Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Porównawcza analiza proteomiczna całej nerki, rdzenia i kanalików korowych w patogenezie cukrzycowej uszkodzenia nerek u myszy

1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68177

⸱

2 maja 2025

 ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Hypertension and Proteomics Technology Center, Department of Medicine, University of Louisville School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół analizy proteomicznej całej nerki, izolowanych kanalików korowych i proteomów rdzeniowych. W badaniu porównano również regionalne proteomy w mysim modelu z cukrzycą i myszach bez cukrzycy.

Streszczenie

Definiowanie sekwencji zdarzeń w chorobie nerek jest kamieniem węgielnym praktyki klinicznej w zestawie narzędzi nefrologów. Analizy proteomiczne tkanek są znaczącym podejściem do zrozumienia podstawowych procesów fizjologicznych i molekularnych patofizjologii nerek. Przedstawione przez nas metody i protokoły pozwolą na molekularną dyssekcję nerki w każdym konkretnym obszarze zainteresowania związanym z następstwami choroby. Aby określić wpływ choroby na określone regiony i struktury nerek o unikalnych funkcjach, celem tego protokołu jest zademonstrowanie uproszczonej techniki kompartmentacji nerek myszy i izolacji kanalików korowych nerek w połączeniu z usprawnionymi ilościowymi przepływami pracy proteomicznej bez znaczników. Połączenie tych metod pomoże w identyfikacji zaburzonych wzorców molekularnych w całej nerce, przedziałach rdzeniowych i strukturach kanalików korowych nerek, z ostatecznym i ostatecznym celem proteomiki pojedynczej komórki w kontekstach patologicznych. Zastosowanie tych metod w praktycznie każdym modelu choroby będzie pomocne w określeniu mechanizmów patologii związanych z dysfunkcją nerek.

Wprowadzenie

Przewlekła choroba nerek (PChN) jest poważnym problemem współczesnej medycyny, pochłaniającym ponad 86 miliardów dolarów wydatków na opiekę zdrowotną w samych Stanach Zjednoczonych1. Na całym świecie częstość występowania PChN wzrasta wraz z występowaniem cukrzycy i związanych z nią chorób współistniejących nerek. Blisko 14% populacji USA cierpi na PChN (raport roczny USRDS 2024). Ponadto nefropatia cukrzycowa jest formą PChN i główną przyczyną schyłkowej niewydolności nerek (ESRD), a 60% pacjentów ze schyłkową niewydolnością nerek ma cukrzycę1,2,3. Cukrzyca wpływa na wszystkie struktury nerek i typy komórek nefronów, jednostki funkcjonalnej nerek. Jak pokazano w Rysunek 1, różne porcje nefronów są zawarte w korze nerkowej i obszarach rdzenia. Większość nerek składa się z kanalików. Dysfunkcja kanalików nerkowych i zmiany strukturalne w istotny sposób przyczyniają się do rozwoju nefropatii cukrzycowej (DN), a zmiany te dobrze korelują z tempem pogarszania się funkcji nerek4,5,6,7,8. We wczesnym stadium cukrzycy, w odpowiedzi na zwiększony wychwyt glukozy i związany z tym wychwyt sodu oraz zapotrzebowanie na białka transportowe przez błonę we wszystkich segmentach kanalików, kanaliki ulegają przerostowi. Wraz ze zwiększonym uszkodzeniem mikrokrążenia w późniejszej cukrzycy, kanaliki wykazują atrofię i rozszerzenie, podczas gdy występuje zwłóknienie i ekspansja śródmi<ąższu class="xref">9. Poprzednie badania z naszego laboratorium wykazały zmienione proteomy i obfitość białek odpowiedzi na stres w kanalikach korowych myszy z cukrzycą10,11. Rdzeń jest ważny dla regulacji stężenia moczu, a dysfunkcja podczas choroby nerek jest związana ze stresem oksydacyjnym, a cukrzyca prowadzi do obniżenia ciśnienia tlenu w tym obszarze nerek z powodu zwiększonego zużycia tlenu z aktywności metabolicznej, zwiększonej aktywności białek transportujących błonę i uszkodzenia mikrokrążenia12,13,14.

