Method Article

Opracowanie opartego na mikrofluidyce podejścia do badania mechaniki polimerów mikrotubul

DOI:

10.3791/68185

⸱

May 30th, 2025

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Department of Biochemistry, Vanderbilt University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje projekt i wykonanie urządzenia mikroprzepływowego odpowiedniego do badania mechaniki polimerów mikrotubul. Synteza technik mikrowytwarzania, zautomatyzowanej kontroli przepływu i modelowania obliczeniowego umożliwia stworzenie elastycznego systemu idealnie nadającego się do sondowania cytoszkieletu komórkowego in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole opisujemy projekt i wykonanie urządzenia mikroprzepływowego opracowanego do badania mechaniki polimerów mikrotubul. Projekt wykorzystuje nieodłączne zalety urządzeń mikroprzepływowych opartych na polidimetylosiloksanach (PDMS) i wprowadza kilka funkcji, które umożliwiają solidne i konfigurowalne podejście eksperymentalne o wysokiej przepustowości. Opracowane urządzenie zawiera redundantne funkcje wychwytywania pęcherzyków powietrza, aby zapobiec występowaniu szkodliwych pęcherzyków powietrza. Ponadto urządzenie łączy się ze zautomatyzowanym systemem sterowania przepływem, aby ograniczyć ręczną interwencję i umożliwić analizy o wysokiej przepustowości. Komercyjne oprogramowanie symulacyjne jest wykorzystywane do lepszego rozwoju i zrozumienia transportu płynów za pomocą tego systemu. Na koniec demonstrujemy zdolność do przeprowadzania wielu eksperymentów jednocześnie w jednym urządzeniu poprzez hodowanie przedłużeń mikrotubul z odrębnymi znacznikami fluorescencyjnymi w różnych sekcjach urządzenia. Ogólnie rzecz biorąc, ten mikroprzepływowy system przepływu może być używany do badania mechaniki polimerów mikrotubul i zapewnia ulepszenia w projektowaniu eksperymentalnym dla szerszych badań mikrotubul in vitro. Synteza metod mikrowytwarzania, zautomatyzowanej kontroli przepływu i modelowania komputerowego umożliwia stworzenie elastycznego systemu idealnie nadającego się do sondowania cytoszkieletu komórkowego in vitro.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrofluidyka umożliwia precyzyjną kontrolę maleńkich objętości płynów, często mniejszych niż jeden mikrolitr, dzięki skomplikowanemu projektowaniu i wytwarzaniu kanałów przepływu płynów1,2. Niewielka skala urządzeń mikroprzepływowych rodzi unikalne zjawiska inżynierskie. Mianowicie, liczba Reynoldsa – bezwymiarowa miara stosunku sił bezwładności do lepkości w przepływie płynu – jest niewielka, zwykle rzędu O(10) lub niższej w mikrofluidyce, co podkreśla znaczenie sił lepkości w urządzeniach mikroprzepływowych. Dodatkowo, liczba Pécleta, która porównuje transport konwekcyjny z dyfuzyjnym, pokazuje, że transport konwekcyjny jest generalnie pomijalny w mikrofluidyce3,4,5. Ten napędzany dyfuzją, laminarny reżim przepływu w mikrofluidyce jest korzystny, ponieważ obsługuje równoległe eksperymenty na jednym urządzeniu, utrzymując precyzyjne gradienty płynów.

