Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje obrazowanie poklatkowe C. elegans oparte na mikroprzepływach w całym rozwoju postembrionalnym.

Streszczenie

Caenorhabditis elegans stał się jednym z najlepiej zbadanych i najlepiej zrozumianych modeli zwierzęcych w biologii. Trzy cechy są kluczem do sukcesu C. elegans jako organizmu modelowego: jego niezmienna linia komórkowa, przezroczystość i podatność genetyczna. Dzięki temu idealnie nadaje się do różnorodnych badań mikroskopowych bezpośrednio in vivo. Żywe larwy i dorosłe osobniki C. elegans często muszą być unieruchomione podczas pozyskiwania obrazu. Tradycyjne metody unieruchomienia niekorzystnie wpływają na rozwój zwierząt, zwłaszcza w zastosowaniach obrazowania poklatkowego. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół konfiguracji i obsługi nowatorskiej metody obrazowania mikroprzepływowego, który odnosi się do ograniczeń związanych z tradycyjną immobilizacją opartą na agarze i innymi strategiami mikroprzepływowymi. Takie podejście umożliwia jednoczesne obrazowanie na żywo w różnych stadiach larwalnych przy jednoczesnym zachowaniu orientacji i tożsamości robaka w czasie. Aby to osiągnąć, stosuje się mikroprzepływowy układ kanałów pułapek, którego geometria jest precyzyjnie zaprojektowana tak, aby utrzymać stabilną orientację robaka, jednocześnie dostosowując się do wzrostu i linienia. Unieruchomienie jest ułatwione przez aktywny zawór hydrauliczny, który wywiera nacisk, aby zabezpieczyć ślimaki przy szkle nakrywkowym wyłącznie podczas akwizycji obrazu. Taka konstrukcja umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości przy minimalnym wpływie na żywotność robaków lub czas rozwoju.

Wprowadzenie

C. elegans można przeprowadzić na kilka sposobów, w zależności od zastosowania, pożądanej przepustowości i rozdzielczości. Gdy wymagana jest wysoka rozdzielczość, standardowa metoda wykorzystuje podkładki agarowe^1,2,3, prostą konstrukcję ze szkła podstawowego, agarozy i szkła nakrywkowego. Zwierzęta na tych szkiełkach są unieruchomione przez nacisk wywierany przez szkło nakrywkowe. Unieruchomienie można dodatkowo poprawić poprzez dodanie środków znieczulających, np. lewamizolu lub azydku sodu^1,2, tak aby zwierzęta na podkładkach agarowych były idealnie nieruchome i mogły być obrazowane w wysokiej rozdzielczości, w tym różne metody superrozdzielczości². Niestety, wiadomo, że podkładki agarowe wpływają na postęp rozwoju, a połączenie wysokich ciśnień i środków znieczulających opóźnia rozwój lub powoduje całkowite zatrzymanie rozwoju^4,5.

Oprócz tych standardowych metod, w ostatnich latach pojawiło się kilka metodologii mikroprzepływowych, z których każda ma swoje zalety i wady lub specjalistyczne przypadki użycia6^,7^{,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19}. Na przykład Gritti et al.²⁰ wprowadzili metodę, w której robaki są zamykane w dużych komorach. Zarodki umieszczone w tych komorach rozwijają się i poruszają swobodnie, pozostając jednocześnie w wyznaczonym obszarze zainteresowania pod mikroskopem. Chociaż podejście to jest ogólnie skuteczne, ogranicza się do stosowania jasnych markerów fluorescencyjnych. Niedawno Keil et al.²¹ zaproponowali zmodyfikowaną wersję tej metody, zawierającą wbudowany zawór hydrauliczny do krępowania zwierząt podczas akwizycji obrazu, rozwiązując w ten sposób pewne ograniczenia pierwotnego podejścia. Ponieważ jednak obie metody wykorzystują większe komory niż te używane do uwięzionych robaków, zwierzęta nadal poruszają się i obracają przez cały czas trwania eksperymentu. W rezultacie śledzenie procesów rozwojowych staje się wyzwaniem i wymaga obszernego przetwarzania obrazu w celu skorygowania ruchu zwierząt.

Aby rozwiązać te ograniczenia, dostosowano podejście wprowadzone przez Berger et al.¹⁸ (Rysunek 1), gdzie zwierzęta nie są trzymane w dużej komorze, ale w kanale pułapki zaprojektowanym tak, aby zmieścić zwierzęta w krótszym oknie rozwojowym (do 2,5 stadium larwalnego). W przeciwieństwie do istniejących metod mikroprzepływowych, podejście to pozwala zachować orientację i tożsamość zwierzęcia przez cały czas trwania eksperymentu i umożliwia uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości wielu robaków równolegle i w wielu stadiach larwalnych w jednym urządzeniu.

Zwierzęta są uwięzione za pomocą wyspecjalizowanej geometrii kanału, gdzie wysokość kanału jest zbliżona do grubości zwierzęcia na początku eksperymentu, co zapobiega rotacji. Szerokości i długości kanałów są dobierane tak, aby zwierzęta mogły się poruszać i rosnąć w czasie, ułatwiając linienie i przejście z jednego stadium larwalnego do drugiego. Zrównoleglenie osiąga się po prostu poprzez umieszczenie wielu kanałów pułapek obok siebie, tak aby wiele zwierząt było widocznych w jednym polu widzenia (FOV, Rysunek 1A'), a do 41 zwierząt może być obrazowanych w jednej jednostce urządzenia ( Rysunek 1A). Zwierzęta na chipie są stale zaopatrywane w wysoce skoncentrowaną bakteryjną zawiesinę pokarmową przez kanał o niskiej wysokości, który jednocześnie pomaga uwięzić zwierzęta na końcu układu kanału pułapki (krok wysokości, Rysunek 1A, czerwony). Podobnie jak w przypadku podejścia przyjętego przez Keila i in.²¹, zaimplementowano duży hydrauliczny zawór na chipie, który można napompować podczas akwizycji obrazu, dociskając zwierzęta do szkła nakrywkowego, poprawiając w ten sposób unieruchomienie zwierzęcia (Rysunek 1B). Ograniczenie uruchamiania zaworu hydraulicznego tylko do okresu akwizycji obrazu minimalizuje niekorzystny wpływ na rozwój zwierząt, zapewniając niezawodny rozwój we wszystkich stadiach larwalnych. W przeciwieństwie do metod opisanych przez Gritti et al.²⁰ i Keil et al.²¹, zwierzęta nie mogą być obrazowane w całym rozwoju postembrionalnym w ramach tego samego urządzenia. Zamiast tego wprowadzono pięć odrębnych urządzeń, oznaczonych odpowiednio jako L1, L1-4, L2-A, L3-A i L4-A, obejmujących cały etap L1 i wczesny etap L2, średni późny etap L1 do połowy etapu L4, środkowy późny L2 aż do młodej dorosłości, środkowy koniec L3 do młodej dorosłości i późny L4 do młodej dorosłości (Rysunek 1C), które umożliwiają nieprzerwane obrazowanie dużych części rozwoju postembrionalnego. Takie podejście jest przyjmowane ze względu na duży wzrost wielkości zwierząt od L1 do dorosłości, tak że kanał odpowiedni dla zwierząt L1 byłby o wiele za mały dla dorosłych, co spowodowałoby zatrzymanie rozwoju, a kanał pasujący do dorosłych byłby o wiele za duży dla L1, co spowodowałoby nadmierny ruch, rotację i ucieczkę zwierząt z kanałów pułapek.

Korzystając z tego podejścia, osiąga się niezawodny postęp rozwojowy dla różnych tkanek¹⁸, np. postembrionalny rozwój tkanki podskórnej (etap L1 do L4), indukcja losów komórek sromu (etap L2 i L3), morfogeneza sromu (L3 do dorosłości¹⁹) i inwazja komórek kotwicznych. Od momentu ich wprowadzenia, te długoterminowe urządzenia do obrazowania były używane do badania różnych procesów^22,23, przy czym platforma została nawet połączona z technikami takimi jak mikroskopia superrozdzielcza AiryScan²⁴, umożliwiając liczne odkrycia, które wcześniej były niemożliwe.

Poniżej przedstawiono krok po kroku aspekty operacyjne tych urządzeń do długoterminowego obrazowania, podkreślając oczekiwane wyniki i niektóre potencjalne wyzwania podczas konfiguracji systemu.

Protokół

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Produkcja urządzeń

UWAGA: Wszystkie urządzenia zostały wyprodukowane przy użyciu poniższego protokołu, jednak urządzenia są bezpośrednio dostępne u autorów. Dla każdego typu urządzenia wytwarzany jest oddzielny wafel, przy czym każdy wafel urządzenia jest wytwarzany z dwóch warstw SU8 o różnych wysokościach (tj. warstwy żywności i warstwy pułapki). Płytka zaworu jest wytwarzana na oddzielnej płytce o pojedynczej wysokości SU-8, z pominięciem kroków 1,3-1,6. Silany są toksyczne i uwalniają opary. Dlatego ten krok należy wykonać w dygestorium. Szczegółowe informacje na temat procedury wytwarzania można znaleźć w Berger et al.¹⁸.

1. Oczyść wafle za pomocą plazmy powietrznej.
2. Pierwszą warstwę SU8 należy obtoczyć w wirowaniu, a następnie wypiekać na miękko w temperaturze 95 °C.
3. Odsłoić pierwszą warstwę, a następnie upiec w temperaturze 95 °C i wywołać.
4. Ponownie wykonaj czyszczenie plazmowe po wywołaniu i wysuszeniu wafla
.
5. Drugą warstwę SU8 obtoczyć w wirówce, a następnie wypiekać na miękko w temperaturze 95 °C (w razie potrzeby przeprowadzić wstępne pieczenie w temperaturze 65 °C).
6. Wyrównaj drugą maskę do istniejących obiektów za pomocą znaczników wyrównania po obu stronach płytki, a następnie odświetl drugą warstwę.
7. Po upieczeniu i rozwinięciu wafla, a następnie wykonaj twardy pieczenie w temperaturze 200 °C.
8. Traktuj wafel chlorotrimetylosilanem przez co najmniej 2 godziny.
9. Przygotować partię 20 g prepolimeru PDMS (część A) i dokładnie wymieszać ją z 1 g środka sieciującego (stosunek 20:1, część B) (patrz tabela materiałów).
10. Odgazowuje przez 10 minut lub do momentu, gdy wszystkie bąbelki znikną.
11. Usunąć 2 ml mieszaniny PDMS i odłożyć na krok 1.13.
12. Do pozostałej mieszaniny PDMS dodać kolejne 3 g środka sieciującego i dokładnie wymieszać (końcowe proporcje ok. 5:1).
13. Korzystając z wsadu PDMS 20:1, wiruj płytkę urządzenia z prędkością 750 obr./min przez 30 s.
14. Umieść płytkę zaworu w aluminiowym naczyniu i odlej na nią PDMS 5:1. Odgazuj płytkę urządzenia przez około 10 minut. Po odgazowaniu usuń wszelkie pozostałe pęcherzyki za pomocą pipety.
15. Piecz zarówno warstwę zaworu, jak i urządzenia w temperaturze 70 °C odpowiednio przez około 15/20 minut.
16. Oceń utwardzenie warstwy urządzenia i zaworu, delikatnie sondując je końcówką pipety lub pęsetą. Warstwa zaworu powinna być solidna, podczas gdy warstwa urządzenia powinna pozostać lekko lepka.
17. Odłącz warstwę zaworu i przytnij ją do wymaganego rozmiaru za pomocą skalpela lub żyletki.
18. Wybij otwór dostępowy w kanale zaworu (manometr 20).
19. Umieść płytkę urządzenia pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w górne oświetlenie.
20. Ostrożnie umieść element PDMS zawierający warstwę zaworu na płytce urządzenia.
21. Precyzyjnie wyrównaj funkcje zaworu i urządzenia, zapewniając usunięcie całego powietrza uwięzionego między warstwami.
22. Zmontowane urządzenie przełożyć do piekarnika i piec przez noc w temperaturze 70 °C.
23. Odłącz urządzenie od płytki.
24. Przebij wszystkie pozostałe otwory dostępowe (grubość 20).
25. Przymocuj PDMS do szkła nakrywkowego za pomocą plazmy powietrznej, a następnie umieść połączone urządzenie w piecu w temperaturze 70 °C na kilka godzin.

