Artykuł metodologiczny

Ulepszone dostarczanie i ekspresja genów za pomocą dokostnego wstrzykiwania nanocząstek chitozanu Enkapsulowane plazmidy edytora zasad adeninowych

DOI:

10.3791/68181

⸱

16 maja 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anhui University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy podejście do terapii genowej, które dostarcza chitozan pokryty ABE bezpośrednio do szpiku kostnego poprzez wstrzyknięcie doszpikowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostarczanie egzogennych plazmidów do zwierząt doświadczalnych ma kluczowe znaczenie w badaniach biomedycznych, w tym w badaniu funkcji genów, wyjaśnianiu mechanizmów chorobowych i ocenie skuteczności leków. Jednak skuteczność transfekcji obecnej metody jest stosunkowo niska, a wprowadzenie plazmidów do długotrwałej ekspresji genów może być zakłócone przez układ odpornościowy. Aby rozwiązać te ograniczenia, opracowaliśmy i zbadaliśmy nową metodę, która wykorzystuje chitozan do enkapsulacji plazmidów edytora zasad adeninowych (ABE), a następnie bezpośredniego dostarczania kompleksu do szpiku kostnego myszy poprzez wstrzyknięcie doszpikowe. W tym badaniu, aby celować w gen δ CaMK II , który jest ściśle związany z różnicowaniem osteoklastów, wykorzystaliśmy chitozan do enkapsulacji plazmidów ABE CaMK II δ . Bezpośrednio wstrzyknęliśmy ładunek plazmidu do jamy szpiku kostnego za pomocą iniekcji doszpikowej. Wyniki wykazały wysoką skuteczność edycji in vivo wynoszącą 14,27% w locus A1 i 10,69% w locus A2 u myszy biorców. Ta nowatorska strategia jest nie tylko szczególnie przydatna w chorobach spowodowanych nieprawidłową funkcją osteoklastów, ale ma również znaczny potencjał w dziedzinie terapii genowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapia genowa okazała się obiecującym podejściem w dziedzinie badań biomedycznych 1,2. Oferuje ona potencjał do leczenia różnych zaburzeń poprzez wprowadzanie obcych plazmidów u zwierząt doświadczalnych w celu modulowania ekspresji określonych genów i badania ich efektów terapeutycznych. Konwencjonalne metody dostawy napotkały jednak pewne problemy, które ograniczają ich skuteczność i bezpieczeństwo3. Obawy obejmują niską wydajność transfekcji, wysokie uszkodzenia biologiczne i niską wydajność ekspresji genów. W związku z tym konieczne jest opracowanie nowatorskiej metody dostarczania terapii genowej, która może przezwyciężyć te ograniczenia.

Chitozan jest naturalnym polisacharydem o dobrej biodegradowalności i biokompatybilności 4,5,6, co ułatwia jego degradację w organizmach zwierzęcych bez powodowania poważnej toksyczności biologicznej. Jest szeroko stosowany w dostarczaniu leków ze względu na wysoki współczynnik osadzania leku 7,8, zwiększoną wydajność dostarczania i zmniejszone szkody dla zwierząt.

Technologia edycji genów ABE, która umożliwia bezpośrednią konwersję par zasad A-T do G-C, jest obiecująca w badaniach genetycznych i medycznych. W porównaniu z obecną technologią edycji genów głównego nurtu, technologia ABE może osiągnąć dokładną mutację pojedynczej zasady, zmniejszając w ten sposób edycję sekwencji DNA niebędących celem, zmniejszając efekty off-target 9,10 i prowadząc do zera pęknięć dwuniciowych DNA11, co znacznie zmniejsza ryzyko edycji genów12. Technologia ABE jest również wysoce biokompatybilna i jest bardziej odpowiednia do badań nad leczeniem chorób.

Iniekcja do żyły ogonowej jest powszechną metodą stosowaną do dostarczania plazmidów in vivo, zwłaszcza w terapii genowej. Genem docelowym dla tego badania jest CaMK II δ, który jest ściśle związany z różnicowaniem osteoklastów13,14. Zastosowanie iniekcji doszpikowej zamiast żyły ogonowej pozwala edytowanemu plazmidowi dostać się do osteoklastów bezpośrednio do szpiku kostnego. Ta bezpośrednia transmisja do szpiku kostnego zwiększa wydajność i stabilność ekspresji genów, co jest korzystne w leczeniu chorób związanych z dysfunkcją osteoklastów.