Fotolitografia pozostaje podstawową metodą wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych6,7,8. Krótko mówiąc, proces ten polega na stworzeniu "głównego" wytrawionego szablonu projektu mikroprzepływowego (Rysunek 1). Przygotowuje się światłoczułe podłoże, a fotomaska o konstrukcji mikroprzepływowej selektywnie naświetla obszary fotorezystu na promieniowanie ultrafioletowe. Kolejne metody trawienia rozwijają podłoże, tworząc relief wzoru. Polidimetylosiloksan (PDMS) jest często odlewany i utwardzany na mistrzu. Utwardzony PDMS, który przejmuje negatywne cechy wzoru, jest następnie usuwany z wzorca i przyklejany do szklanego szkiełka nakrywkowego. Cały proces produkcyjny trwa zwykle 1-2 dni, co umożliwia szybkie iteracje projektowe i produkcję wielu urządzeń. Szczegółowe recenzje procesów miękkiej litografii i mikroprodukcji są dostępne w innych źródłach1,2,3,10,11,12,13.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Przegląd tradycyjnego procesu fotolitografii i procesu mikrofabrykacji. (A) Tradycyjny proces fotolitografii i (B) proces mikrofabrykacji. W zależności od zastosowania i pożądanych właściwości fotorezystu, można zastosować fotorezystor ujemny lub dodatni, nawet jeśli uzyskają one ten sam wzorzec projektowania. Cechy, takie jak pożądana wysokość elementu lub temperatura topnienia fotorezystu, pomagają określić odpowiedni typ fotorezystu. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Rogers (2022)14. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zastosowanie mikrofluidyki rozszerzyło możliwości w wielu dziedzinach badawczych, a ostatnio wpłynęło na nauki biologiczne. Ze względu na swoją niewielką skalę, mikrofluidyka pozwala na precyzyjne zarządzanie ograniczonymi, cennymi zasobami, takimi jak komórki czy białka. Jeszcze większy wpływ ma możliwość przestrajania układów mikroprzepływowych w celu naśladowania warunków fizjologicznych, takich jak modyfikacje sztywności podłoża, wywieranie siły na próbkę, a nawet integracja prądu elektrycznego. Ponadto zastosowanie mikrofluidyki oferuje możliwość równoległego manipulowania wieloma odczynnikami oraz szybkiego prototypowania i iteracyjnego udoskonalania projektów systemów. Funkcje te umożliwiają miniaturyzację całych procesów laboratoryjnych na jednym urządzeniu, powszechnie nazywanym "lab-on-a-chip"1,6,9,15,16,17,18,19.

Jednym z zastosowań mikrofluidyki jest badanie polimerów mikrotubul. Mikrotubule są niezbędnym składnikiem cytoszkieletu komórki, odgrywając istotną rolę w procesach takich jak podział komórek i wewnątrzkomórkowy transport ładunków20,21. Jako najsztywniejszy element cytoszkieletu, mikrotubule wykazują moduł sprężystości porównywalny do pleksiglas22,23. Ich silne właściwości mechaniczne mają kluczowe znaczenie dla różnych funkcji komórkowych, w tym na przykład skurczu kardiomiocytów, gdzie cyklicznie zginają się i rozluźniają podczas skurczowej i rozkurczowej fazy serca24. Urządzenia mikroprzepływowe były już wcześniej stosowane do badania właściwości mikrotubul i ich struktur wyższego rzędu in vitro. Rzeczywiście, mikrofluidyka została wykorzystana do zbadania dynamiki polimeryzacji mikrotubul, interakcji mikrotubula-mikrotubula oraz wpływu białek związanych z mikrotubulami na właściwości mechaniczne mikrotubul25,26,27,28,29,30,31, 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41.

Chociaż wprowadzenie mikrofluidyki do dziedziny mikrotubul przyniosło wiele ekscytujących odkryć, miejsce na ulepszenia nadal leży w adaptacji tych urządzeń do badań nad mikrotubulami. W tej pracy zajmiemy się dwoma konkretnymi ograniczeniami, które utrzymują się w badaniu mikrotubul w urządzeniach mikroprzepływowych: możliwością tworzenia się pęcherzyków powietrza w urządzeniu, zwykle wprowadzanymi przez ręczną manipulację urządzeniami mikroprzepływowymi, oraz niedostatecznym wykorzystaniem testów wysokoprzepustowych. Po pierwsze, ręczne manipulacje, takie jak podłączanie i odłączanie rurek, mogą powodować tworzenie się pęcherzyków w kanałach. Powstawanie pęcherzyków powietrza w komórce przepływowej jest katastrofalne, ponieważ pęcherzyki powietrza mogą denaturować białka, ścinać polimery mikrotubul i niekorzystnie wpływać na hodowle komórkowe42,43. Ponadto ostre narożniki i skośne kąty w urządzeniu powodują nierównomierne zwilżanie powierzchni, zwiększając możliwość porywania powietrza. Opracowano liczne techniki mające na celu ograniczenie powstawania, trwałości i wpływu pęcherzyków powietrza; Jednak stosowanie metod ograniczania bąbelków nie jest uniwersalne42,43,44,45,46. Ponadto, chociaż jedną z głównych zalet stosowania mikrofluidyki jest możliwość eksperymentowania z dużą przepustowością, mikrofluidyka nie została jeszcze wykorzystana do zwiększenia skali badań nad mikrotubulami. Urządzenia mikroprzepływowe mogą być zaprojektowane do równoległego testowania wielu warunków eksperymentalnych na tym samym urządzeniu. Na przykład gradienty płynów mogą być wykorzystywane do kierowania przepływem różnych białek lub leków związanych z mikrotubulami, umożliwiając ich ukierunkowane dostarczanie do określonych regionów podzielonych mikrotubul w tym samym urządzeniu.

