En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Podsumowanie

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości < 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

Streszczenie

Złożona struktura laminarna siatkówki stanowi poważne wyzwanie dla kompleksowego przestrzennego mapowania molekularnego. Obecne techniki badania architektury tkankowej i interakcji molekularnych są ograniczone przez ograniczenia techniczne, które naruszają relacje przestrzenne lub ograniczają profilowanie molekularne. Istniejące metody, takie jak przekrój poprzeczny, preparaty całego montażu, dysocjacje chemiczne lub mechaniczne oraz grube przekroje en face, albo zaburzają integralność tkanki, tracą krytyczny kontekst przestrzenny, albo, najczęściej, są po prostu niekompatybilne z wysokowymiarowymi platformami sekwencjonowania przestrzennego.

To badanie wprowadza technikę kriosekcji, która wytwarza cienkie (<20 μm) przekroje en face, zachowując jednocześnie relacje przestrzenne niezbędne do mapowania rozkładów komórek siatkówki. Metoda ta pozwala zachować integralność RNA i architekturę tkankową, jednocześnie generując skrawki kompatybilne z wysokoprzepustowymi platformami analizy molekularnej. Integralność RNA jest zachowana, ponieważ technika ta tnie świeżo zamrożoną tkankę, którą producenci przestrzennych platform transkryptomicznych oficjalnie popierają w odniesieniu do tkanki postfiksowej. Walidujemy to podejście przy użyciu wielu metod profilowania molekularnego, wykazując udaną integrację zarówno z ręczną hybrydyzacją RNAscope in situ (12 celów), jak i sekwencjonowaniem przestrzennym Xenium (300 celów). Technika ta konsekwentnie zachowuje architekturę tkankową we wszystkich próbkach, zachowując jednocześnie jakość RNA odpowiednią dla tych wrażliwych zastosowań molekularnych.

Ten postęp metodologiczny umożliwia nowe badania nad rozkładem typów komórek siatkówki, gradientami molekularnymi na blaszkach oraz przestrzennymi aspektami patologii siatkówki. Wszechstronność i kompatybilność tej techniki z nowoczesnymi platformami biologii przestrzennej stanowią podstawę do kompleksowego mapowania molekularnego złożonej organizacji komórkowej siatkówki.

Wprowadzenie

Neurony siatkówki rozwinęły topografie przestrzenne, które ułatwiają przetwarzanie informacji, co u wielu gatunków skutkuje dużymi specjalizacjami, takimi jak dołki, obszar centralny i smugi1^,2,3. W przeciwieństwie do dobrze poznanej różnorodności rozmieszczenia fotoreceptorów, specjalizacja przestrzenna wyjścia siatkówki, utworzonego przez komórki zwojowe siatkówki (RGC), jest mniej jasna. W przypadku większości gatunków rozmieszczenie przestrzenne RGC jest całkowicie nieznane. Nawet w przypadku myszy, prawdopodobnie jednego, jeśli nie najlepiej zbadanego modelu funkcji wzrokowych kręgowców, mniej niż jedna trzecia podtypów RGC została zmapowana za pomocą tradycyjnych technik, takich jak immunohistochemistry whole mount². Techniki te zawodzą, ponieważ większość podtypów RGC nie ma specyficznego markera genetycznego. Zamiast tego do dokładnej klasyfikacji RGC potrzebne są bardziej wymiarowe informacje molekularne⁴ za pomocą sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki^5,6,7.

Informacje o rozmieszczeniu RGC są ważne, ponieważ topografie obserwowane u myszy wykazują wyraźne korelacje ekologiczne między umiejscowieniem RGC a funkcją wzrokową. Najbardziej uderzającym przykładem jest organizacja przestrzenna ɑON-S RGC, które skupiają się w siatkówce skroniowej. Ten region otrzymuje obraz prey⁸ podczas zachowań łowieckich⁹. Docenia się również fakt, że podtypy RGC są w różny sposób podatne na chorobę¹⁰, a niektóre powszechne choroby, takie jak jaskra, mają komponent przestrzenny w ich postępowaniu^11,12. W związku z tym ważnym pytaniem, przed którym stoi ta dziedzina, jest: jaka jest organizacja przestrzenna podtypów RGC, gdy kafelkują one siatkówkę¹? Ta luka w wiedzy ogranicza obecnie wgląd w inne wizualnie sterowane zachowania i choroby.

