Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Częstotliwość i dystrybucja krzyżowania się w mejozie Caenorhabditis elegans za pomocą genotypowania SNP przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68183

⸱

11 lipca 2025

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 2Department of Genetic Engineering, Faculty of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 3Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten zapewnia metodę pomiaru częstotliwości i dystrybucji krzyżowania podczas mejozy u Caenorhabditis elegans. Do określenia pochodzenia chromosomów wykorzystano genotypowanie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Mapowanie 4-punktowe pozwoliło określić rozkłady krzyżowe regionów lewego, środkowego i prawego ramienia każdego chromosomu.

Streszczenie

Caenorhabditis elegans jest doskonałym organizmem modelowym do badania mejozy. Oprócz ogólnych zalet, takich jak krótki cykl rozrodczy, wiele potomstwa i przezroczyste ciało do obrazowania, istnieje sześć par homologicznych chromosomów holocentrycznych. Istnieje silna interferencja zwrotnicy i regulacja dystrybucji zwrotnicy. Aby zmierzyć częstotliwość krzyżowania, opracowano mapowanie markerów widzialnych, mapowanie snip-SNP oraz kwantyfikację markerów cytologicznych jako prekursorów powstawania krzyżówek. W tym miejscu wprowadzamy zmodyfikowaną metodę genotypowania SNP w celu pomiaru częstotliwości i dystrybucji krzyżowania w oogenezie C. elegans . Ta metoda może pominąć pracochłonne etapy trawienia restrykcyjnego i elektroforezy żelowej oraz uniknąć niejednoznacznej oceny nieprzeciętych prążków DNA. Genotypowanie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) przeprowadza się przy użyciu hybrydowego szczepu Bristol/Hawaiian. Krzyżowanie hermafrodytów z samcami wykazującymi ekspresję mio-3p::GFP pozwala nam skupić się na oogenezie. Pojedynczy lizat robaka wytwarza wystarczającą matrycę DNA dla wszystkich sześciu chromosomów. Oparte na egzonukleazie 5' sondy chemiczne TaqMan i specyficzne dla SNP spoiwo z małym rowkiem (MGB) pozwalają na precyzyjne wykrywanie SNP przy szybkości genotypowania wynoszącej około 97,7%. Wykorzystujemy dokładną detekcję SNP do pomiaru częstotliwości krzyżowania się u C. elegans. Metoda ta może być również stosowana do określenia częstości krzyżowania u mutantów męskich lub mutantów z wadami krzyżowymi, a także do bardziej szczegółowych interwałów chromosomowych.

Wprowadzenie

Powstawanie krzyżówek między chromosomami homologicznymi jest niezbędne do prawidłowej segregacji chromosomów, a także do generowania różnorodności genetycznej1. Błędy w tworzeniu krzyża powodują aneuploidię, która może prowadzić do niepłodności, poronienia i wad wrodzonych2. Częstotliwość krzyżowania różni się w zależności od regionu chromosomu, typu mutacji, wieku i płci, co podkreśla potrzebę dokładnego pomiaru częstotliwości krzyżowania w każdym z tych warunków 3,4,5. Ogólnym celem tej metody jest dokładny pomiar częstotliwości krzyżowania się każdej domeny chromosomowej, a tym samym dokładne określenie rozkładu krzyżówek na całej długości chromosomu C. elegans.

