Method Article

Prosta i skuteczna metoda testowania środków immunomodulujących do wytwarzania tolerogennych komórek dendrytycznych z ludzkich monocytów CD14+

DOI:

10.3791/68159

⸱

April 11th, 2025

 , 
1Chemical and Biological Engineering Department, Drexel University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy procedurę oceny zdolności środków farmakologicznych do generowania tolerogennych komórek dendrytycznych z naiwnych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów in vitro i walidacji ich siły poprzez autologiczne generowanie regulatorowych limfocytów T.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tolerogenne komórki dendrytyczne (tolDCs) to podzbiór komórek dendrytycznych (DC), o których wiadomo, że wpływają na naiwne limfocyty T w kierunku fenotypu regulatorowego limfocytu T (Treg). TolDC są obecnie badane jako terapie autoimmunologiczne i transplantacyjne, zarówno jako terapia komórkowa, jak i metoda indukcji tolDC z endogennych DC. Do tej pory jednak liczba znanych czynników indukujących tolDC z naiwnych DC jest stosunkowo niewielka, a ich zdolność do generowania Treg in vivo była niespójna, szczególnie w przypadku terapii indukujących tolDC z endogennych DC. Daje to możliwość zbadania nowych związków w celu wytworzenia tolerancji.

Tutaj opisujemy metodę testowania nowych związków immunomodulujących na DC pochodzących z monocytów (moDCs) in vitro i walidacji ich funkcjonalności do generowania autologicznych Treg. Najpierw uzyskujemy PBMC i izolujemy monocyty CD14 + i limfocyty T CD3 + za pomocą dostępnych na rynku zestawów do separacji magnetycznej. Następnie różnicujemy monocyty w moDC, leczymy je ustalonym immunomodulatorem, takim jak rapamycyna, deksametazon, IL-10 lub witamina D3, przez 24 godziny i testujemy ich zmianę markerów tolerogennych jako walidację protokołu. Na koniec hodujemy indukowane tolDC z autologicznymi limfocytami T w obecności stymulacji anty-CD3 / CD28 i obserwujemy zmiany w populacjach Treg i proliferacji limfocytów T. Przewidujemy, że protokół ten zostanie wykorzystany do oceny skuteczności nowych środków immunomodulujących w celu przeprogramowania już zróżnicowanych DC w kierunku tolDC.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki dendrytyczne (DC) są kluczowymi mediatorami między odpornością wrodzoną a nabytą. DC, które znajdują się głównie w błonach śluzówkowych, skórze i tkance limfatycznej, są głównymi komórkami prezentującymi antygen (APC)1. DC wychwytują obce białka i przetwarzają je oraz prezentują na głównych białkach zgodności tkankowej (MHC) do naiwnych limfocytów T. DC specyficznie eksprymują białka MHC klasy II, takie jak ludzki antygen leukocytarny-DR (HLA-DR) u ludzi. Stan aktywacji DC po ekspozycji na antygen ma kluczowe znaczenie dla dalszej odpowiedzi limfocytów T2. Niedojrzałe DC wyrażają różne receptory rozpoznawania wzo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie próbki ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) zostały pobrane z Human Immunology Core Uniwersytetu Pensylwanii od niezidentyfikowanych dawców za uprzednią zgodą Institutional Review Board (IRB) Uniwersytetu Pensylwanii za zgodą pacjenta.

