Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Prosta i skuteczna metoda testowania środków immunomodulujących do wytwarzania tolerogennych komórek dendrytycznych z ludzkich monocytów CD14+

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68159

⸱

11 kwietnia 2025

 , 
1Chemical and Biological Engineering Department, Drexel University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy procedurę oceny zdolności środków farmakologicznych do generowania tolerogennych komórek dendrytycznych z naiwnych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów in vitro i walidacji ich siły poprzez autologiczne generowanie regulatorowych limfocytów T.

Streszczenie

Tolerogenne komórki dendrytyczne (tolDCs) to podzbiór komórek dendrytycznych (DC), o których wiadomo, że wpływają na naiwne limfocyty T w kierunku fenotypu regulatorowego limfocytu T (Treg). TolDC są obecnie badane jako terapie autoimmunologiczne i transplantacyjne, zarówno jako terapia komórkowa, jak i metoda indukcji tolDC z endogennych DC. Do tej pory jednak liczba znanych czynników indukujących tolDC z naiwnych DC jest stosunkowo niewielka, a ich zdolność do generowania Treg in vivo była niespójna, szczególnie w przypadku terapii indukujących tolDC z endogennych DC. Daje to możliwość zbadania nowych związków w celu wytworzenia tolerancji.

Tutaj opisujemy metodę testowania nowych związków immunomodulujących na DC pochodzących z monocytów (moDCs) in vitro i walidacji ich funkcjonalności do generowania autologicznych Treg. Najpierw uzyskujemy PBMC i izolujemy monocyty CD14 + i limfocyty T CD3 + za pomocą dostępnych na rynku zestawów do separacji magnetycznej. Następnie różnicujemy monocyty w moDC, leczymy je ustalonym immunomodulatorem, takim jak rapamycyna, deksametazon, IL-10 lub witamina D3, przez 24 godziny i testujemy ich zmianę markerów tolerogennych jako walidację protokołu. Na koniec hodujemy indukowane tolDC z autologicznymi limfocytami T w obecności stymulacji anty-CD3 / CD28 i obserwujemy zmiany w populacjach Treg i proliferacji limfocytów T. Przewidujemy, że protokół ten zostanie wykorzystany do oceny skuteczności nowych środków immunomodulujących w celu przeprogramowania już zróżnicowanych DC w kierunku tolDC.

Wprowadzenie

Komórki dendrytyczne (DC) są kluczowymi mediatorami między odpornością wrodzoną a nabytą. DC, które znajdują się głównie w błonach śluzówkowych, skórze i tkance limfatycznej, są głównymi komórkami prezentującymi antygen (APC)1. DC wychwytują obce białka i przetwarzają je oraz prezentują na głównych białkach zgodności tkankowej (MHC) do naiwnych limfocytów T. DC specyficznie eksprymują białka MHC klasy II, takie jak ludzki antygen leukocytarny-DR (HLA-DR) u ludzi. Stan aktywacji DC po ekspozycji na antygen ma kluczowe znaczenie dla dalszej odpowiedzi limfocytów T2. Niedojrzałe DC wyrażają różne receptory rozpoznawania wzorców (PRR), które rozpoznają klasy cząsteczek zwane wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP), takimi jak składnik ściany bakteryjnej, lipopolisacharyd (LPS) 3. Po stymulacji PRR, DC stają się dojrzałymi DC i zwiększają ważność białek kostymulujących limfocyty T, takich jak CD80, CD86 i CD40, oraz wydzielają prozapalne cytokiny, takie jak czynnik martwicy nowotworu-alfa (TNFα), ułatwiając różnicowanie naiwnych limfocytów T w konwencjonalne limfocyty T efektorowe lub pomocnicze2. Wręcz przeciwnie, jeśli dojrzewanie DC zostanie przerwane lub jeśli DC rozwijają się w środowisku tolerogennym, DC mogą generować tolerogenny stan DC (tolDCs)4. TolDC obniżają klasyczną kostymulację receptorów limfocytów T i zamiast tego zwiększają receptory tolerancji, takie jak ligand programowanej śmierci komórki 1 (PD-L1) i tłumik limfocytów B i T (BTLA) oraz generują cytokiny supresyjne, takie jak interleukina 10 (IL-10) i transformujący czynnik wzrostu beta (TGF-β)4. Nie jest to wyczerpująca lista znaczników tolerancji i w rzeczywistości istnieje ograniczony konsensus co do tego, które markery tolDC są odpowiednie do zdefiniowania stanu tolDC5. Biorąc to pod uwagę, proponujemy wytwarzanie regulatorowych limfocytów T (Treg) jako markera funkcjonalnego, który powinien być używany do porównywania skuteczności różnych środków indukcyjnych tolDC.