Tradycyjnie, mapowanie dwupunktowe przy użyciu markerów morfologicznych było używane do pomiaru częstotliwości krzyżowania 6,7,8,9,10. U C. elegans fenotypy przysadziste, niskie, grube (Dpy) i nieskoordynowane ruchy (Unc) są często wykorzystywane do tworzenia map chromosomów6. Zaletami tej metody są jej niski koszt i możliwość analizy wielu potomstwa. Do wad tych metod należy ograniczenie wyboru interesujących nas loci oraz brak możliwości wykorzystania letalnych progenii, ponieważ ich fenotypy nie są widoczne. Aby przezwyciężyć niedogodności związane z wyborem miejsca, transpozony Tc1 zostały wykorzystane jako markery dla miejsc znakowanych sekwencją polimorficzną (STS)11,12. Tc1 można wykryć za pomocą PCR i elektroforezy. Podczas gdy standardowy szczep Bristol N2 miał 30 kopii transpozonu Tc1, izolaty C. elegans z Bergerac we Francji (RW7000 i DP13) miały 500 kopii Tc1. W związku z tym liczba i dystrybucja transpozonów Tc1 różni się między izolatami, co służy do analizy chromosomów potomstwa robaków hybrydowych między izolatami metodą PCR. Następnie SNP wykorzystano również do pomiaru częstotliwości i rozkładu krzyżowania13,14. SNP między szczepami Bristol N2 i Hawaiian CB4856 pojawiał się co 1000 pz15,16. SNP są wykrywane jako polimorfizmy długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) za pomocą PCR, trawienia restrykcyjnego i elektroforezy. Ostatnio zaproponowano małe miejsca insercji/delecji (InDel), a także SNP między Bristol N2 a hawajskim CB4856 jako bardziej wydajne markery17. Jednak pomiar częstotliwości krzyżowania za pomocą Tc1, RFLP i InDel wymaga pracochłonnych procesów, takich jak PCR, leczenie enzymami restrykcyjnymi i elektroforeza. Jeśli każdy proces nie zostanie zoptymalizowany w analizie na dużą skalę, wyniki mogą zostać błędnie zinterpretowane ze względu na takie czynniki, jak dokładność PCR, rodzaj zastosowanego enzymu restrykcyjnego, wydajność rozszczepienia DNA oraz przejrzystość i separacja prążków podczas elektroforezy. Natomiast proponowana metoda wykorzystuje genotypowanie SNP za pomocą PCR w czasie rzeczywistym, aby ułatwić dokładną i precyzyjną kwantyfikację.

Krzyżówki nie są losowo rozmieszczone wzdłuż chromosomów. U C. elegans pojedyncze skrzyżowania mają tendencję do częstszego tworzenia się w ramionach i są tłumione w środku 3,5. Dwupunktowe mapowanie morfologiczne nie jest w stanie określić, gdzie występują krzyżówki poza genami markerowymi. I odwrotnie, mapowanie SNP pozwala na zwiększenie liczby markerów i wykazano, że ułatwia określenie dokładnego regionu skrzyżowania wzdłuż całego chromosomu 5,14,18. W tym badaniu wykorzystaliśmy granice domen chromosomalnych zaproponowane przez Rockmana i Kruyglyaka5 i wybraliśmy cztery SNP do analizy: na obu końcach chromosomu i na obu końcach granicy centrum/ramienia.

Korzystając z poprzednich metod, zaproponowaliśmy dokładną i szybką metodę wykrywania SNP za pomocą PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu TaqMan, nukleazy 5'19 do pomiaru skrzyżowania między lewym ramieniem, centrum i prawym ramieniem każdego chromosomu. Przewagą naszej metody nad alternatywnymi technologiami, w porównaniu z wcześniejszymi badaniami 20,21,22, jest dokładność i prostota. Metoda ta jest metodą analizy krzyżowej qPCR dla C. elegans i jest szeroko stosowana przez naukowców zajmujących się mejozą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pierwsza krzyżówka genetyczna

  1. Przygotować płytki współpracujące, które zawierają normalne płytki pożywki wzrostu nicieni (NGM) z małą plamką OP50 (średnica ~5 mm) w naczyniu o średnicy 35 mm.
  2. Dodać trzy hermafrodyty L4 szczepu Bristol N2 (lub mutanty o pochodzeniu bristolskim) i dziewięć młodych dorosłych samców hawajskiego szczepu CB4856 na płytce kryjącej (ryc. 1A).
    UWAGA: Aby przeanalizować mutanty o wysokiej śmiertelności embrionalnej, konieczne jest użycie zrównoważonych mutantów o pochodzeniu zarówno bristolskim, jak i hawajskim w tej krzyżówce. Aby uzyskać mutanty o pochodzeniu hawajskim, mutanty z Bristolu muszą zostać skrzyżowane ze szczepem hawajskim co najmniej sześć razy, aż wszystkie interesujące miejsca SNP będą miały pochodzenie hawajskie. W rezultacie, hawajski mutant zawiera tło bristolskie tylko w zmutowanym regionie i chromosomie równoważącym.
  3. Inkubować płytkę przez 1,5 dnia w temperaturze 20 °C, aby połączyć oba szczepy. Przenieś każdy hermafrodytę na nową, indywidualną płytkę NGM za pomocą OP50.
  4. Umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 20 °C na 1 dzień, aby umożliwić im złożenie zapłodnionych jaj. Przenieś każdy hermafrodytę na nową, indywidualną płytkę NGM za pomocą OP50.
  5. Umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 20 °C na 1 dzień, aby umożliwić ponowne złożenie zapłodnionych jaj. Usuń hermafrodyty. Przechowywać płytki przez 0,5 - 1 dzień w inkubatorze w temperaturze 20 °C, aby wyhodować potomstwo do L4.