W tym miejscu przedstawiamy nowatorską metodę, która polega na kapsułkowaniu plazmidu ABE chitozanem, a następnie bezpośrednim wprowadzeniu kompleksu do myszy poprzez wstrzyknięcie doszpikowe. Mamy nadzieję, że dzięki tej metodzie uda nam się utorować drogę do skuteczniejszego leczenia terapią genową obcych plazmidów wnikających do organizmów, zwłaszcza chorób związanych z dysfunkcją osteoklastów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Zdrowia Zwierząt Uniwersytetu Anhui ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami. W tym badaniu ABE zostało hojnie podarowane przez profesora Tian Chi (Uniwersytet Nauki i Technologii w Szanghaju, Szanghaj, Chiny; Rysunek 1D).

1. Budowa plazmidu ABE

  1. Zaprojektuj gRNA z sekwencją TCCATGATGCACAGGAGAGGA, w której PAM jest prezentowany przez GAC.
  2. Zgodnie z firmowym przewodnikiem po liście podkładów, dodaj podkład do odpowiedniej objętości ddH2O, aby uzyskać stężenie 100 μM. Następnie wstrząśnij i dokładnie wymieszaj, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Do reakcji wyżarzania należy przygotować roztwór 10 μM, dodając 10 μl podstawowego roztworu startera do nowej probówki do mikrowirówki, 90 μl ddH2O i dobrze wymieszać.
  3. Dodać 5 μl startera przed przepływem, 5 μl startera za starterem i 40 μl ddH2O do probówki mikrowirówkowej. Aby ułatwić reakcję wyżarzania, zanurz rurkę w pojemniku wypełnionym wrzącą wodą na 5 minut. Upewnij się, że poziom wody nie sięga otworu rurki, aby zapobiec przedostawaniu się wody i zanieczyszczeniu podkładów. Schłodzić do temperatury pokojowej, aby zakończyć reakcję wyżarzania.
  4. Dodać 2 μg pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP (ryc. 1D), 1 μl ESP3I, 4 μl buforu i 33 μl ddH2O do probówki mikrowirówkowej i pozostawić do reakcji w łaźni wodnej o stałej temperaturze 37 °C przez 45 min.
  5. Wykonaj elektroforezę w żelu agarozowym. Przygotuj żel 1% agarozowy, ważąc 0,5 g agarozy i przelej go do szklanej butelki. Dodaj 50 ml buforu 1x TAE do szklanej butelki i wstrząśnij, aby rozpuścić proszek agarozy. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez 2 minuty, aż całkowicie się rozpuści. Dodaj 5 μl YeaRed Nucleic Acid Gel Stain, dokładnie wymieszaj i wlej do formy żelowej; Po zestaleniu się żelu zacznij dodawać próbki.
    UWAGA: Do przygotowania 1xTAE należy użyć odczynników wymienionych w Tabeli 1.
  6. Dodaj 1x TAE do zbiornika do elektroforezy i włóż skonfigurowany blok żelu agarozowego, który należy zanurzyć w TAE. Dodać 5 μl 1x buforu ładującego do produktu mineralizacji z kroku 1.4 i wymieszać. Dodaj próbkę do żelu. Dodatkowo do żelu należy dodać 6 μl markera.
  7. Uruchom program elektroforezy przy stałym napięciu 110 V przez 35 minut. Po elektroforezie określ położenie pasma w próbce zgodnie ze znacznikiem i odetnij pasek żelu czystym ostrzem w celu odzyskania żelu.
  8. Wykonaj operację odzyskiwania żelu zgodnie z instrukcją zestawu do oczyszczania żelu maxi. Ustawić łaźnię wodną na 50 °C. Dodać odpowiednią objętość roztworu PN do probówki zawierającej cięty żel zgodnie z zestawem. Nakłuć żel końcówką pipety, aby ułatwić rozpuszczenie, a następnie umieścić go w łaźni wodnej. Raz na jakiś czas potrząsaj probówką i obserwuj proces rozpuszczania, aż do całkowitego rozpuszczenia bloku żelu.
  9. Weź kolumnę wirową, CA3, z zestawu. Dodać 500 μl roztworu BL z zestawu do kolumny wirowej i odwirować go przy 2 000 x g przez 1 minutę w celu zrównoważenia kolumny. Po odwirowaniu usunąć ciecz odpadową z dna probówki zbiorczej i umieścić kolumnę adsorpcyjną z powrotem w probówce zbiorczej.
  10. Kontynuować wirowanie przy 2 000 x g przez 1 min. Wylać odpady cieczy na dno probówki wirówkowej, dodać 600 μl roztworu PN i odwirować 2 000 x g przez 30 s; Ponownie wyrzuć zużytą ciecz. Powtórz operację i ponownie wyrzuć zużytą płyn.