2. Przygotowanie robaka

UWAGA: Ta sekcja opisuje przygotowanie robaków przez bielenie, co pozwala na generowanie dużych liczb (setek) zwierząt. Inne metody synchronizacji, takie jak pobieranie ręczne, są możliwe, ale są zazwyczaj bardziej czasochłonne i pracochłonne. Wszystkie robaki użyte w protokole są utrzymywane zgodnie ze standardowymi protokołami w temperaturze 20 °C i na płytkach NGM wysianych E. coli OP50.

1. Począwszy od talerzy z wieloma ciężarnymi zwierzętami.
2. Zmyj zwierzęta z talerza za pomocą bufora M9.
3. Dodać 5% NaClO i 5 M NaOH do zawiesiny robaka (200 μL/100 μL na każdy 1 ml zawiesiny robaka).
4. Delikatnie potrząśnij mieszanką wybielającą, aż zwierzęta zaczną się rozpadać (~10 min).
5. Odwirować mieszaninę wybielającą w temperaturze pokojowej, 1300 x g przez 1 min.
6. Usunąć supernatant za pomocą pipety i dodać równą ilość świeżego buforu M9.
7. Ponownie odwirować w temperaturze pokojowej, 1300 x g przez 1 min.
8. Usunąć supernatant i przenieść granulowane robaki do probówki o pojemności 15 ml z 5 ml świeżego buforu M9.
9. Wstrząsnąć przez noc w temperaturze 20 °C.
10. Przepuścić zawiesinę robaka przez sitko o wielkości 10 μm.
11. Odwirować zawiesinę ślimakową o stężeniu 1300 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
12. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić robaki w równej objętości buforu M9.
13. Ponownie odwirować mieszaninę robaków w temperaturze 1300 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
14. Usunąć supernatant i przenieść robaki na płytki NGM. Jeśli potrzebne są larwy L1, należy je natychmiast zużyć.
15. Gdy robaki osiągną pożądany etap rozwoju, zmyj je z płytki za pomocą świeżego buforu S-Basal przefiltrowanego przez filtr 0,2 μm.
16. Pozostawić robaki do osadzania się grawitacyjnie lub granulować je przez odwirowanie w temperaturze 750 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
17. Odrzucić supernatant i dodać równą objętość świeżego buforu S-Basal.
18. Powtórzyć etapy sedymentacji lub wirowania (kroki 2.16 i 2.17)
19. Usunąć supernatant i dodać równą objętość świeżego buforu S-Basal.
20. Wykonaj etapy sedymentacji lub wirowania po raz ostatni.
21. Usunąć większość supernatantu.
22. Trzymaj robaki w tubie, aż rozpocznie się eksperyment.

3. Przygotowanie bakterii

UWAGA: Na chipie można stosować różne szczepy bakterii (np. OP50, NA22, HT114, itp.). Dostosuj proporcję pożywki o gradiencie gęstości dodawanej do mieszanki spożywczej, aby skompensować różnice w gęstości. Wszystkie są przepuszczane przez filtr 0,2 μm w celu usunięcia cząstek stałych.

1. Przygotować 40 ml LBroth w 2 x 20 ml w probówkach wirówkowych, sterylnych kolbach Erlenmeyera itp.
2. Zaszczep LB bakteriami pobranymi z talerza podstawowego.
3. Hoduj bakterie, wstrząsając przez noc w temperaturze 37 °C (~16 h) (OD₆₀₀ = 1,9).
4. Odwirować bakterie przy 3000 x g przez 10 min.
5. Usunąć supernatant i dodać 2 ml świeżego buforu S-Basal do każdej probówki. Połącz wszystkie rurki.
6. Mechanicznie zawiesić bakterie za pomocą pipety.
7. Odwirować bakterie w stężeniu 3000 x g przez 5 minut.
8. Usunąć supernatant i ponownie dodać 2 ml świeżego buforu S-Basal.
9. Mechanicznie zawiesić bakterie za pomocą pipety.
10. Odwirować bakterie w stężeniu 3000 x g przez 5 minut.
11. Usuń jak najwięcej supernatantu i dodaj 1 ml świeżego buforu S-Basal przed mechanicznym ponownym zawieszeniem wszystkich bakterii.
12. Połącz 0,60 ml pożywki o gradiencie gęstości, 0,38 ml S-Basal + 1% wagowo Pluronic F-127 (niejonowy kopolimer triblokowy, reprezentowany tutaj jako PF) z 1 ml zawiesiny bakterii OP50 lub 0,65 ml pożywki o gradiencie gęstości, 0,33 ml S-Basal + 1% wagowo PF z 1 ml zawiesiny bakterii NA22 lub HT114.
13. Dokładnie wymieszaj przygotowane potrawy za pomocą miksera wirowego.
14. Przefiltruj żywność przez sitko o wielkości 5 μm lub 10 μm. Mniejsze sitko jest szczególnie zalecane w przypadku korzystania z mniejszych urządzeń, np. urządzeń L1.
    UWAGA: Żywność można przechowywać w temperaturze pokojowej do 2 dni.

4. Przygotowanie żetonów

UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 2, aby zapoznać się ze schematem urządzenia, przewodów i połączeń. Wszystkie są przepuszczane przez filtr 0,2 μm w celu usunięcia kurzu. Stalowy kołek wspomniany w poniższych krokach odnosi się do krótkiej, pustej rury, która służy do łączenia większej rurki o średnicy zewnętrznej (1/16") z otworami o małej średnicy wykonanymi w urządzeniu PDMS. Te stalowe kołki są po prostu wkładane w wewnętrzną średnicę rurki, a następnie wciskane w materiał PDMS, skutecznie łącząc te dwa.

1. Zacznij od napełnienia strzykawki wodą dejonizowaną (DI).
2. Przymocuj igłę 23 G i długi kawałek rurki 1/16", z wydrążonym stalowym kołkiem (wygiętym pod kątem 90°) na końcu. Rurka powinna być wystarczająco długa, aby rozciągać się od elektrozaworu do stolika mikroskopu.
3. Napełnij rurkę wodą DI ze strzykawki i podłącz ją do wlotu zaworu, wkładając stalowy kołek do wybitego otworu (Rysunek 2A,J).
4. Wyjmij strzykawkę i igłę, a następnie przymocuj rurkę do elektrozaworu poza chipem (Rysunek 2A, J).
5. Korzystając z oprogramowania do obrazowania, włącz elektrozawór i zwiększ ciśnienie w urządzeniu przez kilka minut, aby usunąć całe powietrze z zaworu. Sprawdź zakończenie, wizualnie sprawdzając interfejs powietrze-woda na chipie, który powinien być ciemny i zniknąć w materiale PDMS (Rysunek 2B).
6. Wyłącz elektrozawór (Rysunek 2C).
7. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml przefiltrowanym roztworem bakterii (wystarczy ~0,5 ml jedzenia).
8. Przymocuj igłę 30 G i długi kawałek rurki 1/32" do igły.
9. Nacisnąć tłok, aby napełnić zarówno igłę, jak i dołączoną rurkę, upewniając się, że w strzykawce lub rurce nie pozostało powietrze.
10. Włóż rurkę 1/32" bezpośrednio do wlotu żywności urządzenia mikroprzepływowego, używając pęsety, aby zapobiec uszkodzeniu rurki (zalecana jest pęseta SMD) (Rysunek 2D,K).
11. Umieścić strzykawkę na pompie strzykawkowej ( Rysunek 2D).
12. Naciśnij tłok strzykawki za pomocą skrzydełkowej z tyłu, aby napełnić urządzenie płynem. Kropla płynu powinna pojawić się przy każdym otwartym połączeniu (Rysunek 2D, strzałka).
13. Zablokuj zarówno wlot, jak i wylot ślimaka za pomocą uszczelnionego stalowego kołka (stalowy kołek z krótkim kawałkiem rurki 1/16" przymocowany i uszczelniony przez spalenie) (Rysunek 2E,L).
14. Zastosuj dodatkowy nacisk za pomocą skrzydełkowej, aby usunąć resztki powietrza z urządzenia (Rysunek 2E, strzałka).
15. Wyjmij zablokowany kołek na wylocie i przymocuj pojemnik na odpady (wykonany z probówki kriowialnej lub mikrowirówki, z dwoma stalowymi kołkami wbitymi w pokrywę i zabezpieczonymi klejem). Pojemnik na odpady jest połączony za pomocą krótkiego odcinka rurki 1/16", przy czym jeden koniec jest przymocowany do pojemnika, a drugi koniec jest połączony z wydrążonym stalowym kołkiem (wygiętym pod kątem 90°) (Rysunek 2F,G,M).
16. Naciskać strzykawkę, aby upewnić się, że pojemnik na odpady jest prawidłowo podłączony i że w systemie nie ma żadnych zatorów. W tym celu przepchnij niewielką ilość płynu przez system (przekręć skrzydełkową na pompie strzykawki), aż płyn przepłynie przez rurkę odpływową (Rysunek 2G, strzałka).
17. Usuń drugi zablokowany stalowy kołek.
18. Wciskać strzykawkę, aż na wlocie ślimaka pojawi się mała kropla płynu (Rysunek 2H,N).
19. Podłącz dłuższy kawałek rurki 1/16" (15-20 cm) do strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej buforem S-Basal, używając igły 23 G (Rysunek 2H, N).
20. Przymocuj prosty stalowy kołek 23 G do drugiego końca rurki.
21. Napełnić igłę i rurkę buforem ze strzykawki, upewniając się, że w strzykawce lub drengu nie pozostało powietrze.
22. Włóż stalowy kołek na końcu rurki do rurki zawierającej ślimaki.
23. Przeciśnij niewielką ilość płynu przez rurkę, upewniając się, że nie pozostało powietrze.
24. Wciągnąć robaki do rurki, ale nie należy ich wciągać do strzykawki.
25. Wciśnij strzykawkę podłączoną do ślimaków, aż na stalowym kołku pojawi się mała kropla płynu (Rysunek 2H).
26. Włóż stalowy kołek do wlotu ślimaka (Rysunek 2I).
    UWAGA: Przygotowanie urządzenia można przeprowadzić przed ostatecznym przygotowaniem robaków i pozostawić pod mikroskopem, aż robaki będą gotowe.