Oprócz stanów aktywacji tolDC/dojrzałego DC, DC mogą być również kategoryzowane na podstawie ich pochodzenia lub lokalizacji tkanki, przy czym każdy podzbiór wykazuje nieco inną funkcjonalność. Podczas gdy podział tolDC/dojrzały DC jest mniej ostateczny i istnieje bardziej jako kontinuum, podziały linii mają dobrze zdefiniowane markery zarówno u ludzi, jak i myszy. Prekursory DC powstają w szpiku kostnym, ale istnieją dwa główne podtypy DC w zależności od ich linii: 1) plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (pDC), które wywodzą się z linii limfoidalnych i 2) konwencjonalne komórki dendrytyczne (cDC), które wywodzą się z linii szpikowych. U ludzi pDC dojrzewają w narządach limfatycznych, wykazują ekspresję CD303 i są wysoce wrażliwe w infekcjach wirusowych6. Tymczasem cDC eksprymujące CD11c dojrzewają w tkankach obwodowych i występują w dwóch odrębnych podtypach, CD1c+ cDC1s i CD141+ cDC2, z których każdy generuje odrębne odpowiedzi limfocytów T7. Co więcej, wszystkie cDC mogą istnieć w podstanach rezydujących w tkankach (CD103-) lub migrujących (CD103+)8. Wreszcie, w pewnych warunkach, komórki z linii monocytów (CD14 +) mogą być indukowane w kierunku fenotypu komórek dendrytycznych i są identyfikowane jako CD14-, CD141 +, CD1c + 9. Komórki te, znane jako DC pochodzące z monocytów (moDCs), są najczęściej używane do analizy ex vivo u ludzi, ponieważ monocyty stanowią około 10-30% ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), podczas gdy pDC stanowią tylko 1-3%10. To sprawia, że moDC są atrakcyjnym wyborem, ale wiadomo również, że moDC są bardziej zapalne niż typowe cDC izolowane z pierwotnej tkanki9.

Obecnie istnieją dwie szerokie kategorie działań mających na celu wykorzystanie tolDC do generowania tolerancji klinicznej. Po pierwsze, tolDC są generowane z monocytów do stosowania jako terapia komórkowa. W tym paradygmacie moDC są zwykle różnicowane za pomocą IL-4/GM-CSF jednocześnie z immunomodulatorami, takimi jak witamina D3, rapamycyna (rapa), IL-10, deksametazon lub kombinacje tych11,12. Te tolDC zostały zbadane jako autologiczne terapie komórkowe w chorobach autoimmunologicznych i transplantacjach13. Innym zastosowaniem tolDC jest przeprogramowanie endogennych DC w kierunku tolDC przy użyciu wolnych leków lub nanonośników w celu dostarczenia zarówno immunomodulatora, jak i antygenu będącego przedmiotem zainteresowania14,15,16. Indukcja już zróżnicowanych DC jest jednak trudniejsza ze względu na rozwój silnych fenotypów metabolicznych DC, które zazwyczaj kontrastują z metabolizmem tolDC17,18. Jest to wysoka poprzeczka dla większości immunomodulatorów farmakologicznych; z tego powodu większość badań nad endogennym przeprogramowaniem DC informuje o skutecznej supresji DC i często pewnej indukcji Treg, ale brakuje sukcesu klinicznego, często z powodu braku trwałości limfocytów T15,19,20. Podkreśla to potrzebę opracowania strategii identyfikacji potencjalnych czynników indukcyjnych tolDC z istniejących DC.

Tutaj prezentujemy metodę oceny in vitro czynników immunomodulujących przeciwko zróżnicowanym moDC z końcowym wskaźnikiem autologicznej indukcji Treg. Protokół ten ma na celu ocenę skuteczności leków immunomodulujących w przeprogramowaniu już zróżnicowanych ludzkich moDC w kierunku tolerancji. Ponadto protokół ten weryfikuje funkcjonalność przeprogramowanych tolDC w celu generowania limfocytów Treg przeciwko autologicznym limfocytom T wyizolowanym z tej samej próbki PBMC. Jest to przeciwieństwo innych protokołów, które indukują tolerancję podczas różnicowania i/lub prowokują tolDC za pomocą limfocytów T od allogenicznych dawców21. W tym protokole używamy powszechnego środka tolerancyjnego rapa jako przykładu, ale pokazujemy również ograniczoną skuteczność moDC traktowanych rapą w generowaniu Treg. W naszych reprezentatywnych wynikach pokazujemy również skuteczność innych popularnych terapii immunomodulujących, takich jak IL-10, deksametazon i witamina D3. Przewidujemy, że ten protokół będzie używany do sprawdzania potencjalnie bardziej skutecznych środków indukujących tolDC pod kątem już istniejących moDCs22.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie próbki ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) zostały pobrane z Human Immunology Core Uniwersytetu Pensylwanii od niezidentyfikowanych dawców za uprzednią zgodą Institutional Review Board (IRB) Uniwersytetu Pensylwanii za zgodą pacjenta.

Opcjonalnie: Podczas gdy w tej metodzie użyliśmy świeżo wyizolowanych PBMC uzyskanych z laboratorium akademickiego, PBMC mogą być izolowane zarówno z krwi pełnej, jak i produktów krwiopochodnych wzbogaconych w leukaferezę. Zalecamy stosowanie metody wirowania w gradiencie gęstości, ponieważ jest to dobrze znana i niezawodna metoda, która jest opisana w innym miejscu23.