  11. Po odwirowaniu zastąp probówkę zbiorczą o pojemności 2 ml nową probówką o pojemności 1,5 ml. Otwórz pokrywę i pozostaw do wyschnięcia w przewiewnym miejscu na 30 minut, aby całkowicie usunąć etanol. Następnie dodać podgrzane 40 μl ddH2O, odwirować i wymyć wymagane DNA.
    UWAGA: PN należy dodawać z bezwodnym etanolem zgodnie z instrukcją. Użycie podgrzanej wody może zwiększyć wydajność.
  12. Dodać 7 μl produktu do wyżarzania z kroku 1.3, 3 μl produktu do odzyskiwania żelu z kroku 1.11, 1 μl ligazy DNA T4, 2 μl 10x buforu ligazy T4 i 7 μl ddH2O do probówki mikrowirówki i przechowywać przez noc w temperaturze 16 °C w celu uzyskania produktu ligacji.
  13. Dodać 10 μl produktu do ligacji i 70 μl DH5α w probówce mikrowirówkowej na lodzie przez 30 min. Ustawić łaźnię wodną na 42 °C. Po kąpieli lodowej włóż rurkę do łaźni wodnej na 90 s, a następnie ponownie na lodzie na 2 min.
  14. Do probówki dodać 600 μl płynnego podłoża Luria-Bertani (LB) i wstrząsać na shakerze przez 30 minut. W tym samym czasie należy napromieniać płytkę LB ze stałym medium wewnątrz komory laminarnej przez 30 minut. Po inkubacji równomiernie rozprowadzić 100 μl roztworu na płytce. Po pokryciu należy umieścić płytkę do góry nogami w inkubatorze bakteryjnym o temperaturze 37 °C w celu przeprowadzenia hodowli.
    UWAGA: DH5α jest zwykle przechowywany w temperaturze -80 °C. LB stałe podłoże jest przygotowywane przy użyciu odczynników wymienionych w tabeli 2. Płynne podłoże LB przygotowuje się przy użyciu odczynników wymienionych w tabeli 3.
  15. Wybierz pojedynczą kolonię i rozwijaj kolonię bakteryjną przez 14 godzin na świeżej płytce. Weź probówkę wirówkową o pojemności 50 ml, dodaj 50 ml płynnej pożywki LB, dodaj 50 μl ampicyliny w stosunku 1:1000 i dobrze wymieszaj. Podziel to na nowe probówki po 15 ml na probówkę.
  16. Sprawdź płytkę hodowlaną pod kątem okrągłych białych kolonii o dobrym wzroście. Wybierz je za pomocą pipety o pojemności 10 μl i przenieś do pożywki LB. Hoduj to w wytrząsarce przez 12 godzin, a następnie wyślij tę próbkę do sekwencjonowania.
  17. Porównaj wyniki sekwencjonowania z docelowym gRNA, aby zidentyfikować szczep z pasującą sekwencją, Camk II δ-sgRNA, jako szczepem docelowym, a następnie wyekstrahuj plazmid.
  18. Wykonaj ekstrakcję plazmidu zgodnie z instrukcjami zestawu mini plazmidów. Dodać 500 μl BL do kolumny adsorpcyjnej CP3, odwirować przez 1 minutę przy 2 000 x g i wyrzucić odpad ciekły. Umieść kolumnę adsorpcyjną z powrotem w probówce zbiorczej. Dodać 500 μl roztworu bakteryjnego i odwirować przy 4 000 x g przez 10 minut.
  19. Zbierz przepływ. Ponownie odwirować, a po usunięciu supernatantu dodać 250 μl P1 do probówki wirówkowej z wytrącaniem bakteryjnym, a następnie przenieść do probówki mikrowirówkowej i odwirować. Dodaj 250 μL P2 i delikatnie odwróć 6x-8x. Dodaj 350 μL P3 i ponownie delikatnie odwróć 6x-8x. Pojawia się biały kłaczkowaty osad.
  20. Wirować przez 10 minut przy 2 000 x g. Przenieść supernatant do nowej kolumny adsorpcyjnej CP3, odwirować przy 2 000 x g przez 30 s i usunąć odpady cieczowe. Dodać 600 μl PW, ponownie odwirować przy 2.000 x g przez 30 s i usunąć odpady. Ponownie dodać 600 μl PW, odwirować przy 2.000 x g przez 30 s i usunąć odpady.
  21. Umieścić kolumnę adsorpcyjną w probówce zbiorczej i wirować przez 2 minuty przy 2,000 x g , aby usunąć resztki PW. Następnie umieścić kolumnę adsorpcyjną w czystej probówce do mikrowirówki, pozostawić do wyschnięcia na 30 minut i dodać 35 μl podgrzanego ddH2O do środka filmu adsorpcyjnego, a następnie przechowywać otrzymany produkt w temperaturze -20 °C do kolejnych testów.
    UWAGA: PW należy dodać z bezwodnym etanolem zgodnie z instrukcją. Użycie podgrzanej wody może zwiększyć wydajność.