5. Wczytywanie i obrazowanie robaków

1. Umieść urządzenie na mikroskopie w małym powiększeniu (5x lub 10x) lub na mikroskopie preparacyjnym.
2. Zidentyfikuj aktualnie używaną jednostkę urządzenia i znajdź wlot ślimaka za pomocą oświetlenia w jasnym polu.
3. Ustawić urządzenie w taki sposób, aby wlot był widoczny po jednej stronie pola widzenia, a tył wlotu kanału syfonu był widoczny po drugiej stronie.
4. Delikatnie nacisnąć tłok strzykawki ślimakowej. Ciecz będzie zauważalnie przepływać od wlotu przez układ kanałów w kierunku wylotu. Obecność bakterii i różnica w współczynniku załamania światła spowodowana dodatkiem ośrodka gradientu gęstości sprawiają, że przepływ cieczy jest widoczny.
5. Upewnij się, że robaki pojawiają się z wlotu i płyną w kierunku tylnej części układu kanałów.
6. Delikatnie popchnij zwierzęta w kierunku układu kanałów. Gdy zwierzę stanie twarzą do kanału, wepchnij je do kanału i powtórz dla kolejnych zwierząt.
   UWAGA: Zwierzęta muszą być skierowane głowami w stronę wylotu, aby mieć łatwy dostęp do pożywienia. Można je zorientować poprzez pchanie i ciągnięcie za tłok oraz pływanie.
7. Po schwytaniu wystarczającej liczby zwierząt należy umieścić strzykawkę, nadal przymocowaną do wlotu robaka, na stoliku mikroskopu, gdzie pozostanie przez cały czas trwania eksperymentu. Krótkie odłączenie rurki ślimakowej od strzykawki może być konieczne w celu uwolnienia nagromadzonego ciśnienia, a następnie ostrożne ponowne przymocowanie jej do igły.
8. Jeśli obciążenie zostało wykonane na mikroskopie preparacyjnym, przenieś urządzenie do mikroskopu obrazowego. Rurka może pozostać przymocowana do chipa, a strzykawka jest podłączona do pompy.
9. Włączyć pompę strzykawkową i uruchomić ją z zadaną szybkością 1 μL/h dla 0,5 μL, zwiększyć szybkość o 100 μL/h dla 0,5 μL i zmniejszyć ją z powrotem do 1 μL/h. Cykl ten jest automatycznie powtarzany dla całego eksperymentu. Informacje na temat programowania pompy można znaleźć w instrukcji obsługi urządzenia.
10. Umieść urządzenie na stoliku mikroskopu i upewnij się, że jest mocno trzymane (sugestie dotyczące mechanizmów montażowych można znaleźć w Rysunek 3A).
11. Jeśli ładowanie nie zostało wykonane na mikroskopie obrazowym, zidentyfikuj jednostkę zainteresowania urządzenia przy małym powiększeniu.
12. Przełącz na żądane powiększenie obrazu.
    UWAGA: Urządzenia są kompatybilne ze wszystkimi typami obiektywów.
13. Zidentyfikuj zwierzęta i obszary zainteresowania w układzie kanałów pułapki i ustaw żądane warunki obrazowania.
14. Obraz w żądanych warunkach obrazowania, z wbudowanym zaworem uruchamianym przez elektromagnes 10 s przed akwizycją obrazu, dzięki czemu zwierzęta są utrzymywane w miejscu.
    UWAGA: Uruchomienie zaworu na chipie spowoduje wydłużenie i spłaszczenie zwierząt, co może wymagać regulacji obszaru obrazowania (ROI).

6. Przygotowanie do konfiguracji

UWAGA: Ta sekcja odnosi się do wstępnego przygotowania mechanizmu kontroli urządzenia i nie musi być powtarzana przed każdym eksperymentem. Patrz Rysunek 3B,C. Ponieważ wiele elektrozaworów wymaga wyższego napięcia, elektromagnes najprawdopodobniej nie będzie podłączony bezpośrednio do mikrokontrolera, ale za pomocą przekaźnika lub tranzystora MOSFET (patrz Rysunek 3C).

1. Zidentyfikuj źródło sprężonego powietrza (np. instalację naścienną lub butlę z gazem).
2. Podłącz źródło ciśnienia do odpowiedniego regulatora ciśnienia (zakres ciśnienia 0-2 bar) za pomocą rurki 6 mm (źródło ścienne) lub bezpośrednio podłącz odpowiedni reduktor do butli z gazem.
3. Podłącz regulator ciśnienia do wejścia zaworu elektromagnetycznego (rurka 6 mm, patrz Rysunek 3B).
4. Umieść elektrozawór jak najbliżej stolika mikroskopu (sugerowane jest ~0.5-1 m od stolika, chociaż w razie potrzeby możliwe są większe odległości).
5. Podłączyć elektrozawór elektronicznie do wybranego sterownika. Dostępne są różne opcje, takie jak sterowanie nim za pomocą oddzielnej płytki mikrokontrolera (np. Arduino) lub istniejącej karty DAq.

7. Czyszczenie i przechowywanie

1. Po zakończeniu eksperymentu wyjmij urządzenie z mikroskopu.
2. Usuń płyn zanurzeniowy. Olejek immersyjny można usunąć za pomocą rozpuszczalników organicznych (np. acetonu, metanolu itp.).
3. Umieść urządzenie na płaskiej powierzchni i odłącz wszystkie rurki z wyjątkiem rurki zaworu. Aby bezpiecznie odłączyć każdą rurkę, naciśnij znajdujący się w pobliżu PDMS i delikatnie pociągnij. Nie podnoś i nie zginaj urządzenia, ponieważ może to spowodować pęknięcie szkła nakrywkowego.
4. Oczyść powierzchnię PDMS 70% etanolem.
5. Przechowuj urządzenie w temperaturze pokojowej z dołączoną rurką zaworu.
   UWAGA: Urządzenie może być ponownie użyte, dopóki wszystkie jednostki nie zostaną użyte, prawdopodobnie bez konieczności ponownego napełniania rurki zaworu. Jednak woda w rurkach zaworu wyparuje przez dłuższy czas i może ostatecznie wymagać ponownego napełnienia.

Wyniki

Konstrukcja i wymiary urządzenia
Zaprojektowano pięć różnych urządzeń, aby dostosować je do wszystkich czterech stadiów larwalnych. Urządzenia te oznaczono w następujący sposób: L1, dla larw L1 umieszczonych bezpośrednio po wykluciu i obrazowanych do stadium L2; L1-L4, zdolne do utrzymania larw od środkowego do późnego stadium L1 aż do wczesnego i środkowego stadium L4; L2-A, odpowiednie dla zwierząt od około środkowego stadium L2 do wczesnej dorosłości; L3-A, dla zwierząt od około środkowego stadium L3 do wczesnej dorosłości; oraz L4-A, które pomieści zwierzęta od około późnego stadium L4 do wczesnej dorosłości.

Wszystkie urządzenia mają ten sam podstawowy układ, składający się z wlotu dla nicieni, 1 (lub 2 w przypadku wymiany pożywki) wlotu/wlotów pożywki bakteryjnej oraz wspólnego odpływu odpadów. Pomiędzy częścią wlotową a wylotową umieszczono układ 41 równoległych kanałów pułapek, przy czym strona wlotowa i wylotowa są skutecznie oddzielone kanałem doprowadzającym pożywkę o mniejszej wysokości (Rysunek 1A,A′). Wymiary kanałów dobrano tak, aby były znacznie dłuższe i szersze niż nicienie wprowadzane na początku eksperymentu, z długością/szerokością 400/15 µm dla urządzeń L1, 575/22 µm dla urządzeń L1-L4, 800/27 µm dla urządzeń L2-A, 900/30 µm dla urządzeń L3-A oraz 1000/65 µm dla urządzeń L4-A (Plik uzupełniający 1, Plik uzupełniający 2, Plik uzupełniający 3, Plik uzupełniający 4 oraz Plik uzupełniający 5).

Długość kanału dobrano tak, aby odpowiadała rozmiarowi, jaki zwierzęta osiągnęły do końca eksperymentu, natomiast szerokość wybrano tak, aby nicienie na początku eksperymentu zajmowały około dwóch trzecich szerokości kanału. Taka konstrukcja zapewnia wystarczającą przestrzeń do wzrostu i poruszania się podczas linienia, jednocześnie zapobiegając obracaniu się lub rotacji nicieni. W przeciwieństwie do szerokości, wysokość kanału ustawiono blisko grubości nicieni na początku eksperymentu: 8 µm dla wczesnych larw L1, 12 µm dla larw L1 w fazie środkowej/późnej, 15 µm dla larw L2 w fazie środkowej, 17,5 µm dla larw L3 w fazie środkowej oraz 22,5 µm dla larw L4 w fazie późnej, co odpowiada odpowiednio urządzeniom L1, L1-L4, L2-A, L3-A i L4-A. Zredukowana wysokość kanału, w połączeniu z precyzyjnie dobraną szerokością (przy zachowaniu stosunku wysokości do szerokości wynoszącego 0,5-0,6), gwarantuje, że nicienie pozostają w stałej orientacji. Co istotne, przy wystarczająco małej wysokości kanału wszystkie nicienie są konsekwentnie ustawione w pożądanej orientacji bocznej.

Kanał doprowadzania pokarmu został wykonany na wysokości 3 µm dla L1 oraz 5 µm dla wszystkich pozostałych urządzeń, aby zapewnić bakteriom łatwy dostęp do zwierząt, jednocześnie zapobiegając ucieczce zwierząt z kanałów pułapek. Wszystkie urządzenia wykorzystują tę samą warstwę doprowadzania pokarmu (Supplementary File 6) oraz tę samą warstwę zaworową (Supplementary File 7). Należy pamiętać, że warstwa zaworowa jest wykonywana na osobnym waflu na wysokości 20 µm i umieszczana na warstwie urządzenia dopiero podczas produkcji urządzenia z PDMS (krok 1.21).