Przedmiotem obecnej metody jest wypełnienie tych luk w wiedzy molekularnej poprzez podejście do kriosekcji en face, które zachowuje relacje przestrzenne, umożliwiając jednocześnie analizę molekularną o wysokiej rozdzielczości. Nowoczesne platformy sekwencjonowania przestrzennego, takie jak Xenium firmy 10X, stanowią przełomowy postęp w profilowaniu molekularnym, oferując bezprecedensowy wgląd w organizację tkanek i interakcje komórkowe. Jednak platformy te, wraz z technikami o niższej pleksacji, takimi jak RNAscope, i metodami sekwencjonowania przestrzennie kodowanego kreskowo, takimi jak Visium, mają wspólne ograniczenie techniczne: wymagają skrawków tkanek cieńszych niż 20 μm. Wymóg ten stanowi szczególne wyzwanie dla tkanki siatkówki, która zwykle mierzy 200 μm grubości.

Do tej pory badacze opierali się głównie na przekrojach poprzecznych przy stosowaniu tych technologii do tkanki siatkówki¹³. Podczas gdy przekroje czynne skutecznie ujawniają relacje molekularne w warstwach jądrowych i pleksikształtnych w kontekście obwodów pionowych, są one mniej odpowiednie do uchwycenia szerszych rozkładów przestrzennych komórek siatkówki, które tradycyjnie ujawniały całe preparaty wierzchowców⁸. Ostatnie próby przekroju en face były ograniczone przez ograniczenia grubości sekcji, przy czym badania wykazały tylko 50 μm przekrojów^{14-zbyt grube} dla nowoczesnych platform analizy molekularnej o wysokiej pleksie. Inne historyczne podejścia, które zostały wdrożone do badania poszczególnych blaszek siatkówki, ale nie są kompatybilne z nowoczesnymi technikami sekwencjonowania przestrzennego, obejmują trawienie enzymatyczne w połączeniu z dysocjacją mechaniczną^15,16, lub same dysocjacje mechaniczne^17,18,19,20. W tym miejscu przedstawiamy nowatorską technikę kriosekcji zaprojektowaną specjalnie dla cienkiej, zakrzywionej tkanki siatkówki, która pokonuje te ograniczenia. Krótko mówiąc, nasza metoda polega na ekstrakcji tylnej komory oka, wykonaniu nacięć reliefowych zarówno przez siatkówkę, jak i twardówkę, spłaszczeniu tkanki z wewnętrzną siatkówką do szkła nakrywkowego, osadzeniu tkanki w OCT, a na końcu kriosekcji od zewnętrznej do wewnętrznej siatkówki (Rysunek 1). Nasza metoda utrzymuje relacje przestrzenne podczas wytwarzania skrawków wystarczająco cienkich (<20 μm) dla wysokowymiarowych narzędzi biologii przestrzennej, co zostało potwierdzone przez udane wdrożenie zarówno z ręcznym RNAscope (12 celów), jak i zautomatyzowaną platformą Xenium (300 celów), wykazując kompatybilność w różnych skalach złożoności analizy molekularnej.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie i za zgodą Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) oraz odpowiednimi wytycznymi instytucjonalnymi zatwierdzającymi te metody nadzorowane przez University of Colorado. Wszystkie kroki związane z wykorzystywaniem zwierząt i eutanazją muszą być zgodne z lokalnymi przepisami i pozwoleniami eksperymentalnymi. Wszystkie myszy były trzymane pod standardową opieką w akredytowanej placówce weterynaryjnej z bezpłatnym dostępem do jedzenia i wody. Ta technika kriosekcji en face opiera się na standardowych technikach preparacji siatkówki zoptymalizowanych dla myszy C57BL/6. Do opracowania tej techniki wykorzystano około 150 myszy obojga płci w wieku od 6 tygodni do 2 lat. Ostatnia przedstawiona tutaj technika ma wskaźnik sukcesu wynoszący około 95%, niezależnie od cech demograficznych myszy. Należy pamiętać, że jeśli temperatura nie jest podana dla danego stopnia, przewiduje się temperaturę pokojową około 20-25 °C. Roztwory bez podanej temperatury będą działać, jeśli zostaną schłodzone, a zatem zakres temperatur roboczych dla roztworów wynosi 4-25 °C.

