyczne czynniki stresowe. Mróz i susza są najczęstszymi abiotycznymi czynnikami stresowymi w letniej produkcji soczewicy zielonej5. Choroby grzybowe, takie jak więdnięcie, zespół zgnilizny korzeni i korony, wywoływane przez Ascochyta lentis, Rhizoctonia solani, R. bataticola, Aphanomyces euteiche, Pythium i gatunki Fusarium są najważniejszymi chorobami grzybiczymi, które powodują kombinację chorób, w tym zgorzelanie, zarazę siewek, więdnięcie i zgniliznę korzeni, w zależności od czasu infekcji, podatności żywiciela i warunków meteorologicznych6,7, 8.

Fusarium to nitkowaty, niedoskonały grzyb występujący w glebie, roślinach i podłożach organicznych i jest kosmopolitycznym rodzajem wśród tych patogenów9. Powoduje różne choroby, takie jak więdnięcie Fusarium, zgnilizna korzeni i szyjki korzeniowej, a także zaraza kłosów Fusarium w pszenicy, więdnięcie Fusarium w dyniowatych i zgnilizna korzeni w większości roślin strączkowych, w tym soczewicy10,11,12. Więdnięcie naczyń krwionośnych, zgnilizna korzeni i szyjki korzeniowej wywołana przez Fusarium spp. jest najważniejszą chorobą soczewicy w wielu obszarach uprawy soczewicy na całym świecie10. Fusarium oxysporum jest najczęstszym gatunkiem Fusarium związanym z więdnięciem, zgnilizną korzeni i szyjki korzeniowej soczewicy. Na całym świecie choroby więdnięcia, zgnilizny korzeni i koron są wywoływane przez F. graminearum, F. sporotrichioides, F. equity, F. acuminatum, F. redolent, F. avenaceum, F. culmorum, F. solani i F. verticillioides na obszarach sadzenia soczewicy7. Choroby więdnięcia, zgnilizny korzeni i koron wywoływane przez Fusarium spp. występują zarówno w stadium siewek, jak i dorosłych i powodują nagłe więdnięcie, wysuszenie i ostateczną śmierć liści. Objawy choroby obejmują zgniliznę nasion, zgniliznę korzeni, więdnięcie górnych listków, karłowatość, kurczenie się i zwijanie liści. W środkowej i późnej fazie napełniania strąków nasiona są zwykle skurczone, a objawy korzeniowe obejmują zahamowanie wzrostu, brązowe przebarwienia, uszkodzone końcówki korzeni palowych i proliferację korzeni wtórnych. Przebarwienia tkanki naczyniowej mogą nie być widoczne we wszystkich przypadkach13.

W regionie Centralnej Anatolii przeprowadzono badania nad stanem chorób więdnących i zgnilizny korzeni soczewicy w ograniczonej liczbie. Yozgat ma łagodny i umiarkowany klimat z obfitymi opadami deszczu zimą w porównaniu do lata i jest klasyfikowany jako Dsb (Ciepły, wilgotny klimat lądowy) przez Köppena i Geigera14. Średnia temperatura wynosi 9.6 °C, a średnie opady 512 mm. Yozgat znajduje się na półkuli północnej. Lato występuje w czerwcu, lipcu, sierpniu i wrześniu. Bardzo ważne jest posiadanie informacji na temat regionalnej epidemiologii i etiologii fitopatogennych czynników grzybowych wywołujących chorobę dla opracowania różnych strategii zwalczania przenoszonych przez glebę Fusarium spp., w celu zwalczania choroby15. W tym kontekście celem niniejszego badania jest określenie i zidentyfikowanie - parametrów chorobowych (częstość występowania choroby, częstość występowania i nasilenie) chorób więdnięcia, zgnilizny korzeni i korony soczewicy soczewicy poprzez przeprowadzenie badania w prowincji Yozgat, gdzie około 40% całkowitej produkcji soczewicy zielonej odbywa się pojedynczo, patogennego Fusarium gatunki powodujące więdnięcie i zgniliznę korzeni soczewicy za pomocą analiz morfologicznych i molekularnych oraz określenie indywidualnych poziomów zjadliwości gatunków Fusarium poprzez przeprowadzenie testów chorobotwórczości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Badanie terenowe, pobieranie próbek i izolacja grzybów

UWAGA: Badania przeprowadzono w 2022 i 2023 roku, zgodnie z Endes16. W sumie 83 obszary sadzenia soczewicy obejmujące dziewięć dystryktów w prowincji Yozgat zaobserwowano chorobę więdnięcia, korzeni i zgnilizny szyjki korzeniowej (Rysunek 1).