Zrozumienie szczegółowych mechanizmów rozwoju i progresji DN to ciągły wysiłek, który będzie wymagał nowatorskich i zintegrowanych podejść odwołujących się do modelowania choroby i profilowania molekularnego procesów sygnalizacji, adaptacyjnych zmian w dynamice białek komórkowych oraz precyzyjnego definiowania komórek nerkowych i składników tkanek dotkniętych urazem w przewlekłych warunkach. Proteomika, metabolomika i transkryptomika dają możliwość analitycznego badania mechanizmów molekularnych chorób nerek. Omika to stosunkowo nowa dziedzina, która wykorzystuje podejścia biologii systemowej w celu uzyskania bardziej globalnego zrozumienia systemów biologicznych. Proteomika jest potężnym narzędziem omicznym w nefrologii w ostatnich dziesięcioleciach. Badania nad biomarkerami rozszerzyły się w ciągu ostatnich 20 lat, na co wskazuje wzrost liczby publikacji, chociaż konieczne są szeroko zakrojone prace, aby w pełni wdrożyć te odkrycia do clinic15. Dzięki bardzo różnym populacjom komórek kanalików i odpowiednim rolom funkcjonalnym w korze nerkowej i rdzeniu, analiza proteomiczna całych nerek może maskować unikalne zmiany związane z określonymi strukturami w tych różnych regionach. Dlatego celem tego badania jest wykazanie oddzielenia kory nerkowej i rdzenia, a także oddzielenia kanalików korowych od kłębuszków nerkowych, a następnie szczegółowe protokoły przygotowania ekstraktów białkowych z izolowanych struktur do najnowocześniejszej spektrometrii mas i analiz bioinformatycznych. Mysie modele nefropatii cukrzycowej odgrywają zasadniczą rolę w definiowaniu mechanizmów progresji choroby. W tym badaniu użyliśmy transgenicznej myszy OVE26, u której rozwija się cukrzyca typu I o wczesnym początku i wykazuje cechy wczesnego i późnego stadium DN u ludzi, w tym 1) wczesny wzrost i późniejszy spadek współczynnika filtracji kłębuszkowej, 2) przerost nerek, 3) pogrubienie błony podstawnej kłębuszków nerkowych i rozszerzenie mezangiów, 4) ciężki białkomocz i 5) zwłóknienie cewkowo-śródmiąższowe9, 16,17. Wybrano dwumiesięczne myszy, aby wykazać zmiany proteomiczne w przedziałach kanalików przed jawnymi zmianami strukturalnymi. Jak wcześniej zgłoszono i pokazano w Rysunek 2, 2-miesięczne myszy OVE26 wykazują ekspansję kłębuszkowej macierzy mezangialnej (Rysunek 2, zielona strzałka) i ciężką białkomocz17, bez jawnych zmian histologicznych w kanalikach proksymalnych (Rysunek 2, żółta strzałka) u młodych myszy z cukrzycą. Tutaj przedstawiamy połączone ilościowe podejście proteomiczne do charakterystyki całej nerki, rdzenia i kanalików korowych w celu wyjaśnienia i zilustrowania różnic w proteomie w każdym kompartmencie z cukrzycą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania z myszami OVE26 i FVB zostały zatwierdzone przez wytyczne University of Louisville Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Transgeniczna samica OVE26 (cukrzyca; Szczep #:005564) i FVB (bez cukrzycy; szczep tła; Myszy szczepu #:001800) zakupiono w Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Zwierzęta utrzymywano w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność w temperaturze 25 °C i zapewniono im swobodny dostęp do wody i pożywienia. Wszystkie badania przeprowadzono na 2-miesięcznych myszach.