1. Izolacja monocytów/limfocytów T i różnicowanie moDC

  1. Izolacja monocytów i limfocytów T z PBMCs-Dzień 1
    1. Pozyskaj 200 milionów ludzkich PBMC od zdrowego dawcy. Umieść komórki w probówce o pojemności 15 ml i przenieś je na lód.
    2. Podwielokrotność 50 ml buforu separacyjnego (dostarczanego w dostępnych na rynku zestawach do rozdzielania) w stożkowej probówce.
      UWAGA: Bufor separacyjny można również zastąpić DPBS z 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA).
    3. Wyjmij probówkę PBMC z lodu i napełnij ją buforem separacyjnym. Wirować przy 300 x g przez 5 minut.
    4. Odessać supernatant za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Zawiesić osad komórkowy w 4 ml zalecanego podłoża za pomocą pipety serologicznej.
    5. Podzielić zawiesinę na dwie różne probówki o pojemności 15 ml, dodając 2 ml na probówkę (5 × 107 komórek/ml na probówkę). Oznacz jedną rurkę "T", a drugą "Monocyty".
    6. Odzyskaj zestaw do izolacji ludzkich monocytów i postępuj zgodnie z protokołem producenta, aby wyizolować monocyty z probówki znakowanej monocytami.
    7. Odzyskaj zestaw do izolacji ludzkich limfocytów T i postępuj zgodnie z protokołem producenta dotyczącym drugiej probówki, aby wyizolować limfocyty T.
  2. Posiewanie monocytów w celu różnicowania i zamrażania limfocytów T-Dzień 1
    1. Podgrzej 50 ml pożywki hodowlanej moDC (tabela 1) w temperaturze 37 °C przez co najmniej 10 minut.
    2. Odwirować probówki o pojemności 15 ml ze wzbogaconymi monocytami i probówkę o pojemności 15 ml z limfocytami T z kroku 1.1 w temperaturze 250 × g przez 5 minut.
    3. Odessać supernatant. Zawiesić monocyty w 1 ml pożywki hodowlanej moDC i limfocyty T w pożywce do hodowli komórek T (tabela 1), pipetując w górę iw dół. Upewnij się, że pelety są odpowiednio rozproszone.
    4. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub ręcznego hemacytometru za pomocą barwienia błękitem trypanowym.
      UWAGA: Aby uzyskać reprezentatywne dane, wyizolowano 10 milionów limfocytów T i 3 miliony monocytów.
    5. Wziąć probówkę z monocytami i dodać 9 ml ciepłej pożywki hodowlanej moDC do zawiesiny, aby uzyskać końcową objętość 10 ml. Następnie dodać po 100 μl po 10 μg/mL GM-CSF i 10 μg/ml IL-4, aby uzyskać końcowe stężenie 100 ng/ml zarówno GM-CSF, jak i IL-4 w pożywce. Przenieść zawiesinę na płytkę Petriego i oznaczyć jako "moDC" (dzień 1) i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    6. Weź probówkę z limfocytami T i wymieszaj 1 ml pożywki do zamrażania limfocytów T (Tabela 1) z 1 ml zawiesiny limfocytów T. Podzielić na dwie kriowiale po 2 ml (1 ml / fiolkę); szczelnie zamknąć (końcowe stężenie 5 milionów komórek na fiolkę). Umieść kriowiale w komorze zamrażania z rurkami równoważącymi w nieużywanych studzienkach. Przechowywać komorę w temperaturze -80 °C przez noc, a następnie przenieść kriofiokule do kriozbiornika.
    7. W dniu 4 odśwież pożywkę z dodatkiem 5 ml świeżej pożywki hodowlanej moDC i dodaj po 100 μl bulionu GM-CSF i IL-4. Zróżnicowane moDC będą gotowe w dniu 7.

2. Dodawanie leków immunomodulujących do generowania tolerogennych moDC

  1. Skonfiguruj płytę moDC.
    1. W dniu 7 należy pobrać zróżnicowane moDC z inkubatora i przenieść zawiesinę komórek moDC do probówki o pojemności 50 ml.
    2. Odwirować zawiesinę o stężeniu 250 × g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml ciepłej pożywki hodowlanej moDC, pipetując w górę i w dół. Policz komórki za pomocą hemacytometru i rozcieńcz komórki do stężenia 3 × 105 komórek/ml w ciepłym pożywce hodowlanej moDC zawierającej 100 ng / mL GM-CSF i IL-4.
    3. Dodać 3 × 104 komórki/basenik w 100 μl do żądanej liczby dołków na płaskiej 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.
      UWAGA: Aby uzyskać reprezentatywne wyniki, użyliśmy łącznie 48 dołków (cztery warunki wykonane w trzech egzemplarzach przygotowanych dla czterech różnych analiz w sekcjach 3 i 4), ale można to dostosować do maksymalnie 60 dołków. Napełnij wszystkie pozostałe studzienki 100 μl/studzienkę PBS, aby zapobiec wysuszeniu, zwłaszcza dołki zewnętrzne. Zalecamy przygotowanie różnych płytek dla każdej metody analizy.
    4. Dodaj 1 μl / studzienkę leków immunomodulujących do żądanych studzienek (tutaj 10 ng / ml rapa). Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
      UWAGA: Jeśli w 8 dniu przeprowadzana jest immunostymulacja, należy przygotować studzienki na lek immunomodulujący zarówno z immunostymulacją, jak i bez niej. Stosowanie immunostymulacji u dojrzałych moDC jest opcjonalne.
  2. Rozmrozić limfocyty T.
    1. W dniu 8 wyjmij dwa kriofiale z kriozbiornika i rozmroź je w gorącej kąpieli kulkowej lub łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, aż zawartość zacznie się topić (w <3 min).
    2. Gdy zawartość zacznie się topić, przenieś fiolki do okapu do hodowli komórkowych i odpipetuj 1 ml ciepłej pożywki do hodowli komórek T do fiolki w celu szybkiego rozmrożenia. Przenieść całą zawartość fiolki do probówki o pojemności 50 ml. Przepłukać kriowiale 1 ml pożywki do hodowli limfocytów T, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały przeniesione do probówki.
    3. Uzupełnić zawiesinę roztworem barwiącym przepływowym (Tabela 1) do objętości 15 ml. Odwirować przy 200 × g przez 10 minut i odessać supernatant. Następnie ponownie zawiesić osad w 5 ml roztworu do barwienia przepływowego i ponownie odwirować.
    4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml ciepłej pożywki do hodowli limfocytów T. Policz komórki za pomocą hemacytometru.
      UWAGA: Na tym etapie rentowność powinna wynosić >70%; jeśli pozostaną duże ilości martwych komórek, przenieś do świeżej probówki, dodaj 10 ml roztworu do barwienia komórek, odwiruj przy 200 × g przez 5 minut, ponownie zawieś w 1 ml pożywki z limfocytów T i przelicz.
    5. Dodać 9 ml ciepłej pożywki do hodowli limfocytów T, aby uzyskać końcową objętość 10 ml. Przenieść zawiesinę na szalkę Petriego. Oznacz go jako "Rozmrożone limfocyty T" i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , aby komórki odpoczęły.
  3. Umyj płytkę moDC i w razie potrzeby dodaj immunostymulator.
    1. W dniu 8 odwirować płytkę moDC (od dnia 7) w stężeniu 300 × g przez 5 minut.
    2. Odessać supernatant, przemyć ciepłym HBSS, powtórzyć wirowanie, ponownie odessać i ponownie zawiesić komórki w ciepłym pożywce hodowlanej moDC zawierającej GM-CSF i IL-4 (100 μl/basenik).
      UWAGA: Uważaj, aby nie przeszkadzać komórkom. Przechyl płytkę podczas aspiracji. W studni może pozostać około 10 μl.
    3. Jeśli korzystasz z immunostymulacji, dodaj 1 μl / studzienkę 100x podstawowego LPS (lub innego środka immunostymulującego) do pożądanych dołków. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .

