Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje obrazowanie poklatkowe C. elegans oparte na mikroprzepływach w całym rozwoju postembrionalnym.

Streszczenie

Caenorhabditis elegans stał się jednym z najlepiej zbadanych i najlepiej zrozumianych modeli zwierzęcych w biologii. Trzy cechy są kluczem do sukcesu C. elegans jako organizmu modelowego: jego niezmienna linia komórkowa, przezroczystość i podatność genetyczna. Dzięki temu idealnie nadaje się do różnorodnych badań mikroskopowych bezpośrednio in vivo. Żywe larwy i dorosłe osobniki C. elegans często muszą być unieruchomione podczas pozyskiwania obrazu. Tradycyjne metody unieruchomienia niekorzystnie wpływają na rozwój zwierząt, zwłaszcza w zastosowaniach obrazowania poklatkowego. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół konfiguracji i obsługi nowatorskiej metody obrazowania mikroprzepływowego, który odnosi się do ograniczeń związanych z tradycyjną immobilizacją opartą na agarze i innymi strategiami mikroprzepływowymi. Takie podejście umożliwia jednoczesne obrazowanie na żywo w różnych stadiach larwalnych przy jednoczesnym zachowaniu orientacji i tożsamości robaka w czasie. Aby to osiągnąć, stosuje się mikroprzepływowy układ kanałów pułapek, którego geometria jest precyzyjnie zaprojektowana tak, aby utrzymać stabilną orientację robaka, jednocześnie dostosowując się do wzrostu i linienia. Unieruchomienie jest ułatwione przez aktywny zawór hydrauliczny, który wywiera nacisk, aby zabezpieczyć ślimaki przy szkle nakrywkowym wyłącznie podczas akwizycji obrazu. Taka konstrukcja umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości przy minimalnym wpływie na żywotność robaków lub czas rozwoju.

Wprowadzenie

C. elegans można przeprowadzić na kilka sposobów, w zależności od zastosowania, pożądanej przepustowości i rozdzielczości. Gdy wymagana jest wysoka rozdzielczość, standardowa metoda wykorzystuje podkładki agarowe^1,2,3, prostą konstrukcję ze szkła podstawowego, agarozy i szkła nakrywkowego. Zwierzęta na tych szkiełkach są unieruchomione przez nacisk wywierany przez szkło nakrywkowe. Unieruchomienie można dodatkowo poprawić poprzez dodanie środków znieczulających, np. lewamizolu lub azydku sodu^1,2, tak aby zwierzęta na podkładkach agarowych były idealnie nieruchome i mogły być obrazowane w wysokiej rozdzielczości, w tym różne metody superrozdzielczości². Niestety, wiadomo, że podkładki agarowe wpływają na postęp rozwoju, a połączenie wysokich ciśnień i środków znieczulających opóźnia rozwój lub powoduje całkowite zatrzymanie rozwoju^4,5.

Oprócz tych standardowych metod, w ostatnich latach pojawiło się kilka metodologii mikroprzepływowych, z których każda ma swoje zalety i wady lub specjalistyczne przypadki użycia6^,7^{,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19}. Na przykład Gritti et al.²⁰ wprowadzili metodę, w której robaki są zamykane w dużych komorach. Zarodki umieszczone w tych komorach rozwijają się i poruszają swobodnie, pozostając jednocześnie w wyznaczonym obszarze zainteresowania pod mikroskopem. Chociaż podejście to jest ogólnie skuteczne, ogranicza się do stosowania jasnych markerów fluorescencyjnych. Niedawno Keil et al.²¹ zaproponowali zmodyfikowaną wersję tej metody, zawierającą wbudowany zawór hydrauliczny do krępowania zwierząt podczas akwizycji obrazu, rozwiązując w ten sposób pewne ograniczenia pierwotnego podejścia. Ponieważ jednak obie metody wykorzystują większe komory niż te używane do uwięzionych robaków, zwierzęta nadal poruszają się i obracają przez cały czas trwania eksperymentu. W rezultacie śledzenie procesów rozwojowych staje się wyzwaniem i wymaga obszernego przetwarzania obrazu w celu skorygowania ruchu zwierząt.

Aby rozwiązać te ograniczenia, dostosowano podejście wprowadzone przez Berger et al.¹⁸ (Rysunek 1), gdzie zwierzęta nie są trzymane w dużej komorze, ale w kanale pułapki zaprojektowanym tak, aby zmieścić zwierzęta w krótszym oknie rozwojowym (do 2,5 stadium larwalnego). W przeciwieństwie do istniejących metod mikroprzepływowych, podejście to pozwala zachować orientację i tożsamość zwierzęcia przez cały czas trwania eksperymentu i umożliwia uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości wielu robaków równolegle i w wielu stadiach larwalnych w jednym urządzeniu.

Zwierzęta są uwięzione za pomocą wyspecjalizowanej geometrii kanału, gdzie wysokość kanału jest zbliżona do grubości zwierzęcia na początku eksperymentu, co zapobiega rotacji. Szerokości i długości kanałów są dobierane tak, aby zwierzęta mogły się poruszać i rosnąć w czasie, ułatwiając linienie i przejście z jednego stadium larwalnego do drugiego. Zrównoleglenie osiąga się po prostu poprzez umieszczenie wielu kanałów pułapek obok siebie, tak aby wiele zwierząt było widocznych w jednym polu widzenia (FOV, Rysunek 1A'), a do 41 zwierząt może być obrazowanych w jednej jednostce urządzenia ( Rysunek 1A). Zwierzęta na chipie są stale zaopatrywane w wysoce skoncentrowaną bakteryjną zawiesinę pokarmową przez kanał o niskiej wysokości, który jednocześnie pomaga uwięzić zwierzęta na końcu układu kanału pułapki (krok wysokości, Rysunek 1A, czerwony). Podobnie jak w przypadku podejścia przyjętego przez Keila i in.²¹, zaimplementowano duży hydrauliczny zawór na chipie, który można napompować podczas akwizycji obrazu, dociskając zwierzęta do szkła nakrywkowego, poprawiając w ten sposób unieruchomienie zwierzęcia (Rysunek 1B). Ograniczenie uruchamiania zaworu hydraulicznego tylko do okresu akwizycji obrazu minimalizuje niekorzystny wpływ na rozwój zwierząt, zapewniając niezawodny rozwój we wszystkich stadiach larwalnych. W przeciwieństwie do metod opisanych przez Gritti et al.²⁰ i Keil et al.²¹, zwierzęta nie mogą być obrazowane w całym rozwoju postembrionalnym w ramach tego samego urządzenia. Zamiast tego wprowadzono pięć odrębnych urządzeń, oznaczonych odpowiednio jako L1, L1-4, L2-A, L3-A i L4-A, obejmujących cały etap L1 i wczesny etap L2, średni późny etap L1 do połowy etapu L4, środkowy późny L2 aż do młodej dorosłości, środkowy koniec L3 do młodej dorosłości i późny L4 do młodej dorosłości (Rysunek 1C), które umożliwiają nieprzerwane obrazowanie dużych części rozwoju postembrionalnego. Takie podejście jest przyjmowane ze względu na duży wzrost wielkości zwierząt od L1 do dorosłości, tak że kanał odpowiedni dla zwierząt L1 byłby o wiele za mały dla dorosłych, co spowodowałoby zatrzymanie rozwoju, a kanał pasujący do dorosłych byłby o wiele za duży dla L1, co spowodowałoby nadmierny ruch, rotację i ucieczkę zwierząt z kanałów pułapek.

Korzystając z tego podejścia, osiąga się niezawodny postęp rozwojowy dla różnych tkanek¹⁸, np. postembrionalny rozwój tkanki podskórnej (etap L1 do L4), indukcja losów komórek sromu (etap L2 i L3), morfogeneza sromu (L3 do dorosłości¹⁹) i inwazja komórek kotwicznych. Od momentu ich wprowadzenia, te długoterminowe urządzenia do obrazowania były używane do badania różnych procesów^22,23, przy czym platforma została nawet połączona z technikami takimi jak mikroskopia superrozdzielcza AiryScan²⁴, umożliwiając liczne odkrycia, które wcześniej były niemożliwe.

Poniżej przedstawiono krok po kroku aspekty operacyjne tych urządzeń do długoterminowego obrazowania, podkreślając oczekiwane wyniki i niektóre potencjalne wyzwania podczas konfiguracji systemu.

Protokół

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Produkcja urządzeń

UWAGA: Wszystkie urządzenia zostały wyprodukowane przy użyciu poniższego protokołu, jednak urządzenia są bezpośrednio dostępne u autorów. Dla każdego typu urządzenia wytwarzany jest oddzielny wafel, przy czym każdy wafel urządzenia jest wytwarzany z dwóch warstw SU8 o różnych wysokościach (tj. warstwy żywności i warstwy pułapki). Płytka zaworu jest wytwarzana na oddzielnej płytce o pojedynczej wysokości SU-8, z pominięciem kroków 1,3-1,6. Silany są toksyczne i uwalniają opary. Dlatego ten krok należy wykonać w dygestorium. Szczegółowe informacje na temat procedury wytwarzania można znaleźć w Berger et al.¹⁸.