1. Model zwierzęcy

  1. Izolacja nerek
    1. Znieczulenie myszy należy podawać dootrzewnowo 80 mg/kg ketaminy i 12 mg/kg ksylazyny.
    2. Wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej za pomocą małych nożyczek chirurgicznych i delikatnie przesuń jelita na zewnątrz myszy za pomocą wacików, aby odsłonić żyłę główną.
    3. Wykonaj małe nacięcie w żyle głównej nad prawą nerką.
    4. Przepłukać mysz przez lewą komorę 20 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej zimnymi fosforanami (PBS: pH 7,4; 210 mg/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 726 mg/L Na2HPO4·7H2O) za pomocą pompy perystaltycznej, z szybkością 10 ml/min.
      UWAGA: Ten etap nie jest wymagany, jeśli włączenie białek i komórek krwi do nerek nie jest czynnikiem krytycznym w dalszych analizach.
    5. Usuń nerki za pomocą małych nożyczek chirurgicznych. Usuń nadmiar tłuszczu z zewnętrznej strony nerek. Zważ nerki i umieść je w zimnym PBS na lodzie.
    6. Usunąć torebkę nerkową.
    7. Umieść nerki na szklanym talerzu lub szalce Petriego ustawionej na lodzie. Wykonaj kilka poprzecznych nacięć przez nerki za pomocą żyletki (Ryc. 3), aby uzyskać 3-4 plasterki między górnym i dolnym biegunem nerek.
    8. Odłóż na bok 1-2 środkowe plastry i dwie tyczki (zakreślone plastry nerki w Ryc. 3) z każdej nerki, aby służyły jako próbki "całej nerki". Umieść porcję w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml i dodaj lodowaty bufor homogenizacyjny (10% glicerolu, 50 mM HEPES, 100 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,1% NP40, 10 mM NaF, 0,25 mM NaVO3, 1x inhibitor proteazy HALTS) w ilości około 10 μl/mg próbki tkanki (na podstawie szacowanej masy wycinków nerki, pochodzącej z nabytej masy nerki). Pozostaw tubkę na lodzie.
    9. W przypadku pozostałej części środkowych poprzecznych plasterków połóż plasterek płasko i ostrożnie odetnij korę (zewnętrzny 1 mm) z każdego plasterka za pomocą żyletki lub skalpela (Rysunek 3, schematyczny przebieg pracy). Utrzymuj korę oddzielnie od obszarów rdzenia w celu protokołu izolacji kanalików korowych (poniżej, krok 1.3).
    10. Umieścić część wypreparowanego rdzenia w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml, dodać lodowaty bufor homogenizacyjny, jak w kroku 1.1.8, i pozostawić probówkę na lodzie.
    11. Błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie wszystkich pozostałych całych części nerki i rdzenia nieużywanych do homogenizacji i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Alternatywnie, należy zamrozić wszystkie oddzielone całe przedziały nerki i rdzenia i przechowywać je w sposób opisany w kroku 1.1.11. Wyjąć je z magazynu w późniejszym czasie w celu dodania buforu homogenizacyjnego, jak w kroku 1.1.8.
  3. Izolacja kanalików korowych
    1. Wypreparowaną korę zmielić na 1-3 mm kawałki na szklanej płytce lub szalce Petriego za pomocą żyletki, tworząc pastę.
    2. Trawić rozdrobnioną korę w 1 ml kolagenazy typu IA (1 mg/ml) przez 30 minut, w temperaturze 37 °C, w kołyszącej kąpieli wodnej.
    3. Umieść sitko o pojemności 100 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml na lodzie.
    4. Umieścić strawioną zawiesinę korową na sitku o objętości 100 μm i delikatnie przecisnąć przez sitko za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 10 ml. Umyj górną część sitka 1 ml PBS, a spód sitka 1 ml PBS.
    5. Przepuścić filtrat w probówce o pojemności 50 ml przez dodatkowe sitko o pojemności 100 μm, a następnie przemyć górną część sitka 1 ml PBS.
    6. Przepuścić filtrat przez sitko o wielkości 70 μm umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 ml na lodzie. Kanaliki przejdą przez to sitko do filtratu (kłębuszki zostaną zatrzymane na sitku o średnicy 70 μm). Umyj sitko 1 ml PBS.
    7. Odwirować końcowy filtrat o masie 120 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Wyrzucić nadmiar PBS z osadu kanalika.
    8. Sprawdź czystość osadu kanalików korowych poprzez wizualizację pod mikroskopem, przy użyciu obiektywu 10x. Jeżeli więcej niż 10% frakcji zawiera kłębuszki nerkowe, należy ponownie zawiesić filtrat w 1 ml PBS i przepuścić przez czyste sitko o wielkości 70 μm bez dodatkowego przemywania sitka.
    9. Rozprowadzić wzbogaconą frakcję kanalikową do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i wirować w temperaturze 2000 × g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    10. Dodać bufor homogenizacyjny do osadu kanalika, tak jak w przypadku całej nerki i rdzenia (kroki 1.1.8 i 1.1.10).
  4. Homogenizacja tkanek/ekstrakcja białek
    1. Homogenizować każdy rodzaj próbki w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml za pomocą plastikowego tłuczka przeznaczonego do probówek o pojemności 1,5 ml. Jeśli homogenizowana zawiesina jest zbyt gęsta, w razie potrzeby dodać dodatkowy bufor homogenizacyjny.
    2. Pozostawić homogenizowaną zawiesinę na lodzie na 15 minut, a następnie sonikację na 5 minut w sonikatorze kąpielowym (tylko włącznik/wyłącznik, brak regulowanych ustawień na urządzeniu), z wodą w kąpieli o temperaturze 25 °C. Pozostawić próbki na lodzie na 10 minut.
    3. Krótko zwirować (1000-1500 obr./min), homogenizować, następnie rozcierać 20 razy pipetą i pozostawić na lodzie na kolejne 15 minut.
    4. Próbki należy kilkakrotnie rozcierać przed odwirowaniem w temperaturze 13 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Przenieś oczyszczone ekstrakty białkowe do czystych probówek.
    6. Podwielokrotność 30 μl oczyszczonego ekstraktu do oznaczania białka i przygotowania próbki do analizy metodą spektrometrii mas. Pozostałe próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Protokół trawienia mini kolumny wirowej Suspension-Trap