Opcjonalnie: Podczas gdy w tej metodzie użyliśmy świeżo wyizolowanych PBMC uzyskanych z laboratorium akademickiego, PBMC mogą być izolowane zarówno z krwi pełnej, jak i produktów krwiopochodnych wzbogaconych w leukaferezę. Zalecamy stosowanie metody wirowania w gradiencie gęstości, ponieważ jest to dobrze znana i niezawodna metoda, która jest opisana w innym miejs....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy protokół dla ludzkich PBMCs, izolujemy zarówno limfocyty T CD3+, jak i monocyty CD14+ za pomocą komercyjnie dostępnych zestawów do separacji magnetycznej, różnicujemy monocyty na moDC CD14-, HLA-DR+, CD141+, CD1c+ za pomocą GM-CSF i IL-4, leczymy je przez 24 godziny, a następnie hodujemy razem z autologicznymi limfocytami T ze stymulacją anty-CD3/CD28 przez 72 godziny. Schemat eksperymentalny jest pokazany w Rysunek 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy wiarygodną i wszechstronną metodę oceny funkcjonalności środków immunomodulujących w celu indukowania tolDC z moDC i walidacji ich funkcjonalności w celu generowania Treg z autogennych limfocytów T ex vivo. W tym protokole jest kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, monocyty są notorycznie wrażliwymi komórkami i muszą być pozyskiwane ze świeżych, nie wcześniej mrożonych PBMC, aby uzyskać najlepsze wyniki. Monocyty należy jak najszybciej wyizolować i umieścić w koktajlu różnicującym. Zazwy.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Human Immunology Core (HIC) Uniwersytetu Pensylwanii za dostarczenie świeżych ludzkich PBMC od dawców. HIC jest częściowo wspierany przez NIH P30 AI045008 i P30 CA016520.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,1-10 i mikro; L Końcówki do pipet z filtremVWR76322-158komórkowa
1,5 ml probówka wirówkowaVWR77508-358Ogólna hodowla komórkowa
10 ml Pipety serologiczneVWR414004-267Ogólna hodowla komórkowa
100-1000 &mikro; L Końcówki do pipet z filtremVWR76322-164Ogólna
hodowla komórkowa 15 ml Rurka stożkowaVWR77508-212Ogólna hodowla komórkowa
20-200 i mikro; L Filtrowane końcówki do pipetVWR76322-160Ogólna hodowla komórkowa
2-merkaptoetanolMP Biomedyczna194834Hodowla komórek T
50 ml Rurka stożkowaVWR21008-736Ogólna hodowla komórkowa
60 x 15 mm, Nunclon DeltaThermo Fischer150326Ogólna hodowla komórkowa
96 Stożkowa (V) płyta dolna, nieobrobiona powierzchniaThermo Fischer277143Ogólna hodowla komórkowa
96-dołkowa płaska płytka z płaskim dnemThermo Fischer161093Ogólna hodowla komórkowa
Przeciwciało antyludzkie APC/cyjaninina 7 CD272 (BTLA)Biolegend344518Cytometria przepływowa
Attune NxT (czerwony/niebieski laser, 7-kanałowy)Thermo FischerA24863Cytometria przepływowa
BSAThermo Fischer15260-037Komórka ogólna
Kultura Przeciwciało monoklonalne CD14 (61D3), PEThermo Fischer12-0149-42Cytometria przepływowa
CD1c Przeciwciało monoklonalne (L161), PE-cyjanina7Thermo Fischer25-0015-42Cytometria przepływowa
CD209 (DC-SIGN) Przeciwciało monoklonalne (eB-h209), PerCP-cyjanina 5.5Thermo Fischer45-2099-42Cytometria przepływowa
Przeciwciało monoklonalne CD25 (CD25-4E3), APCThermo Fischer17-0257-42Cytometria przepływowa
CD274 (PD-L1, B7-H1) Przeciwciało monoklonalne (MIH1), PEThermo Fischer12-5983-42Cytometria przepływowa
CD4 Przeciwciało monoklonalne (RPA-T4), Alexa Fluor 488Thermo Fischer53-0049-42Cytometria przepływowa
CD40 Przeciwciało monoklonalne (5C3), APCThermo Fischer17-0409-42Cytometria przepływowa
CD40 Przeciwciało monoklonalne (5C3), APC-eFluor 780Thermo Fischer47-0409-42Cytometria przepływowa
CD69 Przeciwciało monoklonalne (FN50), PEThermo FischerMA1-10276Cytometria przepływowa