Te specyficzne dla stadium ograniczenia geometryczne, niezbędne do zapobiegania obracaniu się nicieni lub odwracaniu głowy i ogona, wymagają zastosowania trzech różnych typów urządzeń, aby dostosować je do wszystkich stadiów larwalnych. Gdyby larwy L1 zostały umieszczone w kanale o rozmiarze przeznaczonym dla młodych osobników dorosłych, nie zachowałyby stabilności i szybko opuściłyby kanał pułapki.

C. elegans przygotowanie
O ile nie zaznaczono inaczej, nicienie były hodowane zgodnie ze standardowymi protokołami²⁵ na płytkach NGM z wysiewem E. coli OP50 w temperaturze 20 °C. Sekcja dotycząca przygotowania nicieni szczegółowo opisuje przygotowanie zsynchronizowanej populacji nicieni wykorzystywanej w eksperymencie obrazowania. Synchronizację przeprowadzono zgodnie ze standardowymi protokołami z użyciem podchlorynu sodu²⁶, zmodyfikowanych o dodatkowy etap filtracji w celu usunięcia zanieczyszczeń i niewyklutych osobników po całonocnym głodzeniu. Celem jest uzyskanie licznej grupy zsynchronizowanych larw L1, które następnie wysiewa się na płytki NGM lub wprowadza bezpośrednio do urządzenia do obrazowania. Inne metody synchronizacji, takie jak ręczne zbieranie lub kontrolowane składanie jaj, są równie odpowiednie. Są one jednak bardziej czasochłonne w uzyskiwaniu wystarczającej liczby zwierząt (zaleca się 200 osobników na warunek).

Po osiągnięciu przez nicienie pożądanego stadium, można je delikatnie spłukać z płytki NGM, używając czystego buforu S-Basal (najlepiej przefiltrowanego przez filtr 0,2 µm). Celem jest zebranie jak największej liczby zwierząt, unikając przy tym pobierania bakterii lub zanieczyszczeń z płytki. Zwierzęta zbiera się do małej probówki do wirowania i przemywa 2-3 razy świeżym buforem S-Basal, na koniec usuwając jak największą ilość cieczy. Następnie zwierzęta pobiera się bezpośrednio z zagęszczonej objętości. Jeśli stężenie zwierząt będzie zbyt niskie, wprowadzanie ich do urządzenia będzie trwało dłużej, co będzie wymagało przepływu większej objętości cieczy przez urządzenie i zwiększy ryzyko zablokowania kanałów pułapek przez zanieczyszczenia.

Przygotowanie pożywki bakteryjnej
Hodowla bakterii jest prowadzona zgodnie ze standardowymi protokołami, przy czym początkowe stężenie bakterii (OD₆₀₀ = 1.9) zwiększa się około 40-krotnie w buforze S-Basal (przefiltrowanym przez filtr 0.2 µm), a następnie miesza się je z medium gradientu gęstości oraz buforem S-Basal zawierającym PF (przefiltrowanym przez filtr 0.2 µm). Oczekiwanym wynikiem tego etapu procesu jest przygotowanie bardzo gęstej zawiesiny bakteryjnej oraz zapobieganie sedymentacji bakterii podczas eksperymentu obrazowania. Wysoka gęstość jest niezbędna do karmienia zwierząt na chipie przy niskich przepływach stosowanych podczas dostarczania mediów (1 µL/h). Celem zastosowania medium gradientu gęstości jest zapobieganie precypitacji bakterii podczas eksperymentu, natomiast celem PF jest zapobieganie przywieraniu bakterii do ścianek kanałów. Zarówno medium gradientu gęstości, jak i PF są nietoksyczne i nie wpływają na żywotność zwierząt.

W przypadku zastosowania innego rodzaju bakterii w eksperymencie, konieczne będzie określenie odpowiedniego stężenia medium gradientu gęstości. Można to osiągnąć poprzez mieszanie zawiesiny bakterii z różnymi ilościami medium, a następnie przeprowadzenie wirowania. Jeśli stężenie gradientu gęstości będzie zbyt niskie, bakterie osadzą się na dnie; jeśli stężenie będzie zbyt wysokie, bakterie będą unosić się na powierzchni. Po znalezieniu odpowiedniego stężenia zaleca się walidację wyniku poprzez pozostawienie mieszaniny bakterii w temperaturze pokojowej przez około 48 h, aby określić, jak pokarm będzie zachowywał się w trakcie trwania eksperymentu. Po zakończeniu eksperymentu zaleca się również sprawdzenie strzykawki, przez którą podawane są bakterie, aby upewnić się, że nie uległy one osadzeniu ani wypłynięciu. Różnicę w objętości wynikającą z dodania różnych ilości Optiprep można skompensować, dodając więcej lub mniej S-Basal + 1% by weight PF. Podobnie, do zawiesiny można dodać dodatkowe media lub związki (np. auksynę), a nadmiarową objętość odjąć od objętości S-Basal + 1% by weight PF.

Przygotowanie układu
Zainstaluj system zasilania ciśnieniowego jak najbliżej mikroskopu, aby można było nim wygodnie sterować. Wszystkie przebiegi przewodów, zwłaszcza przewód 1/16" łączący się z chipem, powinny być krótkie (mniej niż 0,5 m dla przewodów o średnicy zewnętrznej 1/16") (Rysunek 2 i Rysunek 3B). Jak wskazano w poprzedniej sekcji, sterowanie komputerowe zaworem w chipie można zrealizować na różne sposoby. Powinno być to możliwe w dowolnym oprogramowaniu do mikroskopii (przetestowano w Micro-Manager, Metamorph, NIS oraz ZenBlue), poprzez podłączenie dedykowanej płytki mikrokontrolera (np. Arduino) lub poprzez podłączenie systemu do istniejącej karty akwizycji danych (DAq) przy użyciu wyjścia cyfrowego. Wybrane wyjście płytki należy następnie skonfigurować jako migawkę, która włącza się na 10 s przed akwizycją obrazu lub jest uruchamiana ręcznie podczas konfiguracji urządzenia. Jak wspomniano wcześniej, nie zaleca się bezpośredniego podłączania elektrozaworu do mikrokontrolera; zamiast tego należy go podłączyć via tranzystor MOSFET lub przekaźnik, aby elektrozawór i mikrokontroler pozostały odizolowane elektronicznie (Rysunek 3C).

Podobnie jak w przypadku przewodów doprowadzających ciśnienie, wszystkie pozostałe odcinki przewodów prowadzące do chipa (1/16" OD i 1/32" OD) należy utrzymać w jak najkrótszej formie. Przewody dla nicieni oraz odpływowe (1/16" OD) powinny mieć długość odpowiednio poniżej 2,5 cm i 20 cm. Przewód doprowadzający bakterie (1/32" OD) musi być wystarczająco długi, aby umożliwić połączenie pompy strzykawkowej z urządzeniem po jego umieszczeniu na stole mikroskopu. Niemniej jednak, zdecydowanie zaleca się maksymalne skrócenie tego przewodu oraz umieszczenie pompy strzykawkowej jak najbliżej stołu mikroskopu, np. obok niego, na półce lub na obudowie inkubatora. Każdy dodatkowy odcinek przewodu w systemie zwiększy ciśnienie zwrotne odczuwalne podczas wprowadzania zwierząt do urządzenia oraz zwiększy całkowite ciśnienie działające na uwięzione zwierzęta.

Obsługa urządzenia
Na tym etapie (początek kroku 4 protokołu) wszystkie rurki można przygotować i podłączyć do odpowiednich tępych igieł, stalowych pinów oraz strzykawek. Jak wspomniano powyżej, należy utrzymać długość rurek na możliwie najkrótszym poziomie (Rysunek 2J-N). Co ważne, należy zadbać o to, aby w strzykawkach lub rurkach nie pozostały pęcherzyki powietrza, ponieważ utrudnią one wprowadzanie zwierząt i mogą doprowadzić do ich ucieczki z kanału pułapki podczas eksperymentu. Pęcherzyki powietrza można usunąć ze strzykawki na kilka różnych sposobów, np. poprzez napełnienie strzykawki, odwrócenie jej i delikatne wstrząsanie tak, aby pęcherzyki powietrza wyniosły się na górę strzykawki (nie zaleca się energicznego potrząsania strzykawką, ponieważ może to spowodować uwięzienie dodatkowych pęcherzyków powietrza). Alternatywnie strzykawkę można napełnić, zanurzając ją w buforze i szybko przesuwając tłok w górę i w dół, aby szybko usunąć większość pęcherzyków.

Po napełnieniu strzykawki i usunięciu pęcherzyków powietrza, należy przymocować tępy igielnik oraz dren i napełnić je buforem. Należy zachować szczególną ostrożność podczas napełniania strzykawki, ponieważ w plastikowej części tępego igielnika może łatwo uwięznąć powietrze. W przypadku uwięzienia powietrza należy wymienić igłę. Alternatywnie, problem ten można rozwiązać poprzez uprzednie napełnienie igły cieczą, np. za pomocą pipety.

Po rozmieszczeniu wszystkich komponentów można podłączyć przewody do urządzenia, zaczynając od przewodu łączącego zawór elektromagnetyczny z zaworem na chipie (Rysunek 2A-C,J). Przewód ten jest początkowo wypełniany wodą dejonizowaną, a system zostaje poddany nadciśnieniu w celu usunięcia całego powietrza z kanału zaworu ślepego. PDMS jest przepuszczalny dla gazów, zatem podwyższone ciśnienie wypchnie całe powietrze z kanału do PDMS, pozostawiając kanał zaworu wypełniony wodą. Proces ten można monitorować pod mikroskopem, upewniając się, że cały kanał zaworu jest wypełniony. Po wypełnieniu zaworu można podłączyć dopływ bakterii, a następnie wypełnić i poddać nadciśnieniu urządzenie poprzez zablokowanie wszystkich otwartych wlotów/wylotów (Rysunek 2D,E,K,L). Powietrze zostaje wyparte, co można monitorować pod mikroskopem. Po usunięciu całego powietrza bakterie powinny równomiernie wypełnić urządzenie. Następnie należy usunąć piny blokujące i podłączyć rurkę do zbierania odpadów (Rysunek 2F,G,M). W tym momencie niewielka ilość cieczy powinna przepłynąć przez urządzenie do rurki odpływowej, co potwierdzi, że wszystkie połączenia z rurką są drożne. Można to potwierdzić wizualnie przed podłączeniem przewodów do rurki zbierającej. Jeśli ciecz nie przepływa do rurki odpływowej, prawdopodobnie jest ona zablokowana. Mogłoby to doprowadzić do wzrostu ciśnienia w trakcie eksperymentu, co negatywnie wpłynęłoby na uwięzione organizmy. W przypadku zablokowania rurki lub jej połączeń należy ją usunąć i oczyścić wszystkie połączenia za pomocą igły lub przepłukać je strzykawką wypełnioną wodą.