  1. Wybierz pola soczewicy o powierzchni ponad 1000m2 jako obszar pobierania próbek. Zbierz każdą próbkę, idąc losowo od granicy do środka lub środka pola zygzakami idąc po przekątnych za pomocą ramy o powierzchni 1 m2, umieszczając ją losowo w co najmniej trzech losowo wybranych różnych punktach. Zbierz rośliny soczewicy wykazujące objawy choroby z każdego punktu, umieść je w papierowych torbach i przenieś do laboratorium w celu wykorzystania w badaniach nad izolacją i identyfikacją grzybów.
    UWAGA: Korzenie i szyjki korzeniowe chorych roślin soczewicy przeniesionych do laboratorium zostały najpierw umyte wodą z kranu, aby pozbyć się gruboziarnistych pozostałości; później poddano je dezynfekcji powierzchni w celu wyizolowania patogenów grzybowych, zgodnie z opisem Endes16.
  2. Namocz chore tkanki roślinne w 70% etanolu przez 10-15 s, a następnie spłucz 3x po 3 min w sterylnej wodzie. Trzymaj je wszystkie w 1% podchlorynie sodu (NaOCl) przez 5 minut i spłukuj 3x po 5 minut ponownie sterylną wodą.
  3. Wysuszyć mokre tkanki roślinne na bibule filtracyjnej w sterylnej szafce, aby zakończyć proces dezynfekcji powierzchni. Następnie pokrój zdezynfekowane tkanki roślinne na kawałki o długości 5-10 mm i umieść 4-5 kawałków na podłożu PDA zawierającym 0,01% streptomycyny na szalkach Petriego (średnica 90 mm). Umieścić szalki Petriego w inkubatorze w ciemności w temperaturze 25 ± 1 °C na 4-7 dni i obserwować rozwój grzybów.
    UWAGA: Rozwijające się izolaty grzybów oczyszczono metodą izolacji pojedynczych zarodników. W tym celu zmodyfikowano i wykorzystano badanie przeprowadzone przez Choi et al.17 na uzyskiwaniu pojedynczych kultur zarodnikowych grzybów należących do Ascomycetes, Basidiomycetes, Coelomycetes i Hyphomycetes, a następnie wykorzystano je w sposób opisany poniżej.
  4. W celu oczyszczenia izolatów grzybów, izolaty grzybów otrzymane po zakończeniu badań izolacyjnych należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 25 ± 1 °C przez 12 godzin światła fluorescencyjnego / 12 godzin ciemności przez 15 dni, aby zachęcić do tworzenia anamorficznych struktur rozrodczych na PDA.
  5. Zważyć szpatułką około 100 mg grzybni z 15-dniowych kultur, przenieść ją do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, a następnie dokładnie zmielić sterylnymi plastikowymi tłuczkami w celu homogenizacji.
  6. Dodaj 1 ml sterylnej wody i wiruj przez 1 minutę, aby zapewnić przeniesienie zarodników do wody. Aby dostosować liczbę zarodników przenoszących się do wody, należy pobrać pipetą 20 μl tej mieszaniny i sprawdzić liczbę zarodników pod 10-krotnym powiększeniem mikroskopu świetlnego.
  7. Gdy ilość zarodników jest większa niż pożądana, rozcieńczyć mieszaninę zarodników i wody w proporcjach takich jak 1/10, 1/100 i 1/1000. Dostarczyć mieszaninę zawierającą 4-6 zarodników w polu widzenia mikroskopu.
  8. Pobrać 100 μl przygotowanej zawiesiny zarodników i przenieść ją na szalki Petriego o średnicy 90 mm zawierające pożywkę PDA uzupełnioną 0,1% streptomycyną. Następnie rozprowadzić przeniesioną zawiesinę na palmtopie za pomocą szpatułki Drigalskiego.
  9. Przygotowane szalki Petriego inkubować w ciemności w temperaturze 25 ± 1 °C przez 12–24 godzin. Pod koniec tego okresu przenieś małe kawałki strzępek powstałych z pojedynczych konidiów z pętlą inokulacyjną na nową szalkę Petriego zawierającą pożywkę PDA. Każda kultura uzyskana z każdego zarodnika jest pojedynczą kulturą zarodników. Należy je przechowywać w celu wykorzystania w testach chorobotwórczości oraz identyfikacji morfologicznej i molekularnej.
    UWAGA: Głównym celem jest utrzymanie izolatów grzybów przy życiu przez długi czas bez zmiany ich morfologii, genetyki i zjadliwości. Proces przechowywania został przeprowadzony przy użyciu dwóch różnych metod18,19. Wszystkie metody przechowywania zastosowane w tym badaniu zostały szczegółowo wyjaśnione poniżej.