2. Drugi krzyż

  1. Wybierz sześć skrzyżowanych L4-hermafrodytów (hybrydy bristolsko-hawajskie) i 12-15 ccIs4251[(pSAK2) myo-3p::GFP::LacZ::NLS + (pSAK4) myo-3p::mitochondrialne GFP + dpy-20(+)] I (TTS24) samce Bristol na nową płytkę kojarzeniową (Figura 1B).
    UWAGA: Wprowadzony szczep ccIs4251 jest uzyskiwany z Centrum Genetyki Caenorhabditis i musi być krzyżowany ze szczepem N2 typu dzikiego więcej niż sześć razy.
  2. Przechowywać płytkę przez 1,5 dnia w temperaturze 20 °C w inkubatorze do krycia. Przenieś każdy hermafrodytę na nową płytkę NGM za pomocą OP50.
  3. Umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 20 °C na 1 dzień, aby umożliwić im złożenie zapłodnionych jaj. Przenieś każdy hermafrodytę na nową, indywidualną płytkę NGM za pomocą OP50.
  4. Przechowywać płytki przez 1 dzień w inkubatorze o temperaturze 20 °C, aby mogły ponownie złożyć zapłodnione jaja. Przenieś każdy rodzicielski hermafrodyt do probówki PCR z 3 μl buforu do lizy, aby sprawdzić, czy pierwsza krzyżówka się powiodła.
  5. Sprawdź genotypy rodziców jako hybrydę bristolsko-hawajską metodą PCR w regionie chromosomu V. Oddziel prążki za pomocą 2,5% elektroforezy w żelu agarozowym.
    1. W SNP, WBVar01973670, długość amplikonu PCR z genomu Bristolu wynosi 220 pz, a z genomu hawajskiego 196 pz. Jeśli wyniki PCR wskazują, że rodzice są homozygotami bristolskimi, jest to spowodowane samozapłodnieniem pierwszej krzyżówki. Nie używaj potomstwa tych robaków do dalszej analizy.

3. Kontrola wyrywkowa

  1. Przygotuj bufor do lizy robaków w następujący sposób: 50 mM KCL, 10 mM Tris pH 8,2, 2,5 mM MgCl2, 0,45% IGEPAL CA-630 (NP-40), 0,45% Tween 20 i 0,01% żelatyny. Sterylizować przez filtrację i przechowywać w temperaturze pokojowej. Bezpośrednio przed użyciem dodać 3 μl 20 mg/ml proteinazy K (wH2O) do 1 ml buforu do lizy i przechowywać w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C.
  2. Sprawdź ekspresję GFP w mięśniu ściany ciała potomków drugiej krzyżówki za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego przed dodaniem robaków do poszczególnych probówek PCR. Powiększenie wynosi 6,1-55x, a zastosowana długość fali to 440-460 nm.
  3. Wybrać pojedynczego robaka z dodatnim wynikiem GFP i dodać do każdej probówki PCR zawierającej 3 μl buforu do lizy robaków (ryc. 1C). Zbierz łącznie 360 (90 x 4 replikaty biologiczne) dorosłych samców skrzyżowanych przodków w każdej z 360 probówek PCR.
    UWAGA: Aby uniknąć zbierania samozapłodnionego potomstwa, do pobierania próbek należy wybrać robaki z dodatnim wynikiem GFP. Niekojarzone hermafrodyty młodsze niż L4 są również dostępne do analizy autosomów, ale ponieważ mają różną liczbę chromosomów X, samce i hermafrodyty muszą być zidentyfikowane po dojściu do L4 i pobrane próbki podczas analizy chromosomu X.
  4. Umieścić próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 5 minut. Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu rozpoczęcia lizy.
  5. Analizując mutanty o wysokiej śmiertelności embrionalnej, należy zebrać martwe zarodki zamiast żywych larw, aby uzyskać bezstronne wyniki. Do pobrania zarodków należy użyć końcówki pipety z 0,5 μl roztworu chitynazy (20 mg/ml chitynazy, 50 mM NaCl, 70 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2). Zbierz zarodki w ciągu 4 godzin od zniesienia.
    UWAGA: Martwe zarodki złożone ponad 4 godziny temu nie nadają się do analizy PCR, prawdopodobnie z powodu degradacji genomowego DNA.