1. Oczyść wafle za pomocą plazmy powietrznej.
2. Pierwszą warstwę SU8 należy obtoczyć w wirowaniu, a następnie wypiekać na miękko w temperaturze 95 °C.
3. Odsłoić pierwszą warstwę, a następnie upiec w temperaturze 95 °C i wywołać.
4. Ponownie wykonaj czyszczenie plazmowe po wywołaniu i wysuszeniu wafla
.
5. Drugą warstwę SU8 obtoczyć w wirówce, a następnie wypiekać na miękko w temperaturze 95 °C (w razie potrzeby przeprowadzić wstępne pieczenie w temperaturze 65 °C).
6. Wyrównaj drugą maskę do istniejących obiektów za pomocą znaczników wyrównania po obu stronach płytki, a następnie odświetl drugą warstwę.
7. Po upieczeniu i rozwinięciu wafla, a następnie wykonaj twardy pieczenie w temperaturze 200 °C.
8. Traktuj wafel chlorotrimetylosilanem przez co najmniej 2 godziny.
9. Przygotować partię 20 g prepolimeru PDMS (część A) i dokładnie wymieszać ją z 1 g środka sieciującego (stosunek 20:1, część B) (patrz tabela materiałów).
10. Odgazowuje przez 10 minut lub do momentu, gdy wszystkie bąbelki znikną.
11. Usunąć 2 ml mieszaniny PDMS i odłożyć na krok 1.13.
12. Do pozostałej mieszaniny PDMS dodać kolejne 3 g środka sieciującego i dokładnie wymieszać (końcowe proporcje ok. 5:1).
13. Korzystając z wsadu PDMS 20:1, wiruj płytkę urządzenia z prędkością 750 obr./min przez 30 s.
14. Umieść płytkę zaworu w aluminiowym naczyniu i odlej na nią PDMS 5:1. Odgazuj płytkę urządzenia przez około 10 minut. Po odgazowaniu usuń wszelkie pozostałe pęcherzyki za pomocą pipety.
15. Piecz zarówno warstwę zaworu, jak i urządzenia w temperaturze 70 °C odpowiednio przez około 15/20 minut.
16. Oceń utwardzenie warstwy urządzenia i zaworu, delikatnie sondując je końcówką pipety lub pęsetą. Warstwa zaworu powinna być solidna, podczas gdy warstwa urządzenia powinna pozostać lekko lepka.
17. Odłącz warstwę zaworu i przytnij ją do wymaganego rozmiaru za pomocą skalpela lub żyletki.
18. Wybij otwór dostępowy w kanale zaworu (manometr 20).
19. Umieść płytkę urządzenia pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w górne oświetlenie.
20. Ostrożnie umieść element PDMS zawierający warstwę zaworu na płytce urządzenia.
21. Precyzyjnie wyrównaj funkcje zaworu i urządzenia, zapewniając usunięcie całego powietrza uwięzionego między warstwami.
22. Zmontowane urządzenie przełożyć do piekarnika i piec przez noc w temperaturze 70 °C.
23. Odłącz urządzenie od płytki.
24. Przebij wszystkie pozostałe otwory dostępowe (grubość 20).
25. Przymocuj PDMS do szkła nakrywkowego za pomocą plazmy powietrznej, a następnie umieść połączone urządzenie w piecu w temperaturze 70 °C na kilka godzin.

2. Przygotowanie robaka

UWAGA: Ta sekcja opisuje przygotowanie robaków przez bielenie, co pozwala na generowanie dużych liczb (setek) zwierząt. Inne metody synchronizacji, takie jak pobieranie ręczne, są możliwe, ale są zazwyczaj bardziej czasochłonne i pracochłonne. Wszystkie robaki użyte w protokole są utrzymywane zgodnie ze standardowymi protokołami w temperaturze 20 °C i na płytkach NGM wysianych E. coli OP50.

1. Począwszy od talerzy z wieloma ciężarnymi zwierzętami.
2. Zmyj zwierzęta z talerza za pomocą bufora M9.
3. Dodać 5% NaClO i 5 M NaOH do zawiesiny robaka (200 μL/100 μL na każdy 1 ml zawiesiny robaka).
4. Delikatnie potrząśnij mieszanką wybielającą, aż zwierzęta zaczną się rozpadać (~10 min).
5. Odwirować mieszaninę wybielającą w temperaturze pokojowej, 1300 x g przez 1 min.
6. Usunąć supernatant za pomocą pipety i dodać równą ilość świeżego buforu M9.
7. Ponownie odwirować w temperaturze pokojowej, 1300 x g przez 1 min.
8. Usunąć supernatant i przenieść granulowane robaki do probówki o pojemności 15 ml z 5 ml świeżego buforu M9.
9. Wstrząsnąć przez noc w temperaturze 20 °C.
10. Przepuścić zawiesinę robaka przez sitko o wielkości 10 μm.
11. Odwirować zawiesinę ślimakową o stężeniu 1300 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
12. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić robaki w równej objętości buforu M9.
13. Ponownie odwirować mieszaninę robaków w temperaturze 1300 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
14. Usunąć supernatant i przenieść robaki na płytki NGM. Jeśli potrzebne są larwy L1, należy je natychmiast zużyć.
15. Gdy robaki osiągną pożądany etap rozwoju, zmyj je z płytki za pomocą świeżego buforu S-Basal przefiltrowanego przez filtr 0,2 μm.
16. Pozostawić robaki do osadzania się grawitacyjnie lub granulować je przez odwirowanie w temperaturze 750 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
17. Odrzucić supernatant i dodać równą objętość świeżego buforu S-Basal.
18. Powtórzyć etapy sedymentacji lub wirowania (kroki 2.16 i 2.17)
19. Usunąć supernatant i dodać równą objętość świeżego buforu S-Basal.
20. Wykonaj etapy sedymentacji lub wirowania po raz ostatni.
21. Usunąć większość supernatantu.
22. Trzymaj robaki w tubie, aż rozpocznie się eksperyment.

3. Przygotowanie bakterii

UWAGA: Na chipie można stosować różne szczepy bakterii (np. OP50, NA22, HT114, itp.). Dostosuj proporcję pożywki o gradiencie gęstości dodawanej do mieszanki spożywczej, aby skompensować różnice w gęstości. Wszystkie są przepuszczane przez filtr 0,2 μm w celu usunięcia cząstek stałych.

1. Przygotować 40 ml LBroth w 2 x 20 ml w probówkach wirówkowych, sterylnych kolbach Erlenmeyera itp.
2. Zaszczep LB bakteriami pobranymi z talerza podstawowego.
3. Hoduj bakterie, wstrząsając przez noc w temperaturze 37 °C (~16 h) (OD₆₀₀ = 1,9).
4. Odwirować bakterie przy 3000 x g przez 10 min.
5. Usunąć supernatant i dodać 2 ml świeżego buforu S-Basal do każdej probówki. Połącz wszystkie rurki.
6. Mechanicznie zawiesić bakterie za pomocą pipety.
7. Odwirować bakterie w stężeniu 3000 x g przez 5 minut.
8. Usunąć supernatant i ponownie dodać 2 ml świeżego buforu S-Basal.
9. Mechanicznie zawiesić bakterie za pomocą pipety.
10. Odwirować bakterie w stężeniu 3000 x g przez 5 minut.
11. Usuń jak najwięcej supernatantu i dodaj 1 ml świeżego buforu S-Basal przed mechanicznym ponownym zawieszeniem wszystkich bakterii.
12. Połącz 0,60 ml pożywki o gradiencie gęstości, 0,38 ml S-Basal + 1% wagowo Pluronic F-127 (niejonowy kopolimer triblokowy, reprezentowany tutaj jako PF) z 1 ml zawiesiny bakterii OP50 lub 0,65 ml pożywki o gradiencie gęstości, 0,33 ml S-Basal + 1% wagowo PF z 1 ml zawiesiny bakterii NA22 lub HT114.
13. Dokładnie wymieszaj przygotowane potrawy za pomocą miksera wirowego.
14. Przefiltruj żywność przez sitko o wielkości 5 μm lub 10 μm. Mniejsze sitko jest szczególnie zalecane w przypadku korzystania z mniejszych urządzeń, np. urządzeń L1.
    UWAGA: Żywność można przechowywać w temperaturze pokojowej do 2 dni.

4. Przygotowanie żetonów

UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 2, aby zapoznać się ze schematem urządzenia, przewodów i połączeń. Wszystkie są przepuszczane przez filtr 0,2 μm w celu usunięcia kurzu. Stalowy kołek wspomniany w poniższych krokach odnosi się do krótkiej, pustej rury, która służy do łączenia większej rurki o średnicy zewnętrznej (1/16") z otworami o małej średnicy wykonanymi w urządzeniu PDMS. Te stalowe kołki są po prostu wkładane w wewnętrzną średnicę rurki, a następnie wciskane w materiał PDMS, skutecznie łącząc te dwa.

1. Zacznij od napełnienia strzykawki wodą dejonizowaną (DI).
2. Przymocuj igłę 23 G i długi kawałek rurki 1/16", z wydrążonym stalowym kołkiem (wygiętym pod kątem 90°) na końcu. Rurka powinna być wystarczająco długa, aby rozciągać się od elektrozaworu do stolika mikroskopu.
3. Napełnij rurkę wodą DI ze strzykawki i podłącz ją do wlotu zaworu, wkładając stalowy kołek do wybitego otworu (Rysunek 2A,J).
4. Wyjmij strzykawkę i igłę, a następnie przymocuj rurkę do elektrozaworu poza chipem (Rysunek 2A, J).
5. Korzystając z oprogramowania do obrazowania, włącz elektrozawór i zwiększ ciśnienie w urządzeniu przez kilka minut, aby usunąć całe powietrze z zaworu. Sprawdź zakończenie, wizualnie sprawdzając interfejs powietrze-woda na chipie, który powinien być ciemny i zniknąć w materiale PDMS (Rysunek 2B).
6. Wyłącz elektrozawór (Rysunek 2C).
7. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml przefiltrowanym roztworem bakterii (wystarczy ~0,5 ml jedzenia).
8. Przymocuj igłę 30 G i długi kawałek rurki 1/32" do igły.
9. Nacisnąć tłok, aby napełnić zarówno igłę, jak i dołączoną rurkę, upewniając się, że w strzykawce lub rurce nie pozostało powietrze.
10. Włóż rurkę 1/32" bezpośrednio do wlotu żywności urządzenia mikroprzepływowego, używając pęsety, aby zapobiec uszkodzeniu rurki (zalecana jest pęseta SMD) (Rysunek 2D,K).
11. Umieścić strzykawkę na pompie strzykawkowej ( Rysunek 2D).
12. Naciśnij tłok strzykawki za pomocą skrzydełkowej z tyłu, aby napełnić urządzenie płynem. Kropla płynu powinna pojawić się przy każdym otwartym połączeniu (Rysunek 2D, strzałka).
13. Zablokuj zarówno wlot, jak i wylot ślimaka za pomocą uszczelnionego stalowego kołka (stalowy kołek z krótkim kawałkiem rurki 1/16" przymocowany i uszczelniony przez spalenie) (Rysunek 2E,L).
14. Zastosuj dodatkowy nacisk za pomocą skrzydełkowej, aby usunąć resztki powietrza z urządzenia (Rysunek 2E, strzałka).
15. Wyjmij zablokowany kołek na wylocie i przymocuj pojemnik na odpady (wykonany z probówki kriowialnej lub mikrowirówki, z dwoma stalowymi kołkami wbitymi w pokrywę i zabezpieczonymi klejem). Pojemnik na odpady jest połączony za pomocą krótkiego odcinka rurki 1/16", przy czym jeden koniec jest przymocowany do pojemnika, a drugi koniec jest połączony z wydrążonym stalowym kołkiem (wygiętym pod kątem 90°) (Rysunek 2F,G,M).
16. Naciskać strzykawkę, aby upewnić się, że pojemnik na odpady jest prawidłowo podłączony i że w systemie nie ma żadnych zatorów. W tym celu przepchnij niewielką ilość płynu przez system (przekręć skrzydełkową na pompie strzykawki), aż płyn przepłynie przez rurkę odpływową (Rysunek 2G, strzałka).
17. Usuń drugi zablokowany stalowy kołek.
18. Wciskać strzykawkę, aż na wlocie ślimaka pojawi się mała kropla płynu (Rysunek 2H,N).
19. Podłącz dłuższy kawałek rurki 1/16" (15-20 cm) do strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej buforem S-Basal, używając igły 23 G (Rysunek 2H, N).
20. Przymocuj prosty stalowy kołek 23 G do drugiego końca rurki.
21. Napełnić igłę i rurkę buforem ze strzykawki, upewniając się, że w strzykawce lub drengu nie pozostało powietrze.
22. Włóż stalowy kołek na końcu rurki do rurki zawierającej ślimaki.
23. Przeciśnij niewielką ilość płynu przez rurkę, upewniając się, że nie pozostało powietrze.
24. Wciągnąć robaki do rurki, ale nie należy ich wciągać do strzykawki.
25. Wciśnij strzykawkę podłączoną do ślimaków, aż na stalowym kołku pojawi się mała kropla płynu (Rysunek 2H).
26. Włóż stalowy kołek do wlotu ślimaka (Rysunek 2I).
    UWAGA: Przygotowanie urządzenia można przeprowadzić przed ostatecznym przygotowaniem robaków i pozostawić pod mikroskopem, aż robaki będą gotowe.