Tutaj iteracyjnie zaprojektowaliśmy urządzenie mikroprzepływowe, które rozwiązuje te ograniczenia. Udostępniamy protokół produkcji urządzenia krok po kroku, umożliwiając w ten sposób szerszemu gronu odbiorców zastosowanie technologii mikroprzepływowej w badaniach nad mikrotubulami. Ta konstrukcja urządzenia zawiera funkcje wychwytywania pęcherzyków powietrza i wykorzystuje zautomatyzowany system kontroli przepływu w celu zmniejszenia ręcznej interwencji, jednocześnie umożliwiając gradienty rozwiązań w urządzeniu do analiz o wysokiej przepustowości. Podsumowując, opracowanie tej konstrukcji mikroprzepływowej może ułatwić szersze badania i zrozumienie mechaniki mikrotubul, oferując jednocześnie cenne ulepszenia w projektach eksperymentalnych w szerszej dziedzinie badań nad mikrotubulami.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Praca opisana w tej części protokołu została wykonana w głównym pomieszczeniu czystym klasy 100 Vanderbilt Institute of Nanoscale Science and Engineering (VINSE). Pożądane jest kontrolowane pomieszczenie czyste z odpowiednim fartuchem i oświetleniem z filtrem UV, aby zapobiec uszkodzeniom urządzenia z powodu wilgotności/warunków oświetleniowych otoczenia oraz zapobiec zanieczyszczeniu cząstkami stałymi. Wszystkie manipulacje na płytkach krzemowych powinny być wykonywane wypolerowaną stroną płytki krzemowej skierowaną do góry. Podczas manipulowania waflami używaj pęsety i zminimalizuj dotykające się powierzchnie wafla, aby zapobiec zarysowaniu. Wafle należy przechowywać na szalkach Petriego z przykrytymi pokrywkami podczas transportu i na koniec każdego dnia, chyba że zalecono inaczej.