2. Ekstrakcja komórek szpiku

  1. Wybierz myszy KM w wieku 8-9 tygodni (dopuszczalne są również myszy inne niż szczepy KM), samce i o wadze około 30 g. Zamocuj myszy w lewej ręce z głową skierowaną w dół i wstrzyknij 150 μl 1% pentobarbitalu sodu z boku brzucha za pomocą strzykawki prawą ręką. Potwierdź znieczulenie przez uszczypnięcie palca u nogi.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z lokalnymi wytycznymi instytucjonalnymi, aby uzyskać odpowiedni schemat znieczulenia.
  2. Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy myszy, usuń kość piszczelową nożyczkami chirurgicznymi i pęsetą oraz usuń otaczający nadmiar tkanki mięśniowej. Namocz usuniętą piszczel w PBS i umyj, pozostawiając tylko czyste kości.
  3. Weź 1 ml PBS do strzykawki, aby przepłukać komórki szpiku kostnego z jednego końca kości piszczelowej, aż kość stanie się biała.
  4. Zebrać zawiesinę komórkową i odwirować w temperaturze 800 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Po usunięciu supernatantu należy poddać krwinki czerwone lizie za pomocą 500 μl lizatu krwinek czerwonych. Po 1 minutach dodać 1 ml buforu separacyjnego, aby zakończyć lizat krwinek czerwonych. Po odwirowaniu w temperaturze 800 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, usunąć supernatant i umieścić komórki na lodzie do późniejszego wykorzystania.
    UWAGA: Jeśli czerwone krwinki są całkowicie zmielone, komórki wytrącają się i nie są widoczne żadne czerwone krwinki. Jeśli krwinki czerwone są nadal widoczne, można je ponownie poddać lizie, ale czas inkubacji nie powinien być zbyt długi, aby uniknąć uszkodzenia innych komórek.