5. Wczytywanie i obrazowanie robaków

1. Umieść urządzenie na mikroskopie w małym powiększeniu (5x lub 10x) lub na mikroskopie preparacyjnym.
2. Zidentyfikuj aktualnie używaną jednostkę urządzenia i znajdź wlot ślimaka za pomocą oświetlenia w jasnym polu.
3. Ustawić urządzenie w taki sposób, aby wlot był widoczny po jednej stronie pola widzenia, a tył wlotu kanału syfonu był widoczny po drugiej stronie.
4. Delikatnie nacisnąć tłok strzykawki ślimakowej. Ciecz będzie zauważalnie przepływać od wlotu przez układ kanałów w kierunku wylotu. Obecność bakterii i różnica w współczynniku załamania światła spowodowana dodatkiem ośrodka gradientu gęstości sprawiają, że przepływ cieczy jest widoczny.
5. Upewnij się, że robaki pojawiają się z wlotu i płyną w kierunku tylnej części układu kanałów.
6. Delikatnie popchnij zwierzęta w kierunku układu kanałów. Gdy zwierzę stanie twarzą do kanału, wepchnij je do kanału i powtórz dla kolejnych zwierząt.
   UWAGA: Zwierzęta muszą być skierowane głowami w stronę wylotu, aby mieć łatwy dostęp do pożywienia. Można je zorientować poprzez pchanie i ciągnięcie za tłok oraz pływanie.
7. Po schwytaniu wystarczającej liczby zwierząt należy umieścić strzykawkę, nadal przymocowaną do wlotu robaka, na stoliku mikroskopu, gdzie pozostanie przez cały czas trwania eksperymentu. Krótkie odłączenie rurki ślimakowej od strzykawki może być konieczne w celu uwolnienia nagromadzonego ciśnienia, a następnie ostrożne ponowne przymocowanie jej do igły.
8. Jeśli obciążenie zostało wykonane na mikroskopie preparacyjnym, przenieś urządzenie do mikroskopu obrazowego. Rurka może pozostać przymocowana do chipa, a strzykawka jest podłączona do pompy.
9. Włączyć pompę strzykawkową i uruchomić ją z zadaną szybkością 1 μL/h dla 0,5 μL, zwiększyć szybkość o 100 μL/h dla 0,5 μL i zmniejszyć ją z powrotem do 1 μL/h. Cykl ten jest automatycznie powtarzany dla całego eksperymentu. Informacje na temat programowania pompy można znaleźć w instrukcji obsługi urządzenia.
10. Umieść urządzenie na stoliku mikroskopu i upewnij się, że jest mocno trzymane (sugestie dotyczące mechanizmów montażowych można znaleźć w Rysunek 3A).
11. Jeśli ładowanie nie zostało wykonane na mikroskopie obrazowym, zidentyfikuj jednostkę zainteresowania urządzenia przy małym powiększeniu.
12. Przełącz na żądane powiększenie obrazu.
    UWAGA: Urządzenia są kompatybilne ze wszystkimi typami obiektywów.
13. Zidentyfikuj zwierzęta i obszary zainteresowania w układzie kanałów pułapki i ustaw żądane warunki obrazowania.
14. Obraz w żądanych warunkach obrazowania, z wbudowanym zaworem uruchamianym przez elektromagnes 10 s przed akwizycją obrazu, dzięki czemu zwierzęta są utrzymywane w miejscu.
    UWAGA: Uruchomienie zaworu na chipie spowoduje wydłużenie i spłaszczenie zwierząt, co może wymagać regulacji obszaru obrazowania (ROI).

6. Przygotowanie do konfiguracji

UWAGA: Ta sekcja odnosi się do wstępnego przygotowania mechanizmu kontroli urządzenia i nie musi być powtarzana przed każdym eksperymentem. Patrz Rysunek 3B,C. Ponieważ wiele elektrozaworów wymaga wyższego napięcia, elektromagnes najprawdopodobniej nie będzie podłączony bezpośrednio do mikrokontrolera, ale za pomocą przekaźnika lub tranzystora MOSFET (patrz Rysunek 3C).

1. Zidentyfikuj źródło sprężonego powietrza (np. instalację naścienną lub butlę z gazem).
2. Podłącz źródło ciśnienia do odpowiedniego regulatora ciśnienia (zakres ciśnienia 0-2 bar) za pomocą rurki 6 mm (źródło ścienne) lub bezpośrednio podłącz odpowiedni reduktor do butli z gazem.
3. Podłącz regulator ciśnienia do wejścia zaworu elektromagnetycznego (rurka 6 mm, patrz Rysunek 3B).
4. Umieść elektrozawór jak najbliżej stolika mikroskopu (sugerowane jest ~0.5-1 m od stolika, chociaż w razie potrzeby możliwe są większe odległości).
5. Podłączyć elektrozawór elektronicznie do wybranego sterownika. Dostępne są różne opcje, takie jak sterowanie nim za pomocą oddzielnej płytki mikrokontrolera (np. Arduino) lub istniejącej karty DAq.

7. Czyszczenie i przechowywanie

1. Po zakończeniu eksperymentu wyjmij urządzenie z mikroskopu.
2. Usuń płyn zanurzeniowy. Olejek immersyjny można usunąć za pomocą rozpuszczalników organicznych (np. acetonu, metanolu itp.).
3. Umieść urządzenie na płaskiej powierzchni i odłącz wszystkie rurki z wyjątkiem rurki zaworu. Aby bezpiecznie odłączyć każdą rurkę, naciśnij znajdujący się w pobliżu PDMS i delikatnie pociągnij. Nie podnoś i nie zginaj urządzenia, ponieważ może to spowodować pęknięcie szkła nakrywkowego.
4. Oczyść powierzchnię PDMS 70% etanolem.
5. Przechowuj urządzenie w temperaturze pokojowej z dołączoną rurką zaworu.
   UWAGA: Urządzenie może być ponownie użyte, dopóki wszystkie jednostki nie zostaną użyte, prawdopodobnie bez konieczności ponownego napełniania rurki zaworu. Jednak woda w rurkach zaworu wyparuje przez dłuższy czas i może ostatecznie wymagać ponownego napełnienia.

Wyniki

Konstrukcja i wymiary urządzenia
Zaprojektowano pięć odrębnych urządzeń, aby pomieścić wszystkie cztery stadia larwalne. Urządzenia te są oznaczone w następujący sposób: L1 dla larw L1 ładowanych natychmiast po wykluciu i obrazowanych aż do stadium L2; L1-L4, zdolne do utrzymywania larw od środkowego do późnego stadium L1 do wczesnego do środkowego stadium L4; L2-A, odpowiedni dla zwierząt od około połowy stadium L2 do młodej dorosłości; L3-A, dla zwierząt od mniej więcej połowy stadium L3 do młodej dorosłości; oraz L4-A, który obejmuje zwierzęta od mniej więcej późnego stadium L4 do młodej dorosłości.

Wszystkie urządzenia mają ten sam podstawowy układ, składający się z wlotu robaka, 1 (lub 2 w przypadku wymiany mediów) bakteryjnego wlotu pokarmu i wspólnego odpływu odpadów. Pomiędzy częścią wlotową i wylotową umieszczony jest układ 41 równoległych kanałów pułapki, przy czym strona wlotowa i wylotowa są skutecznie oddzielone kanałem doprowadzającym żywność o niższej wysokości (Rysunek 1A,A′). Wymiary kanałów zostały wybrane tak, aby były znacznie dłuższe i szersze niż ślimaki załadowane na początku eksperymentu, o długości/szerokości 400/15 μm dla urządzeń L1, 575/22 μm dla urządzeń L1-L4, 800/27 μm dla urządzeń L2-A, 900/30 μm dla urządzeń L3-A i 1000/65 μm dla urządzeń L4-A (plik uzupełniający 1, Plik uzupełniający 2, plik uzupełniający 3, plik uzupełniający 4 i plik uzupełniający 5).

Długość kanału została wybrana tak, aby odpowiadała rozmiarowi, jaki zwierzęta osiągnęły pod koniec eksperymentu, natomiast szerokość została wybrana tak, że robaki na początku eksperymentu zajmowały około dwóch trzecich szerokości kanału. Taka konstrukcja zapewnia wystarczającą przestrzeń do wzrostu i ruchu podczas linienia, jednocześnie zapobiegając obracaniu się lub obracaniu robaków. W przeciwieństwie do szerokości, wysokość kanału ustalono na początku eksperymentu blisko grubości robaków: 8 μm dla wczesnych larw L1, 12 μm dla larw średnich/późnych L1, 15 μm dla larw środkowych L2, 17,5 μm dla larw środkowych L3 i 22,5 μm dla późnych larw L4, co odpowiada L1, Urządzenia L1-L4, L2-A, L3-A i L4-A. Zmniejszona wysokość kanału w połączeniu ze starannie dobraną szerokością (przy zachowaniu stosunku wysokości do szerokości 0,5-0,6) zapewnia, że robaki pozostają w stałej orientacji. Warto zauważyć, że przy wystarczająco małej wysokości kanału wszystkie robaki są konsekwentnie ustawione w pożądanej orientacji bocznej.

Kanał doprowadzający żywność został wykonany na wysokości 3 μm dla L1 i 5 μm dla wszystkich innych urządzeń, zapewniając, że bakterie mogą łatwo dotrzeć do zwierząt bez ucieczki zwierząt z kanałów pułapek. Wszystkie urządzenia wykorzystują tę samą warstwę doprowadzającą żywność (plik uzupełniający 6) i tę samą warstwę zaworu (plik uzupełniający 7). Należy pamiętać, że warstwa zaworu jest wytwarzana na oddzielnej płytce na wysokości 20 μm i umieszczana na warstwie urządzenia tylko podczas produkcji urządzenia PDMS (krok 1.21).