  1. Trawienie proteolityczne białek na fragmenty tryptyczne do analiz proteomicznych
  2. Rozcieńczyć ~40-50 μg próbki (przy ~2 μg/ μL) do buforu do lizy próbki (10% w/v dodecylosiarczanu sodu [SDS] w 100 mM wodorowęglanu trietyloamonu (TEA-BC) pH 8,5, 40 mM tris (2-karboksetylo)fosfiny [TCEP]) do końcowej objętości 46 μL.
  3. Redukcja i alkilacja białek
    1. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 30 minut (końcowe stężenie TCEP wynosi 20 mM).
    2. Dodać 4 μl 0,5 M jodoacetamidu do wody klasy LC-MS i chromatografii mas (LC-MS) i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) w ciemności przez 30 minut (końcowe stężenie jodoacetamidu wynosi 40 mM).
  4. Dodać 5 μl 12% w/w kwasu fosforowego do wody klasy LC-MS (rozcieńczyć 141 μl 85% kwasu fosforowego w 859 μl wody na 12% roztwór).
    1. Alternatywą dla kwasu fosforowego jest użycie kwasu trifluorooctowego lub kwasu mrówkowego, jeśli wykonujesz wzbogacanie fosfopeptydami18.
  5. Dodać 350 μl buforu wiążącego zawiesinę-pułapkę (100 mM TEA-BC w 90% v/v metanolu/10% v/v pH wody 7,55).
  6. Dodaj próbkę do kolumny pułapki zawieszenia. Wirować przy 4 000 × g przez 30 s w temperaturze pokojowej w wirniku o stałym kącie nachylenia, aby przepuścić każdą objętość przez kolumnę.
  7. Przemyć 4x 400 μL bufora do wiązania zawiesiny. Wirować przy 4 000 x g przez 30 s przy wilgotności względnej w wirniku o stałym kącie nachylenia, aby przepuścić każde płukanie przez kolumnę.
    UWAGA: Aby pomóc w usuwaniu SDS, po każdym praniu obróć kolumnę w wirniku o 180°.
  8. Wirować przy 4 000 g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby całkowicie usunąć bufor wiążący (zapobiega kapaniu podczas trawienia).
  9. Przenieść kolumnę pułapki zawiesiny do czystej probówki zbiorczej.
  10. Dodaj 2,5-5 μg trypsyny w 125 μL 50 mM TEA-BC pH 8,5 w wodzie klasy LC-MS (Trypsin Protease, MS-Grade). Ostateczny stosunek trypsyny do próbki wynosi od 1:20 do 1:10.
  11. Inkubować w temperaturze 47 °C przez 2 godziny (nie dokręcać nakrętki; preferowany jest mieszalnik termiczny ustawiony na 0 obr./min). Przebicie otworu w nasadce za pomocą igły może zapobiec wzrostowi ciśnienia w górnej komorze pułapki zawiesinowej (zwiększone ciśnienie spowoduje, że roztwór trypsyny będzie kapał przez kolumnę).
  12. Dodaj 80 μl 50 mM TEA-BC o pH 8,5 do wody klasy LC-MS. Wirować przy 4 000 g w temperaturze pokojowej przez 1 minutę w wirniku o stałym kącie nachylenia, aby przepuścić każdy trawiony materiał przez kolumnę.
  13. Dodać 80 μl 0,2% v/v kwasu mrówkowego do wody klasy LC-MS. Wirować przy 4 000 g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w wirniku o stałym kącie nachylenia w celu zebrania z trawieniem z kroku 2.11.
  14. Dodaj 80 μl 50% v/v acetonitrylu do wody klasy LC-MS. Wirować przy 4 000 g przy temperaturze pokojowej przez 1 minutę w wirniku o stałym kącie nachylenia w celu zebrania z trawieniem z kroku 2.11.
  15. Przechowywać eluat pułapki zawiesiny w temperaturze -80 °C.
  16. Wysuszyć próbkę w koncentratorze próżniowym.
  17. Wysuszoną próbkę przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Sprzątanie za pomocą kolumny równowagi hydrofilowo-lipofilowej (HLB)