3. Transfekcja chitozanu

  1. Przygotowanie chitozanu: Odważyć 4 mg chitozanu i rozpuścić w 20 ml 0,2 mg/ml roztworu kwasu octowego. Doprowadzić pH do 5,5 za pomocą 10 M NaOH. Weź 500 μl tego roztworu i dodaj go do pojedynczych probówek do mikrowirówek.
  2. Dodaj 2 μg, 3 μg, 4 μg i 5 μg plazmidów ABE do pojedynczych probówek i rozpuść je w 500 μl 30 mM Na2SO4. Zmieszać 500 μl roztworu chitozanu i 500 μl plazmidu.
  3. Inkubować je w łaźni wodnej w temperaturze 50-55 °C przez 15 minut. Po dokładnym wymieszaniu obu roztworów wirować przez 15-30 s i odstawić na 30 minut.
  4. Charakterystyka chitozanu: Analizuj średnice i potencjały zeta chitozanu za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS), ze stężeniem chitozanu utrzymywanym na poziomie 0,1 mg / ml w ddH2O. Uruchom każdą próbkę 3 razy.
  5. Odlewać próbki o wielkości 0,1 mg/ml na chip krzemowy. Dodać 20 μl zawieszonych próbek do siatki o oczkach 200 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Zabarwić kratki 2% kwasem fosfowolframowym przez 3 minuty i usunąć pozostałą ciecz bibułą filtracyjną. Obserwuj za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego.
  6. Skuteczność enkapsulacji nanocząstek: Przefiltruj supernatant za pomocą filtra 0,1 μm, aby usunąć niewytrącone cząstki. Prześlij plazmid i zmierz stężenie za pomocą spektrofotometru przy 260 nm. Obliczone sprawności plazmidu ABE i plazmidu gRNA wynosiły odpowiednio 84% ± 0,37% i 85% ± 0,53%.
  7. Wstrzyknąć 100 μl chitozanu osadzonego w plazmidzie myszom przez jamę szpiku kostnego (krok 5). Po 7 dniach od wstrzyknięcia należy wyizolować komórki szpiku kostnego i poddać lizie krwinki czerwone zgodnie z opisem w kroku 2.
  8. Dodać 2 ml pożywki DMEM zawierającej surowicę do 6-dołkowych płytek do hodowli komórek i dodać komórki szpiku kostnego (około 1 x 106) zawieszone w 500 μl pożywki DMEM zawierającej surowicę. Zmierz intensywność fluorescencji pod mikroskopem fluorescencyjnym. Plazmid CaMK II δ-sgRNA ma czerwoną fluorescencję TagRFP po wzbudzeniu przy 580 nm (ryc. 2B).
    UWAGA: Pożywkę DMEM zawierającą surowicę przygotowuje się przy użyciu odczynników wymienionych w Tabeli 4.

4. Cytometria przepływowa

  1. Przygotuj różne dawki plazmidów ABE: 2 μg, 3 μg, 4 μg i 5 μg i dostarcz myszom biorcom zgodnie z opisem w kroku 3. Po 7 dniach odizoluj komórki szpiku kostnego od myszy, jak opisano w kroku 3.
  2. Zebrać komórki szpiku kostnego i odwirować przy sile 800 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant i poddać krwinki czerwone lizie za pomocą 500 μl lizatu krwinek czerwonych. Po upływie 1 minuty zakończyć reakcję 1 ml buforu rozdzielającego i policzyć liczbę komórek za pomocą licznika komórek.
  3. Przenieść 1 x 106 komórek do nowej probówki do mikrowirówki i wirować z 800 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić komórki z 500 μl PBS i przenieść je do rurki przepływowej. Zmierz wydajność za pomocą cytometrii przepływowej. Przygotuj grupę kontrolną cytometrii przepływowej zgodnie z opisem w kroku 2.
    UWAGA: Szczątki komórek i martwe komórki z niższymi sygnałami FSC i znajdujące się w lewym dolnym rogu wykresu punktowego FSC w porównaniu z SSC (mniej niż 400) zostały wykluczone (Rysunek 3). Ponieważ plazmidy mają czerwoną fluorescencję TagRFP, można je posortować.

5. Iniekcja do jamy szpiku kostnego

  1. Wybierz samce myszy KM w wieku od 8 do 9 tygodni, o wadze około 30 g. Znieczulij je wstrzyknięciem dootrzewnowym 150 μl 1% pentobarbitalu sodu (krok 2.1). Po znieczuleniu nałóż sterylny lubrykant do oczu zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu rogówki i owrzodzeniom. Potwierdź głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z lokalnymi wytycznymi instytucjonalnymi, aby uzyskać odpowiedni schemat znieczulenia.
  2. Zamocuj znieczuloną mysz w pozycji leżącej na stole operacyjnym i przymocuj przednią kończynę myszy taśmą.
  3. Zdezynfekuj tylną kość piszczelową myszy wacikiem nasączonym alkoholem. Napełnij sterylny roztwór plazmidu do wstrzyknięcia w strzykawce o pojemności 1 ml za pomocą igły 26G. Usunąć pęcherzyki powietrza i przygotować się do wstrzyknięcia.
  4. Dotknij goleni myszy i przytrzymaj goleń myszy palcami. Określić położenie igły iniekcyjnej w taki sposób, aby trzon piszczeli został przebity z płaskowyżu piszczelowego w stawie kolanowym myszy. Obróć igłę do wstrzykiwań równolegle do kości piszczelowej, wbij ją w jamę szpiku kostnego i wstrzyknij powoli (około 3 s) 100-200 μl, aby zminimalizować uszkodzenia myszy.
  5. Po wykonaniu wstrzyknięcia należy powoli wyciągnąć igłę (około 3 s) i natychmiast za pomocą wacika nasączonego alkoholem zatamować krwawienie i zdezynfekować miejsce wkłucia.
  6. Umieść klatkę myszy na poduszce grzewczej lub (ostrożnie) pod lampą grzewczą, tak aby temperatura otoczenia wynosiła około 37 °C. Poczekaj, aż myszy wyzdrowieją ze znieczulenia i obserwuj ich powrót do zdrowia.