Te specyficzne dla danego etapu ograniczenia geometryczne, niezbędne do zapobiegania obracaniu się robaków lub odwracaniu głowy do ogona, wymagają użycia trzech różnych typów urządzeń, aby dostosować się do wszystkich stadiów larwalnych. Gdyby larwy L1 zostały umieszczone w kanale przeznaczonym dla młodych dorosłych zwierząt, nie pozostałyby stabilne i szybko opuściłyby kanał pułapki.

C. elegans przygotowanie
O ile nie zaznaczono inaczej, robaki były utrzymywane zgodnie ze standardowymi protokołami²⁵ na płytkach NGM wysianych E. coli OP50 w temperaturze 20 °C. Sekcja dotycząca przygotowania robaków wyraźnie opisuje przygotowanie zsynchronizowanej populacji robaków używanej w eksperymencie obrazowym. Synchronizacja została przeprowadzona zgodnie ze standardowymi protokołami przy użyciu wybielacza z podchlorynem sodu²⁶, zmodyfikowanego dodatkowym etapem filtracji w celu usunięcia zanieczyszczeń i niewyklutych zwierząt po całonocnym głodzeniu. Celem jest uzyskanie wielu zsynchronizowanych larw L1, które są następnie wysiewane na płytkach NGM lub ładowane bezpośrednio do urządzenia obrazującego. Inne metody synchronizacji, takie jak ręczne zbieranie lub kontrolowane składanie jaj, są równie odpowiednie. Są jednak bardziej pracochłonne w generowaniu wystarczającej liczby zwierząt (zalecane jest 200 na warunek).

Gdy robaki osiągną pożądany etap, mogą być delikatnie zmyte z płytki NGM za pomocą czystego S-Basal (najlepiej przefiltrowanego przez filtr 0,2 μm). Celem jest zebranie jak największej liczby zwierząt bez zbierania bakterii lub zanieczyszczeń z talerza. Zwierzęta zbiera się do małej probówki wirówkowej i myje 2-3 razy świeżym buforem S-Basal, ostatecznie usuwając jak najwięcej płynu. Zwierzęta są następnie pobierane bezpośrednio ze skoncentrowanej objętości. Jeśli koncentracja zwierząt jest zbyt niska, ładowanie będzie wolniejsze, co będzie wymagało przepływu większej objętości cieczy przez urządzenie i zwiększy ryzyko zablokowania kanałów pułapki zanieczyszczeniami.

Bakteryjne przygotowanie żywności
Wzrost bakterii odbywa się zgodnie ze standardowymi protokołami, przy czym początkowe stężenie bakterii (OD₆₀₀ = 1,9) wzrasta około 40-krotnie w buforze S-Basal (przefiltrowanym przez filtr 0,2 μm) i zmieszanym z podłożem o gradiencie gęstości i buforem S-Basal zawierającym PF (przefiltrowanym przez filtr 0,2 μm). Oczekiwanym rezultatem tego etapu procesu jest przygotowanie bardzo gęstej zawiesiny bakteryjnej i zapobieganie sedymentacji bakterii podczas eksperymentu obrazowego. Wysoka gęstość jest niezbędna do karmienia zwierząt na chipie przy niskich natężeniach przepływu stosowanych przy podawaniu pożywki (1 μl/h). Celem ośrodka o gradiencie gęstości jest zapobieganie wytrącaniu się bakterii podczas eksperymentu, a celem PF jest zapobieganie przywieraniu bakterii do ścian kanału. Zarówno podłoże o gradiencie gęstości, jak i PF są nietoksyczne i nie wpływają na żywotność zwierząt.

Jeśli w eksperymencie zostanie użyty inny typ bakterii, konieczne będzie określenie niezbędnego stężenia podłoża o gradiencie gęstości. Można to osiągnąć poprzez zmieszanie zawiesiny bakteryjnej z różnymi ilościami pożywki, a następnie odwirowanie. Jeśli stężenie gradientu gęstości jest zbyt niskie, bakterie będą się osadzać; Jeśli stężenie jest zbyt wysokie, bakterie będą unosić się na wodzie. Po znalezieniu odpowiedniego stężenia zaleca się walidację wyniku poprzez pozostawienie mieszaniny bakterii w temperaturze pokojowej na około 48 godzin, aby wskazać, jak żywność będzie się zachowywać przez cały czas trwania eksperymentu. Po eksperymencie zaleca się również sprawdzenie strzykawki, przez którą dostarczane są bakterie i upewnienie się, że bakterie nie osadzają się ani nie unoszą na wodzie. Różnica w objętości wynikająca z dodawania różnych ilości Optiprepu może być skompensowana przez dodanie mniej lub bardziej S-Basal + 1% wagowo PF. Podobnie, do zawiesiny można dodać dodatkowe pożywki lub związki (np. auksynę), a dodatkową objętość odejmuje się od objętości S-Basal + 1% wagowo PF.

Przygotowanie do konfiguracji
Ustaw system zasilania ciśnieniem jak najbliżej mikroskopu, tak aby można go było wygodnie obsługiwać. Wszystkie odcinki przewodów, zwłaszcza rurki 1/16" łączące się z chipem, powinny pozostać krótkie (mniej niż 0,5 m dla rurki o średnicy zewnętrznej 1/16") (Rysunek 2 i Rysunek 3B). Jak wskazano w powyższej sekcji, komputerowe sterowanie zaworem w układzie scalonym można osiągnąć na różne sposoby. Powinno to być możliwe w każdym oprogramowaniu mikroskopowym (testowanym w Micro-Manager, Metamorph, NIS i ZenBlue), albo poprzez podłączenie dedykowanej płytki mikrokontrolera (np. Arduino), albo poprzez podłączenie systemu do istniejącej karty akwizycji danych (DAq) za pomocą wyjścia cyfrowego. Wybrane wyjście płytki należy następnie skonfigurować jako migawkę, która włącza się na 10 s przed akwizycją obrazu lub jest uruchamiana ręcznie podczas konfiguracji urządzenia. Jak wspomniano wcześniej, podłączanie elektrozaworu bezpośrednio do mikrokontrolera nie jest zalecane; zamiast tego podłącz za pomocą tranzystora MOSFET lub przełącznika przekaźnika, tak aby elektrozawór i mikrokontroler pozostały elektronicznie odizolowane (Rysunek 3C).

Podobnie jak w przypadku przewodów doprowadzających ciśnienie, utrzymuj wszystkie inne przewody do chipa (1/16" OD i 1/32" OD) tak krótko, jak to możliwe. Rurki ślimakowe i odpływowe (1/16" OD) należy przechowywać odpowiednio poniżej 2.5 cm i 20 cm. Rurka doprowadzająca bakterie (1/32" OD) musi być wystarczająco długa, aby można ją było podłączyć od pompy strzykawkowej do urządzenia po umieszczeniu na stoliku mikroskopu. Niemniej jednak zdecydowanie zaleca się maksymalne skrócenie tego czasu i umieszczenie pompy strzykawkowej w pobliżu stolika mikroskopu, np. obok stolika, za pomocą półki lub na obudowie inkubatora. Dowolna długość rurki dodana do systemu zwiększy ciśnienie wsteczne odczuwane podczas załadunku zwierząt do urządzenia i zwiększy całkowite ciśnienie na uwięzionych zwierzętach.

Obsługa urządzenia
Na tym etapie wszystkie rurki można przygotować i podłączyć do odpowiedniej igły, stalowego kołka i strzykawki (początek kroku 4 protokołu). Jak wspomniano powyżej, długość rurki powinna być jak najkrótsza (Rysunek 2J-N). Co ważne, należy uważać, aby w strzykawkach lub rurkach nie pozostały pęcherzyki powietrza, ponieważ będą one przeszkadzać w ładowaniu zwierząt i mogą spowodować ucieczkę zwierząt z kanału pułapki podczas eksperymentu. Pęcherzyki powietrza można usunąć ze strzykawki na wiele różnych sposobów, np. poprzez napełnienie strzykawki, odwrócenie jej i delikatne potrząśnięcie nią tak, aby pęcherzyki powietrza uniosły się do górnej części strzykawki (nie zaleca się pstrykania strzykawką, ponieważ może to spowodować uwięzienie dodatkowych pęcherzyków powietrza). Alternatywnie, strzykawkę można napełnić, wkładając ją do bufora i szybko przesuwając tłok w górę i w dół, aby szybko usunąć większość pęcherzyków.

Gdy strzykawka jest napełniona i pozbawiona pęcherzyków, igła i rurka są dołączane i napełniane buforem. Należy również zachować szczególną ostrożność podczas napełniania strzykawki, ponieważ powietrze może łatwo zostać uwięzione w plastikowej części igły. Jeśli powietrze zostanie uwięzione, wymienić igłę. Alternatywnie, wstępne napełnienie igły płynem, np. za pomocą pipety, może złagodzić problem.

Gdy wszystkie komponenty są na miejscu, rurka może być podłączona do urządzenia, zaczynając od rurki łączącej elektromagnes i zawór na chipie (Rysunek 2A-C,J). Rurka ta jest początkowo wypełniona wodą dejonizowaną, a system jest pod ciśnieniem, aby usunąć całe powietrze z kanału zaworu ślepego zaułka. PDMS jest przepuszczalny dla gazów; w ten sposób podwyższone ciśnienie wepchnie całe powietrze z kanału do PDMS, pozostawiając kanał zaworu wypełniony wodą. Proces ten można śledzić pod mikroskopem, upewniając się, że cały kanał zaworu jest wypełniony. Po napełnieniu zaworu można podłączyć dopływ bakterii, a urządzenie można napełnić i zwiększyć ciśnienie, blokując wszystkie otwarte wloty / wyloty (Rysunek 2D, E, K, L). Powietrze jest wypierane, a proces można monitorować pod mikroskopem. Gdy całe powietrze zostanie wyparte, bakterie powinny równomiernie wypełnić urządzenie. Kołki blokujące są usuwane, a rura do zbierania odpadów jest podłączona (Rysunek 2F,G,M). W tym momencie niewielka ilość płynu powinna przepłynąć przez urządzenie do rurki do zbierania odpadów, upewniając się, że wszystkie połączenia z rurką są otwarte. Można to wizualnie potwierdzić przed podłączeniem rurki do rurki zbiorczej. Jeśli do rurki zbierającej odpady nie przepływa ciecz, prawdopodobnie jest ona zablokowana. Spowodowałoby to wzrost ciśnienia w trakcie eksperymentu, co negatywnie wpłynęłoby na uwięzione zwierzęta. Jeśli rurka lub jej połączenia są zablokowane, wyjmij ją i wyczyść wszystkie połączenia za pomocą igły lub przepłucz je strzykawką wypełnioną wodą.