    1. Pierwsza metoda przechowywania próbek jest następująca. Hoduj izolaty grzybów na pożywce PDA w temperaturze 25 ± 1 °C w temperaturze 12:12 h dark: light przez 15 dni, aby uzyskać krążki grzybni o średnicy 4 mm, które można przechowywać w sterylnej wodzie.
    2. Wytnij krążki grzybni (średnica 4 mm, 10 krążków) za pomocą świdra korkowego z kultur grzybów, które rosły w wyżej wymienionych warunkach. Przenieść krążki grzybni do probówek mikrowirówek zawierających 1 ml sterylnej wody. Próbki należy przechowywać w probówkach do mikrowirówek w lodówce w temperaturze -20 °C przez 6 miesięcy.
    3. Druga metoda przechowywania próbek jest następująca. Po pierwsze, weź szczyptę czystego krążka grzybów z pojedynczych kultur zarodników uzyskanych za pomocą pętli inokulacyjnej i przenieś ją na szalki Petriego zawierające PDA uzupełnione chloramfenikolem, kwasem mlekowym, ampicyliną, ryfampicyną, tetracykliną, streptomycyną itp.
    4. Rosnąć przez 5-10 dni przed przechowywaniem w temperaturze 25 ± 1 °C w temperaturze 12 h: 12 h ciemny: jasny. Wytnij i wysterylizuj bibuły filtracyjne ogólnego przeznaczenia o wymiarach 1 cm x 1 cm w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 psi przez 60 min.
    5. Umieścić bibuły filtracyjne na nowych szalkach Petriego z tym samym lub selektywnym podłożem. Wytnij kolonie/zarodniki z czystej kultury grzybów i umieść je na wierzchu każdego kawałka.
    6. Zamknij szalki Petriego i umieść je w inkubatorze w odpowiednich warunkach wzrostu (jak wspomniano powyżej). Izolaty grzybów rosną powoli na bibule filtracyjnej. Inkubować przez około 15 dni, aby zapewnić całkowitą kolonizację.
    7. Po zarodnikowaniu lub całkowitym utworzeniu kolonii na bibułach filtracyjnych, przenieś poszczególne kawałki bibuły na nową szalkę Petriego bez pożywki hodowlanej. Później umieść szalki Petriego w inkubatorze, aż bibuła filtracyjna i grzyb całkowicie wyschną (około 20-30 dni).
    8. Po wysuszeniu umieścić 10 kawałków bibuły filtracyjnej w każdej sterylnej kopercie papierowej, oznaczyć każdą kopertę, umieścić te koperty w plastikowych torebkach i przechowywać plastikowe torby zawierające koperty w plastikowym i przezroczystym pojemniku w temperaturze -20 °C.
  10. Oblicz częstość występowania więdnięcia soczewicy, choroby korzeni i zgnilizny korony w Yozgat zgodnie ze wzorem podanym poniżej, biorąc pod uwagę częstość występowania choroby na każdym polu soczewicy, a następnie nazwę dystryktu prowincji.
    Częstość występowania choroby (%) = (a / b) x 100
    gdzie A oznacza liczbę chorych pól; b oznacza łączną liczbę badanych pól w okręgu.
  11. Oblicz częstość występowania choroby zgodnie z metodą średniej ważonej zgłoszoną przez Bora i Karaca20. Policz rośliny w każdym kwadracie na polu. Podziel je na chore i niechore rośliny w każdym kwadracie i oblicz częstość występowania choroby zgodnie ze wzorem podanym poniżej.
    Częstość występowania choroby (%) = (x / y) x 100
    gdzie x oznacza liczbę chorych roślin; y oznacza łączną liczbę badanych roślin.
  12. Oblicz nasilenie choroby według skali 0-4 Öğüt21, gdzie 0 = brak objawów, 1 = łagodne objawy w 25% liści; 2 = umiarkowane objawy w 26%-50% liści; 3= silna chloroza i więdnięcie w 51%-75% liści; i 4 = bardzo silna chloroza i objawy więdnięcia lub wysuszenia, linienie, opóźnienie wzrostu lub martwe liście na ponad 75% roślin w tej samej kolejności (Rysunek 2).
  13. Oblicz nasilenie choroby za pomocą następującego wzoru z uzyskanymi wartościami skali16.
    Nasilenie choroby (%) = [∑ [ i (ni x vi) / (V) x N)] x 100
    gdzie ni liczba roślin w wartości skali; vi wartość skali; V najwyższa wartość skali; N całkowita liczba zaobserwowanych roślin; i oznacza liczbę klas.