4. Liza próbki

  1. Ustaw probówki PCR w termocyklerze w temperaturze 60 °C na 1 godzinę, a następnie 95 °C na 15 minut. Dodaj 100 μl wody wolnej od nukleaz do każdej probówki i dobrze wymieszaj.
  2. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu rozpoczęcia genotypowania SNP metodą PCR w czasie rzeczywistym.

5. Genotypowanie SNP

  1. Przygotuj mieszaninę w następujący sposób (Rysunek 2). Do probówki o pojemności 1,5 ml dodaj 125 μl Master Mix, 6 μl testu genotypowania SNP (40x), 280 μl wody destylowanej (DW), starter do przodu (450 nM), starter do tyłu (450 nM), sondę 1 (100 nM), sondę 2 (100 nM).
    UWAGA: Sondy i startery są wymienione w Tabeli 1.
  2. Dokładnie wymieszać, kilkakrotnie pipetując, aby uzyskać jednolite stężenie. Dodać 4 μl mieszaniny do każdego dołka 96-dołkowej płytki do PCR na podstawie nośnej za pomocą 12-kanałowej mikropipety.
  3. Dodać 1 μl lizatu zawierającego każdy genomowy DNA do każdej studzienki i kilkakrotnie wymieszać, pipetując.
  4. Przygotuj kontrole pozytywne, tj. homozygoty bristolskie, homozygoty hawajskie i hybrydy bristolsko-hawajskie, a także trzy kontrole bez matrycy jako kontrole ujemne (ryc. 3A).
  5. Uszczelnij płytkę optyczną folią samoprzylepną. Dociśnij folię, skupiając się na krawędziach każdej studzienki za pomocą aplikatora.
  6. Odwirować płytkę na krótko, aby zebrać płyn na dnie i usunąć pęcherzyki powietrza z cieczy.
  7. Załaduj płytkę na urządzenie do PCR w czasie rzeczywistym. Kliknij przycisk Utwórz nowy eksperyment w oprogramowaniu.
  8. W ustawieniu Properties (Właściwości) ustaw Typ instrumentu na QuantStudio 1 System, Block type (Typ bloku) na 96-well 0.2 mL Block (Blok) , Experimental type (Typ eksperymentalny) na Genotypowanie, Chemistry (Chemia) na TaqMan Reagents (Odczynniki) i Run mode (Tryb pracy) na Fast (Szybki).
  9. W ustawieniu Method (Metoda) ustaw Volume (Objętość) na 5 μL (upewniając się, że prawidłowa objętość reakcji jest zgodna z konfiguracją), Cycle Count (Liczba cykli) na 40 cykli (domyślnie). Ustaw ustawienia temperatury i czasu w następujący sposób: Etap wstępnego odczytu w temperaturze 25 °C przez 30 s, Etap wstrzymania (aktywacja enzymatyczna, gorący start) w temperaturze 95 °C przez 20 s, etap PCR w temperaturze 95 °C przez 1 s, 60 °C przez 20 s i etap po odczytie w temperaturze 25 °C przez 30 s.
  10. W ustawieniu Plate (Płytka) dopasuj pozycje próbek i kontrolek do każdego dołka na ekranie oprogramowania.
  11. Zapisz eksperyment w urządzeniu USB, załaduj go do instrumentu PCR w czasie rzeczywistym i kliknij przycisk Uruchom .