Na koniec można podłączyć rurkę z nicieniami (Rycina 2H,N). Nicienie pobiera się z probówki wirówkowej, po prostu zasysając je do rurki przymocowanej do strzykawki wypełnionej pożywką S-Basal. Zwierzęta powinny zostać zassane jedynie do rurki, a nie do wnętrza strzykawki. Następnie rurkę można podłączyć do urządzenia. Przed tym zabiegiem należy wypchnąć niewielką ilość cieczy z urządzenia oraz z rurki z nicieniami, a następnie połączyć obie krople w taki sposób, aby podczas ładowania do urządzenia nie dostało się powietrze.

Załadunek nicieni
Po wykonaniu wszystkich połączeń zwierzęta można załadować, naciskając i odciągając tłok strzykawki z nicieniami. Zwierzęta zostaną wypłukane z wlotu w kierunku układu kanałów pułapek; będą one jednak naturalnie płynąć pod prąd. W związku z tym konieczne jest ponowne zorientowanie zwierząt tak, aby ich głowy były skierowane w stronę kanału pułapki. Prawidłowa orientacja zwierząt jest osiągana poprzez naciskanie i odciąganie tłoka oraz zapewnienie zwierzętom czasu na obrócenie się do pożądanej pozycji. Można to osiągnąć niemal w odniesieniu do pojedynczego nicienia, jednak wymaga to wprawy. Po prawidłowym zorientowaniu zwierzęta można wprowadzić do kanału pułapki, gdzie przesuną się do końca kanału i zostaną zatrzymane przez skok wysokości (Rysunek 1A,B). Jeśli zwierzęta nie mogą wejść do kanału, oznacza to, że są zbyt duże dla wybranego urządzenia i muszą zostać zobrazowane w urządzeniu o większych rozmiarach. Jeśli zwierzęta obracają się lub zawracają po umieszczeniu w kanale pułapki, oznacza to, że są zbyt młode i należy użyć mniejszego urządzenia lub pozostawić zwierzęta do wzrostu na kilka kolejnych godzin.

Ważne jest to, że zwierzęta w różnych kanałach nie będą na siebie oddziaływać. W związku z tym zwierzęta załadowane nieprawidłowo nie wpłyną na te załadowane prawidłowo, jednak nie będą miały wystarczającego dostępu do pożywienia, przez co będą rosnąć wolniej lub ich rozwój zostanie zahamowany.

Jeśli zwierzęta zostaną wprowadzone w odpowiednim wieku, ruch wzdłuż osi podłużnej kanału powinien być minimalny. Niemniej jednak zwierzęta mogą swobodnie poruszać się (Rycina 1B) i zaczynają żerować w ciągu kilku minut. Jeśli zwierzęta wykazują znaczący ruch wzdłuż osi podłużnej kanału, jest to prawdopodobnie spowodowane wzrostem ciśnienia w urządzeniu lub pęcherzykiem powietrza uwięzionym w przewodach, tępej igle lub strzykawce. Nadmiar ciśnienia w urządzeniu można zniwelować, delikatnie odłączając przewód z nicieniami od tępej igły i ponownie go mocując. Jeśli pęcherzyk powietrza pozostał w układzie mimo zastosowania powyższych kroków i środków ostrożności, może być konieczne usunięcie całej strzykawki z nicieniami i zastąpienie jej nową, pozbawioną pęcherzyków powietrza. Pęcherzyki powietrza w układzie działają jak sprężyny, które zostają ściśnięte podczas wprowadzania zwierząt i powoli rozprężają się po zakończeniu tej operacji. Przepływ wywołany rozprężaniem się pęcherzyków powietrza może prowadzić do niestabilności układu, co skutkuje wypchnięciem zwierząt z kanałów pułapek.

Pozyskiwanie obrazów i rozwój na chipie
Ostatecznie, po załadowaniu zwierząt, można rozpocząć pozyskiwanie obrazów. Co do zasady urządzenia są kompatybilne z większością metod obrazowania: w świetle przechodzącym, epifluorescencją^18,19,22,23(Rycina 4), konfokalną mikroskopią z dyskiem obrotowym^19, a nawet z technikami nadrozdzielczymi (AiryScan²⁴), ponieważ cały proces obrazowania odbywa się przez szkiełko nakrywkowe o grubości 170 µm. W konsekwencji urządzenie mikrofluidyczne wykazuje niewielki lub żaden wpływ na osiągalną jakość obrazu na chipie. Niezależnie od zastosowanej metody obrazowania należy jednak dobrać odpowiednie warunki, które nie wpłyną na żywotność zwierząt. Wysokie natężenia wzbudzenia szybko doprowadzą do blaknięcia fluoroforów i zahamowania rozwoju ze względu na wysoką energię i ciepło przekazywane do próbki. Zaleca się stosowanie krótkich czasów ekspozycji (~10 ms) i niskich natężeń wzbudzenia (poniżej 10% typowego źródła LED do fluorescencji), co pozwala uzyskać użyteczny obraz przy ustawieniach kontrastu min = 0 i max = 1000 (przy użyciu kamery 16-bitowej) (Rycina 4).

Reprezentatywne dane uzyskane przy użyciu urządzeń L1, L1-4 i L2-A przedstawiono na Rysunku 4. Przedstawiono rozwój komórek nabłonkowych C. elegans od momentu wyklucia/nocnego głodzenia do połowy stadium larwalnego L2 (Rysunek 4A, Film uzupełniający 1), indukcję komórek prekursorowych vulvy o przeznaczeniu 1° i ich późniejsze podziały od późnego stadium L1 do wczesnego stadium larwalnego L4 (Rysunek 4B, Film uzupełniający 2) oraz wreszcie formowanie się vulvy C. elegans od wczesnego stadium larwalnego L3 aż do wywinięcia w momencie przejścia w wiek dorosły (Rysunek 4C, Film uzupełniający 3).

Każda aplikacja jest powiązana z kwantyfikacją różnych wskaźników czasu rozwoju. Obrazy na Rysunku 4A,B przedstawiono bez zastosowania obróbki post-processingu, tzn. nie zastosowano dekonwolucji ani rejestracji obrazu. Z kolei obrazy na Rysunku 4C zostały poddane dekonwolucji²⁷ i rejestracji, co podkreśla poprawę jakości obrazowania możliwą do osiągnięcia przy użyciu urządzeń do obrazowania długoterminowego.

W pierwszej kolejności zidentyfikowano moment rozpoczęcia podziału każdej komórki szwu dla zwierząt przedstawionych na Rysunku 4A (pełny przebieg czasowy znajduje się w Supplementary Movie 1), co wykazało spójny i terminowy podział wszystkich komórek u 12 osobników (Rysunek 4D). Wykorzystując komórki szwu, oceniono również ogólny czas rozwoju we wszystkich czterech stadiach larwalnych; stwierdzono, że wszystkie podziały komórek szwu zostały zakończone po 12,0 h ± 1,7 h (średnia ± SD) w stadium L1 (n = 22), 10,2 h ± 1,0 h w L2 (n = 27), 10,9 h ± 1,4 h w L3 (n = 27) oraz 14,6 h ± 2,2 h u zwierząt w stadium L4 (n = 19). Dane te są zgodne z wartościami literaturowymi^2,28, a także z wartościami zmierzonymi u zwierząt hodowanych na płytkach, gdzie mediany czasu rozwoju wynosiły: L1 15 h (n = 21), L2 10 h (n = 15), L3 12 h (n = 21) i L4 12,5 h (n = 61) (Adaptowano z Berger et al.¹⁸). Zaobserwowane niewielkie opóźnienia są prawdopodobnie konsekwencją akwizycji obrazów i wynikającej z niej fototoksyczności lub zwiększonego ograniczenia przestrzeni po wzroście zwierząt w kanale pułapkowym.

Po drugie, monitorowaliśmy wzrost zwierząt w stadiach L2 i L3, ilościowo określając długość gonady jako doskonały wskaźnik postępu rozwojowego (Rycina 4E, pełny przebieg czasowy przedstawiono w Supplementary Movie 2). Podobnie jak w przypadku podziałów komórek szwu, dokładna długość gonady mogła zostać zmierzona dzięki prostej orientacji zwierzęcia, a u wszystkich obrazowanych osobników stwierdzono spójny wzrost gonady (n = 19). Pierwszy podział VPC w tych eksperymentach zaobserwowano 14,26 h ± 2,47 h po rozpoczęciu doświadczenia (~30 h po wysianiu), a drugi nastąpił 1,46 h ± 0,13 h później (n = 19). Dane te są zgodne z wartościami literaturowymi ustalonymi dla płytek NGM^29,30. Euling i Ambros³⁰ stwierdzili, że pierwszy podział następuje po około 29 h, a drugi około 3 h później.

Na koniec określono ilościowo czas osiągnięcia konkretnych etapów rozwoju sromnika (Rysunek 4F, pełny przebieg czasowy przedstawiono w Supplementary Movie 3), oceniając w szczególności czas potrzebny na przejście od inwaginacji (L4.0, t1) do środkowego etapu L4 (L4.5, t4) zgodnie z podetapami zdefiniowanymi przez Moka i wsp.³¹. Średni czas przejścia między t1-t2 wyniósł 3,8 h ± 1,2 h, między t2-t3 3,5 h ± 1,2 h, a między t3-t4 2,8 h ± 1,6 h (n = 7), co wskazuje na w przybliżeniu liniowy postęp rozwoju. Podobnie jak w teście czasu rozwoju, czasy te, w szczególności t1-t2, wydają się być nieco opóźnione w porównaniu z wartościami raportowanymi w literaturze (t1-t2: 0,7 h, t2-t3: 3 h, t3-t4: 2,3 h³¹), co może wynikać z niewielkich wymiarów urządzenia spowalniających linienie. Niemniej jednak tempo rozwoju pozostaje wysoce spójne u wszystkich osobników, a wszystkie z nich pomyślnie osiągają stadium dorosłe.

Kompensacja ruchu zwierzęcia i dryfu mikroskopu
Ruch zwierzęcia w obrębie pojedynczego stosu Z jest zazwyczaj minimalny podczas aktywacji zaworu na chipie. Nie należy jednak oczekiwać, że zwierzę pozostanie całkowicie nieruchome. Pozostałe drgania obserwowane w pojedynczym stosie można skompensować poprzez zwiększenie ciśnienia aktywującego zawór na chipie, skrócenie czasu ekspozycji lub zwiększenie wybranego kroku Z w celu przyspieszenia akwizycji stosu. Czas akwizycji stosu można dodatkowo skrócić, stosując piezonapęd w osi Z, co zapewnia znacznie szybszy ruch w osi Z w porównaniu z konwencjonalnym napędem ostrości mikroskopu, lub korzystając z filtrów wielopasmowych (np. GFP/mCherry), dzięki czemu poszczególne kolory mogą być rejestrowane bez konieczności czasochłonnej wymiany filtrów. Dla odniesienia, w przedstawionych przykładach (Rycina 4 oraz Supplementary Movie 1, Supplementary Movie 2, i Supplementary Movie 3), czas akwizycji stosu wynosił zazwyczaj od 3 do 8 sekund. W razie potrzeby pozostały ruch można również usunąć za pomocą różnych metod rejestracji obrazu.