1. Fotolitografia (6 - 8 godzin)

  1. Plazma czyści 3-calową płytkę krzemową przez 5 minut w próżni (najlepiej podciśnienie < 5 × 10-5 torów) przy użyciu plazmy tlenowej (O2) lub czystego suchego powietrza (CDA).
  2. Wyśrodkuj płytkę krzemową na powlekarce wirowej w celu osadzenia fotorezystu.
  3. Umieść ~1-2 ml fotorezystu SPR 220 7.0 na środku płytki krzemowej.
    UWAGA: Z fotorezystem należy obchodzić się w rękawicach i okularach ochronnych, a następnie utylizować zgodnie z protokołami producenta/danego miejsca.
  4. Powlekaj fotorezyst na płytce krzemowej do żądanej grubości na podstawie krzywych wirowania producenta. Generuj warstwy o grubości ~13 μm, wirując z prędkością 1000 obr./min przez 30 s. Później wyczyść resztki fotorezystu na powlekarce wirowej acetonem i zutylizuj je zgodnie z protokołami specyficznymi dla danego miejsca.
    UWAGA: Jeśli po wirowaniu płytka nie jest równomiernie pokryta fotorezystem, powtórz kroki 1.2-1.4. Niejednorodna powłoka może być spowodowana niewyśrodkowaną płytką na powlekarce wirowej, użyciem zbyt małej ilości fotorezystu i/lub nieosadzeniem fotorezystu na środku płytki.
  5. Dotykając jak najmniejszej ilości fotorezystu na płytce, przenieś płytkę krzemową na płytkę grzejną ustawioną w temperaturze 70 °C.
  6. Inkubować płytkę krzemową na płycie grzejnej, zwiększając temperaturę o 10 °C co 3-5 minut, aż temperatura osiągnie 115 °C.
  7. Wyłącz płytę grzejną i pozwól płytce krzemowej ostygnąć, aż jej temperatura spadnie poniżej 65 °C.
    UWAGA: Etapy ogrzewania i chłodzenia są wykonywane powoli, aby zapobiec pękaniu termicznemu fotorezystu, co jest powszechne przy tej grubości. Jeśli wystąpią pęknięcia termiczne, zwykle można je naprawić poprzez ponowne podgrzanie płytki krzemowej i spowolnienie tempa chłodzenia.
  8. Za pomocą kleszczyków przenieś schłodzoną płytkę silikonową do wyrównywacza maski i załaduj zarówno płytkę silikonową, jak i odpowiadającą jej fotomaskę do nakładki maski zgodnie z protokołami specyficznymi dla producenta/miejsca.
    UWAGA: Fotomaski zostały wyprodukowane przez firmę zewnętrzną przy użyciu określonego projektu, który został utworzony za pomocą programu AutoCAD. Zobacz Plik uzupełniający 1, aby zapoznać się z renderingiem projektu maski.
  9. Wystaw płytkę krzemową na działanie promieniowania ultrafioletowego (UV) przez określony czas (w zależności od mocy lampy UV), postępując zgodnie z protokołami producenta/miejsca. Pożądana energia dla tego zastosowania wynosi ~400 mJ/cm2, a czas ekspozycji należy obliczyć według wzoru: figure-protocol-1.
  10. Po naświetleniu wyjmij wafel silikonowy z wyrównywacza maski i pozwól fotorezystorowi nawodnić się przez 4 godziny dzięki cyrkulacji powietrza. Upewnij się, że pokrywka szalki Petriego jest opuszczona, aby umożliwić cyrkulację powietrza, ale umieść naczynie w miejscu, w którym jest mało prawdopodobne, aby było narażone na działanie cząstek stałych.
    UWAGA: W tym czasie nawadniania można zrobić 4-godzinną przerwę, ale zaleca się kontynuowanie zabiegu tego samego dnia.
  11. Po 4-godzinnym ponownym nawodnieniu przenieś odsłoniętą płytkę na gorącą płytę ustawioną w temperaturze 70 °C.
  12. Inkubować płytkę krzemową na płycie grzejnej, zwiększając temperaturę o 10 °C co 3-5 minut, aż temperatura osiągnie 115 °C.
  13. Pozostawić wafel do inkubacji w temperaturze 115 °C przez 10 minut.
  14. Stwórz izolacyjną "osłonę" dla odsłoniętej płytki, formując arkusz folii aluminiowej w kształcie pokrywki szalki Petriego.
  15. Wyłącz płytę grzejną i przykryj odsłoniętą płytkę osłoną z folii aluminiowej. Pozostaw wafel do ostygnięcia w temperaturze otoczenia przez noc.
    UWAGA: Pękanie termiczne fotorezystu jest znacznie częstsze na etapie inkubacji po ekspozycji, dlatego zaleca się powolne chłodzenie przez noc. Na tym kończą się kroki wymagane w pierwszym dniu produkcji. Zaleca się przejście do następnej sekcji następnego dnia.