6. Analiza danych

  1. Zapisz wyniki na USB i przenieś je do komputera w celu analizy danych.
  2. Analizuj dane delta Rn (dRn) w czasie rzeczywistym za pomocą poniższego wzoru, gdzie Rn (znormalizowany reporter) to sygnał fluorescencyjny z barwnika reporterowego, VIC i FAM, znormalizowany przez podzielenie przez sygnał fluorescencyjny pasywnego barwnika referencyjnego, ROX.
    dRn = Rn - linia bazowa
  3. Przejrzyj wykres dyskryminacji allelicznej.
  4. Potwierdź rozdzielenie klastrów (rysunek 3B). Na wykresie dyskryminacji alleli homozygoty bristolskie są zgrupowane w prawym dolnym rogu, hybrydy bristolsko-hawajskie są zgrupowane w prawym górnym rogu, homozygoty hawajskie są zgrupowane w lewym górnym rogu, a kontrole ujemne są zgrupowane w lewym dolnym rogu. Użyj następujących kodów kolorów:
    Czerwony: allel bristolski
    Niebieski: allel hawajski
    Zielony: Heterozygotyczny
    : Kontrola ujemna
  5. Wyeksportuj wyniki do pliku arkusza kalkulacyjnego i zbierz dane genotypowania ze wszystkich czterech pozycji SNP. Jeśli na czterech kolejnych pozycjach występują nieokreślone połączenia, należy wykluczyć dane z wartości N. Do analizy należy użyć 90 próbek na płytkę.
    1. Zidentyfikuj krzyżówki w następujący sposób: Jeśli SNP na pozycji #1 jest hybrydą bristolsko-hawajską, a pozycje #2-#4 są wszystkimi homozygotami bristolskimi [B/H]-[B/B]-[B/B] lub pozycja #1 jest homozygotą bristolską, a pozycja #2-#4 to wszystkie hybrydy bristolsko-hawajskie [B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/H]-[B/H], Wyniki te wskazują na pojedyncze skrzyżowanie między pozycjami #1 i #2 (gdzieś na lewym ramieniu chromosomu). Podobnie w przypadku [B/H]-[B/H]-[B/B]-[B/B] lub [B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/H], pojedyncze skrzyżowanie następuje między #2 i #3 (gdzieś w centralnym regionie chromosomu), a w przypadku [B/H]-[B/H]-[B/H]-[B/B] lub [B/B]-[B/B]-[B/B]-[B/H], Pojedyncze skrzyżowanie następuje między #3 i #4 (gdzieś na prawym ramieniu chromosomu).
      UWAGA: Istnieje sześć wzorów podwójnych zwrotnic. Po lewej i prawej: [B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/B] i [B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/H], po lewej i pośrodku: [B/B]-[B/H]-[B/B]-[B/B] i [B/H]-[B/H]-[B/H]-[B/H], w środku i po prawej: [B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/B] i [B/H]-[B/H]-[B/B]-[B/H].