3. Analiza przepływu dla moDC (walidacja + tolerancja)

  1. Analiza przepływu w celu walidacji moDC
    1. W dniu 8 przygotuj koktajle przeciwciał dla panelu walidacyjnego, ukierunkowane na następujące markery: HLA-DR, CD14, lektyna typu C specyficzna dla komórek dendrytycznych (DC-SIGN), CD1c i CD40, jak opisano w Tabeli 2. Rozcieńczyć wszystkie przeciwciała roztworem barwienia przepływowego.
      UWAGA: Panel został zaprojektowany dla 7-kanałowego, czerwono-niebieskiego cytometru przepływowego z laserem.
    2. Pobrać płytkę moDC z inkubatora. Odwirować płytkę o masie 300 × g przez 5 minut. Usunąć supernatanty. Opcjonalnie: Zachowaj supernatanty do analizy ELISA dla cytokin IL-10 i TNFα przy użyciu dostępnych na rynku zestawów zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Dodać 200 μl/studzienkę płynnego roztworu barwiącego. Odwirować płytkę o masie 300 × g przez 5 minut.
    4. Odessać supernatant i dodać 50 μl/studzienkę przeciwciała inhibitora wiązania receptora Fc rozcieńczonego w stosunku 1:200 w roztworze barwiącym przepływ, aby zablokować niespecyficzne wiązanie. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut.
    5. Dodać 50 μl/basenik przygotowanego koktajlu przeciwciał z panelu walidacyjnego.
    6. Przygotować kontrole kompensacyjne na płytce lub w probówkach o pojemności 1,5 ml, mieszając 50 μl kulek kompensacyjnych z 50 μl każdego rozcieńczonego przeciwciała. Inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez 1 h.
      UWAGA: Do kompensacji stosuje się tutaj koraliki kompensacyjne, a nie komórki, ze względu na potencjalnie niską ekspresję markerów na moDC.
    7. Przemyć przez odwirowanie w stężeniu 300 × g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 200 μl płynnego roztworu barwiącego. Wykonaj dwa prania.
    8. Po ostatnim myciu ponownie odwirować i ponownie zawiesić komórki w 110 μl/studzienkę roztworu do barwienia przepływowego. Próbki są teraz gotowe do analizy metodą cytometrii przepływowej.
  2. Analiza przepływu dla tolerogennego moDC (Panel Tolerancji)
    1. Podobnie jak w kroku 3.1 w dniu 8, przygotuj koktajle przeciwciał dla Panelu Tolerancji, ukierunkowane na następujące markery: CD86, PD-L1, DC-SIGN, CD1c, BTLA i CD40 (Tabela 2).
    2. Powtórz kroki 3.1.2-3.1.8, zastępując koktajl przeciwciał koktajlem z panelu tolerancji
      3. .