2. Rozwój (1 - 2 h)

  1. Gdy będzie gotowy do wywołania naświetlonej płytki, zaopatrz się w czysty pojemnik i odpowiedni wywoływacz fotorezystu. W tym przypadku programator MF-319 jest używany z dedykowanym kontenerem.
    UWAGA: Z wywoływaczem należy obchodzić się w rękawicach i okularach ochronnych, przenieść pojemnik zbiorczy do pojemnika wtórnego i zutylizować go zgodnie z protokołami specyficznymi dla producenta/miejsca.
  2. Wlej tyle wywoływacza do pojemnika, aby całkowicie zanurzyć odsłoniętą płytkę (rzeczywista objętość będzie się różnić w zależności od pojemnika).
  3. Zanurz naświetloną płytkę w wywoływaczu i poczekaj, aż cały niechciany fotorezystor zostanie rozpuszczony. Delikatne obracanie/mieszanie pojemnika pomaga w rozwoju, aż do momentu, gdy na płytce nie będzie widoczny nikłe lub żaden resztkowy fotorezystor inny niż konstrukcja urządzenia.
    UWAGA: W celu całkowitego usunięcia niepożądanego fotorezystu może być wymagane wielokrotne wprowadzenie rozwiązania deweloperskiego, w zależności od ilości użytego rozwiązania deweloperskiego.
  4. Wyjmij wytworzony wafel z roztworu rozwijającego i delikatnie płucz obie strony płytki wodą dejonizowaną (DI) przez 30 sekund.
  5. Wysuszyć wytworzony wafel azotem (N2) gazowym.
  6. Przechowuj rozwinięty wafel na szalce Petriego w suchym, chłodnym miejscu, aż będzie gotowy do dalszego użycia. Zawiń szalkę Petriego w folię aluminiową, aby zapobiec degradacji fotorezystu w wyniku wystawienia na działanie światła otoczenia.
    UWAGA: Zaleca się, ale nie jest to wymagane, aby przejść do następnej sekcji tego samego dnia.

3. Silanizacja (1 - 2 h)

  1. Przenieść płytkę krzemową do eksykatora.
  2. Umieść mały aluminiowy pojemnik (lub kawałek folii aluminiowej złożony w kształt pojemnika) w eksykatorze.
  3. Odmierzyć pipetą 1 kroplę (~50 μL) trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylo) silanu do aluminiowego pojemnika.
    UWAGA: Z roztworem silanu należy obchodzić się w rękawicach i okularach ochronnych, a następnie utylizować go zgodnie z protokołami producenta/danego miejsca.
  4. Zamknij eksykator i włącz podciśnienie.
  5. Pozostawić do wysuszenia/silanizacji na 1-2 godziny.
  6. Po zakończeniu czasu silanizacji wyłącz próżnię i odzyskaj silanizowaną płytkę. Przechowuj silanizowaną wafel na szalce Petriego owiniętej folią aluminiową w suchym, chłodnym miejscu, aż będzie gotowy do dalszego użycia.
    UWAGA: Może być konieczne okresowe powtarzanie silanizacji na płytkach i częściej na urządzeniach, w których stosuje się cieńsze warstwy PDMS. Jeśli podczas wyjmowania PDMS z płytki zostanie zauważona przyczepność PDMS, może być konieczne ponowne silanizowanie płytki, a tę sekcję należy powtórzyć po usunięciu całego PDMS z płytki. Na tym kończą się kroki wymagane do tworzenia wzorców urządzeń mikroprzepływowych. Wzorce są stabilne, a kolejne sekcje mogą być wykonywane w razie potrzeby.

4. Składanie PDMS (1 - 2 h)

UWAGA: Jeśli na urządzeniu głównym znajdują się resztki PDMS z poprzedniej mikroprodukcji, resztki PDMS muszą zostać usunięte przed złożeniem nowego PDMS.