7. Analiza statystyczna

  1. Wstaw wartości do oprogramowania SPSS Statistics (IBM). W celu porównania rozkładu krzyżowania w lewym ramieniu, regionie centralnym i prawym ramieniu chromosomów, wstaw 82 chromosomy ze skrzyżowaniem w lewym ramieniu, 20 chromosomów ze skrzyżowaniem w regionie centralnym i 68 chromosomów ze skrzyżowaniem w prawym ramieniu.
  2. Wykonaj korektę ANOVA i Bonferroniego i określ istotność statystyczną za pomocą dwustronnej wartości p. Wykonaj tyle porównań, ile potrzeba, na przykład lewa ręka kontra środek lub WT kontra mutant.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykryliśmy cztery miejsca SNP na chromosomie II u C. elegans za pomocą testu genotypowania SNP w celu ilościowego określenia tworzenia krzyżówek na całej długości chromosomu, w lewym ramieniu, w regionie centralnym i w prawym ramieniu. Wykrywanie SNP odbywa się zgodnie z instrukcjami producenta. Mieszanka główna zawiera polimerazę DNA Taq, termolabilną uracylo-N-glikozylazę (UNG), dNTP z dUTP i pasywny referencyjny barwnik ROX. Polimeraza DNA Taq jest aktywowana w temperaturze 95 °C, co umożliwia zahamowanie nie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu wprowadziliśmy metodę pomiaru częstotliwości i dystrybucji krzyżowania w mejozie C. elegans w oparciu o genotypowanie SNP skrzyżowanych przodków z hybrydy bristolsko-hawajskiej. Podczas gdy konwencjonalna metoda snip-SNP (RFLP) wymaga elektroforezy żelowej po PCR, a detekcja prążków DNA wymaga systemu dokumentacji żelu14,18, genotypowanie SNP za pomocą testu nukleazy 5' przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym nie wymaga pracochłonnej procedur...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Szczepy zostały dzięki uprzejmości Caenorhabditis Genetics Center (CGC), finansowanego przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440). Dziękujemy członkom Laboratorium Saito za ich pomocne dyskusje na temat tej pracy. Prace te były wspierane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) KAKENHI Grant JP23K05868 dla TTS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
101-1000μ l Końcówka do pipetNajlepszy zawodnikNumer katalogowy 111-N-Q
Roztwór 0,5 mol/I-EDTA (pH 8,0)Teski Nacalai14347-21
10mol/I-roztwór wodorotlenku soduTeski Nacalai94611-45
10X Zielony Bufor DreamTaqThermo Fisher Naukowy EP0713 powiedział:
10μ L, długa końcówka, granduatedFUKAEKASEI, WATSON110-207C
200μ L, końcówka standardowa, z podziałkąFUKAEKASEI, WATSON110-705C
Agar w proszkuTeski Nacalai01028-14
AgarozyPH JaponiaPH108 powiedział:
Autoklaw TOMY model ES-215 Wysokociśnieniowy sterylizator parowyTOMY SEIKOES-215
Bacto Pepton Enzymatyczne Trawienie BiałkaThermo Fisher Naukowy 211677
Kwas borowyTeski Nacalai05215-05
Caenorhabditis elegans Bristol typu dzikiego Centrum Genetyki CaenorhabditisN2
Caenorhabditis elegans Hawajski typ dzikiCentrum Genetyki CaenorhabditisZobacz materiał CB4856
Chlorek wapniaTeski Nacalai06729-55
ccIs4251 [(pSAK2) myo-3p::GFP::LacZ::NLS + (pSAK4) myo-3p::mitochondrialny GFP + dpy-20(+)] ILaboratorium SaitoZobacz materiał TTS24Oryginalnie z PD4251
CholesterolTeski Nacalai08721-62
Niestandardowe testy genotypowania TaqMan SNPThermo Fisher Naukowy 4332077
Mieszanina roztworów deoksynukleotydów (dNTP)Laboratoria biologiczne w Nowej AngliiN04470 powiedział:
DigPrint Doc Tablet DP-T130zNarzędzia biologiczneDP-T130z
Wodorofosforan di-potasuTeski Nacalai28726-05
Mikroskop preparacyjnyNikonSMZ-745 C-DS
Polimeraza DNA Dream TaqThermo Fisher Naukowy EP0713 powiedział:
Roztwór bromku etydynyTeski Nacalai14631-94
Wstęp do przodu dla WBVar01973670Identyfikator IDT103988736atgtctcacccaaggttgaa powiedział:
żelatynaTeski Nacalai166-31
Gilson PIPETMAN Klasyczna pipetaThermo Fisher Naukowy 
IGEPAL CA-630Sigma-Aldrich18896
Siarczan magnezu siedmiowodnyTeski Nacalai21003-75
MicroAmp Optyczny 96-dołkowy talerz reactonThermo Fisher Naukowy N8010560
Optyczna folia adhedowa MicroAmpThermo Fisher Naukowy 4311971
Wzmacniacz MiniAmp  Cykler termicznyThermo Fisher Naukowy Wzmacniacz MiniAmp
Poziomy system elektroforezy Mini-Sub Cell GT, taca 7 x 10 cmLaboratoria Bio-Rad1704466
Nichipet EXIINichiryo powiedział:00-NPX2-2
Zasilacz EXII MULTINichiryo powiedział:00-NPM-12VP
Pippete Mate NEONichiryo powiedział:00-PMNEO
Chlorek potasuTeski Nacalai285-38
Diwodorofosforan potasuTeski Nacalai28720-65
Proteinaza KThermo Fisher Naukowy EO0491 powiedział:
System QuantStudio 1 do PCR w czasie rzeczywistym, 96-dołkowy, 0,2 mlThermo Fisher Naukowy Numer katalogowy A40426
Szybko ładowana fioletowa drabinka DNA 1kb plusLaboratoria biologiczne w Nowej AngliiN0550S
Odwrotny podkład dla WBVar01973670Identyfikator IDT103988737tggctactcctagtcactga powiedział:
Chlorki soduTeski Nacalai31319-45
TaqPath ProAmp Master MixThermo Fisher Naukowy A30866 (wersja angielska)
Naczynie TC 35, standardoweSARSTEDT (w języku angielskim)83.3900
Tris (hydroksymetylo)aminometanTeski Nacalai35406-75
Baza TrizmaSigma-Aldrich  T1503-1KG
Animacja 20Odczynnik Yoneyama03706
WormStuff Pick do robakówGenesee Scientific59-AWP (Język angielski)
Końcówki do wybierania robaków WormStuff (90/10% Pt/IR, 30 gauge)Genesee Scientific59-30PI36