  1. Przygotować roztwory A (2% v/v acetonitrylu/0,1% v/v kwasu mrówkowego) i B (80% v/v acetonitrylu/0,1% v/v kwasu mrówkowego).
  2. Rozpuścić próbkę w 500 μl roztworu A.
  3. Umieść kolumnę w kolektorze próżniowym i zastosuj ciśnienie gazu na poziomie ~1-2 ml/min.
  4. Dodać 500 μl roztworu B do kolumny HLB i opróżnić z prędkością 1-2 ml/min; powtórzyć dwukrotnie.
  5. Dodać 750 μl roztworu A do kolumny HLB i opróżnić z prędkością 1-2 ml/min; powtórzyć dwukrotnie.
  6. Umieścić czystą mikroprobówkę o pojemności 2 ml w stojaku pod kolumną HLB, załadować próbkę do 500 μl roztworu A i ciśnienie gazu jak powyżej; przepuścić przepływ do kolumny po raz drugi.
  7. Umieścić kolumnę HLB nad rurką odpływową, dodać 500 μl roztworu A i ewakuować jak powyżej; powtórzyć dwukrotnie.
  8. Umieścić kolumnę nad czystą mikroprobówką o pojemności 2 ml, dodać 500 μl roztworu B i opróżnić jak powyżej; powtórzyć dwukrotnie.
  9. Zamrozić eluat w temperaturze -80 °C, a następnie wysuszyć w koncentratorze próżniowym. Wysuszoną pozostałość przechowywać w temperaturze -80 °C.
  10. Rozpuścić pozostałość w 20 μl 2% v/v acetonitrylu/0,1% v/v kwasu mrówkowego przed analizą MS. Użyć spektrofotometru, aby oszacować stężenie peptydu przy absorbancji 205 nm.