2. Dane meteorologiczne

  1. Przeprowadzanie badań ankietowych. Na potrzeby tego protokołu badania ankietowe przeprowadzono w okresie maja i czerwca 2022 r. oraz 2023 r. Uzyskaj wartości temperatury, wilgotności względnej i całkowitych opadów dla okresu marzec-lipiec w 2022, 2023 i długich latach z Dyrekcji Meteorologii Prowincji w Yozgat (Tabela 1).

3. Identyfikacja morfologiczna

  1. Porównaj cechy kulturowe (kolor kolonii, grzybnia powietrzna, tempo wzrostu grzybni) i konidialne (wymiary konidialne, kształt, kolor i liczba przegrody) izolatów Fusarium z tymi z wcześniejszych badań i wstępnie zidentyfikuj gatunki grzybów.
  2. Wybrać reprezentatywne próbki z grup, które mają być wykorzystane w identyfikacji morfologicznej. Oczyść te próbki zgodnie z metodą izolacji pojedynczych zarodników, jak wspomniano powyżej. W tym okresie obserwuj charakterystykę pigmentacji kolonii izolatów Fusarium, a także struktury mikro/makrokonidiów i chlamydospor.
  3. Aby ułatwić tworzenie struktur mikromorfologicznych, takich jak mikro/makrokonidia i chlamydospory, w otrzymanych czystych kulturach grzybów, inkubować na PDA w temperaturze 25 ± 1 °C i 12 godzin: 12 godzin ciemno: światło przez 25-30 dni w inkubatorze. Zmierz długość i szerokość konidiów dla każdego izolatu Fusarium za pomocą mikroskopii świetlnej. Ponadto należy udokumentować strukturę, kształt, kolor i przegrody lub bez przegród konidiów za pomocą mikroskopu świetlnego dostarczonego z aparatem cyfrowym.
  4. Na podstawie powyższych obserwacji pogrupuj izolaty Fusarium według poziomu gatunku, zgodnie z opisem w Leslie i Suerell22.

4. Identyfikacja molekularna

UWAGA: Całkowite genomowe DNA izolatów Fusarium zostało wyekstrahowane przy użyciu następującej metody, która została nieznacznie zmodyfikowana w stosunku do protokołu Cenis23. Analizy PCR i elektroforezę izolatów Fusarium przeprowadzono przy użyciu protokołu opisanego przez Aras and Endes24.