Bibliografia

  1. Jones, G., Kleckner, N., Zickler, D. Meiosis through three centuries. Chromosoma. 133 (2), 93-115 (2024).
  2. Hassold, T. J., Hunt, P. A. Missed connections: Recombination and human aneuploidy. Prenat Diagn. 41 (5), 584-590 (2021).
  3. Barnes, T. M., Kohara, Y., Coulson, A., Hekimi, S. Meiotic recombination, noncoding DNA and genomic organization in caenorhabditis elegans. Genetics. 141 (1), 159-179 (1995).
  4. Lim, J. G., Stine, R. R., Yanowitz, J. L. Domain-specific regulation of recombination in Caenorhabditis elegans in response to temperature, age, and sex. Genetics. 180 (2), 715-726 (2008).
  5. Rockman, M. V., Kruglyak, L. Recombinational landscape and population genomics of Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 5 (3), e1000419(2009).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  7. Li, W., Yanowitz, J. L. Atm and atr influence meiotic crossover formation through antagonistic and overlapping functions in Caenorhabditis elegans. Genetics. 212 (2), 431-443 (2019).
  8. Rose, A. M., Baillie, D. L. The effect of temperature and parental age on recombination and nondisjunction in Caenorhabditis elegans. Genetics. 92 (2), 409-418 (1979).
  9. Villeneuve, A. M. A cis-acting locus that promotes crossing over between X chromosomes in Caenorhabditis elegans. Genetics. 136 (3), 887-902 (1994).
  10. Youds, J. L., et al. Rtel-1 enforces meiotic crossover interference and homeostasis. Science. 327 (5970), 1254-1258 (2010).
  11. Emmons, S. W., Yesner, L., Ruan, K. S., Katzenberg, D. Evidence for a transposon in Caenorhabditis elegans. Cell. 32 (1), 55-65 (1983).
  12. Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131 (3), 609-624 (1992).
  13. Hillers, K. J., Villeneuve, A. M. Chromosome-wide control of meiotic crossing over in C. elegans. Curr Biol. 13 (18), 1641-1647 (2003).
  14. Wicks, S. R., Yeh, R. T., Gish, W. R., Waterston, R. H., Plasterk, R. H. Rapid gene mapping in Caenorhabditis elegans using a high-density polymorphism map. Nat Genet. 28 (2), 160-164 (2001).
  15. Campos, T. L., Korhonen, P. K., Sternberg, P. W., Gasser, R. B., Young, N. D. Predicting gene essentiality in Caenorhabditis elegans by feature engineering and machine-learning. Comput Struct Biotechnol J. 18, 1093-1102 (2020).
  16. Fay, D., Bender, A. Snps: Introduction and two-point mapping. WormBook. , (2008).
  17. Hwang, H. Y., Wang, J. Fast genetic mapping using insertion-deletion polymorphisms in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 11 (1), 11017(2021).
  18. Davis, M. W., et al. Rapid single nucleotide polymorphism mapping in C. elegans. BMC Genomics. 6, 118(2005).
  19. Livak, K. J. Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay. Genet Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).
  20. Li, Q., et al. The tumor suppressor BRCA1-BARD1 complex localizes to the synaptonemal complex and regulates recombination under meiotic dysfunction in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 14 (11), e1007701(2018).
  21. Saito, T. T., Lui, D. Y., Kim, H. M., Meyer, K., Colaiacovo, M. P. Interplay between structure-specific endonucleases for crossover control during Caenorhabditis elegans meiosis. PLoS Genet. 9 (7), e1003586(2013).
  22. Saito, T. T., Youds, J. L., Boulton, S. J., Colaiacovo, M. P. Caenorhabditis elegans him-18/slx-4 interacts with slx-1 and xpf-1 and maintains genomic integrity in the germline by processing recombination intermediates. PLoS Genet. 5 (11), e1000735(2009).
  23. Longo, M. C., Berninger, M. S., Hartley, J. L. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene. 93 (1), 125-128 (1990).