Na koniec, rurka ślimakowa może zostać podłączona (Rysunek 2H,N). Robaki są zbierane z probówki wirówkowej po prostu poprzez zassanie ich do rurki dołączonej do strzykawki wypełnionej S-Basal. Zwierzęta powinny być wciągane wyłącznie do rurki, a nie do strzykawki. Rurkę można następnie podłączyć do urządzenia. Wcześniej niewielka ilość płynu jest wypychana z urządzenia i rurki ślimakowej, a dwie kropelki są połączone w taki sposób, aby podczas ładowania powietrze nie było wpychane do urządzenia.

Ładowanie robaka
Po wykonaniu wszystkich połączeń zwierzęta można ładować, popychając i ciągnąc za tłok strzykawki ślimakowej. Zwierzęta będą spłukiwane od wlotu w kierunku układu kanałów pułapek; Jednak w naturalny sposób będą pływać pod prąd, którego doświadczają. W związku z tym zwierzęta muszą być przeorientowane z głową skierowaną w stronę kanału pułapki. Prawidłowa orientacja zwierzęcia odbywa się poprzez popychanie i ciągnięcie tłoka oraz danie zwierzętom czasu na obrócenie się do pożądanej orientacji. Można to prawie osiągnąć na zasadzie pojedynczego robaka, ale będzie to wymagało pewnej praktyki. Gdy zwierzęta są już prawidłowo zorientowane, można je wepchnąć do kanału pułapki i przesunąć do końca kanału, gdzie zatrzymuje je stopień wysokości (Rysunek 1A,B). Jeśli zwierzęta nie mogą wejść do kanału, są zbyt duże dla wybranego urządzenia i muszą być zobrazowane w większym urządzeniu. Jeśli zwierzęta mogą się obracać lub obracać po umieszczeniu w kanale pułapki, są zbyt młode i należy użyć mniejszego urządzenia lub pozostawić zwierzęta do wzrostu na kilka godzin.

Co ważne, zwierzęta w różnych kanałach nie będą na siebie wpływać. W związku z tym zwierzęta załadowane nieprawidłowo nie wpłyną na te załadowane prawidłowo, jednak nie będą miały wystarczającego dostępu do pożywienia i dlatego będą rosły wolniej lub zahamują rozwój.

Jeśli zwierzęta są załadowane w odpowiednim wieku, powinien wystąpić minimalny ruch wzdłuż osi kanału podłużnego. Jednak zwierzęta mogą się swobodnie poruszać (Rysunek 1B) i rozpocząć żerowanie w ciągu kilku minut. Jeśli zwierzęta wykazują znaczny ruch wzdłuż osi kanału podłużnego, jest to prawdopodobnie spowodowane wzrostem ciśnienia w urządzeniu lub pęcherzykiem powietrza utkwionym gdzieś w rurce, igle lub strzykawce. Wzrost ciśnienia w urządzeniu można uwolnić, delikatnie odłączając rurkę ślimakową od igły i delikatnie ją ponownie zakładając. Jeśli pęcherzyk powietrza pozostał w systemie pomimo wyżej wymienionych kroków i środków ostrożności, może być konieczne usunięcie całej strzykawki ślimakowej i zastąpienie jej nową bez pęcherzyków powietrza. Pęcherzyki powietrza w systemie działają jak sprężyny, które są ściskane podczas załadunku i powoli uwalniane po załadowaniu zwierząt. Przepływ wytwarzany przez rozszerzające się pęcherzyki powietrza może powodować niestabilność systemu, wypychając zwierzęta z kanałów pułapek.

Akwizycja i rozwój obrazu na chipie
Wreszcie, po załadowaniu zwierząt, można rozpocząć akwizycję obrazu. Zasadniczo urządzenia są kompatybilne z większością metod obrazowania, jasnym polem, epifluorescencją^18,19,22,23(Rysunek 4), konfokalna dysk wirująca^19, a nawet modalności superrozdzielczości (AiryScan²⁴), ponieważ całe obrazowanie odbywa się przez szkło nakrywkowe o grubości 170 μm. W związku z tym urządzenie mikroprzepływowe wykazuje niewielki lub żaden wpływ na osiągalną jakość obrazu w układzie scalonym. Jednak odpowiednie warunki obrazowania, które nie mają wpływu na żywotność zwierząt, muszą być wybrane niezależnie od metody obrazowania. Wysoka intensywność wzbudzenia łatwo spowoduje bielenie fluoroforu i zatrzymanie rozwoju z powodu wysokiej energii i ciepła przekazywanego na próbkę. Zalecane są krótkie czasy naświetlania (~10 ms) i niskie intensywności wzbudzenia (mniej niż 10% typowego fluorescencyjnego źródła LED), co daje użyteczny obraz przy ustawieniu kontrastu min = 0 i max = 1000 (przy użyciu kamery 16-bitowej) (Rysunek 4).

Reprezentatywne dane uzyskane za pomocą urządzeń L1, L1-4 i L2-A są pokazane w Rysunek 4. Pokazanie rozwoju komórek nabłonkowych C. elegans od wylęgu/nocnego głodu do środkowego stadium larwalnego L2 (Rysunek 4A, film uzupełniający 1), indukcja komórek prekursorowych sromu z losem 1° i ich późniejsze podziały od późnego stadium L1 do wczesnego stadium larwalnego L4 (Rysunek 4B, film uzupełniający 2) i wreszcie powstanie C. elegans srom od wczesnego stadium larwalnego L3 do ewersji w momencie przejścia do dorosłości (Ryc. 4C, film uzupełniający 3).

Każdej aplikacji towarzyszy kwantyfikacja różnych wskaźników czasu rozwoju. Obrazy w klasie Rysunek 4A,B są pokazane bez żadnego zastosowanego przetwarzania końcowego, tzn. nie zastosowano żadnej dekonwolucji ani rejestracji obrazu. Obrazy w Rysunek 4C, z drugiej strony, zostały zdekonwoluowane²⁷ i zarejestrowane, podkreślając poprawę jakości obrazu możliwą do uzyskania przy długotrwałym korzystaniu z urządzeń do obrazowania.

Po pierwsze, identyfikując początek każdego podziału komórek szwu u u zwierząt pokazanych w Rysunek 4A (zobacz Dodatkowy Film 1 dla kursu w pełnym wymiarze godzin), wskazując na konsekwentny i terminowy podział wszystkich komórek u 12 zwierząt (Rysunek 4D). Za pomocą komórek szwu oceniono również ogólny czas rozwoju we wszystkich czterech stadiach larwalnych i stwierdzono, że wszystkie podziały komórek szwu zostały zakończone po 12,0 h ± 1,7 h (średnia ± SD) w L1 (n = 22), 10,2 h ± 1,0 h w L2 (n = 27), 10,9 h ± 1,4 h w L3 (n = 27), i 14,6 h ± 2,2 h u zwierząt L4 (n = 19). Dane te są zgodne z wartościami literaturowymi^2,28, a także wartościami zmierzonymi u zwierząt hodowanych na talerzu, dały medianę czasów rozwoju dla L1 15 h (n = 21), L2 10 h (n = 15), L3 12 h (n = 21) i L4 12,5 h (n = 61) (Na podstawie Berger et al.¹⁸). Zaobserwowane niewielkie opóźnienia są prawdopodobnie konsekwencją akwizycji obrazu i wynikającej z tego fototoksyczności lub zwiększonego zamknięcia, gdy zwierzęta dorosną i znajdą kanał pułapki.

Po drugie, obserwowaliśmy wzrost zwierząt na wszystkich etapach L2 i L3, określając ilościowo długość gonad jako doskonały wskaźnik postępu rozwoju (Rysunek 4E, zobacz Dodatkowy Film 2 dla kursu w pełnym wymiarze godzin). Podobnie jak w przypadku podziału komórek szwowych, dokładną długość gonad można było zmierzyć dzięki prostej orientacji zwierzęcia i stwierdzono stały wzrost gonad u wszystkich obrazowanych zwierząt (n = 19). Pierwszy podział VPC w tych doświadczeniach obserwowano 14,26 h ± 2,47 h po rozpoczęciu eksperymentu (~30 h po wysiewie), a drugi nastąpił 1,46 h ± 0,13 h później (n = 19). Dane te są zgodne z wartościami literaturowymi ustalonymi na płytach NGM^29,30. Euling i Ambros³⁰ stwierdzili, że pierwszy podział nastąpił po około 29 godzinach, a drugi około 3 godziny później.

Na koniec, czas, do którego osiągane są określone etapy rozwoju sromu, został określony ilościowo (Rysunek 4F, zobacz film uzupełniający 3 dla kursu w pełnym wymiarze godzin), w szczególności oceniając czas potrzebny do przejścia od etapu inwazyjnego (L4.0, t1) do środkowego etapu L4 (L4.5, t4) zgodnie z podetapami zdefiniowanymi przez Mok et al.³¹. Średni czas progresji między t1-t2 wynosił 3,8 h ± 1,2 h, między t2-t3 wynosił 3,5 h ± 1,2 h, a między t3-t4 wynosił 2,8 h ± 1,6 h (n = 7), co wskazuje w przybliżeniu na liniową progresję rozwojową. Podobnie jak w teście czasu rozwoju, czasy te, szczególnie t1-t2, wydają się nieco opóźnione w porównaniu z wartościami podawanymi w literaturze (t1-t2: 0,7 h, t2-t3: 3 h, t3-t4: 2,3 h³¹), prawdopodobnie ze względu na wąskie wymiary urządzenia spowalniające linienie. Niemniej jednak czas rozwoju pozostaje wysoce spójny wśród zwierząt i wszystkie z powodzeniem przechodzą do dorosłości.

Kompensacja ruchu zwierząt i dryfu mikroskopu
Ruch zwierząt w pojedynczym stosie Z jest zwykle minimalny, gdy uruchamiany jest zawór w układzie scalonym. Nie oczekuje się jednak, że zwierzęta pozostaną całkowicie nieruchome. Szczątkowy jitter obserwowany w pojedynczym stosie można skompensować, zwiększając ciśnienie w celu uruchomienia zaworu w układzie scalonym, skracając używany czas ekspozycji lub zwiększając wybrany krok Z w celu przyspieszenia akwizycji stosu. Czas akwizycji stosu można dodatkowo skrócić, stosując piezoelektryczny napęd Z, co skutkuje znacznie szybszym ruchem Z w porównaniu z konwencjonalnym napędem ostrości mikroskopu, lub wykorzystując filtry wielopasmowe (np. GFP/mCherry), dzięki czemu można uzyskać oddzielne kolory bez konieczności czasochłonnej wymiany filtrów. Dla porównania, w podanych przykładach (Rysunek 4 i Dodatkowy film 1, Dodatkowy film 2 i Dodatkowy film 3), czas akwizycji stosu wynosił zwykle od 3 do 8 sekund. W razie potrzeby ruch szczątkowy można również usunąć za pomocą różnych metod rejestracji obrazu.