Oczekuje się, że zwierzęta znajdujące się na chipie będą rosły w sposób ciągły. W związku z tym cechy budzące zainteresowanie będą nieuchronnie przemieszczać się wzdłuż osi podłużnej kanału (Rysunek 4A,B, Supplementary Movie 1 oraz Supplementary Movie 2). Zaleca się zatem ustawienie pola widzenia (FOV) obrazowania w taki sposób, aby badana cecha mogła wzrastać w obrębie FOV i nie zostać utracona w trakcie trwania eksperymentu (Rysunek 1B oraz Rysunek 4A,B). Alternatywnie, zwierzęta można obrazować w wielu sąsiednich polach FOV, obejmujących całe ciało zwierzęcia. Może to jednak powodować dodatkową fototoksyczność i stres. Podobnie jak w przypadku ruchu w osi Z, różne procedury rejestracji mogą kompensować ruch zwierzęcia w kanale w czasie. Jeśli zwierzęta wykazują nieregularne ruchy wzdłuż osi podłużnej, bardziej rozległe niż te, które można przypisać wzrostowi, jest to prawdopodobnie spowodowane pęcherzykiem powietrza.

Każde urządzenie do obrazowania długoterminowego zawiera sześć oddzielnych jednostek obrazujących, z których każdą można wykorzystać do osobnego eksperymentu. Każda jednostka może pomieścić do 41 zwierząt, a kanały pułapek są rozmieszczone w taki sposób, aby wiele zwierząt mogło zostać zobrazowanych w jednym polu widzenia (FOV). Dodatkowo, w obrębie jednej jednostki lub urządzenia można obrazować wiele FOV. Podobnie jak w przypadku wszystkich próbek mikroskopowych, przemieszczanie się po powierzchni próbki może wprowadzić dryft ostrości wynikający z utraty medium immersyjnego. Dryft ten można skompensować, stosując olej immersyjny o niższej lepkości lub korzystając z różnych trybów autofokusu. Jednak niektóre sprzętowe systemy autofokusu mogą nie działać w przypadku użycia mikrofluidycznego urządzenia z PDMS, ponieważ wykorzystują one przejście ze szkła do medium wodnego jako punkt odniesienia (strona próbki szkiełka nakrywkowe). Znaczna część FOV wewnątrz urządzenia jest wypełniona silikonem, który ma wyższy współczynnik załamania światła niż woda; choć nie wpływa to na jakość obrazu, może to negatywnie oddziaływać na autofocus. Podczas obrazowania pojedynczego FOV zaobserwowany w urządzeniu dryft ostrości jest minimalny (mniej niż 2 µm). Jeśli zaobserwowany zostanie nadmierny dryft ostrości, może on wynikać z niestabilności termicznej systemu mikroskopowego lub otoczenia, nadmiernego ruchu w osiach XY podczas pozyskiwania wielu FOV lub niewłaściwego zamocowania urządzenia na mikroskopie (sugerowane mechanizmy montażowe przedstawiono na Rysunku 3A).

Podobnie, nadmierny ruch w osiach XY oraz niewłaściwy montaż mogą również prowadzić do dryftu XY. Ponieważ urządzenie i obiektyw mikroskopu są połączone poprzez ciecz imersyjną, gwałtowne ruchy w osiach X, Y lub Z mogą powodować działanie sił na urządzenie. Jeśli urządzenia są zamontowane prawidłowo i nie działają na nie żadne siły zewnętrzne, wykazują one wyjątkową stabilność przy minimalnym dryfcie ostrości i braku dryftu XY.

Wreszcie, jeśli konkretne parametry systemu są niewłaściwe, mikrofluidyczne urządzenia PDMS mogą niekorzystnie wpływać na rozwój zwierząt. Żywotność jest zaburzana przez nadmierne ciśnienie w zaworach, wysoką fototoksyczność wynikającą z wysokiej intensywności wzbudzenia, długie czasy ekspozycji lub krótkie odstępy czasu między akwizycjami stosów obrazów. Szczególnie przy pierwszym użyciu tego systemu wysoce zalecane jest ocena żywotności zwierząt przy użyciu jasnego markera fluorescencyjnego lub obrazowania w polu jasnym, aby upewnić się, że warunki obrazowania nie wpływają na wzrost zwierząt. Gdy zwierzęta będą rozwijać się w sposób powtarzalny, parametry obrazowania można zmieniać w zależności od potrzeb.