4. Analiza przepływu limfocytów T

  1. Połącz limfocyty T z leczonymi tolerogennymi moDC.
    1. W dniu 9 należy pobrać rozmrożoną szalkę Petriego z limfocytów T z inkubatora i przenieść wszystkie limfocyty T do probówki o pojemności 50 ml. Uzupełnij roztworem do barwienia przepływowego.
    2. Opcjonalnie: Jeśli wykonujesz analizę proliferacji limfocytów T, podziel limfocyty T na dwie probówki.
      1. Pierwszą probówką odwirować z prędkością 250 × g przez 5 minut i usunąć supernatant. Wybarwić tę probówkę barwnikiem proliferacji komórek zgodnie z instrukcjami producenta.
        UWAGA: Użyliśmy Fixable Viability Dye eFluor 670, który wymaga 30-minutowego etapu inkubacji, a następnie dwóch etapów mycia. Sugerujemy stosowanie stożkowych probówek o pojemności 50 ml, aby zapobiec utracie komórek i stosowanie HBSS z 10% HIFBS do prania po barwieniu.
      2. Użyj drugiej probówki zawierającej niebarwione limfocyty T do analizy Treg. Podobnie odwirować do 250 × g przez 5 minut, usunąć supernatant, ponownie zawiesić w ciepłym podłożu do hodowli komórkowych i przechowywać w inkubatorze podczas procesu barwienia. Jeśli nie jest wymagana proliferacja limfocytów T, odwiruj wszystkie limfocyty T i zastąp je ciepłym podłożem do hodowli komórek T.
    3. Policz komórki i uzyskaj co najmniej 4 miliony (w przypadku samej analizy Treg) lub 8 milionów (w przypadku analizy proliferacji Treg i T).
    4. Wyjąć płytkę moDC z inkubatora wraz z pozostałymi studzienkami, odwirować przy 300 × g przez 5 minut i spiratować supernatanty. Dodać 200 μl / basenik limfocytów T w 1,6 × 105 komórek / basenik. Dodaj niebarwione limfocyty T do płytek do analizy Treg i barwione limfocyty T do płytek proliferacyjnych limfocytów T.
      UWAGA: Pozwoli to utrzymać stosunek limfocytów T do moDC wynoszący 5:1, ponieważ początkowe 3 ×104 moDC zwykle nieznacznie się rozszerzają.
    5. Dodać 25 μl / ml koktajlu przeciwciał anty-CD3 / CD28 do wszystkich grup z wyjątkiem studzienek kontroli ujemnej w celu stymulacji limfocytów T. Inkubować płytkę przez 72 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 do dnia 12.
      UWAGA: Pamiętaj, aby używać barwionych limfocytów T do analizy proliferacji i niebarwionych do analizy Treg.
  2. Analiza przepływu limfocytów Treg
    1. Barwienie markerem powierzchniowym
      1. W dniu 12 należy przygotować koktajle przeciwciał do panelu Treg (Tabela 2).
      2. Przenieś wszystkie zawiesiny komórek z 96-dołkowej płytki hodowlanej na płytkę z dnem w kształcie litery V za pomocą roztworu do barwienia przepływowego. Zachowaj supernatanty do analizy cytokin.
      3. Przemyć komórki 2x przez odwirowanie (200 × g przez 5 minut, a następnie 200 μl roztworu barwienia przepływowego). Odłóż na bok kilka komórek do kontroli kompensacji. Odłóż jeden na bok do barwienia FOXP3 i do niebarwionych kontroli.
        UWAGA: Sugerujemy przeczesanie 10 μl wszystkich próbek przed ostatnim wirowaniem w kroku 4.2.1.3 w celu uzyskania niezbędnych kontroli kompensacji. Zapewnia to reprezentatywną próbkę całej ekspresji na poziomie powierzchni każdego markera na komórkach.
      4. Po drugim przemyciu odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i aspirować, a następnie dodać 50 μl/dołek przeciwciała hamującego wiązanie receptora Fc (rozcieńczonego w stosunku 1:200 w roztworze do barwienia przepływowego). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
      5. Dodać 50 μl/studzienkę przygotowanego koktajlu przeciwciał Treg Panel.
      6. W przypadku kontroli kompensacyjnych zmieszać 50 μl niebarwionych komórek kompensacyjnych z 50 μl każdego pojedynczego barwionego przeciwciała.
      7. Inkubować płytkę i urządzenia kompensacyjne w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. Umyć płytkę raz roztworem barwienia przepływowego i odwirować przy 300 × g przez 5 minut.
      8. Barwienie żywym/martwym barwnikiem bliskiej podczerwieni rozcieńczonym w HBSS (1:1,000) w stężeniu 200 μl/studzienkę. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
      9. Umyć płytkę raz roztworem do barwienia przepływowego (200 μl/studzienkę) o stężeniu 300 × g przez 5 minut.
    2. Zabarwić FoxP3 zgodnie z instrukcjami producenta, co będzie wymagało inkubacji przez noc. Krótki przegląd protokołu barwienia FoxP3 jest opisany poniżej.
      1. Przygotuj roztwór roboczy do utrwalania/przepuszczalności FoxP3 zgodnie z instrukcjami producenta. Wymieszaj 1 część koncentratu utrwalającego/przepuszczalnego FoxP3 z 3 częściami rozcieńczalnika utrwalającego/przepuszczalnego FoxP3. Przygotować 200 μl roztworu roboczego na próbkę.