Oczekuje się, że liczba zwierząt na chipie będzie stale rosła. W związku z tym interesujące cechy nieuchronnie przesuną się wzdłuż osi kanału podłużnego (Rysunek 4A,B, Film uzupełniający 1 i Film uzupełniający 2). W związku z tym zaleca się ustawienie pola widzenia obrazowania w taki sposób, aby interesująca cecha mogła przekształcić się w pole widzenia i nie została utracona w trakcie eksperymentu (Rysunek 1B i Rysunek 4A,B). Alternatywnie, zwierzęta mogą być obrazowane w wielu sąsiadujących ze sobą FOV, obejmujących całe ciało zwierzęcia. Może to jednak powodować dodatkową fototoksyczność i stres. Podobnie jak w przypadku Z-motion, różne procedury rejestracji mogą z czasem kompensować ruch zwierząt w kanale. Jeśli zwierzęta wykazują nieregularny ruch wzdłuż osi podłużnej, większy niż ten, który można przypisać wzrostowi, prawdopodobnie jest to spowodowane pęcherzykiem powietrza.

Każde urządzenie do długoterminowego obrazowania zawiera sześć indywidualnych jednostek obrazowania, z których każda może być użyta do osobnego eksperymentu. Każda jednostka może pomieścić do 41 zwierząt, a kanały pułapek są rozmieszczone w taki sposób, że wiele zwierząt może być obrazowanych w jednym polu widzenia. Dodatkowo, wiele fov może być obrazowanych w jednym urządzeniu lub urządzeniu. Podobnie jak w przypadku wszystkich próbek mikroskopowych, ruch po powierzchni próbki może powodować dryft ostrości z powodu utraty mediów immersyjnych. Ten dryft można skompensować za pomocą olejku immersyjnego o niższej lepkości lub za pomocą różnych metod autofokusa. Jednak niektóre sprzętowe systemy autofokusa mogą nie działać, gdy są używane z urządzeniem mikroprzepływowym PDMS, ponieważ wykorzystują one przejście ze szkła do ośrodka wodnego jako punkt odniesienia (strona próbki szkła nakrywkowego). Duża część pola widzenia jest wypełniona silikonem w urządzeniu, który ma wyższy współczynnik załamania światła niż woda; Chociaż nie wpływa to na jakość obrazu, może negatywnie wpłynąć na autofokus. Podczas obrazowania pojedynczego pola widzenia dryft ostrości obserwowany w urządzeniu jest minimalny (mniej niż 2 μm). Jeśli zaobserwuje się nadmierny dryft ostrości, może to wynikać z niestabilności termicznej systemu mikroskopu lub otoczenia, nadmiernego ruchu XY powodującego wiele pól widzenia lub nieprawidłowego montażu urządzenia na mikroskopie (patrz Rysunek 3A dla sugerowanych mechanizmów montażu).

Podobnie, nadmierny ruch XY i niewłaściwe montowanie mogą również skutkować dryfem XY. Ponieważ urządzenie i obiektyw mikroskopu są połączone za pomocą cieczy zanurzeniowej, szybkie ruchy w osi X, Y lub Z mogą powodować przyłożenie sił do urządzenia. Jeśli urządzenia są prawidłowo zamontowane i nie działają na nie żadne siły zewnętrzne, są wyjątkowo stabilne, z minimalnym dryftem ostrości i brakiem dryftu XY.

Na koniec, jeśli określone parametry systemu są nieodpowiednie, urządzenia mikroprzepływowe PDMS mogą negatywnie wpłynąć na rozwój zwierząt. Na żywotność ma wpływ nadmierne ciśnienie w zaworze, wysoka fototoksyczność wynikająca z dużej intensywności wzbudzenia, długie czasy ekspozycji lub krótkie odstępy czasu między nabyciem komina. Szczególnie przy pierwszym użyciu tego systemu zdecydowanie zaleca się ocenę żywotności zwierząt za pomocą jasnego markera fluorescencyjnego lub obrazowania w jasnym polu, upewniając się, że warunki obrazowania nie wpływają na wzrost zwierząt. Gdy zwierzęta rozwijają się niezawodnie, parametry obrazowania można zmieniać w zależności od potrzeb.