Rycina 1: Układ urządzenia i schemat działania. (A) Przegląd urządzenia przedstawiający pojedynczą jednostkę z wlotem dla nicieni (i), wlotem dla pożywki bakteryjnej (ii) i ogólnym wylotem (iii). (A') Powiększony widok kanału pułapki w urządzeniu L2-A, wyróżniający liczbę nicieni widocznych w jednym polu widzenia (FOV) przy różnych powiększeniach (40x-100x). (B) Zasada działania zaworu na chipie. W stanie OFF wysokość kanału jest dobrana tak, aby zwierzęta mogły swobodnie zmieścić się w kanale pułapki. W stanie ON wysokość kanału zmniejsza się, dociskając zwierzę do szkiełka nakrywkowego, co prowadzi do odwracalnej immobilizacji schwytanych zwierząt. Obrazy pokazują dwa schwytane na chipie zwierzęta przy zaworze OFF oraz przy zaworze ON, przy czym zwierzęta widocznie prostują się i wydłużają pod wpływem nacisku. Górne zwierzę zostało załadowane prawidłowo i jest skierowane w stronę źródła pożywienia (), a dolne jest skierowane w przeciwną stronę (X). (C-C") Schemat konfiguracji urządzenia. (C) Dostępne rozmiary urządzeń. L1 jest odpowiednie dla zwierząt od stadium L1 do połowy L2, L1-4 dla zwierząt od połowy stadium larwalnego L2 do połowy L4, a L2-A dla zwierząt od połowy stadium larwalnego L2 do wieku dorosłego. Paski skali wynoszą (A) 1000 µm, (B) 100 µm i (C) 50 µm. Rycina jest częściowo zaadaptowana z pracy Berger et al.¹⁸. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 2: Konfiguracja i połączenia urządzenia. (A-I) Schematyczny przegląd procesu konfiguracji. (A) Podłączenie wypełnionej wodą rurki 1/16" do wlotu zaworu za pomocą pustego stalowego pinu (szary), z drugim końcem przyłączonym do systemu zasilania ciśnieniowego. (B) Napełnianie hydraulicznego zaworu na chipie poprzez zewnętrzny zawór elektromagnetyczny i poddawanie urządzenia ciśnieniu przez kilka minut. (C) Odłączenie ciśnienia przed przejściem do kolejnych kroków. (D) Podłączenie strzykawki zawierającej pożywkę bakteryjną do wlotu pożywki za pomocą rurki 1/32" i tępej igły 30 G, a następnie napełnianie urządzenia, aż ciecz pojawi się w obu otwartych połączeniach. (E) Uszczelnienie wlotu dla nicieni i wylotu odpadów za pomocą stalowych pinów zablokowanych fragmentem rurki 1/16" () i poddanie urządzenia ciśnieniu przy użyciu strzykawki z pożywką i pompy (poprzez regulację śruby kciukowej), z utrzymaniem ciśnienia przez kilka minut. (F) Usunięcie zatyczek z kroku (E), zapewniając powstanie kropli cieczy przy każdym otwartym połączeniu. (G) Podłączenie pojemnika na odpady poprzez krótki fragment rurki 1/16" i pusty stalowy pin. (H) Podłączenie strzykawki wypełnionej buforem do urządzenia za pomocą pustego stalowego pinu i tępej igły 23 G. Nicienie są zasysane do rurki przed jej podłączeniem do urządzenia; aby uniknąć wprowadzenia powietrza, należy dopasować krople cieczy przy wlocie i na końcu rurki. (I) Końcowa konfiguracja ze wszystkimi ustanowionymi połączeniami urządzenia. (J) Obraz urządzenia z rurką zaworu podłączoną do wlotu i zaworu elektromagnetycznego (tło), odpowiadający krokom (A-C). (K) Powiększony widok urządzenia z podłączoną rurką doprowadzającą pożywkę, pokazujący dwie krople cieczy (strzałki) przy wlocie dla nicieni i wylocie odpadów, odpowiadający krokowi (D). (L) Powiększony widok urządzenia z podłączoną rurką doprowadzającą pożywkę oraz zablokowanym wlotem dla nicieni i wylotem odpadów, odpowiadający krokowi (E). (M) Powiększony widok urządzenia z podłączoną rurką odpływową i pojemnikiem, odpowiadający krokowi (G). (N) Końcowy montaż ze wszystkimi połączeniami rurek na miejscu, odpowiadający krokowi (I). Częściowo zaadaptowano z Berger et al.¹⁸. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Konfiguracja sprzętowa. (A-A') Sugerowany montaż urządzenia. (A) Możliwy montaż dla mikroskopu pionowego. Urządzenia są przymocowane do prostokątnej, wydrukowanej w technologii 3D ramki z dużym otworem centralnym. Dwa małe paski dwustronnej taśmy są początkowo umieszczane na szkiełku podstawowym, po obu stronach części PDMS urządzenia. Następnie ramka wydrukowana w 3D jest nakładana na urządzenie w taki sposób, aby część PDMS wystawała przez otwór, a następnie ramka jest mocno dociskana do dwustronnej taśmy, co trwale mocuje urządzenie do ramki. W ten sposób ramka stabilnie utrzymuje urządzenie i sama jest mocowana do stolika mikroskopu za pomocą magnesów osadzonych w ramce i wkładce stolika. Zapewnia to stabilny montaż urządzenia i zapobiega kolizji obiektywu mikroskopu z jakimkolwiek elementem montażowym. Wszystkie rurki są poprowadzone na przód urządzenia. (A') Możliwy montaż dla mikroskopu odwróconego. Zestaw zacisków ściśle trzyma urządzenie. Należy upewnić się, że zaciski dociskają urządzenie do wkładki stolika, aby zapobiec jakimkolwiek przesunięciom w osi XY podczas pracy. (B) Widok elementów systemu ciśnieniowego. (i) Rurka poliuretanowa o średnicy zewnętrznej 6 mm podłączona do źródła ciśnienia. (ii) Adapter wciskowy G1/8 na 6 mm łączący rurkę (i) z regulatorem ciśnienia (iii). Następnie rurka jest połączona z elektrozaworem (vi) poprzez adapter wciskowy M5 na 6 mm (v), a na koniec rurka jest połączona za pomocą konektora Luer-lock na karbirowany (vii) i tępej igły 23 G (viii) z rurką o średnicy zewnętrznej 1/16" podłączoną do urządzenia mikrofluidycznego. (C) Schematyczne zestawienie połączeń elektronicznych i zmontowanego systemu ciśnieniowego. (i) Wyzwalacz TTL (+3.3-5 V) generowany przez Arduino, kartę DAq lub dowolny inny mikrokontroler, wraz z odpowiednim zasilaczem (ii, 24 VDC), jest połączony z MOSFET-em (iii) i połączeniami elektronicznymi elektrozaworu zgodnie ze schematem, z diodą zabezpieczającą (iv) wpiętą równolegle do połączeń zasilania elektrozaworu. Po wysłaniu sygnału TTL z mikrokontrolera do bramki MOSFET-a, do normalnie zamkniętego elektrozaworu przyłożone jest napięcie +24 VDC, a hydrauliczny zawór na chipie zostaje nadmuchany. Po usunięciu sygnału TTL ciśnienie zostaje zwolnione, a hydrauliczny zawór na chipie spuszczony. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki. (A) Zwierzę z markerem połączeń nabłonkowych (ML2615, dlg-1(mc103[dlg-1::gfp]))) rozwijające się od nocnego głodzenia do wczesnego/środkowego stadium larwalnego L2, z użyciem urządzenia L1. Widoczne są dzielące się komórki szwu (seam cells) oraz komórki P, które migrują i dzielą się w kierunku późnego stadium larwalnego L1. (B) Zwierzę rozwijające się od późnego stadium larwalnego L1 do wczesnego stadium L4, z użyciem urządzenia L1-4. Widoczny jest marker dla komórki prekursorowej sromki (VPC) o przeznaczeniu 1° (AH1187, arIs92[egl-17::cfp]); na początku eksperymentu widoczna jest pojedyncza komórka, a następnie dwie rundy widocznych podziałów komórkowych w stadium larwalnym L3. (C) Zwierzęta rozwijające się od późnego stadium larwalnego L2 do wczesnej dorosłości, z użyciem urządzenia L2-A. Widoczny jest marker połączeń nabłonkowych (AH5786, hmr-1(cp21[hmr-1::gfp + LoxP])), podkreślający rozwijającą się tkankę sromkową tworzącą wyraźne struktury toroidalne, oraz obraz złożony z markerem komórki kotwiczącej macicy (AC) (AH5786, qyIs50[Pcdh-3>mCherry::moeABD, unc-119(+)])), która nacieka tkankę sromkową pod koniec stadium larwalnego L3, łącząc tkanki. Dla wszystkich eksperymentów (A-C) pole widzenia (FOV) jest początkowo ustawione tak, aby widoczna była tylko część zwierząt. W miarę postępu eksperymentu zwierzę wypełnia coraz większą część kanału, a cechy przemieszczają się wzdłuż osi kanału w wyniku wzrostu zwierzęcia. (D) Czas, w którym poszczególne komórki szwu rozpoczynają podziały podczas stadium larwalnego L1 (n = 12). Wstawka podkreśla tożsamość komórek szwu (H1-V6) wzdłuż przednio-tylnej osi ciała. (E) Przedstawia wzrost gonad w czasie dla zwierząt z Rysunku 4B (n = 19). (F) Przedstawia czas wymagany do osiągnięcia 4 wyraźnych punktów czasowych rozwoju w morfogenezie sromki (t1-t4), wskazując na spójne przejście dla wszystkich obrazowanych zwierząt (n = 7). Paski skali wynoszą (A,B) 50 µm oraz (C) 25 µm. Pełny przebieg czasowy znajduje się w Supplementary Movie 1, Supplementary Movie 2 oraz Supplementary Movie 3. Wykresy pudełkowe przedstawiają wartości mediany (czerwone linie) z kwartylami górnym i dolnym oraz słupkami wskazującymi ekstrema rozkładu, z wyłączeniem wartości odstających. Rysunek został zaadaptowany z Berger et al.¹⁸. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Film uzupełniający 1: Pojedyncza larwa C. elegans rozwijająca się od nocnego głodzenia do wczesnego stadium L2. Przedstawiono obrazy epifluorescencyjne z maksymalną projekcją intensywności (całkowita wysokość projekcji wynosi 1,5µm) w formacie nieprzetworzonym. Widoczne są wszystkie zdarzenia podziału i fuzji komórek szwu występujące w określonym stadium (góra). Cechy zostały zarysowane przy użyciu markera DLG-1::GFP (złącze nabłonkowe) w odstępach 15-minutowych przez łącznie 25 h. Film został ponownie wykorzystany z pracy Berger et al.¹⁸. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film uzupełniający 2: Pojedyncza larwa rozwijająca się od późnego stadium L1 do wczesnego stadium L4, wykazująca ekspresję markera EGL-17::CFP (komórka prekursorowa vulvy (VPC) o przeznaczeniu 1°). We wczesnym stadium L2 (~400 min) fluorescencja EGL-17::CFP pojawia się w P6.p, a jej intensywność stale wzrasta. Podczas stadium L3 komórka P6.p przechodzi dwie kolejne rundy podziałów, tworząc stadia 1-komórkowe, 2-komórkowe i 4-komórkowe rozwoju vulvy. Obrazy przedstawiono w odstępach 30-minutowych przez łącznie 34 h. Film pochodzi z publikacji Berger et al.¹⁸. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film uzupełniający 3: Widok z góry: Projekcja Z rozwijającej się wulwy od stadium L3 do przejścia L4/dorosły. Widok z dołu: Projekcja X tej samej wulwy w czasie. Oba widoki pokazują początkowy podział VPC, a następnie inwaginację, formowanie i powiększanie toroidów, po których następuje zapadnięcie podczas ewersji. Obrazy epifluorescencyjne są prezentowane po przycięciu, dekonwolucji, rejestracji i projekcji. Struktury są zarysowane za pomocą markera HMR-1::GFP (hipodermis i VPC) oraz markera mCherry::moeABD (zarysowującego AC). Film został wykorzystany ponownie z publikacji Berger et al.¹⁸. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Plik uzupełniający 1: Plik CAD dla urządzenia L1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Plik CAD dla urządzenia L1-4. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Plik CAD dla urządzenia L2-A. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Plik CAD dla urządzenia L3-A. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Plik CAD dla urządzenia L4-A. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: Plik CAD dla struktury dystrybucji żywności. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 7: Plik CAD dla warstwy zaworowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W artykule opisano działanie unikalnej mikroprzepływowej platformy do długoterminowego obrazowania, która nadaje się do obrazowania w wysokiej rozdzielczości i śledzenia różnych procesów rozwojowych u C. elegans podczas wszystkich czterech stadiów larwalnych do wczesnej dorosłości¹⁸. Możliwość śledzenia procesów rozwojowych w czasie in vivo, przy użyciu tej i innych metod obrazowania, stała się nieodzowna w wielu dziedzinach badań nad C. elegans i pozwoliła na znalezienie odpowiedzi na wcześniej niedostępne pytania 23,24,29.

W przeciwieństwie do tradycyjnych metod obrazowania wykorzystujących podkładki agarowe i wcześniej opublikowanych długoterminowych strategii obrazowania opartych na mikroprzepływach, podejście to zachowuje tożsamość i orientację robaka przez cały czas trwania eksperymentu, umożliwiając śledzenie złożonych procesów rozwojowych w czasie. Niezależnie od etapu rozwoju, zwierzęta są zamknięte w jednym z 41 równoległych kanałów pułapek, z których każdy jest podłączony do wbudowanego źródła pożywienia i pokryty dużym zaworem hydraulicznym. Unieruchomienie wszystkich uwięzionych robaków następuje poprzez napompowanie zaworu hydraulicznego, dociskanie ślimaków do szkła osłonowego tylko podczas akwizycji obrazu. Obrazowanie o wysokiej przepustowości jest możliwe dzięki wąsko rozmieszczonemu układowi kanałów pułapek, z wieloma zwierzętami widocznymi w jednym polu widzenia. Długoterminowe urządzenia do obrazowania są kompatybilne z większością konfiguracji mikroskopów, wymagają minimalnego dodatkowego sprzętu (mniej niż 1000 USD) i nie wymagają modyfikacji istniejącego sprzętu. Obsługa urządzeń jest celowo prosta, więc wszyscy użytkownicy powinni szybko być w stanie się jej nauczyć, postępując zgodnie z powyższym protokołem i przedstawionymi wynikami.

Krótko mówiąc, zwierzęta mogą być obrazowane na chipie w maksymalnie 2,5 stadium larwalnym (ryc. 1C). Zwierzęta są wstępnie synchronizowane i albo bezpośrednio ładowane na chip (urządzenie L1), albo wysiewane na płytkę NGM do pożądanego etapu rozwoju (urządzenia L1-L4 i L2-A). Zwierzęta na chipie są karmione za pomocą wysoce skoncentrowanej zawiesiny bakteryjnej i unieruchamiane za pomocą wbudowanego zaworu hydraulicznego uruchamianego przez oprogramowanie do obrazowania (rysunek 1B). Zwierzęta są manewrowane do kanałów pułapki za pomocą strzykawki, ostrożnie ustawiając zwierzęta z głową w kierunku źródła pożywienia, a na koniec łapiąc zwierzęta na końcu kanału pułapki (Rysunek 1A i Rysunek 2). Należy zachować ostrożność, aby powietrze nie zostało uwięzione w strzykawkach, igłach i rurkach, ponieważ pęcherzyki powietrza łatwo zakłócą pozycję zwierzęcia. Urządzenia są kompatybilne z większością metod obrazowania 18,19,24, ponieważ materiał PDMS jest wysoce przezroczysty, niefluorescencyjny i uszczelniony na cienkim szkle nakrywkowym (Rysunek 4, Film uzupełniający 1, Film uzupełniający 2 i Film uzupełniający 3). Należy jednak zachować ostrożność przy wyborze warunków obrazowania, ponieważ długie czasy naświetlania i wysoka intensywność wzbudzenia łatwo wpływają na żywotność zwierząt i powodują fotowybielanie.