1. Sekcja

1. Znieczulij mysz izofluranem i zweryfikuj znieczulenie za pomocą uszczypnięcia palca u nogi lub postępuj zgodnie z lokalnymi zasadami i przepisami, aby wywołać i potwierdzić znieczulenie, ponieważ inne metody są równie odpowiednie.
2. Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy: jedną ręką zabezpiecz głowę myszy, a drugą podstawę ogona, a następnie pociągnij w przeciwnych kierunkach. Dokonać wtórnej eutanazji przez ścięcie.
3. Oznacz biegun skroniowy kuli ziemskiej na rogówce, aby zachować orientację i stworzyć słaby punkt do rozwarstwienia (Rysunek 2B i Rysunek 3A).
4. Zanurz kulę ziemską w roztworze Amesa w naczyniu zawierającym kawałek bibuły filtracyjnej (większy niż kula ziemska, ale mniejszy niż naczynie).
   UWAGA: Stosowanie roztworów innych niż Ames spowoduje pogorszenie stanu siatkówki (Rysunek 4A).
5. Używając ostrych kleszczyków #5 i nożyczek do tęczówki, ostrożnie usuń wszystkie mięśnie, powięź, naczynia krwionośne i nerwy z kuli ziemskiej (Rysunek 2E,F i Rysunek 3B) bez nakłuwania twardówki (Rysunek 2D).
   UWAGA: Nakłucie twardówki na tym etapie (Rysunek 4B) spowoduje przepuklinę tkanki (Rysunek 4C).
6. Umieść końcówkę jednego ostrza nożyczek tęczówki prostopadle do marki rogówki, a nożyczki równolegle do głowy nerwu wzrokowego. Przebij kulę ziemską w tej pozycji (Rysunek 3C,D).
7. Wykonaj pojedyncze czyste nacięcie przez rogówkę i rąbek, kontynuując do twardówki i siatkówki w kierunku głowy nerwu wzrokowego (Rysunek 3E).
   UWAGA: Nie przecinaj głowy nerwu wzrokowego, ponieważ twardówka i siatkówka rozdzielą się. Dokładna długość tego nacięcia będzie się różnić w zależności od wielkości kuli ziemskiej, która może się znacznie różnić między starymi i młodymi zwierzętami, a także w niektórych liniach Cre w stosunku do zwierząt typu dzikiego. Zalecamy pozostawienie około 1 mm tkanki między najgłębszym zakresem tego nacięcia a głową nerwu wzrokowego.
8. Ustaw ostrze prostopadle do początkowego cięcia (Rysunek 3F,G), około 1 mm za rąbkiem (Rysunek 2C). Rozpocznij cięcie promieniście przez twardówkę i siatkówkę.
   1. Utrzymuj stałą linię cięcia z tyłu i równolegle do rąbka, używając ostrych kleszczy do prowadzenia i obracania kuli ziemskiej. Chociaż minimalizacja cięć jest idealna, priorytetem jest utrzymanie czystej ścieżki promieniowej. Jeśli siatkówka i twardówka rozdzielają się, zmień położenie ostrza nożyczek do tęczówki, aby je przeciąć.
      UWAGA: Cięcie w rąbku może spowodować oddzielenie siatkówki od twardówki podczas ekstrakcji soczewki. Dopuszczalne są małe cięcia i rotacje. Unikaj stosowania siły, aby go zabezpieczyć, ponieważ grozi to przepukliną siatkówki.
   2. Oszacuj odległość tylną 1 mm za pomocą środkowej szerokości ostrza nożyczek do tęczówki. W razie niepewności skieruj się w stronę bardziej tylnej pozycji, ponieważ połączenie siatkówki z rąbkiem zakrzywia się wewnętrznie. Bardziej tylne cięcie ułatwia płaską ekstrakcję siatkówki.
9. Po wykonaniu promieniowego cięcia równolegle do rąbka należy sprawdzić, czy nie ma pozostałych połączeń siatkówki. Ostrożnie odetnij je nożyczkami do tęczówki, aż przednia i tylna część kuli ziemskiej zostaną oddzielone.
10. Używając dwóch par ostrych kleszczyków #5, delikatnie oddziel przednią i tylną część kuli ziemskiej (Rysunek 3H). U starszych myszy przezroczyste włókna mogą łączyć soczewkę z miseczką siatkówki; Ostrożnie odetnij je nożyczkami do tęczówki, minimalizując separację siatkówki i twardówki.
    UWAGA: Soczewka powinna pozostać przymocowana do rąbka i rogówki.
11. Używając bibuły filtracyjnej jako platformy nośnej, przetnij siatkówkę w liść koniczyny (znany również jako żelazny krzyż) za pomocą nożyczek do tęczówki (Rysunek 3I-K).
    UWAGA: Nacięcia liści koniczyny powinny być krótsze niż pierwotne nacięcie orientacyjne początkowo wykonane przez rąbek, jeśli pożądane jest rejestrowanie orientacji za pomocą tego plasterka. Zalecamy zmniejszenie rozmiaru tych trzech nowych promieniowych nacięć, aby były o około 1-2 mm krótsze niż pierwotne nacięcie. Jeśli do orientacji zostanie użyta inna cecha, taka jak gradient opsyny, właściwe jest, aby wszystkie nacięcia miały tę samą długość, zawsze zachowując około 1 mm tkanki między najgłębszą częścią nacięcia a głową nerwu wzrokowego, aby zapobiec oddzieleniu siatkówki i twardówki.
12. Powtórz sekcję z drugim okiem. Aby zminimalizować martwicę, należy całkowicie usunąć przednią komorę drugiego oka w ciągu 10 minut od eutanazji.