      2. Inkubować wszystkie próbki w 200 μl/studzienkę roboczego roztworu do utrwalania/permeabilizacji. Pozostawić w temperaturze 4 °C na 1 godzinę.
      3. Przygotuj 1x Bufor Permeabilization: Wymieszaj 1 część 10x Bufor Permeabilizacji (uzyskany z komercyjnego zestawu) z 9 częściami wody destylowanej.
      4. Umyj płytkę 2x 1x buforem permeabilizacyjnym (200 μL/studzienkę) o stężeniu 300 × g przez 5 min.
      5. Barwienie przeciwciałem FoxP3 (PE-Cy5,5, rozcieńczenie 1:300 w 1x bufor permeabilizacyjny): Dodać 100 μl/basenik rozcieńczonego przeciwciała FoxP3 i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
      6. Umyj płytkę 2x 1x buforem permeabilizacyjnym (200 μL/studzienkę) o stężeniu 300 × g przez 5 min.
      7. Ponownie zawiesić komórki w 110 μl/studzienkę płynnego roztworu barwiącego.
      8. Wykonaj analizę cytometrii przepływowej.
  3. Analiza proliferacji limfocytów T
    1. Przygotuj koktajle przeciwciał do panelu proliferacji T (Tabela 2).
    2. Przenieś wszystkie zawiesiny komórek z 96-dołkowej płytki hodowlanej na płytkę z dnem w kształcie litery V za pomocą roztworu do barwienia przepływowego. Zachowaj supernatanty do analizy cytokin.
    3. Przemyć komórki 2x przez odwirowanie (200 × g przez 5 minut, a następnie 200 μl roztworu barwienia przepływowego). Odłóż na bok kilka komórek do kontroli kompensacji. Odłóż jeden na bok do barwienia FOXP3 i do niebarwionych kontroli.
      UWAGA: Sugerujemy przeczesanie 10 μl wszystkich próbek przed ostatnim wirowaniem w kroku 4.3.3 w celu uzyskania niezbędnych kontroli kompensacji. Zapewnia to reprezentatywną próbkę całej ekspresji na poziomie powierzchni każdego markera na komórkach.
    4. Po drugim przemyciu odwirować (200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej) i aspirować, a następnie dodać 50 μl/dołek przeciwciała hamującego wiązanie receptora Fc (rozcieńczonego w stosunku 1:200 w roztworze do barwienia przepływowego). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    5. Dodać 50 μl/studzienkę przygotowanego koktajlu przeciwciał T Proliferation Panel.
    6. W przypadku kontroli kompensacyjnych zmieszać 50 μl niebarwionych komórek kompensacyjnych z 50 μl każdego pojedynczego barwionego przeciwciała.
    7. Inkubować płytkę i urządzenia kompensacyjne w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. Umyć płytkę raz roztworem barwienia przepływowego i odwirować przy 300 × g przez 5 minut.
    8. Barwienie żywym/martwym barwnikiem bliskiej podczerwieni rozcieńczonym w HBSS (1:1,000) w stężeniu 200 μl/studzienkę. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
    9. Umyć płytkę raz roztworem do barwienia przepływowego (200 μl/studzienkę) o stężeniu 300 × g przez 5 minut.
    10. Wykonaj analizę cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisaliśmy protokół dla ludzkich PBMC, w którym izoluje się zarówno limfocyty T CD3+, jak i monocyty CD14+ przy użyciu dostępnych komercyjnie zestawów do separacji magnetycznej, różnicuje monocyty do postaci moDC CD14-, HLA-DR+, CD141+, CD1c+ za pomocą GM-CSF i IL-4, poddaje je 24-godzinnej inkubacji z lekiem, a następnie współhoduje z autologicznymi limfocytami T przy stymulacji przeciwciałami anty-CD3/CD28 przez 72 h. Schemat doświadczenia przedstawiono ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy wiarygodną i wszechstronną metodę oceny funkcjonalności środków immunomodulujących w celu indukowania tolDC z moDC i walidacji ich funkcjonalności w celu generowania Treg z autogennych limfocytów T ex vivo. W tym protokole jest kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, monocyty są notorycznie wrażliwymi komórkami i muszą być pozyskiwane ze świeżych, nie wcześniej mrożonych PBMC, aby uzyskać najlepsze wyniki. Monocyty należy jak najszybciej wyizolować i umieścić w koktajlu różnicującym. Zazwy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Human Immunology Core (HIC) Uniwersytetu Pensylwanii za dostarczenie świeżych ludzkich PBMC od dawców. HIC jest częściowo wspierany przez NIH P30 AI045008 i P30 CA016520.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1-10 i mikro; L Końcówki do pipet z filtremVWR76322-158komórkowa
1,5 ml probówka wirówkowaVWR77508-358Ogólna hodowla komórkowa
10 ml Pipety serologiczneVWR414004-267Ogólna hodowla komórkowa
100-1000 &mikro; L Końcówki do pipet z filtremVWR76322-164Ogólna
hodowla komórkowa 15 ml Rurka stożkowaVWR77508-212Ogólna hodowla komórkowa
20-200 i mikro; L Filtrowane końcówki do pipetVWR76322-160Ogólna hodowla komórkowa