  1. Na wadze zważyć do pojemnika PDMS i związany z nim utwardzacz w stosunku wagowym 10:1. Całkowita wymagana waga będzie się różnić w zależności od pożądanej grubości PDMS i rozmiaru szalki Petriego. W przypadku 4-calowej szalki Petriego, ~20 g PDMS i ~2 g utwardzacza uzyskają grubość 2-3 mm.
    UWAGA: Z roztworem PDMS należy obchodzić się w rękawicach i okularach ochronnych, a następnie utylizować go zgodnie z protokołami producenta/miejsca.
  2. Mieszaj PDMS i utwardzacz w pojemniku przez 5 minut za pomocą plastikowej szpatułki lub innego odpowiedniego narzędzia.
  3. Przenieść zmieszany pojemnik PDMS do eksykatora w celu odgazowania.
  4. Zamknij eksykator i włącz podciśnienie. W PDMS zaczną pojawiać się pęcherzyki powietrza.
  5. Pozostawić do wysuszenia/odgazowania na 30 minut. W zależności od ilości użytego PDMS i kształtu pojemnika, rzeczywisty czas może się różnić; ogólny punkt końcowy występuje wtedy, gdy w PDMS znajduje się niewiele pęcherzyków lub nie ma ich wcale.
  6. Po odgazowaniu wyłącz podciśnienie i wyjmij pojemnik PDMS.
  7. Wlej wymieszany i odgazowany PDMS na urządzenie główne na szalce Petriego.
  8. Inkubować wzorzec na zamkniętej szalce Petriego w temperaturze 65 °C przez noc, aby umożliwić PDMS pełne utwardzenie.
    UWAGA: Na tym kończą się kroki osadzania PDMS. Zaleca się, aby PDMS utwardził się w inkubatorze przez noc. PDMS jest wtedy stabilny, więc kolejne sekcje mogą być wykonywane w razie potrzeby.

5. Montaż urządzenia PDMS (1 - 2 h)

  1. Odzyskaj urządzenie główne, które wyleczyło PDMS, parę kleszczy, standardowy stemple do biopsji 1,5 mm z ręcznym tłokiem oraz skalpel/żyletkę.
    UWAGA: Z ostrzem należy obchodzić się ostrożnie i nigdy nie ciąć w kierunku siebie ani innych. Zalecane jest ostrze samochowane lub bezpieczne.
  2. Wokół funkcji urządzenia wytnij prostokątne kawałki PDMS z wzorca warstw. Upewnij się, że każdy element PDMS ma trochę miejsca z każdej strony, otaczając funkcje urządzenia, aby ułatwić dobry kontakt z klejeniem, jednocześnie upewniając się, że każdy element pasuje samodzielnie 22 mm × 22 mm szklane szkiełko nakrywkowe.
    UWAGA: Ważne jest, aby unikać dotykania dolnej powierzchni PDMS (strony z funkcjami), dlatego zawsze należy chwytać PDMS za krawędzie za pomocą pęsety. Ponadto nigdy nie należy umieszczać strony funkcji PDMS skierowaną w dół na żadnej powierzchni. Gdy nie jest używany, przechowuj PDMS stroną z funkcją skierowaną do góry w zamkniętym pojemniku, aż będzie potrzebny.
  3. Przebij otwory wlotowe i wylotowe w kawałkach PDMS za pomocą czystego dziurkacza o średnicy 1,5 mm. Przebij urządzenie PDMS w zapasową warstwę protektorowego PDMS, a nie w twardą powierzchnię, która mogłaby uszkodzić dziurkacz.
  4. Wyjmij i wyczyść szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm × 22 mm chusteczką nasączoną alkoholem izopropylowym (IPA).
  5. Szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm × 22 mm należy czyścić plazmowo przez 5 minut pod ciśnieniem (ciśnienie < 0,5 Tora) za pomocą plazmy CDA. Spowoduje to usunięcie wszelkich zanieczyszczeń lub powłok organicznych z szkiełka nakrywkowego.
  6. Przetrzyj szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm × 22 mm oraz stronę charakterystyczną PDMS chusteczką nasączoną alkoholem izopropylowym.
  7. Umieść zarówno PDMS (stroną skierowaną do góry), jak i szklane szkiełko nakrywkowe (tą samą stroną skierowaną do góry, która została wcześniej wyczyszczona) w myjce plazmowej i czyść plazmowo jednocześnie przez 30 s pod próżnią (ciśnienie < 0,5 Tora) za pomocą plazmy CDA.
  8. Wyjmij zarówno szklane szkiełko nakrywkowe, jak i urządzenie PDMS z myjki plazmowej. Odwróć PDMS tak, aby strona z elementem była skierowana w dół i umieść go na szklanym szkiełku nakrywkowym. Obserwuj wiązanie i w razie potrzeby lekko dociśnij PDMS, aby ułatwić dobry kontakt.
  9. Inkubować połączone szkiełko nakrywkowe na zamkniętej szalce Petriego w temperaturze 65 °C przez 3 minuty, aby ułatwić wiązanie.
    UWAGA: Wiązanie plazmowe zmienia hydrofobowość szkiełka nakrywkowego, tworząc hydrofilową powierzchnię. Na podstawie anegdotycznych dowodów zaobserwowano, że pierwotny stan hydrofobowy szkiełka nakrywkowego powraca po około 2 dniach inkubacji w temperaturze pokojowej. Zaleca się stosowanie gotowych urządzeń nie wcześniej niż 2 dni po klejeniu plazmowym. Na tym kończą się etapy mikrofabrykacji. Urządzenia nie mają ustalonego okresu trwałości, ale powinny być przechowywane w chłodnym, suchym miejscu, gdy nie są używane.