4. Analiza spektrometrii mas

  1. Jednowymiarowa chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami (LC)-MS/MS
    1. Wstrzyknąć równą masę peptydów (~600 ng) na 1-wymiarowy nano-LC i frakcjonować go na kolumnach C18 z odwróconymi fazami.
    2. Eluować peptydy bezpośrednio do MS przy napięciu rozpylania 1,8 kV, za pomocą rurki przesyłowej jonów utrzymywanej w temperaturze 250 °C.
    3. Uzyskaj widma w zależnym od danych trybie górnych 20 jonów, w którym najbardziej intensywny fragment MS/MS jest usuwany z kolejki analizy, aby poprawić głębokość mapowania jonów na jonach o niższej obfitości.

5. Analiza danych i bioinformatyka

  1. Procedury przetwarzania danych
    1. Po przypisaniu spektralnym i identyfikacji peptydów i białek w PEAKS 12.0 (oprogramowanie do analizy danych LC-MS/MS), prześlij listy białek do analizy w MetaboAnalyst 6.0 (platforma analizy danych metabolomicznych) przy użyciu podejścia jednoczynnikowej analizy statystycznej (https://www.metaboanalyst.ca/).
    2. Użyj oprogramowania do analizy danych LC-MS/MS do wyszukiwania i filtrowania widm przy użyciu ścisłych kryteriów współczynnika fałszywych odkryć (FDR) (1% białka i peptydu) w stosunku do bazy danych FASTA recenzowanej przez mysz.
      UWAGA: Alternatywne programy wyszukiwania, które są łatwo dostępne, obejmują między innymi Maxquant, Proteome Discoverer i inne powszechnie używane opcje.
    3. Określ karbamidometylację cysteiny jako ustaloną modyfikację. Określić utlenianie metioniny jako modyfikację zmienną.
    4. Przekonwertuj listy na format wartości rozdzielanych przecinkami (CSV) i etykiety grup/próbek przypisane do każdej kolumny i wiersza. Ten format jest elastyczny na platformie analizy danych metabolomicznych.
    5. Imputuj brakujące wartości, używając reguły wartości minimalnej 1/5 dla brakujących zmiennych.
    6. Filtruj dane, aby wykluczyć wysoce zmienne wartości przy użyciu przedziału międzykwartylowego, gdzie jako punkt odcięcia jest używany 40% wariancji.
    7. Znormalizuj wartości do mediany intensywności, logarytmu10 przekształconego i średniej wyśrodkowanej na potrzeby skalowania. Użyj innych podejść normalizacji, pamiętając, że wyniki mogą się różnić.
    8. Wykonaj testy T w sposób niesparowany z wartością odcięcia < 0,05. Na tym etapie wykonaj wiele poprawek testowych.
      UWAGA: W tym badaniu nie przeprowadzono tej korekty dla reprezentatywnego zbioru danych do celów prezentacji danych.
    9. Wskaż wykresy wulkanów dla 1,5-krotnej zmiany (FC) i p < 0,05.
    10. Generuj mapy cieplne i wykonuj częściową analizę dyskryminacyjną metodą najmniejszych kwadratów (PLSDA) oraz analizę statystyczną (zmienna o znaczeniu projekcji [VIP]) grup próbek.
    11. Potencjalni kandydaci do kontynuacji są albo wystarczająco silni, aby przyćmić 1,5FC i p-val < 0,05, albo VIP > 1,0, jak wskazano w analizie PLSDA.
    12. Wygeneruj diagramy Venna, aby zilustrować różnice w proteomie całej nerki, kanalika i rdzenia u myszy OVE26.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ogólnie liczba zidentyfikowanych białek dla każdego typu próbki wynosiła: 1) cała nerka (1438), 2) rdzeń (2145) oraz kanaliki korowe (1859). Po przetwarzaniu danych w programie MetaboAnalyst 6.0, filtrowaniu i imputacji, ostateczna liczba analizowanych zidentyfikowanych białek dla każdego przedziału nerki wyniosła: cała nerka (455), rdzeń (997) i kanaliki korowe (896). Rysunek 4 przedstawia globalne zmiany proteomiczne w nerkach myszy cukrzycowych OVE26. Analiza ilościowa bez znakowania (LFQ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metody przedstawione w tym podejściu technicznym mają na celu zilustrowanie porównawczej analizy proteomu różnych obszarów nerki. Tutaj wykorzystaliśmy metody izolacji rdzenia i kanalików korowych u myszy z cukrzycą (OVE26) i kontrolną (FVB) oraz przeprowadziliśmy 1-wymiarową analizę LC-MS / MS i bioinformatyczną, aby zilustrować podstawowe różnice w proteomie w każdej części nerki, oprócz proteomu całych nerek.