Rysunek 1: Układ urządzenia i schematyczne działanie. (A) Przegląd urządzenia pokazujący pojedynczą jednostkę z wlotem robaka (i), wlotem pokarmu bakteryjnego (ii) i ogólnym wylotem (iii). (A') Powiększony widok kanału pułapki w urządzeniu L2-A, podkreślający liczbę robaków widocznych w jednym polu widzenia przy różnych powiększeniach (40x-100x). (B) Zasada działania zaworu w układzie scalonym. Gdy opcja jest wyłączona, wysokość kanału jest wybierana tak, aby zwierzęta mogły wygodnie zmieścić się w kanale pułapki. Po włączeniu wysokość kanału zmniejsza się, dociskając zwierzę do szkła nakrywkowego, odwracalnie unieruchamiając w ten sposób uwięzione zwierzęta. Zdjęcia pokazują dwa uwięzione zwierzęta na chipie z przejętymi z wyłączonym zaworem na chipie i z włączonym zaworem, ze zwierzętami widocznie prostującymi się i wydłużającymi pod ciśnieniem. Górne zwierzę załadowane prawidłowo i skierowane w stronę źródła pożywienia (), a dolne skierowane w stronę (X). (C-C") Schemat konfiguracji urządzenia. (C) Dostępne rozmiary urządzeń. L1 jest odpowiedni dla zwierząt od L1 do połowy stadium L2, L1-4 dla zwierząt od środkowego stadium larwalnego L2 do połowy L4, a L2-A dla zwierząt od środkowego stadium larwalnego L2 do dorosłości. Podziałka wynosi (A) 1000 μm, (B) 100 μm i (C) 50 μm. Rysunek jest częściowo zaadaptowany z Berger et al.¹⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Konfiguracja urządzenia i połączenia. (A-I) Schematyczny przegląd procesu konfiguracji. (A) Podłączenie rurki wypełnionej wodą 1/16" do wlotu zaworu za pomocą wydrążonego stalowego kołka (szarego), z drugim końcem przymocowanym do układu zasilania ciśnieniem. (B) Napełnienie zaworu hydraulicznego na chipie za pomocą elektrozaworu poza chipem i zwiększenie ciśnienia w urządzeniu przez kilka minut. (C) Dezaktywacja ciśnienia przed przejściem do następnych kroków. (D) Podłączenie strzykawki zawierającej pokarm bakteryjny do wlotu pokarmu za pomocą rurki 1/32" i igły 30 G, a następnie napełnienie urządzenia do momentu pojawienia się płynu na obu otwartych połączeniach. (E) Uszczelnienie wlotu i wylotu ślimaka stalowymi kołkami zablokowanymi kawałkiem rurki 1/16" () i zwiększanie ciśnienia w urządzeniu za pomocą strzykawki z jedzeniem i pompy (poprzez regulację śrubą skrzydełkową), utrzymując ciśnienie przez kilka minut. (F) Wyjęcie zatyczek z (E), upewniając się, że przy każdym otwartym połączeniu tworzą się kropelki cieczy. (G) Podłączenie pojemnika na odpady za pomocą krótkiego odcinka rurki 1/16" i wydrążonego stalowego kołka. (H) Przymocowanie strzykawki wypełnionej buforem do urządzenia za pomocą wydrążonego stalowego kołka i igły 23 G. Robaki są wciągane do rurki przed podłączeniem jej do urządzenia, upewniając się, że nie jest wprowadzane powietrze poprzez wyrównanie kropelek cieczy na wlocie i końcu rurki. (I) Ostateczna konfiguracja po nawiązaniu wszystkich połączeń urządzeń. (J) Zdjęcie urządzenia z rurką zaworu podłączoną do wlotu i elektrozaworu (tło), odpowiadające (A-C). (K) Powiększony widok urządzenia z dołączonym wężem doprowadzającym żywność, pokazujący dwie kropelki cieczy (strzałki) na wlocie ślimaka i wylocie odpadów, odpowiadające (D). (L) Powiększony widok urządzenia z podłączonym przewodem doprowadzającym żywność oraz zablokowanym wlotem i wylotem ślimaka, co odpowiada (E). (M) Powiększony widok urządzenia z dołączonym przewodem odpływowym i pojemnikiem, odpowiadający (G). (N) Montaż końcowy ze wszystkimi połączeniami przewodów na miejscu, odpowiadającymi (I). Częściowo zaadaptowane z Berger et al.¹⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Konfiguracja sprzętu. (A-A') Sugerowany montaż urządzenia. (A) Możliwy montaż do mikroskopu pionowego. Urządzenia są przymocowane do prostokątnej, wydrukowanej w 3D ramy z dużym centralnym wycięciem. Dwa małe paski taśmy dwustronnej są początkowo umieszczane na szkle nakrywkowym, po obu stronach części urządzenia PDMS. Ramka wydrukowana w 3D jest następnie umieszczana nad urządzeniem, tak aby część PDMS wystaje przez wycięcie, a ramka jest mocno dociśnięta do taśmy dwustronnej, trwale mocując urządzenie do ramy. W związku z tym rama utrzymuje urządzenie w bezpieczny sposób i sama jest utrzymywana na stoliku mikroskopu za pomocą magnesów osadzonych w ramie i wkładce stolika. Zapewnia to stabilne mocowanie urządzenia i zapobiega kolizji obiektywu mikroskopu z jakimkolwiek elementem montażowym. Wszystkie rurki są poprowadzone z przodu urządzenia. (A') Możliwy montaż do mikroskopu odwróconego. Zestaw zacisków mocno trzyma urządzenie. Upewnij się, że zaciski dociskają urządzenie do wkładki stolika, aby zapobiec ruchowi XY podczas pracy. (B) Widok części układu ciśnieniowego. (i) rurka poliuretanowa o średnicy zewnętrznej 6 mm podłączona do źródła ciśnienia. (ii) Adapter wtykowy G1/8 do 6 mm łączący rurkę (i) z regulatorem ciśnienia (iii). Rurka jest następnie podłączana do elektromagnesu (vi) za pomocą adaptera wciskanego M5 do 6 mm (v), a na koniec rurka jest podłączana do złącza luer-lock-to-barb (vii) i igły 23 G (viii) do rurki o średnicy zewnętrznej 1/16" podłączonej do urządzenia mikroprzepływowego. (C) Schematyczny przegląd połączeń elektronicznych i zmontowanego systemu ciśnieniowego. (i) Wyzwalacz TTL (+3,3-5 V) generowany przez Arduino, kartę DAq lub dowolny inny mikrokontroler, wraz z odpowiednim zasilaczem (ii, 24 VDC) jest podłączony do tranzystora MOSFET (iii) i elektronicznych połączeń elektrozaworu, jak pokazano na schemacie, z diodą flyback (iv) podłączoną do połączeń zasilania elektrozaworów. Po wysłaniu sygnału TTL z mikrokontrolera do bramki MOSFET, +24 VDC jest podawane do normalnie zamkniętego elektrozaworu, a zawór hydrauliczny w układzie scalonym jest nadmuchiwany. Po usunięciu sygnału TTL ciśnienie jest zwalniane, a zawór hydrauliczny na chipie opróżniany. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki. (A) Zwierzę wykazujące wytwarzanie połączeń nabłonkowych (ML2615, dlg-1(mc103[dlg-1::gfp])) rozwijające się od nocnego głodu do wczesnego/środkowego stadium larwalnego L2, przy użyciu urządzenia L1. Widoczne są dzielące się komórki szwu, a także komórki P, które migrują i dzielą się w kierunku późnego stadium larwalnego L1. (B) Zwierzę rozwijające się od późnego stadium larwalnego L1 do wczesnego stadium L4, przy użyciu urządzenia L1-4. Widoczny jest marker komórki prekursorowej sromu (VPC) z losem 1° (AH1187, arIs92[egl-17::cfp]), z pojedynczą komórką widoczną na początku eksperymentu, po której następują dwie rundy widocznych podziałów komórkowych w stadium larwalnym L3. (C) Zwierzęta rosnące od późnego stadium larwalnego L2 do wczesnej dorosłości, przy użyciu urządzenia L2-A. Widoczny jest twórca połączeń nabłonkowych (AH5786, hmr-1(cp21[hmr-1::gfp + LoxP])), podkreślający rozwijającą się tkankę sromu tworzącą wyraźne struktury toroidalne, oraz połączony obraz z markerem komórki kotwiczącej macicy (AC) (AH5786, qyIs50[Pcdh-3>mCherry::moeABD, unc-119(+)]), która atakuje tkankę sromu pod koniec stadium larwalnego L3, łącząc tkanki. We wszystkich eksperymentach (A-C) pole widzenia jest początkowo ustawiane w taki sposób, że widoczna jest tylko część zwierząt. W miarę postępu eksperymentu zwierzę będzie wypełniać większą część kanału, a cechy przesuwają się wzdłuż osi kanału w wyniku wzrostu zwierzęcia. (D) Czas, w którym poszczególne podziały komórek szwu zaczynają się dzielić w stadium larwalnym L1 (n = 12). Wstaw podświetla tożsamości komórek szwu (H1-V6) wzdłuż przedniej i tylnej osi ciała. (E) Pokazuje wzrost gonad w czasie u zwierząt w Rysunek 4B (n = 19). (F) Pokazuje czas potrzebny do osiągnięcia 4 odrębnych punktów czasowych rozwoju w morfogenezie sromu (t1-t4), wskazując na spójne przejście dla wszystkich zobrazowanych zwierząt (n = 7). Podziałki wynoszą (A,B) 50 μm i (C) 25 μm. Zobacz Film Uzupełniający 1, Film Uzupełniający 2 i Film Uzupełniający 3 dla kursu w pełnym wymiarze godzin. Wykresy pudełkowe przedstawiają wartości mediany (czerwone linie) z górnymi i dolnymi kwartylami oraz słupkami wskazującymi skrajności rozkładu, z wyłączeniem wartości odstających. Rysunek został zaczerpnięty z Berger et al.¹⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowy film 1: Pojedyncza larwa C. elegans rozwija się od nocnego głodu do wczesnego stadium L2. Wyświetlane są obrazy epifluorescencyjne o maksymalnej intensywności projekcji (całkowita wysokość projekcji wynosi 1,5 μm), w innym nieprzetworzonym formacie. Widoczne są wszystkie zdarzenia podziału komórek szwu i fuzji zachodzące na określonym etapie (u góry). Cechy są zaznaczone za pomocą znacznika DLG-1::GFP (połączenie nabłonkowe) w odstępach 15-minutowych, co daje łącznie 25 godzin. Film został ponownie wykorzystany z Berger et al.¹⁸. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dodatkowy film 2: Pojedyncza larwa rozwijająca się od późnego stadium L1 do wczesnego stadium L4, wyrażająca marker EGL-17::CFP (komórka prekursorowa sromu o losie 1° (VPC)). We wczesnym L2 (~400 min) fluorescencja EGL-17::CFP objawia się w P6.p, stale zwiększając swoją intensywność. Podczas L3 P6.p przechodzi dwie kolejne rundy podziału, tworząc 1-komórkowe, 2-komórkowe i 4-komórkowe etapy rozwoju sromu. Obrazy są wyświetlane w odstępach 30-minutowych, co daje łącznie 34 godziny. Film został ponownie wykorzystany z Berger et al.¹⁸. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dodatkowy film 3: Widok z góry: Projekcja Z rozwijającego się sromu od etapu L3 do przejścia L4/dorosły. Widok z dołu: projekcja X tego samego sromu w czasie. Oba widoki pokazują początkowy podział VPC, po którym następuje wgłębienie, uformowanie i powiększenie toroidów, a następnie zapadnięcie się podczas wywinięcia. Obrazy epifluorescencyjne są wyświetlane po przycięciu, dekonwolucji, pasowaniu i projekcji. Cechy są przedstawione za pomocą markera HMR-1::GFP (tkanka podskórna i VPC) oraz markera mCherry::moeABD (określającego AC). Film został ponownie wykorzystany z Berger et al.¹⁸. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Plik uzupełniający 1: Plik CAD dla urządzenia L1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: plik CAD dla urządzenia L1-4. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Plik CAD dla urządzenia L2-A. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Plik CAD dla urządzenia L3-A. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Plik CAD dla urządzenia L4-A. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: Plik CAD dla struktury dystrybucji żywności. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 7: Plik CAD dla warstwy zaworu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W artykule opisano działanie unikalnej mikroprzepływowej platformy do długoterminowego obrazowania, która nadaje się do obrazowania w wysokiej rozdzielczości i śledzenia różnych procesów rozwojowych u C. elegans podczas wszystkich czterech stadiów larwalnych do wczesnej dorosłości¹⁸. Możliwość śledzenia procesów rozwojowych w czasie in vivo, przy użyciu tej i innych metod obrazowania, stała się nieodzowna w wielu dziedzinach badań nad C. elegans i pozwoliła na znalezienie odpowiedzi na wcześniej niedostępne pytania 23,24,29.

W przeciwieństwie do tradycyjnych metod obrazowania wykorzystujących podkładki agarowe i wcześniej opublikowanych długoterminowych strategii obrazowania opartych na mikroprzepływach, podejście to zachowuje tożsamość i orientację robaka przez cały czas trwania eksperymentu, umożliwiając śledzenie złożonych procesów rozwojowych w czasie. Niezależnie od etapu rozwoju, zwierzęta są zamknięte w jednym z 41 równoległych kanałów pułapek, z których każdy jest podłączony do wbudowanego źródła pożywienia i pokryty dużym zaworem hydraulicznym. Unieruchomienie wszystkich uwięzionych robaków następuje poprzez napompowanie zaworu hydraulicznego, dociskanie ślimaków do szkła osłonowego tylko podczas akwizycji obrazu. Obrazowanie o wysokiej przepustowości jest możliwe dzięki wąsko rozmieszczonemu układowi kanałów pułapek, z wieloma zwierzętami widocznymi w jednym polu widzenia. Długoterminowe urządzenia do obrazowania są kompatybilne z większością konfiguracji mikroskopów, wymagają minimalnego dodatkowego sprzętu (mniej niż 1000 USD) i nie wymagają modyfikacji istniejącego sprzętu. Obsługa urządzeń jest celowo prosta, więc wszyscy użytkownicy powinni szybko być w stanie się jej nauczyć, postępując zgodnie z powyższym protokołem i przedstawionymi wynikami.

Krótko mówiąc, zwierzęta mogą być obrazowane na chipie w maksymalnie 2,5 stadium larwalnym (ryc. 1C). Zwierzęta są wstępnie synchronizowane i albo bezpośrednio ładowane na chip (urządzenie L1), albo wysiewane na płytkę NGM do pożądanego etapu rozwoju (urządzenia L1-L4 i L2-A). Zwierzęta na chipie są karmione za pomocą wysoce skoncentrowanej zawiesiny bakteryjnej i unieruchamiane za pomocą wbudowanego zaworu hydraulicznego uruchamianego przez oprogramowanie do obrazowania (rysunek 1B). Zwierzęta są manewrowane do kanałów pułapki za pomocą strzykawki, ostrożnie ustawiając zwierzęta z głową w kierunku źródła pożywienia, a na koniec łapiąc zwierzęta na końcu kanału pułapki (Rysunek 1A i Rysunek 2). Należy zachować ostrożność, aby powietrze nie zostało uwięzione w strzykawkach, igłach i rurkach, ponieważ pęcherzyki powietrza łatwo zakłócą pozycję zwierzęcia. Urządzenia są kompatybilne z większością metod obrazowania 18,19,24, ponieważ materiał PDMS jest wysoce przezroczysty, niefluorescencyjny i uszczelniony na cienkim szkle nakrywkowym (Rysunek 4, Film uzupełniający 1, Film uzupełniający 2 i Film uzupełniający 3). Należy jednak zachować ostrożność przy wyborze warunków obrazowania, ponieważ długie czasy naświetlania i wysoka intensywność wzbudzenia łatwo wpływają na żywotność zwierząt i powodują fotowybielanie.