6. Przygotowanie mikroprzepływowego kanału przepływowego (1 h)

  1. Zabezpiecz zmontowane urządzenie mikroprzepływowe w czystym, niestandardowym adapterze stage47.
  2. Wyjmij strzykawkę, adapter Lour-lock i tulejkę mocującą oraz kawałek przezroczystej rurki o średnicy zewnętrznej 1.5 mm (o długości około 15-20 cm). Podłączyć rurkę do strzykawki za pomocą adaptera.
  3. Podłącz trzy kolejne kawałki rurki do wylotów urządzenia mikroprzepływowego (ten przewód nie musi mieć określonej długości) i skieruj drugi koniec tych przewodów do fiolki na odpady za nimi.
  4. Za pomocą strzykawki przygotować urządzenie mikroprzepływowe, wprowadzając roztwory zgodnie z poniższymi krokami. Kolejność i objętość roztworów są następujące: 50 μl roztworu buforowego BRB80, 25 μl roztworu przeciwciał anty-rodaminowych, odczekać 5 minut, 50 μL BRB80, 25 μL poloksamu 407 (F127), odczekać 15 min i 50 μL BRB80. Przykład znajduje się w tabeli 1.
    1. Pobrać roztwór ze źródła do rurki.
      UWAGA: Nie należy wciągać roztworu do końca do samej strzykawki. Roztwór powinien pozostać tylko w rurce.
    2. Delikatnie docisnąć tłok strzykawki, aż na końcu rurki znajdzie się mała kropla płynu. Zapobiegnie to przedostawaniu się powietrza do urządzenia mikroprzepływowego, gdy rurka jest podłączona.
    3. Podłącz rurkę do wlotu urządzenia mikroprzepływowego.
    4. Powoli naciskać tłok strzykawki, aż większość, ale nie całość, roztworu przeleci przez rurkę. Pozostawienie niewielkiej ilości płynu w wężyku zapewni, że powietrze nie zostanie przypadkowo przepchnięte przez rurkę. Podczas tych transferów obserwuj rurki i kanały mikroprzepływowe, szukając pęcherzyków.
      UWAGA: Jeśli w wężyku pojawią się pęcherzyki, rozpocznij rozwiązywanie problemów (spróbuj usunąć pęcherzyk przed wejściem do urządzenia mikroprzepływowego, odłączając rurkę tuż przed nadejściem bąbelka, a następnie ponownie podłączając rurkę po przejściu pęcherzyka itp.).
    5. Powtarzaj kroki 6.4.1-6.4.4 dla następnego odczynnika, aż wszystkie odczynniki zostaną przepuszczone. Do każdego odczynnika potrzebny będzie nowy kawałek rurki wlotowej, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu odczynników źródłowych. Po zakończeniu końcowego mycia BRB80 urządzenie jest stabilne przez kilka minut. Kropla roztworu BRB80 na wlotach zapobiegnie wysychaniu urządzenia.
  5. Przygotować stabilizowane mikrotubulami "nasiona" guanozyno-5'-[(α,β)-metyleno]trifosforanu (GMPCPP) zgodnie ze standardowymi protokołami (ze współczynnikiem znakowania TTR ~25%)47,48.
  6. Przygotować roztwór buforowy do obrazowania ("antifade") o stężeniu roboczym 2x, łącząc następujące odczynniki w odpowiednich ilościach (w zależności od stężeń podstawowych) w celu uzyskania ich określonych stężeń końcowych: BRB80 uzupełniony 40 mM glukozy, 40 μg/ml oksydazy glukozowej, 16 μg/ml katalazy, 0,5 mg/ml kazeiny, 50 mM chlorku potasu, i 10 mM ditiotreitolu (DTT). Ten bufor obrazowania służy do przedłużenia fotostabilności. Przykład znajduje się w tabeli 2.
  7. Rozcieńczyć porcję 2x roztworu zapobiegającego blaknięciu 1:1 w BRB80, aby uzyskać 1x roboczy roztwór przeciwblaknięcia. Podgrzej ten płyn do temperatury pokojowej (RT); Podstawowy roztwór zapobiegający blaknięciu należy przechowywać na lodzie.
porządekOdczynnikiRozcieńczenie objętościObjętość praniaCzas inkubacji
1Zobacz materiał BRB80N/a50 μLN/a
cyfra arabskaPrzeciwciało anty-rodaminowe1:50 w BRB80, dobrze wymieszaj25 μLCzas trwania: 5 min
3Zobacz materiał BRB80N/a50 μLN/a
4Poloxamer 407 (F127)1% w BRB8025 μLCzas trwania: 15 min
5Zobacz materiał BRB80N/a50 μLN/a