2-merkaptoetanolMP Biomedyczna194834Hodowla komórek T
50 ml Rurka stożkowaVWR21008-736Ogólna hodowla komórkowa
60 x 15 mm, Nunclon DeltaThermo Fischer150326Ogólna hodowla komórkowa
96 Stożkowa (V) płyta dolna, nieobrobiona powierzchniaThermo Fischer277143Ogólna hodowla komórkowa
96-dołkowa płaska płytka z płaskim dnemThermo Fischer161093Ogólna hodowla komórkowa
Przeciwciało antyludzkie APC/cyjaninina 7 CD272 (BTLA)Biolegend344518Cytometria przepływowa
Attune NxT (czerwony/niebieski laser, 7-kanałowy)Thermo FischerA24863Cytometria przepływowa
BSAThermo Fischer15260-037Komórka ogólna
Kultura Przeciwciało monoklonalne CD14 (61D3), PEThermo Fischer12-0149-42Cytometria przepływowa
CD1c Przeciwciało monoklonalne (L161), PE-cyjanina7Thermo Fischer25-0015-42Cytometria przepływowa
CD209 (DC-SIGN) Przeciwciało monoklonalne (eB-h209), PerCP-cyjanina 5.5Thermo Fischer45-2099-42Cytometria przepływowa
Przeciwciało monoklonalne CD25 (CD25-4E3), APCThermo Fischer17-0257-42Cytometria przepływowa
CD274 (PD-L1, B7-H1) Przeciwciało monoklonalne (MIH1), PEThermo Fischer12-5983-42Cytometria przepływowa
CD4 Przeciwciało monoklonalne (RPA-T4), Alexa Fluor 488Thermo Fischer53-0049-42Cytometria przepływowa
CD40 Przeciwciało monoklonalne (5C3), APCThermo Fischer17-0409-42Cytometria przepływowa
CD40 Przeciwciało monoklonalne (5C3), APC-eFluor 780Thermo Fischer47-0409-42Cytometria przepływowa
CD69 Przeciwciało monoklonalne (FN50), PEThermo FischerMA1-10276Cytometria przepływowa
CD86 Przeciwciało monoklonalne (BU63), FITCThermo FischerMHCD8601Cytometria przepływowa
CD8a (RPA-T8), PE-cyjanina7Thermo Fischer25-0088-42Cytometria przepływowa
Stożkowe dno (V-studzienka) 96-dołkowa płytkaThermo Fischer2605Fiolki kriogeniczne z cytometrią przepływową
, 2 mlThermo Fischer430488Hodowla komórek T
dimetylosulfotlenku (DMSO), stopień sekwencjonowaniaThermo Fischer20688Ogólna hodowla komórkowa
DPBSThermo Fischer14200166Ogólna
hodowla komórkowa Zestaw do izolacji ludzkich monocytów EasySepTechnologie komórek macierzystych19359Separacja komórek
Zestaw do izolacji ludzkich komórek T EasySep Technologiekomórek macierzystych17951Separacja komórek
EasySep MagnetStem Cell Technologies18000Separacja komórek
EDTAThermo FischerAIM9260Gkomórkowe
Falcon Round-Bottom Polistyrenowe probówki, 5 mlTechnologiekomórek macierzystych38025Separacja komórek
Inhibitor wiązania receptora Fc Przeciwciało poliklonalneThermo Fischer14-9161-73Cytometria przepływowa
Surowica bydlęcapłodu Thermo FischerA5670701Ogólna hodowla komórkowa
Utrwalany barwnik żywotności eFluor 780Thermo Fischer65-0865-18Cytometria przepływowa
Foxp3 / zestaw do barwienia czynnika transkrypcyjnegoThermo Fischer00-5523-00Cytometria przepływowa
FOXP3 Przeciwciało monoklonalne (PCH101), PE-cyjanina 5,5Thermo Fischer35-4776-42Cytometria przepływowa
HBSSThermo Fischer14170-112Ogólna hodowla komórkowa
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęcaThermo FischerA5670801Ogólna hodowla komórkowa
HEPES (1 m)Komórka Thermo Fischer15630106moDC Hodowla
przeciwciał monoklonalnych HLA-DR (L243), Alexa Fluor 488Thermo FischerA51009Cytometria przepływowa
Ludzki aktywator limfocytów T CD3 / CD28 / CD2StemCell Technologies10970Hodowla komórek T
Ludzkie białko rekombinowane GM-CSFThermo Fischer300-03moDC Hodowla komórkowa
Ludzki zestaw ELISA IL-10, ThermoFischerBMS215-2HSElisa
Ludzka IL-4, rekombinowane białko wolne od zwierzątThermo FischerAF-200-04moDC Hodowla komórkowa
Ludzki PBMC (świeżo izolowany)UPenn HICN / A
Cells Ludzki zestaw TNF alfa ELISAThermo FischerBMS223-4ELISA
Light Microscope (DMi1)Lucia391240komórkowa
Lipopolisacharyd (LPS)Invivogentlrl-eblpsmoDC Cell Culture
LIVE/DEAD Naprawialny zestaw do barwienia martwych komórek w bliskiej podczerwieniThermo FischerL34975Cytometria przepływowa
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)Termo Fischer11140050Hodowla komórek T
Penicylina-Streptomycyna (100x)Thermo Fischer15140122hodowli komórkowych
VWR77575-370Ogólna hodowla komórkowa
Rapamycyna, 98+%Thermo FischerJ62473. MFmoDC Hodowla komórkowa
RPMI 1640 z GlutamaxThermo Fischer61870-036Ogólny
bufor do separacjiTechnologie komórek macierzystych20144
Koktajl stymulacji komórek T do separacji komórek T (500x)Thermo Fischer00-4970-93Kultura komórkowa
T UltraComp eBead Plus Koraliki kompensacyjneThermo Fischer01-3333-41Przepływ Zestaw
pipet do cytometrii o zmiennejFischer Scientific05-403-152Ogólna hodowla komórkowa
Ogólna hodowla Ogólne hodowle o wysokiej czułości Ogólna hodowla Ogólny kontroler pipet do kultur komórkowych geometrii