  1. Ekstrakcja genomowego DNA grzybów
    1. Ze świeżej kultury (10-dniowej) izolatów Fusarium wyhodowanych na PDA, zeskrobać 100 mg grzybni sterylnym skalpelem, a następnie przenieść ją do probówki mikrowirówki o pojemności 2 ml. Inkubować probówki w temperaturze -20 °C przez noc.
    2. Po całonocnej inkubacji dodać 500 μl buforu do ekstrakcji DNA (200 mM Tris-HCl pH: 8,5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% dodecylosiarczanu sodu) do probówek i rozdrobnić sterylnym plastikowym tłuczkiem.
    3. Następnie dodać 150 μl octanu sodu 3M (NaOAc) o pH 5,2 do probówek i inkubować w temperaturze -20 °C przez 30 minut. Po tym etapie odwirować probówki o stężeniu 4 000 x g przez 10 minut.
    4. Po odwirowaniu przenieść 400 μl supernatantu z górnej części probówki do nowych probówek (1,5 ml) i dodać równą objętość izopropanolu (2-propanolu). Inkubować nowe probówki w temperaturze -20 °C przez 30 minut. W tym czasie delikatnie wymieszaj probówki 5x lub 6x.
    5. Wirować przy 4 000 x g przez 10 minut, aby wytrącić genomowe DNA i wyrzucić cały płyn pozostały w probówkach.
    6. Dodaj 1 ml 70% etanolu do osadu genomowego DNA w postaci białego lub kremowego osadu na dnie probówki. Delikatnie mieszaj probówkę w górę iw dół 4x-5x przez około 1 minutę, wyrzucając cały etanol z probówek. Następnie otwórz probówki w laminarnym przepływie powietrza przez 30 minut, aby całkowicie odparować etanol z granulki DNA.
    7. Aby rozpuścić genomowe DNA i przechowywać je przez długi czas, należy dodać 50 μl roztworu buforowego TE (1M Tris-HCl pH: 8,0; 0,5M EDTA pH 8,0) do probówek i inkubować probówki w łaźni wodnej w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę. W tym czasie delikatnie wymieszaj rurkę w górę iw dół 8x-10x. Przechowywać genomowe DNA rozpuszczone w roztworze buforowym TE w zamrażarce o temperaturze -20 °C do wykorzystania w badaniach molekularnych.
  2. Do badań PCR użyj starterów oligonukleotydowych ITS5 F (5′GGAAGTAAAGTCGTAACAAGG3') / ITS4 R (5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3') do amplifikacji regionu ITS rDNA25. Każdą reakcję PCR należy przeprowadzić z 2,5 μl 10x buforu PCR, 2,5 μl MgCl2 (25 mM), 2,5 μl dNTP (2 mM), 0,5 μl każdego startera (10 μM), 2 μl matrycy DNA, 0,5 μl polimerazy Taq DNA (1 U/μL, Fermantas) i 14 μL sQH2O w całkowitej objętości 25 μL.
  3. W przypadku reakcji PCR o objętości 25 μl należy uruchomić następujący program PCR w temperaturze 95 °C przez 2 minuty (początkowa denaturacja), a następnie 40 cykli; 95 °C przez 30 s (denaturacja), 55 °C przez 45 s (wyżarzanie), 72 °C przez 90 s (przedłużenie) i 72 °C przez 5 minut (końcowe przedłużenie). Produkty do elektroforetycznego PCR przez 1,5 h przy 90 V w 1,5% żelu agarozowym przygotowanym w 1x roztworze buforowym TAE (Tris Base - Glacial Acetic Acid - EDTA).
    1. Aby przygotować bufor TAE do elektroforezy żelowej, rozpuść 242 g zasady Tris w 700 ml sterylnej wody; dodaj 57,1 ml lodowatego kwasu octowego; dodaj 100 ml 0,5 M roztworu EDTA i dostosuj objętość do 1 litra, dodając sterylną wodę. Doprowadzić końcowe pH 1 l 50-krotnego buforu TAE do 8,5. Aby uzyskać bufor roboczy 1x TAE, dodaj 49 części sterylnej wody do 1 części buforu 50x TAE.
  4. Zabarwić żele bromkiem etydyny o stężeniu 0,5 μg/ml i sprawdzić je wzrokowo, uwidaczniając je na transiluminatorze UV.
  5. W celu zbadania pokrewieństwa filogenetycznego między izolatami czynnika zgnilizny korzeni i korony, należy uzyskać sekwencje zasad genu ITS metodą PCR, które zostały zsyntetyzowane dwukierunkowo (5'-3' i 3'- 5') za pośrednictwem dostawcy. Porównaj sekwencje zasad z danymi genów ze strony internetowej NCBI (National Center of Biotechnology Information) oraz sekwencjami zasad genu ITS innych izolatów Fusarium na świecie za pomocą programu Blast. Użyj tego, aby zidentyfikować izolaty na poziomie gatunku, jak opisano poniżej.
    1. Wejdź na https://www.ncbi.nlm.nih.gov stronę internetową. Kliknij zakładkę BLAST w sekcji Popularne zasoby.
    2. Kliknij zakładkę Nucleotide BLAST w nowym oknie. W sekcji Wprowadź sekwencję zapytania w nowym oknie wprowadź sekwencje podstawowe w formacie Fasta i wpisz nazwę badania w sekcji Stanowisko.
    3. Następnie sprawdź Standardowe bazy danych (nr itp.) w zakładce Baza danych w sekcji Wybierz zestaw wyszukiwania na dole.
    4. Zaznacz Bardzo podobne sekwencje (megablast) w zakładce Optymalizuj dla w sekcji Wybór programu i kliknij zakładkę BLAST na dole strony.
  6. Użyj programu do analizy filogenetycznej MEGA 11, aby określić pokrewieństwo filogenetyczne między izolatami Fusarium. Dopasuj sekwencje podstawowe za pomocą programu ClustalW i utwórz genetyczne drzewa genealogiczne izolatów zgodnie z maksymalną oszczędnością dla genu ITS26.
    1. Aby pobrać oprogramowanie Mega, przejdź do https://www.megasoftware.net stronie internetowej i zainstaluj oprogramowanie Mega. Oprogramowanie MEGA jest dostarczane BEZPŁATNIE do użytku w badaniach i edukacji.
    2. Najpierw zapisz sekwencje na pulpicie jako plik Notatnika (.txt) w formacie FASTA. Uruchom oprogramowanie Mega i kliknij kartę WYRÓWNAJ. Kliknij Edycja/Buduj wyrównanie w oknie. Następnie zaznacz opcję Utwórz nową linię trasowania w nowym oknie i kliknij przycisk OK, aby potwierdzić.
    3. Kliknij zakładkę DNA. Usuń 1. Sekwencja, która automatycznie pojawi się w oknie i przejdź do Edytuj plik, a następnie kliknij Wstaw sekwencję z zakładki Plik. Otwórz plik Notatnik (.txt), który zawiera sekwencje i znajduje się na pulpicie.
    4. Na tym etapie na ekranie pojawiają się wszystkie sekwencje. Najpierw kliknij dowolną sekwencję, która pojawi się na ekranie, a następnie zaznacz wszystkie sekwencje za pomocą CTRL + A. Otwórz plik Alignment i kliknij Align by Clustal W, a następnie kliknij OK, aby uruchomić program w ustawieniach domyślnych.
    5. Po zbadaniu różnic w wyrównaniu sekwencji przejdź do pliku danych, kliknij Analiza filogenetyczna, a następnie kliknij Nie w polu wyboru w oknie, czy sekwencje syntetyzują białka, czy nie. Nasze sekwencje nie syntetyzują białek, ponieważ należą do regionu ITS.
    6. Wróć do głównego okna oprogramowania Mega. Kliknij Filogeneza i wybierz Skonstruuj/Przetestuj Maksymalne Drzewo(y) Oszczędności. W nowym oknie wybierz Metoda Bootstrap dla testu filogenezy i wprowadź wartości bootstrap 1,000, aby przetestować siłę gałęzi. Na karcie Luki/brakujące dane wybierz opcję Częściowe usuwanie, wybierz opcję Poddrzewo-przycinanie-ponowne szczepienie (SPR) jako metodę wyszukiwania MP i kliknij przycisk OK, aby potwierdzić operacje.
    7. Poczekaj, aż wynik analizy pokaże drzewo filogenetyczne.