CD86 Przeciwciało monoklonalne (BU63), FITCThermo FischerMHCD8601Cytometria przepływowa
CD8a (RPA-T8), PE-cyjanina7Thermo Fischer25-0088-42Cytometria przepływowa
Stożkowe dno (V-studzienka) 96-dołkowa płytkaThermo Fischer2605Fiolki kriogeniczne z cytometrią przepływową
, 2 mlThermo Fischer430488Hodowla komórek T
dimetylosulfotlenku (DMSO), stopień sekwencjonowaniaThermo Fischer20688Ogólna hodowla komórkowa
DPBSThermo Fischer14200166Ogólna
hodowla komórkowa Zestaw do izolacji ludzkich monocytów EasySepTechnologie komórek macierzystych19359Separacja komórek
Zestaw do izolacji ludzkich komórek T EasySep Technologiekomórek macierzystych17951Separacja komórek
EasySep MagnetStem Cell Technologies18000Separacja komórek
EDTAThermo FischerAIM9260Gkomórkowe
Falcon Round-Bottom Polistyrenowe probówki, 5 mlTechnologiekomórek macierzystych38025Separacja komórek
Inhibitor wiązania receptora Fc Przeciwciało poliklonalneThermo Fischer14-9161-73Cytometria przepływowa
Surowica bydlęcapłodu Thermo FischerA5670701Ogólna hodowla komórkowa
Utrwalany barwnik żywotności eFluor 780Thermo Fischer65-0865-18Cytometria przepływowa
Foxp3 / zestaw do barwienia czynnika transkrypcyjnegoThermo Fischer00-5523-00Cytometria przepływowa
FOXP3 Przeciwciało monoklonalne (PCH101), PE-cyjanina 5,5Thermo Fischer35-4776-42Cytometria przepływowa
HBSSThermo Fischer14170-112Ogólna hodowla komórkowa
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęcaThermo FischerA5670801Ogólna hodowla komórkowa
HEPES (1 m)Komórka Thermo Fischer15630106moDC Hodowla
przeciwciał monoklonalnych HLA-DR (L243), Alexa Fluor 488Thermo FischerA51009Cytometria przepływowa
Ludzki aktywator limfocytów T CD3 / CD28 / CD2StemCell Technologies10970Hodowla komórek T
Ludzkie białko rekombinowane GM-CSFThermo Fischer300-03moDC Hodowla komórkowa
Ludzki zestaw ELISA IL-10, ThermoFischerBMS215-2HSElisa
Ludzka IL-4, rekombinowane białko wolne od zwierzątThermo FischerAF-200-04moDC Hodowla komórkowa
Ludzki PBMC (świeżo izolowany)UPenn HICN / A
Cells Ludzki zestaw TNF alfa ELISAThermo FischerBMS223-4ELISA
Light Microscope (DMi1)Lucia391240komórkowa
Lipopolisacharyd (LPS)Invivogentlrl-eblpsmoDC Cell Culture
LIVE/DEAD Naprawialny zestaw do barwienia martwych komórek w bliskiej podczerwieniThermo FischerL34975Cytometria przepływowa
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)Termo Fischer11140050Hodowla komórek T
Penicylina-Streptomycyna (100x)Thermo Fischer15140122hodowli komórkowych
VWR77575-370Ogólna hodowla komórkowa
Rapamycyna, 98+%Thermo FischerJ62473. MFmoDC Hodowla komórkowa
RPMI 1640 z GlutamaxThermo Fischer61870-036Ogólny
bufor do separacjiTechnologie komórek macierzystych20144
Koktajl stymulacji komórek T do separacji komórek T (500x)Thermo Fischer00-4970-93Kultura komórkowa
T UltraComp eBead Plus Koraliki kompensacyjneThermo Fischer01-3333-41Przepływ Zestaw
pipet do cytometrii o zmiennejFischer Scientific05-403-152Ogólna hodowla komórkowa
Ogólna hodowla Ogólne hodowle o wysokiej czułości Ogólna hodowla Ogólny kontroler pipet do kultur komórkowych geometrii

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18 (1), 767-811 (2000).
  2. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440 (7085), 808-812 (2006).
  3. Anderson....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tolerogenic Dendritic CellsMonocyte Derived Dendritic CellsImmunomodulatory AgentsRegulatory T CellsCD14 Positive MonocytesFlow CytometryMagnetic Cell SeparationT Cell ProliferationImmunomodulator TreatmentFoxp3 Treg Induction

Related Articles