Izolacja przedziałów nerkowych wymaga starannego wypreparowania kory z dala od rdz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Podziękowania

Praca nad tym projektem była częściowo wspierana funduszami dla MTB (NIH K01DK080951) i TDC (NephCure-Pediatric Nephrology Research Consortium NKI-2023-04) oraz University of Louisville Kidney Disease Program i Proteomics Technology Center (TDC, MTB).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolagenaza typu 1A Sygnał miliporowyC9891
Exploris 480 Orbitrap Thermofisherhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/BRE725539
Filtr siatkowy MS Falcon Cell, 100 &mikro; mVWR21008-950
Filtr siatkowy Falcon Cell, 70 i mikro; mVWR21008-952
Gibco PBS pH 7,4 Thermo1001023
Halt Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazyVWRPI78440
JodoacetamidSigma AldrichI1149
MetaboAnalyst 6.0 MetaboAnalyst 6.0 https://www.metaboanalyst.ca/platforma do analizy danych metabolomicznych
NanoDrop 2000 Kolumna Thermofisherhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-2000
Oasis HLB Waters186002034
PEAKS 12.0Bioinformatics Solutions IncOprogramowanie do analizy danych LC-MS/MS
Tłuczek do mikroprobówek 1,5 mlFisher ScientificNC0782485
Pułapka do zawieszania (pułapka S)ProtifiC02-micro-10
TCEPThermoFisher Scientific20490
TEABCSigma AldrichT7408
Proteaza trypsynowa, MS-GradeThermoFisher Scientific90057
Cole-Parmer   nr wzoru 0884900
Myjka ultradźwiękowa