  24. Kutyavin, I. V., et al. 3'-minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at pcr extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28 (2), 655-661 (2000).
  25. Hammarlund, M., Davis, M. W., Nguyen, H., Dayton, D., Jorgensen, E. M. Heterozygous insertions alter crossover distribution but allow crossover interference in Caenorhabditis elegans. Genetics. 171 (3), 1047-1056 (2005).
  26. Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
  27. Meneely, P. M., Farago, A. F., Kauffman, T. M. Crossover distribution and high interference for both the X chromosome and an autosome during oogenesis and spermatogenesis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 162 (3), 1169-1177 (2002).
  28. Nabeshima, K., Villeneuve, A. M., Hillers, K. J. Chromosome-wide regulation of meiotic crossover formation in Caenorhabditis elegans requires properly assembled chromosome axes. Genetics. 168 (3), 1275-1292 (2004).
  29. Phillips, C. M., Dernburg, A. F. A family of zinc-finger proteins is required for chromosome-specific pairing and synapsis during meiosis in C. elegans. Dev Cell. 11 (6), 817-829 (2006).
  30. Mancera, E., Bourgon, R., Brozzi, A., Huber, W., Steinmetz, L. M. High-resolution mapping of meiotic crossovers and non-crossovers in yeast. Nature. 454 (7203), 479-485 (2008).
  31. Qi, J., et al. Characterization of meiotic crossovers and gene conversion by whole-genome sequencing in Saccharomyces cerevisiae. BMC Genomics. 10, 475(2009).
  32. Miller, D. E., et al. A whole-chromosome analysis of meiotic recombination in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2 (2), 249-260 (2012).
  33. Carlton, P. M., Farruggio, A. P., Dernburg, A. F. A link between meiotic prophase progression and crossover control. PLoS Genet. 2 (2), e12(2006).
  34. Tsai, C. J., et al. Meiotic crossover number and distribution are regulated by a dosage compensation protein that resembles a condensin subunit. Genes Dev. 22 (2), 194-211 (2008).
  35. Bhalla, N., Wynne, D. J., Jantsch, V., Dernburg, A. F. Zhp-3 acts at crossovers to couple meiotic recombination with synaptonemal complex disassembly and bivalent formation in C. elegans. PLoS Genet. 4 (10), e1000235(2008).
  36. Yokoo, R., et al. Cosa-1 reveals robust homeostasis and separable licensing and reinforcement steps governing meiotic crossovers. Cell. 149 (1), 75-87 (2012).
  37. Almanzar, D. E., et al. Meiotic DNA exchanges in C. elegans are promoted by proximity to the synaptonemal complex. Life Sci Alliance. 6 (4), e202301906(2023).
  38. De Los Santos, T., et al. The mus81/mms4 endonuclease acts independently of double-holliday junction resolution to promote a distinct subset of crossovers during meiosis in budding yeast. Genetics. 164 (1), 81-94 (2003).
  39. Saito, T. T., Colaiacovo, M. P. Regulation of crossover frequency and distribution during meiotic recombination. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 82, 223-234 (2017).
  40. Zalevsky, J., Macqueen, A. J., Duffy, J. B., Kemphues, K. J., Villeneuve, A. M. Crossing over during Caenorhabditis elegans meiosis requires a conserved mutS-based pathway that is partially dispensable in budding yeast. Genetics. 153 (3), 1271-1283 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Częstotliwość crossing-overrekombinacja meiotycznamapowanie chromosomowetechnologia TaqMananaliza oogenezymutanty genetycznerozkład crossing-over
Częstotliwość i dystrybucja krzyżowania się w mejozie Caenorhabditis elegans za pomocą genotypowania SNP przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.