Oprócz przedstawionej wersji tej metody obrazowania, możliwe jest już kilka modyfikacji protokołu. Najprostszą modyfikacją jest zastąpienie standardowych szczepów bakterii, np. bakteriami wykazującymi ekspresję RNAi18 lub bakteriami o różnych wartościach odżywczych³². Szczepy bakteryjne można łatwo wymieniać, dostosowując zawartość Optiprep do różnic w gęstości. Podobnie, do pokarmu bakteryjnego można dodać dowolną liczbę związków, np. auksynę, składniki odżywcze lub małocząsteczkowe związki lecznicze, a ich działanie obserwuje się bezpośrednio in vivo, bez konieczności wprowadzania jakichkolwiek zmian w protokole. W szczególności opracowano urządzenie do wymiany pożywek do degradacji białek indukowanej auksyną lub wszelkich zastosowań, które wymagają czasowej lub odwracalnej ekspozycji poprzez dodanie wlotu pokarmu do układu urządzenia bez zmiany geometrii lub działania. Dodatkowy wlot umożliwia proste przełączanie między dwoma różnymi stanami, np. auksyna i brak auksyny, podłączonymi do urządzenia w taki sam sposób, jak pokazano tutaj dla jednego źródła żywności, a wynikające z tego zmiany są obserwowane bezpośrednio. Opracowano również warianty urządzeń, w których zawór hydrauliczny nie jest współdzielony przez wszystkie jednostki w urządzeniu, ale oddzielony dla każdej jednostki, tak aby można było obrazować wiele warunków w tym samym urządzeniu i eksperymentować indywidualnie, zmniejszając potencjalnie szkodliwe skutki długiego czasu uruchamiania zaworu i akwizycji. Wreszcie, poza oryginalnymi wariantami urządzenia opisanymi w Berger i ^wsp.18, opracowano dwa nowe warianty urządzenia, L3-A i L4-A (wprowadzone tutaj), umożliwiające obrazowanie od połowy etapu L3 lub połowy L4 do dorosłości. Celem tych modyfikacji jest opóźnienie czasu rozpoczęcia eksperymentu do późniejszego stadium larwalnego, tak aby większe zwierzęta mogły być ładowane do zastosowań, w których wcześniejsze stadia rozwojowe nie są interesujące.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zawór elektromagnetyczny 3/2	Distrelec	154-22-898 i 154-22-899	Alternatywa dla powyższego. Zawór elektromagnetyczny łączący regulator ciśnienia z zaworem na chipie.
Arduino	Distrelec	301-01-956	Opcjonalny mikrokontroler w zależności od wybranego kontrolera i interfejsu.
Bacto-Tryptone	Thermo Fisher Scientific	211705	do produkcji bulionu L.
Drożdże bakto-drożdżowe	Thermo Fisher Scientific	212750	Do produkcji bulionu L.
igła 23G	Gonano Dosiertechnik	GGA723050	igła łącząca rurkę 1/16" ze strzykawką.
igła 30G	Gonano Dosiertechnik	IG-TE730050	igła łącząca rurkę 1/32" ze strzykawką.
C. elegans Construct 1	NA		AH5786 LGI: hmr-1(cp21[hmr-1::gfp + LoxP]) Marston, D.J. et al. MRCK-1 napędza zwężenie wierzchołkowe u C. elegans, łącząc wzorce rozwojowe z generowaniem siły. Curr. Biol. 26 (16), 2079-2089. 2016.
C. elegans Construct 2	NA		AH1187 LGII: arIs92[egl-17::cfp] Yoo, A.S., Bais, C., Greenwald, I. Przesłuch między szlakami EGFR i LIN-12 / Notch w rozwoju sromu C. elegans. Nauka. 303 (5658), 663-666. 2004.
C. elegans Construct 3	NA		AH5786 LGV: qyIs50[Pcdh-3>mCherry::moeABD, unc-119(+)] Ziel, J.W., Hagedorn, E.J., Audhya, A., Sherwood, D.R. UNC-6 (netrin) orientuje inwazyjną błonę komórki kotwiczącej u C. elegans. Nat. Cell Biol., 11 (2), 183-189. 2009.
C. elegans Construct 4	NA	NA	ML2615 LGX: dlg-1(mc103[dlg-1::gfp]) Vuong-Brender, T.T.K., Suman, S.K., Labouesse, M. Wierzchołkowy ECM zachowuje integralność zarodka i rozkłada naprężenia mechaniczne podczas morfogenezy. Rozwój. 144 (23), 4336-4349. 2017.
	Distrelec	143-46-644	Potrzebny przy wyborze elektrozaworu z distrelec. Przewód łączący elektrozawór z tranzystorem MOSFET.
Chlorotrimetylosilan	Sigma Aldrich	386529-25ML	Silane do pasywacji wafli.
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8667	dla  Produkcja S-Basal.
Dioda Flyback	Distrelec	110-52-628	Dioda Flyback chroniąca mikrokontroler.
Drążony trzpień stalowy	Gonano Dosiertechnik	GGA7R23050	Drążony stalowy trzpień 23G łączący rurkę 1/16" z urządzeniem.
L Rosół	NA	NA	Przygotowany we własnym zakresie według standardowej receptury. 10 g Bakto-trypton, 5 g Drożdże baktologiczne, 5 g NaCl, H2O do 1 litra, pH do 7,0 przy użyciu 1 M NaOH
Urządzenie do obrazowania długoterminowego L1	NA	NA	Urządzenie do długotrwałego obrazowania larw L1 do wczesnych/środkowych larw L2. Wykonane na miejscu, dostępne na zamówienie. Dostępny również w wariancie wymiany mediów.
Urządzenie do obrazowania długoterminowego L1-4	NA	NA	Urządzenie do obrazowania długoterminowego dla larw od środkowego L1 do środkowego L4. Wykonane na miejscu, dostępne na zamówienie. Dostępny również w wariancie wymiany mediów.
Urządzenie do obrazowania długoterminowego L2-A	NA	NA	Urządzenie do obrazowania długoterminowego od połowy L2 do dorosłości (ewersja). Wykonane na miejscu, dostępne na zamówienie. Dostępny również w wariancie wymiany mediów.
Urządzenie do obrazowania długoterminowego L3-A	NA	NA	Urządzenie do obrazowania długoterminowego dla środkowego L3 do dorosłości (ewersja). Wykonane na miejscu, dostępne na zamówienie. Dostępny również w wariancie wymiany mediów.
Urządzenie do obrazowania długoterminowego L4-A	NA		NA Urządzenie do obrazowania długoterminowego dla połowy L4 do dorosłości (ewersja). Wykonane na miejscu, dostępne na zamówienie. Dostępny również w wariancie wymiany mediów.
Bufor M9	NA		NA Przygotowany we własnym zakresie według standardowej receptury.
MOSFET	Distrelec	303-41-391	Tranzystor polowy metalowo-tlenkowo-półprzewodnikowy, używany do przełączania 24VDC wymaganego dla elektrozaworu.
Talerze NGM	NA	NA Przygotowywane	we własnym zakresie według standardowej receptury.
Nylonowy adapter Fisher Scientific 11776048 Luer-Fitting			z rurki OD 6 mm do igły 23G.
Optiprep	Sigma Aldrich	D1556	Ciecz dopasowująca gęstość.
Zestaw elastomerów	PDMS	Ameba	Elastosil RT601A/B
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443	Niejonowy środek powierzchniowo czynny.
Diwodorofosforan potasu	Sigma Aldrich	1.37039	Dla  Produkcja S-Basal.
Wodorofosforan potasu	Sigma Aldrich	1.05099	Dla  Produkcja S-Basal.
Zasilanie 24VDC	Distrelec	301-63-304	Zasilacz 24VDC. Wybierz zasilacz odpowiedni dla wybranego elektrozaworu.
Precyzyjny regulator ciśnienia	Distrelec	154-23-578	Alternatywny do wyższego. Regulator ciśnienia.
Manometr G1/8	Distrelec	154-23-643	Manometr mocuje się do regulatora ciśnienia.
Rurka PU OD 6mm	Distrelec	154-23-866	Rurka łącząca źródło ciśnienia i regulator, a także regulator i zawór elektromagnetyczny.
Złączka wtykowa G1/8 do 6mm	Distrelec	301-69-330	Alternatywna do wyższej. 2x Złączka wtykowa mocowana do regulatora ciśnienia i łącząca się z rurką 6 mm.
Złączka wtykowa M5 do 6 mm	Distrelec	301-69-459	2x Złączka wtykowa mocowana do elektrozaworu i rurki 6 mm.
S-Basal Buffer	NA	NA	Przygotowany we własnym zakresie według standardowej receptury. 5,85 g NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g KH2PO4, 1 ml cholesterolu (5 mg/ml w etanolu), H2O do 1 litra. Sterylizuj w autoklawie.
Chlorek sodu	Sigma Aldrich	S9625	do produkcji bulionu L i S-Basal.
Wodorotlenek sodu (5M)	Sigma Aldrich	567530	Wodorotlenek sodu stosowany do wybielania C. elegans (przygotować roztwór o stężeniu 5M)
Podchloryn sodu (5%)	Sigma Aldrich	1.05614	Podchloryn sodu stosowany do bielenia C. elegans (przygotować roztwór o stężeniu 5%)
Sitko 10 i mikro; m	pluriSelect	43-10010-40	Alternatywa dla bakteryjnego przygotowywania żywności, zwłaszcza w przypadku stosowania mniejszych urządzeń.
Sitko 5 i mikro; m	pluriSelect	43-10005-40	Sitko służące do filtrowania larw L1 po całonocnej głodówce i bakterii po zakończonym przygotowywaniu posiłków.
SU-8	Gersteltec	GM1050	SU-8 dla wysokości od 1-10 &mikrom.
SU-8	Gersteltec	GM1060	SU-8 dla wysokości od 5-30 &mikrom.
SU-9	Gersteltec	GM1070	SU-8 dla wysokości od 15-200 &mikrom.
Strzykawka 1 ml	Fisher Scientific	11338763	strzykawka 1 ml. W przypadku stosowania innego typu należy upewnić się, że korpus strzykawki i tłok są sztywne, tak aby nie uległy deformacji przez pompę strzykawkową.
Pompa strzykawkowa	WPI	Al1000-220	Pompka strzykawkowa (https://www.wpiinc.com/var-2300-aladdin-single-syringe-pump.html).
Tubka 15 ml	Fisher Scientific	50-809-220	Probówka służąca do wybielania robaków i preparatu bakteryjnego.
Probówka 2 ml	Fisher Scientific NC1186931		Probówka służąca do preparatu robaków i bakterii.
Probówka 50 ml	Fisher Scientific	50-465-232	Probówka służąca do przygotowania i rozwoju bakterii.
Pęseta SMD	Brü tsch Rü jajko Werkzeuge	448980	Pęseta służąca do podłączania rurki 1/32" do urządzenia.
Rurka Tygon 1/16"	Fisher Scientific	642002	Elastyczna rurka o średnicy zewnętrznej 1/16" łącząca większość komponentów z urządzeniem.
Rurka Tygon 1/32"	Fisher Scientific	641900	Elastyczna rurka o średnicy zewnętrznej 1/32" łącząca dopływ bakterii do urządzenia.
UV KUB-3	Kloe	NA	Nakładka na maskę i system ekspozycji UV.
Wafel	Siegert Wafel	4P0/>1/525± 25/TPK/TTV< 10	Wafel krzemowy.
Pojemnik na odpady	NA	NA	Przygotowany we własnym zakresie przy użyciu probówki o pojemności 2 ml lub fiolki kriogenicznej i wydrążonych stalowych kołków.

PDMS.