2. Kriokonserwacja

1. Przygotuj jednorazową plastikową pipetę do przenoszenia, przecinając końcówkę, aby utworzyć otwór większy niż wypreparowana siatkówka i twardówka (zwana dalej siatkówką).
2. Delikatnie zassać siatkówkę do pipety i umieścić ją na szklanym szkiełku mikroskopowym. Za pomocą chusteczki laboratoryjnej ostrożnie usuń nadmiar roztworu Amesa wokół siatkówki, aż przestanie on swobodnie unosić się i będzie można go spłaszczyć.
3. Za pomocą dwóch ostrych kleszczyków #5 rozłóż siatkówkę i ustaw ją płasko z wewnętrzną muszlą oczną skierowaną do góry. W zależności od wielkości tkanki, wykonaj 0,5-2 mm nacięcia reliefowe w każdym segmencie koniczyny, aby jeszcze bardziej spłaszczyć siatkówkę, ostrożnie dostosowując tkankę, aby zapobiec fałdowaniu się (Ryc. 5A). Usuń dodatkowy roztwór Amesa, aż płyn pozostanie tylko w sąsiedztwie siatkówki.
4. Za pomocą szkiełka nakrywkowego szybko naciśnij i przenieś siatkówkę (Ryc. 5B) wraz z otaczającym ją płynem tak, aby zewnętrzna twardówka była skierowana do góry, a wewnętrzna muszla oczna stykała się ze szkiełkiem nakrywkowym, to znaczy, że komórki zwojowe siatkówki będą skierowane do góry (Ryc. 5C).
5. Sprawdź, czy siatkówka nie jest zagięta i dokonaj regulacji w razie potrzeby; dodaj roztwór Amesa, aby ułatwić manipulację. Ponieważ nadmiar płynu spowoduje zwijanie się tkanki, użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć cały nadmiar roztworu Amesa i pozostaw siatkówkę do wyschnięcia na powietrzu przez 5-10 s.
   UWAGA: Nieumożliwienie krótkiego wyschnięcia powietrzem może losowo spowodować separację tkanek od OCT podczas kriosekcji. Nadmierne wysuszenie powietrzem może prowadzić do uszkodzenia tkanek związanego z kryształami soli.
6. Nałóż pożywkę OCT, aby pokryć siatkówkę i użyj kleszczy, aby równomiernie rozprowadzić tę warstwę na szkiełku nakrywkowym, zapobiegając flotacji siatkówki. Odczekaj 30 sekund, aby medium OCT przeniknęło do siatkówki.
7. Błyskawiczne zamrożenie siatkówki w OCT (Rysunek 5D) za pomocą metalowej płytki chłodzonej pośrednio parami ciekłego azotu lub poprzez bezpośredni kontakt z suchym lodem.
8. Siatkówki należy przechowywać na suchym lodzie w przypadku natychmiastowego użycia lub w zamrażarce o temperaturze -80 °C w plastikowej torbie lub pojemniku zawierającym środki osuszające, jeśli przechowuje się je przez dłuższy czas.