Oprócz przedstawionej wersji tej metody obrazowania, możliwe jest już kilka modyfikacji protokołu. Najprostszą modyfikacją jest zastąpienie standardowych szczepów bakterii, np. bakteriami wykazującymi ekspresję RNAi18 lub bakteriami o różnych wartościach odżywczych³². Szczepy bakteryjne można łatwo wymieniać, dostosowując zawartość Optiprep do różnic w gęstości. Podobnie, do pokarmu bakteryjnego można dodać dowolną liczbę związków, np. auksynę, składniki odżywcze lub małocząsteczkowe związki lecznicze, a ich działanie obserwuje się bezpośrednio in vivo, bez konieczności wprowadzania jakichkolwiek zmian w protokole. W szczególności opracowano urządzenie do wymiany pożywek do degradacji białek indukowanej auksyną lub wszelkich zastosowań, które wymagają czasowej lub odwracalnej ekspozycji poprzez dodanie wlotu pokarmu do układu urządzenia bez zmiany geometrii lub działania. Dodatkowy wlot umożliwia proste przełączanie między dwoma różnymi stanami, np. auksyna i brak auksyny, podłączonymi do urządzenia w taki sam sposób, jak pokazano tutaj dla jednego źródła żywności, a wynikające z tego zmiany są obserwowane bezpośrednio. Opracowano również warianty urządzeń, w których zawór hydrauliczny nie jest współdzielony przez wszystkie jednostki w urządzeniu, ale oddzielony dla każdej jednostki, tak aby można było obrazować wiele warunków w tym samym urządzeniu i eksperymentować indywidualnie, zmniejszając potencjalnie szkodliwe skutki długiego czasu uruchamiania zaworu i akwizycji. Wreszcie, poza oryginalnymi wariantami urządzenia opisanymi w Berger i ^wsp.18, opracowano dwa nowe warianty urządzenia, L3-A i L4-A (wprowadzone tutaj), umożliwiające obrazowanie od połowy etapu L3 lub połowy L4 do dorosłości. Celem tych modyfikacji jest opóźnienie czasu rozpoczęcia eksperymentu do późniejszego stadium larwalnego, tak aby większe zwierzęta mogły być ładowane do zastosowań, w których wcześniejsze stadia rozwojowe nie są interesujące.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zawór elektromagnetyczny 3/2	Distrelec	154-22-898 i 154-22-899	Alternatywa dla powyższego. Zawór elektromagnetyczny łączący regulator ciśnienia z zaworem na chipie.
Arduino	Distrelec	301-01-956	Opcjonalny mikrokontroler w zależności od wybranego kontrolera i interfejsu.
Bacto-Tryptone	Thermo Fisher Scientific	211705	do produkcji bulionu L.
Drożdże bakto-drożdżowe	Thermo Fisher Scientific	212750	Do produkcji bulionu L.
igła 23G	Gonano Dosiertechnik	GGA723050	igła łącząca rurkę 1/16" ze strzykawką.
igła 30G	Gonano Dosiertechnik	IG-TE730050	igła łącząca rurkę 1/32" ze strzykawką.
C. elegans Construct 1	NA		AH5786 LGI: hmr-1(cp21[hmr-1::gfp + LoxP]) Marston, D.J. et al. MRCK-1 napędza zwężenie wierzchołkowe u C. elegans, łącząc wzorce rozwojowe z generowaniem siły. Curr. Biol. 26 (16), 2079-2089. 2016.
C. elegans Construct 2	NA		AH1187 LGII: arIs92[egl-17::cfp] Yoo, A.S., Bais, C., Greenwald, I. Przesłuch między szlakami EGFR i LIN-12 / Notch w rozwoju sromu C. elegans. Nauka. 303 (5658), 663-666. 2004.
C. elegans Construct 3	NA		AH5786 LGV: qyIs50[Pcdh-3>mCherry::moeABD, unc-119(+)] Ziel, J.W., Hagedorn, E.J., Audhya, A., Sherwood, D.R. UNC-6 (netrin) orientuje inwazyjną błonę komórki kotwiczącej u C. elegans. Nat. Cell Biol., 11 (2), 183-189. 2009.
C. elegans Construct 4	NA	NA	ML2615 LGX: dlg-1(mc103[dlg-1::gfp]) Vuong-Brender, T.T.K., Suman, S.K., Labouesse, M. Wierzchołkowy ECM zachowuje integralność zarodka i rozkłada naprężenia mechaniczne podczas morfogenezy. Rozwój. 144 (23), 4336-4349. 2017.
	Distrelec	143-46-644	Potrzebny przy wyborze elektrozaworu z distrelec. Przewód łączący elektrozawór z tranzystorem MOSFET.
Chlorotrimetylosilan	Sigma Aldrich	386529-25ML	Silane do pasywacji wafli.
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8667	dla  Produkcja S-Basal.
Dioda Flyback	Distrelec	110-52-628	Dioda Flyback chroniąca mikrokontroler.
Drążony trzpień stalowy	Gonano Dosiertechnik	GGA7R23050	Drążony stalowy trzpień 23G łączący rurkę 1/16" z urządzeniem.
L Rosół	NA	NA	Przygotowany we własnym zakresie według standardowej receptury. 10 g Bakto-trypton, 5 g Drożdże baktologiczne, 5 g NaCl, H2O do 1 litra, pH do 7,0 przy użyciu 1 M NaOH
Urządzenie do obrazowania długoterminowego L1	NA	NA	Urządzenie do długotrwałego obrazowania larw L1 do wczesnych/środkowych larw L2. Wykonane na miejscu, dostępne na zamówienie. Dostępny również w wariancie wymiany mediów.
Urządzenie do obrazowania długoterminowego L1-4	NA	NA	Urządzenie do obrazowania długoterminowego dla larw od środkowego L1 do środkowego L4. Wykonane na miejscu, dostępne na zamówienie. Dostępny również w wariancie wymiany mediów.
Urządzenie do obrazowania długoterminowego L2-A	NA	NA	Urządzenie do obrazowania długoterminowego od połowy L2 do dorosłości (ewersja). Wykonane na miejscu, dostępne na zamówienie. Dostępny również w wariancie wymiany mediów.
Urządzenie do obrazowania długoterminowego L3-A	NA	NA	Urządzenie do obrazowania długoterminowego dla środkowego L3 do dorosłości (ewersja). Wykonane na miejscu, dostępne na zamówienie. Dostępny również w wariancie wymiany mediów.
Urządzenie do obrazowania długoterminowego L4-A	NA		NA Urządzenie do obrazowania długoterminowego dla połowy L4 do dorosłości (ewersja). Wykonane na miejscu, dostępne na zamówienie. Dostępny również w wariancie wymiany mediów.
Bufor M9	NA		NA Przygotowany we własnym zakresie według standardowej receptury.
MOSFET	Distrelec	303-41-391	Tranzystor polowy metalowo-tlenkowo-półprzewodnikowy, używany do przełączania 24VDC wymaganego dla elektrozaworu.
Talerze NGM	NA	NA Przygotowywane	we własnym zakresie według standardowej receptury.
Nylonowy adapter Fisher Scientific 11776048 Luer-Fitting			z rurki OD 6 mm do igły 23G.
Optiprep	Sigma Aldrich	D1556	Ciecz dopasowująca gęstość.
Zestaw elastomerów	PDMS	Ameba	Elastosil RT601A/B
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443	Niejonowy środek powierzchniowo czynny.
Diwodorofosforan potasu	Sigma Aldrich	1.37039	Dla  Produkcja S-Basal.
Wodorofosforan potasu	Sigma Aldrich	1.05099	Dla  Produkcja S-Basal.
Zasilanie 24VDC	Distrelec	301-63-304	Zasilacz 24VDC. Wybierz zasilacz odpowiedni dla wybranego elektrozaworu.
Precyzyjny regulator ciśnienia	Distrelec	154-23-578	Alternatywny do wyższego. Regulator ciśnienia.
Manometr G1/8	Distrelec	154-23-643	Manometr mocuje się do regulatora ciśnienia.
Rurka PU OD 6mm	Distrelec	154-23-866	Rurka łącząca źródło ciśnienia i regulator, a także regulator i zawór elektromagnetyczny.
Złączka wtykowa G1/8 do 6mm	Distrelec	301-69-330	Alternatywna do wyższej. 2x Złączka wtykowa mocowana do regulatora ciśnienia i łącząca się z rurką 6 mm.
Złączka wtykowa M5 do 6 mm	Distrelec	301-69-459	2x Złączka wtykowa mocowana do elektrozaworu i rurki 6 mm.
S-Basal Buffer	NA	NA	Przygotowany we własnym zakresie według standardowej receptury. 5,85 g NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g KH2PO4, 1 ml cholesterolu (5 mg/ml w etanolu), H2O do 1 litra. Sterylizuj w autoklawie.
Chlorek sodu	Sigma Aldrich	S9625	do produkcji bulionu L i S-Basal.
Wodorotlenek sodu (5M)	Sigma Aldrich	567530	Wodorotlenek sodu stosowany do wybielania C. elegans (przygotować roztwór o stężeniu 5M)
Podchloryn sodu (5%)	Sigma Aldrich	1.05614	Podchloryn sodu stosowany do bielenia C. elegans (przygotować roztwór o stężeniu 5%)
Sitko 10 i mikro; m	pluriSelect	43-10010-40	Alternatywa dla bakteryjnego przygotowywania żywności, zwłaszcza w przypadku stosowania mniejszych urządzeń.
Sitko 5 i mikro; m	pluriSelect	43-10005-40	Sitko służące do filtrowania larw L1 po całonocnej głodówce i bakterii po zakończonym przygotowywaniu posiłków.
SU-8	Gersteltec	GM1050	SU-8 dla wysokości od 1-10 &mikrom.
SU-8	Gersteltec	GM1060	SU-8 dla wysokości od 5-30 &mikrom.
SU-9	Gersteltec	GM1070	SU-8 dla wysokości od 15-200 &mikrom.
Strzykawka 1 ml	Fisher Scientific	11338763	strzykawka 1 ml. W przypadku stosowania innego typu należy upewnić się, że korpus strzykawki i tłok są sztywne, tak aby nie uległy deformacji przez pompę strzykawkową.
Pompa strzykawkowa	WPI	Al1000-220	Pompka strzykawkowa (https://www.wpiinc.com/var-2300-aladdin-single-syringe-pump.html).
Tubka 15 ml	Fisher Scientific	50-809-220	Probówka służąca do wybielania robaków i preparatu bakteryjnego.
Probówka 2 ml	Fisher Scientific NC1186931		Probówka służąca do preparatu robaków i bakterii.
Probówka 50 ml	Fisher Scientific	50-465-232	Probówka służąca do przygotowania i rozwoju bakterii.
Pęseta SMD	Brü tsch Rü jajko Werkzeuge	448980	Pęseta służąca do podłączania rurki 1/32" do urządzenia.
Rurka Tygon 1/16"	Fisher Scientific	642002	Elastyczna rurka o średnicy zewnętrznej 1/16" łącząca większość komponentów z urządzeniem.
Rurka Tygon 1/32"	Fisher Scientific	641900	Elastyczna rurka o średnicy zewnętrznej 1/32" łącząca dopływ bakterii do urządzenia.
UV KUB-3	Kloe	NA	Nakładka na maskę i system ekspozycji UV.
Wafel	Siegert Wafel	4P0/>1/525± 25/TPK/TTV< 10	Wafel krzemowy.
Pojemnik na odpady	NA	NA	Przygotowany we własnym zakresie przy użyciu probówki o pojemności 2 ml lub fiolki kriogenicznej i wydrążonych stalowych kołków.