6. Sekwencjonowanie Sangera

  1. Siedem dni po wstrzyknięciu należy pobrać komórki szpiku kostnego myszy zgodnie z opisem w kroku 2 i wyizolować genomowe DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji. Zebrać komórki, odwirowując przy 2 000 x g przez 1 minutę. Odrzucić supernatant, dodać 200 μl roztworu GA i wibrować mieszadłem wirowym. Dodać 20 μl proteinazy K i 200 μl GB, wymieszać, a następnie umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C na 10 minut.
  2. Po inkubacji dodać 200 μl bezwodnego etanolu, wstrząsać przez 15 s, a następnie umieścić zmieszaną ciecz w kolumnie adsorpcyjnej. Odwirować przy 2 500 x g przez 1 minutę, wylać odpad ciekły na dno probówki i dodać 500 μl roztworu GD. Odwirować i wyrzucić odpadową ciecz, umyć granulat 2x PW, a na koniec wysuszyć, eluując go 40 μl czystej wody.
    UWAGA: PW należy dodać z bezwodnym etanolem zgodnie z instrukcją.
  3. Amplifikować docelowy gen CaMKIIδ metodą PCR z sekwencją startera do przodu gctaaggtgataaatgtggcact i odwrotną sekwencją startera ctagtgtggggccagattc. Przygotować reakcję PCR, dodając 25 μl buforu 2x, 1 μl mieszanki dNTP, 2 μl startera do przodu, 2 μl startera odwrotnego, 1 μl polimerazy DNA, 2 μl matrycy DNA i 17 μL ddH2O. Uruchom następujący program PCR: 95 °C przez 3 min, 95 °C przez 15 s, 53,7 °C przez 30 s, 72 °C przez 60 s, 12 °C przez zachowanie ciepła.
  4. Po PCR przygotuj 1% żel agarozowy i wykonuj elektroforezę w żelu agarozowym przy napięciu 110 V przez 35 minut (krok 1.5, krok 1.6). Po elektroforezie należy przeciąć docelowy obszar żelu i wysłać do sekwencjonowania Sangera (ryc. 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazmidy in vitro wstrzyknięto myszom przez wstrzyknięcie doszpikowe (ryc. 1A). Średnia wielkość cząstek nanocząstek wynosiła około 202,9 nm, potencjał wynosił 2,77 mV, a PDI wynosił 0,22 (rysunek 1B). Rysunek 1C przedstawia kształt powierzchni nanocząstek zaobserwowanych jako sferyczne za pomocą mikroskopii elektronowej. Rysunek 1D przedstawia mapę plazmidową ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W przypadku badań biomedycznych wyzwanie związane z dostarczaniem egzogennych plazmidów zwierzętom polega na poprawie efektywności dostarczania i ekspresji genów przy jednoczesnym zminimalizowaniu szkód dla zwierząt w celu osiągnięcia pożądanego efektu terapeutycznego15,16. Przedstawiamy nowatorską metodę doszpikowego wstrzykiwania plazmidu ABE za pośrednictwem chitozanu do komórek szpiku kostnego myszy biorców. Strategia ta poprawia wydajność dostarczania plazmi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta została sfinansowana przez Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Anhui (2208085MC74, 2208085MC51) oraz Fundację Badań Naukowych z Departamentu Edukacji Prowincji Anhui w Chinach (KJ2021A0055).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 ml probówki do PCR, płaska nakrętkaWYBIERZ LABSELECT  PT-02-C
Strzykawka 1 mlAnhui Jiangnan sprzęt medyczny Co., LTD/
1% pentobarbital sodu//