3. Kriosekcja

1. Ustaw komorę kriostatu na -18 °C i stage na -12 °C. Umieść siatkówkę w komorze, aby zrównoważyć temperaturę.
2. Utwórz kopułę OCT na uchwycie do próbek. Jeśli używasz tego samego modelu kriostatu, upewnij się, że ta kopuła zajmuje wewnętrzne 2-3 pierścienie. Po zamrożeniu przytnij kopułę OCT, aby utworzyć płaską powierzchnię stage równoległą do ostrza na uchwycie, aby zachować płaskość laminarną (Rysunek 6A).
3. Utwórz lub zanotuj prowadnicę orientacyjną odnoszącą uchwyt do stolika kriostatu.
   UWAGA: W zalecanym przez nas modelu kriostatu prowadnica orientacyjna jest centralną linią wytrawioną w pozycji godziny 12 nad uchwytem uchwytu, podczas gdy sam uchwyt ma trójkątne wycięcie na najbardziej zewnętrznym pierścieniu. Razem odnosimy się do tych funkcji jako do przewodnika orientacyjnego. Jeśli Twój kriostat nie ma takich funkcji, zalecamy użycie markera permanentnego do wykonania własnego.
4. Przygotuj siatkówkę do transferu za pomocą żyletki, usuwając nadmiar OCT otaczającego siatkówkę z boku, a następnie ostrożnie oddzielając siatkówkę od szkiełka nakrywkowego, aby była ruchoma.
5. Zdejmij uchwyt ze stolika i nałóż niewielką kroplę płynu OCT na przygotowaną płaską powierzchnię stolika OCT.
6. Umieść siatkówkę bezpośrednio na płynnym OCT. Używając wstępnie schłodzonego (-18 °C) szkiełka podstawowego, dociśnij i przytrzymaj siatkówkę przy stoliku OCT przez 10-30 s, aż do zamrożenia.
7. Nałóż dodatkowe OCT na siatkówkę i etap, aby zapewnić całkowite połączenie. Zamroź w obszarze szybkiego zamarzania kriostatu. Inkubuj etap siatkówki/OCT w kriostacie przez co najmniej 30 minut, aby zapewnić całkowite wiązanie.
8. Rozpocznij sekcję:
   1. Ostrożnie przycinaj nadmiar OCT, aż siatkówka stanie się widoczna (Rysunek 6B). Użyj żyletki, aby usunąć nadmiar OCT z krawędzi bloków.
      UWAGA: Zawsze chowaj stolik przed wznowieniem cięcia po ręcznym, promieniowym przycinaniu. Do przycinania plastrów en face zalecamy użycie tej samej grubości cięcia, jaka zostanie użyta dla żądanych sekcji; Jednak grubość przycinania może wynosić od 10 μm do 100 μm w zależności od preferencji użytkownika.
   2. Kontynuuj przycinanie, sprawdzając sekcje pod kątem obecności twardówki. Gdy twardówka jest widoczna, dostosuj kąt stage zgodnie z potrzebami. Kontynuuj przycinanie, aż sekcje wykażą równomierny rozkład twardówki, co zapewni optymalną płaskość i maksymalną powierzchnię liści koniczyny w każdej sekcji.
   3. Zbierz skrawki tkanek (Rysunek 6C).
      UWAGA: Optymalna grubość będzie zależeć od przeprowadzanego końcowego testu i musi być zgodna z tym protokołem. Na przykład, jeśli stosowany jest 10X Xenium, zalecamy sekcje o grubości 20 μm. Natomiast w przypadku 10X Visium bardziej odpowiednie są sekcje o grubości 15 μm.
   4. Użyj wstępnie schłodzonych slajdów i manipuluj sekcjami za pomocą dwóch pędzli.
   5. Umieść palec pod sekcją, aż OCT się rozpuści, a tkanka przylega (około 5 s).
   6. Umieść szkiełko z powrotem na zimnej powierzchni w celu ponownego zamrożenia tkanek.
      UWAGA: W przypadku zbierania skrawków na małych obszarach (np. w przypadku Xenium) może być konieczne wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania. Chociaż nie ma to wpływu na techniki oparte na sondzie, może mieć wpływ na jakość RNA w przypadku bezstronnych podejść do sekwencjonowania.
9. Szkiełka należy przechowywać na suchym lodzie do natychmiastowego użycia, w temperaturze -20 °C dla RNAscope następnego dnia i w temperaturze -80 °C dla długotrwałego przechowywania.