Bibliografia

  1. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18 (1), 767-811 (2000).
  2. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440 (7085), 808-812 (2006).
  3. Anderson, A. E., et al. LPS activation is required for migratory activity and antigen presentation by tolerogenic dendritic cells. J Leukoc Bio. 85 (2), 243-250 (2009).
  4. Iberg, C. A., Hawiger, D. Natural and induced tolerogenic dendritic cells. J Immunol. 204 (4), 733-744 (2020).
  5. Ness, S., Lin, S., Gordon, J. R. Regulatory dendritic cells, T cell tolerance, and dendritic cell therapy for immunologic disease. Front Immunol. 12, 633436(2021).
  6. Ali, S., et al. Sources of type I interferons in infectious immunity: Plasmacytoid dendritic cells not always in the driver's seat. Front Immunol. 10, 778(2019).
  7. Fossum, E., et al. Targeting antigens to different receptors on conventional type 1 dendritic cells impacts the immune response. J Immunol. 205 (3), 661-673 (2020).
  8. Kedl, R. M., et al. Migratory dendritic cells acquire and present lymphatic endothelial cell-archived antigens during lymph node contraction. Nat Comm. 8 (1), 2034(2017).
  9. Chow, K. V., Sutherland, R. M., Zhan, Y., Lew, A. M. Heterogeneity, functional specialization and differentiation of monocyte-derived dendritic cells. Immun Cell Biol. 95 (3), 244-251 (2017).
  10. Johnson, R. K., Overlee, B. L., Sagen, J. A., Howe, C. L. Peripheral blood mononuclear cell phenotype and function are maintained after overnight shipping of whole blood. Sci Rep. 12 (1), 19920(2022).
  11. Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction - A comparative study of human clinical-applicable DC. Clinl Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
  12. Navarro-Barriuso, J., et al. Vitamin D3-induced tolerogenic dendritic cells modulate the transcriptomic profile of T CD4+ cells towards a functional hyporesponsiveness. Front Immunol. 11, 599623(2021).
  13. Moorman, C. D., Sohn, S. J., Phee, H. Emerging therapeutics for immune tolerance: Tolerogenic vaccines T cell therapy, and IL-2 therapy. Front Immunol. 12, 657768(2021).
  14. Kenison, J. E., et al. Tolerogenic nanoparticles suppress central nervous system inflammation. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (50), 32017-32028 (2020).
  15. Neshat, S. Y., et al. Improvement of islet engrafts via Treg induction using immunomodulating polymeric tolerogenic microparticles. ACS Biomater Sci Eng. 9 (6), 3522-3534 (2023).
  16. Deak, P., Knight, R., Esser-Kahn, A. Robust tolerogenic dendritic cells via push/pull pairing of toll-like-receptor agonists and immunomodulators reduces EAE. Biomaterials. 286, 121571(2022).
  17. Møller, S. H., Wang, L., Ho, P. -C. Metabolic programming in dendritic cells tailors immune responses and homeostasis. Cell Mol Immunoly. 19 (3), 370-383 (2022).
  18. Adamik, J., et al. Distinct metabolic states guide maturation of inflammatory and tolerogenic dendritic cells. Nat Comm. 13 (1), 5184(2022).
  19. Hals, I. K., et al. Investigating optimal β-cell-preserving treatment in latent autoimmune diabetes in adults: Results from a 21-month randomized trial. Diabetes Obes Metab. 21 (10), 2219-2227 (2019).
  20. Gammon, J. M., et al. Engineering the lymph node environment promotes antigen-specific efficacy in type 1 diabetes and islet transplantation. Nat Comm. 14 (1), 681(2023).
  21. Sim, W. J., Malinarich, F., Fairhurst, A. -M., Connolly, J. E. Generation of immature, mature and tolerogenic dendritic cells with differing metabolic phenotypes. J Vis Exp. (112), e54128(2016).
  22. Jia, S., Kim, J., Esser-Kahn, A. P., Deak, P. High-throughput screening identification of novel immunomodulatory combinations for the generation of tolerogenic dendritic cells. Front Med. 10, 1298424(2024).
  23. Dinh, B., et al. Isolation and cryopreservation of highly viable human peripheral blood mononuclear cells from whole blood: A guide for beginners. J Vis Exp. (212), e66794(2024).
  24. Akkaya, B., et al. Regulatory T cells mediate specific suppression by depleting peptide-MHC class II from dendritic cells. Nat Immunol. 20 (2), 218-231 (2019).
  25. Stallone, G., et al. mTOR inhibitors effects on regulatory T cells and on dendritic cells. J Trans Med. 14 (1), 152(2016).
  26. Dahlqvist, G., et al. Modulatory effect of rapamycin and tacrolimus on monocyte-derived dendritic cells phenotype and function. Immunobiology. 226 (1), 152031(2021).
  27. Cimen Bozkus, C., Blazquez, A. B., Enokida, T., Bhardwaj, N. A T-cell-based immunogenicity protocol for evaluating human antigen-specific responses. STAR Protoc. 2 (3), 100758(2021).
  28. Nakayama, M., Michels, A. W. Determining antigen specificity of human islet infiltrating T cells in type 1 diabetes. Front Immunol. 10, 365(2019).
  29. Gregori, S., et al. Differentiation of type 1 T regulatory cells (Tr1) by tolerogenic DC-10 requires the IL-10-dependent ILT4/HLA-G pathway. Blood. 116 (6), 935-944 (2010).
  30. Taner, T., Hackstein, H., Wang, Z., Morelli, A. E., Thomson, A. W. Rapamycin-treated, alloantigen-pulsed host dendritic cells induce Ag-specific T cell regulation and prolong graft survival. Am J Transpl. 5 (2), 228-236 (2005).
  31. Baroja-Mazo, A., Revilla-Nuin, B., Ramírez, P., Pons, J. A. Immunosuppressive potency of mechanistic target of rapamycin inhibitors in solid-organ transplantation. World J Transplant. 6 (1), 183-192 (2016).
  32. Phillips, B. E., Garciafigueroa, Y., Trucco, M., Giannoukakis, N. Clinical tolerogenic dendritic cells: Exploring therapeutic impact on human autoimmune disease. Front Immunol. 8, 1279(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Komórki dendrytyczne pochodzące z monocytówregulacyjne limfocyty Tmonocyty CD14-dodatniecytometria przepływowamagnetyczna separacja komórekproliferacja limfocytów Tleczenie immunomodulująceindukcja Treg Foxp3
Prosta i skuteczna metoda testowania środków immunomodulujących do wytwarzania tolerogennych komórek dendrytycznych z ludzkich monocytów CD14+
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.