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlWYBIERZ LABSELECTMCT-001-150 (Przekaźnik MCT-001-150)
10 i razy; Bufor ładujący DNAWazymeZobacz materiał P022-01
10X bufor ligazy DNA T4 1 mlTaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., LTD2011A
1250 μ l Końcówka do pipet 102,1 mmWYBIERZ LABSELECTT-001-1250
200 μ l Końcówki do pipet 50,55 mmWYBIERZ LABSELECT  T-001-200
2x Phanta Max BufferaWazymeZobacz materiał P505-d1
4 ? wirówkaRybak termiczny75002425
50 ml Probówka wirówkowaWYBIERZ LABSELECTT-012-50
6-dołkowe płytki do hodowli komórkowychWYBIERZ LABSELECT11110
AgarSangon BiotechnologiaA505255-0250
AmpAbiowell (Abiowell)/
ChitozanSangon BiotechnologiaA600614-0500
Wytrząsarka do kultur o stałej temperaturzeSzanghaj Zhicheng Produkcja instrumentów analitycznych Co., LTDZWY-200D
Hrabina Automatyczny licznik komórekThermo Fisher NaukowyHrabina II/II FL
Szkiełka i uchwyt komory liczenia komórek hrabiny, jednorazoweThermo Fisher NaukowyZobacz materiał C10228
Bufor CutSmartLaboratoria biologiczne w Nowej AngliiB7204SVIAL
DH5 i alfa;Ogólne systemy biologiczneCS01010
DMEM (DMEM)Certyfikat GibcoC11995500BT
Mieszanie dNTPWazymeZobacz materiał P505-d1
Enzym Esp3INEBiolabs powiedział:Czynnik R0734S
Kwas etylenodiaminotetraoctowyVETEC (sigma-aldrich)V900106
Surowica bydlęca płoduOriCell (OriCell)FBSAD-01011-500
Cytometr przepływowyBD FACSCalibur342975
Rura przepływowaBeyotime BiotechnologiaFFC005-1torba
Mikroskop fluorescencyjnyKsięga Leica427019
Zestaw do oczyszczania żelu maxiTIANGENZobacz materiał DP210
Zestaw do ekstrakcji genomowego DNATIANGENDP304 (wersja angielska)
Lodowaty kwas octowyKorporacja Chińskiej Narodowej Grupy Farmaceutycznej10000218
GoldBand DL2,000 DNA MarkerYESEN (TAK)Numer katalogowy: 10501ES60
Maszyna do loduSzanghajzhengqiao powiedział:Zobacz materiał BNS-30Laboratorium zarezerwowane
Bufor ImunoSepPrecision Biomedicals Co., Ltd604050
Seria małych wirówek stołowych Megafuge 8Thermo Fisher Naukowy75004250
MEMTechnologia życiowa11140050
NanoDrop 2000 Thermo Fisher Scientific, Stany Zjednoczone
NaOH powiedział:SIGAM powiedział:S5881-500G
PBSXiGene (Język Xi)Zobacz materiał XG3650
Grafika wektorowa PCMV-SPRY-ABE8E//
Aparatura do amplifikacji PCRRybak termicznyAKC96300441
Penicylina/Streptomycyna Solarbio (Słoneczna Biologia)Zobacz materiał P1400
peptonSangon BiotechnologiaA505247-0500
Polimeraza DNA Phanta Max Super-FidelityWazymeZobacz materiał P505-d1
Lizat krwinek czerwonychBeyotimeZobacz materiał C3702
Chlorek soduKorporacja Chińskiej Narodowej Grupy Farmaceutycznej10019318
Siarczan soduAladdinS433911
T-001-10 10μ l Końcówki do pipet 31,65 mmWYBIERZ LABSELECT  T-001-10
Ligaza DNA T4TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., LTD2011A
TrisBioFroxx powiedział:Numer katalogowy: 1115KG001
tryptonuSangon BiotechnologiaA505250-0500
Mieszalnik wirowySigmaZ258423
Kąpiel wodnaSzanghajyiheng powiedział:DK-80
YeaRed Barwnik żelowy z kwasem nukleinowymYESEN (TAK)Numer katalogowy: 10203ES76
Ekstrakt drożdżowyBBI (Biało-CzerwonA610961-0500
Zetasizer NanoMalvern PanalyticalZetasizer Nano ZS
β-merkaptoetanol Sigma444203