4. Wykrywanie celów i mikroskopia

UWAGA: Chociaż technika ta jest kompatybilna z innymi metodami profilowania molekularnego, szczegółowo opisujemy RNAscope jako jeden z potwierdzonych przykładów.

1. Przygotowanie próbki:
   1. Wyjmij szkiełka z przechowywania w temperaturze -80 °C i ogrzej w temperaturze -20 °C przez 1 godz.
      UWAGA: Szkiełka można przechowywać w temperaturze -20 °C do 12 godzin przed rozpoczęciem reszty tej procedury, ale nie należy ich pozostawiać w temperaturze -20 °C zbyt długo, aby zminimalizować degradację RNA.
2. Szybko podgrzewaj szkiełka w temperaturze 37 °C przez 10 s.
3. Utrwal chusteczkę, zanurzając szkiełka w świeżym 4% PFA na 30 minut w temperaturze pokojowej.
4. Dokładnie umyj szkiełka za pomocą 1x PBS.
5. Odwodnienie tkanek za pomocą serii etanolowej: 50% etanolu przez 5 min, 70% etanolu przez 5 minut, 100% etanolu przez 5 minut, świeży 100% etanol przez 5 min.
   UWAGA: Jest to krytyczny etap kontroli jakości przy montażu tkanek. Jeśli podczas odwodnienia dojdzie do odwarstwienia tkanki, oznacza to zachodzenie OCT na sąsiednie odcinki podczas montażu. Staranne przycinanie nadmiaru OCT podczas cięcia i montażu zapobiega temu problemowi.
6. Przygotowanie bariery:
   1. Suszyć szkiełka na blacie przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego narysuj barierę wokół każdego odcinka tkanki. Pozostaw barierę do całkowitego wyschnięcia na 5 minut w temperaturze pokojowej.
7. Detekcja molekularna:
   1. Zastosuj leczenie proteazą IV w celu przepuszczalności tkanek.
   2. Postępuj zgodnie z protokołem producenta dla hybrydyzacji sondy docelowej (2 godziny w 40 °C), etapów wzmocnienia sygnału (trzy wzmacniacze sekwencyjne), wykrywania fluoroforu (cztery sekwencyjne rundy do barwienia trójpleksowego).
8. Obrazowania:
   1. Wykonaj barwienie jądrowe DAPI przed każdym montażem szkła nakrywkowego.
   2. Zamontuj pokrywę za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu.
   3. Obraz za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z odpowiednimi zestawami filtrów.
   4. W przypadku wykrywania multipleksowego przechwyć to samo pole we wszystkich czterech rundach wykrywania w celu rejestracji obliczeniowej.
   5. Utrzymuj spójne ustawienia ekspozycji między rundami, aby uzyskać dokładne porównanie sygnału.
      UWAGA: Szczegółowe informacje na temat implementacji RNAscope można znaleźć w protokołach producenta (patrz tabela materiałów). W przypadku w pełni zautomatyzowanych platform, takich jak Xenium, postępuj zgodnie ze wszystkimi krokami protokołu producenta dokładnie tak, jak podano. W przypadku wszystkich protokołów należy przewidzieć, że niepowodzenie spowodowane oderwaniem tkanki najprawdopodobniej wystąpi podczas wczesnego etapu odwodnienia lub mycia, z powodu nakładania się OCT, jak zauważono w tym przykładowym protokole.