Bibliografia

  1. Ding, X., et al. Epidemiological patterns of chronic kidney disease attributed to type 2 diabetes from 1990-2019. Front Endocrinol. 15, 1383777(2024).
  2. Liu, W., et al. Global trends in the burden of chronic kidney disease attributable to type 2 diabetes: an age-period-cohort analysis. Diabetes Obes Metab. 26 (2), 602-610 (2024).
  3. Xie, D., et al. Global burden and influencing factors of chronic kidney disease due to type 2 diabetes in adults aged 20-59 years, 1990-2019. Sci Rep. 13 (1), 20234(2023).
  4. Giunti, S., Barit, D., Cooper, M. E. Mechanisms of diabetic nephropathy: role of hypertension. Hypertension. 48 (4), 519-526 (2006).
  5. Thomas, M. C., Burns, W. C., Cooper, M. E. Tubular changes in early diabetic nephropathy. Adv Chronic Kidney Dis. 12 (2), 177-186 (2005).
  6. Thomas, M. C., et al. Diabetic kidney disease. Nat Rev Dis Primers. 1, 15018(2015).
  7. Nath, K. A. Tubulointerstitial changes as a major determinant in the progression of renal damage. Am J Kidney Dis. 20 (1), 1-17 (1992).
  8. Bonventre, J. V. Can we target tubular damage to prevent renal function decline in diabetes. Semin Nephrol. 32 (5), 452-462 (2012).
  9. Powell, D. W., et al. Renal tubulointerstitial fibrosis in OVE26 type 1 diabetic mice. Nephron Exp Nephrol. 111 (1), e11-e19 (2008).
  10. Cummins, T. D., et al. Quantitative mass spectrometry of diabetic kidney tubules identifies GRAP as a novel regulator of TGF-beta signaling. Biochim Biophys Acta. (4), 653-661 (2010).
  11. Barati, M. T., et al. Differential expression of endoplasmic reticulumstress-response proteins in different renal tubule subtypes of OVE26 diabetic mice. Cell Stress Chaperones. 21 (1), 155-166 (2016).
  12. Zheleznova, N. N., et al. Mitochondrial proteomic analysis reveals deficiencies in oxygen utilization in medullary thick ascending limb of Henle in the Dahl salt-sensitive rat. Physiol Genomics. 44 (17), 829-842 (2012).
  13. Nordquist, L., Palm, F. Diabetes-induced alterations in renal medullary microcirculation and metabolism. Curr Diabetes Rev. 3 (1), 53-65 (2007).
  14. dos Santos, E. A., Li, L. -P., Ji, L., Prasad, P. V. Early changes with diabetes in renal medullary hemodynamics as evaluated by fiberoptic probes and BOLD magnetic resonance imaging. Invest Radiol. 42 (3), 157-162 (2007).
  15. Cummins, T. D., et al. Quantitative Mass Spectrometry Normalization in UrineBiomarker Analysis in Nephrotic Syndrome. Glomerular Dis. (3), 121-131 (2022).
  16. Carlson, E. C., Audette, J. L., Klevay, L. M., Nguyen, H., Epstein, P. N. Ultrastructural and functional analyses of nephropathy in calmodulin-induced diabetic transgenic mice. Anat Rec. 247 (1), 9-19 (1997).
  17. Zheng, S., et al. Development of late-stage diabetic nephropathy in OVE26 diabetic mice. Diabetes. 53 (12), 3248-3257 (2004).
  18. Wang, F., Veth, T., Kuipers, M., Altelaar, M., Stecker, K. E. Optimized suspension trapping method for phosphoproteomics sample preparation. Anal Chem. 95 (25), 9471-9479 (2023).
  19. Mather, A., Pollock, C. Glucose handling by the kidney. Kidney Int Suppl. 120, S1-S6 (2011).
  20. Ross, B. D., Espinal, J., Silva, P. Glucose metabolism in renal tubular function. Kidney Int. 29 (1), 54-67 (1986).
  21. Roger, F., Martin, P. Y., Rousselot, M., Favre, H., Féraille, E. Cell shrinkage triggers the activation of mitogen-activated protein kinases by hypertonicity in the rat kidney medullary thick ascending limb of the Henle's loop: requirement of p38 kinase for the regulatory volume increase response. J Biol Chem. 274 (48), 34103-34110 (1999).
  22. Yang, J., Lane, P. H., Pollock, J. S., Carmines, P. K. PKC-dependent superoxide production by the renal medullary thick ascending limb from diabetic rats. Am J Physiol Renal Physiol. 297 (5), F1220-F1228 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Proteomika nerekcukrzycowe uszkodzenie nerekizolacja kanalików korowychproteomika rdzeniaspektrometria masbezetykietowa ilościowa proteomikaprzedziały nerek myszyproteomika pojedynczych komórekidentyfikacja białekanaliza wykresu wulkanicznego
Porównawcza analiza proteomiczna całej nerki, rdzenia i kanalików korowych w patogenezie cukrzycowej uszkodzenia nerek u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.