5. Test chorobotwórczości

  1. Do badań chorobotwórczości należy użyć czterech izolatów dla każdego reprezentatywnego gatunku z gatunku Fusarium, który został zidentyfikowany metodami molekularnymi. Przeprowadzić badania chorobotwórczości w temperaturze 24 °C, 16 godzin światła fluorescencyjnego/8 godzin ciemnego fotoperiodu, przy wilgotności 65% w klimatyzowanym pomieszczeniu.
  2. Nasiona soczewicy siej w czarnych plastikowych fiolkach z 45 otworami o średnicy 5 cm. Przechowywać każdą fiolkę w 1% podchlorynie sodu przez 3 minuty, a następnie spłukać sterylną wodą destylowaną 3x. Suszyć nasiona w sterylnej szafce przez 24 godziny i wysiewać po jednym nasionku w każdym dołku.
    UWAGA: Nasiona soczewicy odmiany Kayı 91, wrażliwej na chorobę, zostały użyte we wszystkich testach patogenności6. Jako metodę inokulacji zastosowano technikę zanurzania siewek27.
  3. Inkubować czyste kultury każdego izolatu w PDA w temperaturze 24 °C przez 7-10 dni. Zeskrobać kolonie wyhodowane z kultury podstawowej z powierzchni pożywki za pomocą szpatułki i przygotować zawiesinę zarodników/grzybni przy użyciu sterylnej wody destylowanej.
  4. Usunąć duże pozostałości z zawiesiny przez filtrację przez 4-warstwową gazę i dostosować stężenie zarodników/grzybni do 1 x 106 zarodników/ml za pomocą hemocytometru.
  5. Po tym etapie wyrwij korzenie sadzonek wcześniej wyhodowanych w fiolkach, gdy mają 2-3 prawdziwe liście. Umyj w wodzie z kranu i lekko uszkodzić korzenie sterylną igłą. Zanurz te sadzonki w przygotowanej zawiesinie zarodników/grzybni na 3 minuty, a następnie przesadzić je do plastikowych fiolek zawierających sterylną mieszaninę gleby i torfu (2:1; v/v).
  6. W przypadku sadzonek używanych jako kontrola wyrwij ich korzenie, uszkodzić je, a następnie posadź je, zanurzając je tylko w sterylnej wodzie. Wykonaj ocenę testu chorobotwórczości 3 tygodnie po procesie inokulacji zgodnie ze skalą 0-4.
  7. Po obliczonych wartościach ciężkości choroby poddano transformacji kąta, uzyskane wartości poddać analizie wariancji i ocenić różnice między średnimi zgodnie z testem HSD Tukeya (p = 0,05). Nasilenie choroby: Izolaty z 0%-15% oceniano jako mające bardzo niską zjadliwość (LV), izolaty z 16%-35% oceniano jako niską zjadliwość (LV), izolaty z 36%-50% oceniano jako umiarkowaną zjadliwość (O), izolaty z 51%-70% oceniano jako wysoką zjadliwość (VV), izolaty z 71%-100% oceniano jako bardzo wysoką zjadliwość (VV), a izolaty bez objawów chorobowych oceniano jako izolaty saprofityczne lub epifityczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyznaczanie parametrów choroby
Oceniono łącznie 83 obszary siewu soczewicy obejmujące dziewięć różnych regionów Yozgat pod kątem występowania objawów więdnięcia oraz zgnilizny korzeni i szyjki, obejmując obszar o wielkości 1,1984 x 106 m2 (Tabela 2). W wszystkich polach stwierdzono objawy więdnięcia lub zgnilizny korzeni. Jednakże częstość występowania więdnięcia i zgnilizny korzeni w Yozgat określono na poziomie 16,9%, przy cięż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wiadomo, że więdnięcie Fusarium powoduje poważne straty ekonomiczne w plonach w niektórych częściach świata31. Choroba została po raz pierwszy zgłoszona na Węgrzech32, a później w wielu krajach, takich jak Egipt, Indie, Birma, Nepal, Pakistan, Turcja, Syria i USA33. Kumar i wsp.34 poinformowali o szerokim rozpowszechnieniu więdnięcia soczewicy, zgnilizny korzeni i szyjki korzeniowej, z doniesieniami o występowaniu w c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Centrum Koordynacji Projektów i Badań Uniwersytetu Bozok, jednostkę BAP o numerze projektu FÇD-2022-1096. To badanie jest częścią pracy doktorskiej Sevima Atmaca.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(S)-kwas mlekowyMerck100366Był stosowany jako antybiotyk w badaniach.
2-propanolMerck109634Stosowany w badaniach molekularnych.
Regulowana mikropipeta automatyczna (0,1-2,5 i mikro; L)Eppendorf ResearchLB. EP.3123000012Służy do pomiaru małych objętości cieczy.
Regulowany zestaw mikropipet automatycznych (2 – 20 µ l, 20 – 200 i mikro; l, 100 – 1.000 &mikro; l)Eppendorf ResearchLB. EP.4924000916Służy do pomiaru małych objętości cieczy.
AgarMerck110453Do stosowania w pożywkach grzybowych.
AgarozaSigma-Aldrich18300012Do stosowania w preparatach żelowych w elektroforezie.
Pomieszczenie klimatyzacyjne?klimlabSłużyło do uprawy roślin w kontrolowanych warunkach.
AmpisilinSigma-AldrichA9393Był stosowany jako antybiotyk w badaniach.
Precyzyjna waga analitycznaShimadzu ATX224Służyła do ważenia materiałów stałych użytych w badaniu.
Sterylizator w autoklawieZealway GF-120DRSłużył do sterylizacji materiałów stałych i ciekłych na każdym etapie badania.
Mikroskop dwuokularowyLeica DM750Do stosowania w diagnostyce morfologicznej.