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ikawa, Y., et al. Gene therapy of hemoglobinopathies: Progress and future challenges. Hum Mol Genet. 28 (R1), R24-R30 (2019).
  2. Ginn, S. L., Mandwie, M., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. Gene therapy clinical trials worldwide to 2023-an update. J Gene Med. 26 (8), e3721(2024).
  3. Chen, J., Wang, K., Wu, J., Tian, H., Chen, X. Polycations for gene delivery: Dilemmas and solutions. Bioconjug Chem. 30 (2), 338-349 (2019).
  4. Tong, H., et al. Progress and prospects of chitosan and its derivatives as non-viral gene vectors in gene therapy. Curr Gene Ther. 9 (6), 495-502 (2009).
  5. Alizadeh, L., Zarebkohan, A., Salehi, R., Ajjoolabady, A., Rahmati-Yamchi, M. Chitosan-based nanotherapeutics for ovarian cancer treatment. J Drug Target. 27 (8), 839-852 (2019).
  6. Dimassi, S., Tabary, N., Chai, F., Blanchemain, N., Martel, B. Sulfonated and sulfated chitosan derivatives for biomedical applications: A review. Carbohydr Polym. 202, 382-396 (2018).
  7. Maity, S., Mukhopadhyay, P., Kundu, P. P., Chakraborti, A. S. Alginate coated chitosan core-shell nanoparticles for efficient oral delivery of naringenin in diabetic animals-an in vitro and in vivo approach. Carbohydr Polym. 170, 124-132 (2017).
  8. Abnoos, M., et al. Chitosan-alginate nano-carrier for transdermal delivery of pirfenidone in idiopathic pulmonary fibrosis. Int J Biol Macromol. 118 (Pt A), 1319-1325 (2018).
  9. Lee, H. K., Smith, H. E., Liu, C., Willi, M., Hennighausen, L. Cytosine base editor 4 but not adenine base editor generates off-target mutations in mouse embryos. Commun Biol. 3 (1), 19(2020).
  10. Lee, S. N., Jang, H. S., Woo, J. S. Heterologous expression and purification of a CRISPR-cas9-based adenine base editor. Methods Mol Biol. 2606, 123-133 (2023).
  11. Tang, J., Lee, T., Sun, T. Single-nucleotide editing: From principle, optimization to application. Hum Mutat. 40 (12), 2171-2183 (2019).
  12. Newby, G. A., et al. Base editing of hematopoietic stem cells rescues sickle cell disease in mice. Nature. 595 (7866), 295-302 (2021).
  13. Lu, D. Z., et al. Camkii(δ) regulates osteoclastogenesis through erk, jnk, and p38 mapks and creb signalling pathway. Mol Cell Endocrinol. 508, 110791(2020).
  14. Sato, K., et al. Regulation of osteoclast differentiation and function by the camk-creb pathway. Nat Med. 12 (12), 1410-1416 (2006).
  15. Li, X., et al. Viral vector-based gene therapy. Int J Mol Sci. 24 (9), 7736(2023).
  16. Gonçalves, G. A. R., Paiva, R. M. A. Gene therapy: Advances, challenges and perspectives. Einstein. 15 (3), 369-375 (2017).
  17. Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV in clinical trials. Curr Gene Ther. 11 (4), 321-330 (2011).
  18. Mingozzi, F., et al. Cd8(+) t-cell responses to adeno-associated virus capsid in humans. Nat Med. 13 (4), 419-422 (2007).
  19. Dong, L., Li, Y., Cong, H., Yu, B., Shen, Y. A review of chitosan in gene therapy: Developments and challenges. Carbohydr Polym. 324, 121562(2024).
  20. Rizeq, B. R., Younes, N. N., Rasool, K., Nasrallah, G. K. Synthesis, bioapplications, and toxicity evaluation of chitosan-based nanoparticles. Int J Mol Sci. 20 (22), 5776(2019).
  21. Mansouri, S., et al. Chitosan-DNA nanoparticles as non-viral vectors in gene therapy: Strategies to improve transfection efficacy. Eur J Pharm Biopharm. 57 (1), 1-8 (2004).
  22. Zhou, C., et al. Off-target rna mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature. 571 (7764), 275-278 (2019).
  23. Betzler, B. K., Chee, Y. J. Bin Abd Razak, H.R. Intraosseous injections are safe and effective in knee osteoarthritis: A systematic review. Arthrosc Sports Med Rehabil. 3 (5), e1557-e1567 (2021).
  24. Lin, Y. W., Aplan, P. D. Leukemic transformation. Cancer Biol Ther. 3 (1), 13-20 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Plasmid TransfectionBone Marrow CellsOsteoclast FunctionFlow CytometryDynamic Light ScatteringGene Editing Efficiency

Powiązane artykuły