Wyniki

Udana implementacja tego protokołu tworzy nienaruszone przekroje siatkówki en face, odpowiednie dla wielu podejść do profilowania molekularnego, zachowując jednocześnie relacje przestrzenne na całej powierzchni siatkówki. Wykazujemy użyteczność protokołu poprzez systematyczne podejście do walidacji, przechodząc od konwencjonalnej immunohistochemii przez ręczne wykrywanie multipleksowego RNA do zautomatyzowanego profilowania molekularnego o wysokiej przepustowości.

Wstępna walidacja na...

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda rozwiązuje krytyczną barierę techniczną w biologii przestrzennej siatkówki, umożliwiając wytwarzanie cienkich przekrojów en face odpowiednich dla nowoczesnych technologii profilowania molekularnego. Najbardziej krytyczne kroki w protokole koncentrują się na obchodzeniu się z tkankami podczas wstępnej sekcji oraz precyzyjnej kontroli temperatury i nawodnienia podczas kriokonserwacji i sekcji. Pomyślne wdrożenie zależy w szczególności od osiągnięcia prawidłowego spłaszczenia tkanki przed...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ames′ Medium	Sigma-Aldrich	A1420-10X1L	Konkretna marka nie jest ważna
Beadsmith Thread Zap, Thread Burner	The Beadsmith Store	7.90524E+11	Można stosować alternatywne kauteryzatory
Kriostat	Leica	cm1950	Ważne kwestie to oddzielnie kontrolowana głośność w zależności od temperatury sceny.
Suchy lód	NA	NA	NA
Fine Science Tools Dumont #5 Kleszcze	Fine Science Tools 1129500	NC9889584	Konkretna marka nieważna
Fisher Healthcare Tissue-Plus OCT Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Konkretna marka nieważna
Fisherbrand Wysoka precyzja prosta, smukła pęseta punktowa	Fisher Scientific	12-000-127	Konkretna marka nie jest ważna
Fisherbrand Standardowe nożyczki preparacyjne	Fisher Scientific	08-951-20	Konkretna marka nie jest ważna
Fisherbrand Superfrost Plus Szkiełka mikroskopowe	Fisher Scientific	22-037-246	Konkretna marka nie jest ważna
Integra Miltex Noyes Nożyczki do tęczówki	Integra Miltex 181510	12-460-278	Konkretna marka nie jest ważna
Mikroskop epifluorescencyjny z wirującym dyskiem Olympus IX81	Dla rysunku 7
	Naukowy	12-567-400	Konkretna marka nieważna
Światowy instrument precyzyjny Precyzyjny mikroskop trójokularowy stereo z zoomem (IV) na stojaku na wysięgniku	Światowy instrument precyzyjny PZMTIVBS	50-253-8607	Konkretna marka nie jest ważna
Mikroskop epifluorescencyjny Zeiss Axio Imager.M2			Możliwość przekroju optycznego (dla rysunku 8)