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoHFsafe Klasa II A2Aby zapewnić bezpieczeństwo miejsca pracy, użytkownika, środowiska i operacji.
OdśrodkowyDLAB DM1424LB. DL.903001124Służy do rozdzielania cząstek w próbce na podstawie ich kształtu, wielkości i gęstości
ChloramfenikolSigma-Aldrich220551Był stosowany jako antybiotyk w badaniach.
Zestaw świdrów korkowychSigma-AldrichZ165220Służył do pobierania próbek z kultur grzybów na szalkach Petriego.
Szkło nakrywkowe i szkiełkoISOLAB075.01.006 / 075.02.005Zastosowano w procesie przygotowania do badań mikroskopowych.
D(+)-glukoza jednowodnaMerck108342Do stosowania w wytwarzaniu pożywek grzybowych.
DFC450 z aparatem cyfrowymLeicaDigital z interfejsem c-mount i 5-megapikselową matrycą ccd.
Mikroskop dwuokularowy Dm750 LeicaMIC5246Był używany do morfologicznej identyfikacji grzybów.
Elektroforeza żelowa DNAthermo fisher scientificB2-UVT
Barwnik w żelu Dna (6x)Thermo ScientificR0611Do stosowania w diagnostyce molekularnej.
Mieszanka dNTPThermo ScientificR0192Stosowany w badaniach molekularnych.
Dreamtaq pcr master mixes (2x)Thermo ScientificK1082Do stosowania w diagnostyce molekularnej.
Szpatułka DrigalskiegoISOLAB082.03.001Służyła do skrobania i rozprowadzania kultur grzybów uprawianych na szalkach Petriego.
Edta Thermo Scientific17892Do stosowania w diagnostyce molekularnej.
EtanolMerck100983stosowany w badaniach molekularnych i badaniach nad dezynfekcją powierzchni.
Bromek etydynySigma-AldrichE7637Służy do barwienia DNA w żelach podczas elektroforezy żelowej.
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-AldrichE6758Stosowany w badaniach molekularnych.
Bibuła filtracyjnaISOLAB107.58.158Stosowana w badaniach kultur stockowych.
Szafa susząca z wymuszonym obiegiem powietrzaZHICHENG ZXDS-A-1090Do stosowania w procesach inkubacji.
DygestoriaElektromag EM1201LB. EM. EM1201Służył do kontrolowania szkodliwych oparów chemicznych, gazów i pyłów.
Żelowy system obrazowaniaSyngene G:BOX Chemi XX6Do stosowania w diagnostyce molekularnej.
Generuler 50 bp dna ladderThermo ScientificSM0372Do stosowania w diagnostyce molekularnej.
Lodowaty kwas octowyMerck1005706Stosowany w badaniach molekularnych.
GlicerolMerck104094Do stosowania w hodowli grzybów.
LancetISOLAB048.50.002Służy do usuwania chorych tkanek z próbek roślin.
Chlorek magnezuSigma-Aldrich814733stosowany w badaniach molekularnych.
Miara zwijanaISOLAB016.07.500Służy do pomiaru objętości cieczy.
Probówki do mikrowirówekISOLAB0778.03.001 / 0778.03.002 / 0778.03.003Służą do przechowywania różnych objętości płynów.
Probówka do PCRISOLAB123.01.002Służyła do umieszczania mieszanki dna w badaniach pcr.
szalki PetriegoISOLAB120.13.090Do stosowania w uprawie kultur grzybów.
Końcówki do pipetISOLAB005.01.001 / 005.01.002 / 005.01.003 / 005.01.004Do przenoszenia objętości cieczy używanych w analizach.
Torba plastikowaISOLAB039.30.005Służyła do transportu próbek do laboratorium.
Plastikowa doniczkaToXAByła używana do uprawy roślin.
Szczypce, zaciskiISOLAB048.08.130Służył do wkładania bibuły filtracyjnej do kopert po tym, jak grzyb wyrósł na szalce Petriego.
Moździerz porcelanowyISOLAB038.02.150Służył do rozdrabniania grzybni.
Agar z dekstrozą ziemniaczanąCondalab1022Do identyfikacji i uprawy oraz grzybów.
System czystej wodyczłowiek CORPORATIONLT. HC. NHP009Był używany do przygotowywania i analizy roztworów we wszystkich badaniach.
Lodówka (+4 ° C / -20 ° C)VestelDo stosowania w magazynie materiałów wyjściowych.
RyfampicynaSigma-Aldrich557303Była stosowana jako antybiotyk w badaniach.
Octan soduMerck106268Stosowany w badaniach molekularnych.
Chlorek soduMerck1064041000Stosowany w badaniach molekularnych.
Dodecylosiarczan soduSigma-Aldrich436143Stosowany w badaniach molekularnych.
Roztwór podchlorynu soduMerck105614Służy do dezynfekcji powierzchni.
SzpatułkaISOLAB047.33.210Służyła do zeskrobywania kultury grzybów rosnących na szalkach Petriego.
Siarczan Streptomyc?nBioShop CanadaSTP101Aby zapobiec zanieczyszczeniu w uprawie kultur grzybów.
Teksoll extra pureTekkimTK.200650Do stosowania jako środek dezynfekujący na wszystkich etapach pracy.
TetrasiklinSigma-AldrichT3258Był stosowany jako antybiotyk w badaniach.
Termocykler PCRBio? Rad T100Do stosowania w analizach genomicznych.
Thoma lamISOLAB075.03.002Do stosowania w liczeniu zarodników.
Tris HCLRoche10812846001Stosowany w badaniach molekularnych.
TrizmaSigma-AldrichT1503Stosowany w badaniach molekularnych.
Tween 80Merck822187Do stosowania w roztworze przetrwalników w testach chorobotwórczości.
Mieszalnik wirowy vorteksVelp WIZARDLB. VLP. F202A0175Służy do mieszania substancji w objętościach cieczy.
Kąpiele wodneMemmert WNB 221018-5702Stosowano go podczas inkubacji w badaniach ekstrakcji DNA.
Aparat mikroskopowy

Bibliografia

  1. Skrzypkowski, W., Kiełkowska, A. Current status of haploidization in cool-season grain legume crop species. Agriculture. 14 (7), 1031(2024).
  2. Liber, M., Duarte, I., Maia, A. T., Oliveira, H. R. The history of lentil (Lens culinaris subsp. culinaris) domestication and spread as revealed by genotyping-by-sequencing of wild and landrace accessions. Front Plant Sci. 12, 628439(2021).
  3. FAOSTAT. , Food and Agriculture Organization of the United Nations. Database on Crops https://www.fao.org/faostat/en/#data (2022).
  4. TÜİK. Agricultural statistics report. , Turkish Statistical Institute. Türkiye. (2023).
  5. Baxevanos, D., et al. Lentil cultivar evaluation in diverse organic mediterranean environments. Agronomy. 14 (4), 790(2024).
  6. Aydın, M., Koç, M., Sağır, A. Investigations on determination of soilborne fungal pathogens causing root rot, crown rot and wilt on lentil in Southeast Anatolia Region. Plant Protect Bulletin. 44 (1), 93-103 (2004).
  7. Zitnick-Anderson, K., et al. Fusarium species associated with root rot of lentil (Lens culinaris) in North Dakota. Plant Health Prog. 22 (4), 524-528 (2021).
  8. Kushwaha, D. A. A research book of seed mycoflora of chickpea (Cicer arietinum). , books.google.com (2020).
  9. Ekwomadu, T. I., Mwanza, M. Fusarium fungi pathogens, identification, adverse effects, disease management, and global food security: A review of the latest research. Agriculture. 13 (9), 1810(2023).
  10. Jiskani, A. M., et al. A destructive disease of lentil: Fusarium wilt of lentil. Plant Arch. 21 (1), 2117-2127 (2021).
  11. Alisaac, E., Mahlein, A. K. Fusarium head blight on wheat: biology, modern detection and diagnosis and integrated disease management. Toxins. 15 (3), 192(2023).
  12. Yang, F., et al. Effects of rhizosphere microbial communities on cucumber Fusarium wilt disease suppression. Microorganisms. 11 (6), 1576(2023).
  13. Kumari, N., Katoch, S. Wilt and root rot complex of important pulse crops: their detection and integrated management. Management of Fungal Pathogens in Pulses. Fungal Biology. , Springer. Cham. (2020).
  14. Köppen, W., Geiger, R. Handbuch der klimatologie. , Gebrüder Borntraeger. Berlin. (1936).
  15. Agrios, G. N. Plant Pathology. , 5th Edn, Elsevier Academic Press. Amsterdam. (2005).
  16. Endes, A. Occurrence and distribution of Chickpea root rot and wilt disease in Yozgat Kırşehir and Kırıkkale Provinces. Çukurova J Agri Food Sci. 38 (2), 284-298 (2023).
  17. Choi, Y. W., Hyde, K. D., Ho, W. H. Single spore isolation of fungi. Fungal Diversity. 3, 29-38 (1999).
  18. Baskarathevan, J., Jaspers, M. V., Jones, E. E., Ridgway, H. J. Evaluation of different storage methods for rapid and cost effective preservation of Botryosphaeria species. New Zealand Plant Protect. 62, 234-237 (2009).
  19. Dikilitaş, M., Katırcıoğlu, Z., Altınok, H. Latest developments and methods on long-term storage, protection, and recycle of fungi and fungal material. JAgric Fac HR U. 15 (1), 55-69 (2011).
  20. Bora, T., Karaca, İ Measurement of disease and damage in cultivated plants. , Ege University Press. Turkey. (1970).
  21. Öğüt, E. Pathogenic and molecular characterization of some Fusarium spp. causing root rot and wilt on lentil with determination of variety reactions in south eastern Anatolia. , Mustafa Kemal University, Institute of Science and Technology. (2015).
  22. Leslie, J. F., Summerell, B. A. The Fusarium Laboratory manual. , Blackwell Publishing. (2006).
  23. Cenis, J. L. Rapid extraction of fungal DNA for PCR amplification. Nuc Acids Res. 20 (9), 2380(1992).
  24. Aras, S., Endes, A. Effect of Fusarium oxysporum infection on strawberry under calcium, iron, and zinc deficiency conditions. Zemdirbyste-Agri. 110 (1), 71-78 (2023).
  25. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protoc A Guide Metho Appl. , 315-322 (1990).
  26. Endes, A. Characterization and pathogenicity of Botryosphaeriaceae species associated with Gummosis, Dieback, Trunk and Branch Cankers of almond trees in Türkiye. J Agri Sci. 30 (4), 698-711 (2024).
  27. Gordon, T. R., Okamoto, D., Jacobson, D. J. Colonization of muskmelon and non-susceptible crops by Fusarium oxysporum f. sp. melonis and other species of Fusarium. Phytopathology. 79 (10), 1095-1100 (1989).
  28. Xu, X., et al. Fusarium species associated with maize leaf blight in Heilongjiang Province, China. J Fungi. 8 (11), 1170(2022).
  29. Fonseca-Guerra, I. R., Chiquillo-Pompeyo, J. C., Benavides Rozo, M. E., Díaz Ovalle, J. F. Fusarium spp. associated with Chenopodium quinoa crops in Colombia. Sci Rep. 12 (1), 20841(2022).
  30. Khan, M. F., et al. First report of damping-off and seedling rot of Hemp (Cannabis sativa) caused by Fusarium solani in North Dakota, U.S.A. Plant Dis. 107 (1), 232(2023).
  31. Chaudhary, R. G., Saxena, D. R., Dhar, V., Singh, R. K., Namdev, J. K. Prevalence of wilt-root rot and their associated pathogens at reproductive phase in lentil. Arch Phytopathol Plant Protect. 43 (10), 996-1000 (2010).
  32. Fleischmann, R. Some observations on Maize smut in Hungary. Pflanzenbau. 14 (5), 199-206 (1937).
  33. Bedasa, T. Distribution and management of Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. lentis) of lentil (Lens culinaris Medikus) in Central Highlands of Ethiopia. , Haramaya University Doctoral dissertation. (2018).
  34. Kumar, S., et al. Vascular wilt disease of lentil: A review. J Lentil Res. 4, 1-14 (2010).
  35. Chenari, S., Abbasi, S., Chehri, K. Phylogeny and host specificity of Fusarium solani species complex isolated from chickpea, lentil and common bean. Arch Phytopathol Plant Protect. , 1-15 (2024).
  36. Rathod, A., et al. Isolation of causal organism of wilt and collar rot of lentil and its pathogenicity tests. Int J Curr Microbiol Appl Sci. 10 (12), 276-282 (2021).
  37. Hayit, T., Endes, A., Hayit, F. The severity level classification of Fusarium wilt of chickpea by pre-trained deep learning models. J Plant Pathol. 106 (1), 93-105 (2024).
  38. Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol Plant Pathol. 13 (4), 414-430 (2012).
  39. Fletcher, J. D., Broadhurst, P. G., Bansal, R. K. F. avenaceum: A pathogen of lentil in New Zealand. New Zealand J Crop Horticultural Sci. 19 (2), 207-210 (1991).
  40. Al Ahmad, M., Mouselli, N. Wilt and root rot of lentis. Lens. 14 (1/2), 27-31 (1987).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

gatunki Fusariumpatogeny gleboweizolacja grzybówanaliza PCRmorfologia koloniiczęstość występowania choróbpokrewieństwo genetyczne

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.