Tabela 1: Kolejność przygotowania kanałów urządzeń mikroprzepływowych.

cyfrowa
głośnośćOdczynnikKoncentracja zapasówStężenie końcowe
16 μLD-glukoza2 mln80 mM
16 μLOksydaza glukozowa2 mg/ml80 μg/ml
16 μLKatalazy0,8 mg/ml32 μg/ml
14 μLkazeina28 mg/ml0,16 mg/ml
8 μLNaziemna telewizja1 mln20 mM
40 μLChlorek potasu1 mln100 mM
290 μLZobacz materiał BRB801xN/a
400 μLFINAL (2x stężenie robocze)

Tabela 2: Przepis na roztwór do obrazowania zapobiegający blaknięciu (stężenie 2x).

7. Wprowadzenie nasion mikrotubul do mikroprzepływów (10 - 15 min)

  1. Podłączyć urządzenie mikroprzepływowe do mikroskopu.
    UWAGA: Ponieważ stabilność mikrotubul zależy od temperatury, zaleca się, aby eksperymenty obrazowe przeprowadzać w temperaturze 35 °C.
  2. Podłącz 10-15 cm nowej rurki do strzykawki i narysuj żądane rozcieńczenie nasion mikrotubul stabilizowanych GMPCPP do rurki.
    UWAGA: Dla tego urządzenia optymalne stężenie stanowiły nasiona mikrotubul GMPCPP ~10 nM.
  3. Delikatnie docisnąć tłok strzykawki, aż na końcu rurki znajdzie się mała kropla płynu. Zapobiegnie to przedostawaniu się powietrza do urządzenia mikroprzepływowego, gdy rurka jest podłączona.
  4. Podłącz rurkę do wlotu urządzenia mikroprzepływowego.
  5. Powoli naciskać tłok strzykawki, aż większość, ale nie całość, roztworu przeleci przez rurkę. Pozostawienie niewielkiej ilości płynu w wężyku zapewni, że powietrze nie zostanie przypadkowo przepchnięte przez rurkę.
  6. Odłączyć rurkę wlotową od urządzenia mikroprzepływowego i strzykawki, a następnie podłączyć nowy kawałek rurki do strzykawki.
  7. Wciągnij BRB80 do rurki.
  8. Powtórz kroki 7.3-7.6, aby wypłukać niezwiązane nasiona mikrotubul z urządzenia.
  9. Obserwuj przyleganie nasion do powierzchni mikroprzepływowej za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF). Idealna liczba nasion w jednym polu widzenia będzie się różnić w zależności od zastosowania i wielkości pola widzenia, ale ogólnie rzecz biorąc, ~10-20 nasion na 80 μm × pole widzenia 80 μm jest optymalne. W razie potrzeby powtarzaj kroki 7.2-7.9, aż do osiągnięcia pożądanej gęstości nasion.
    UWAGA: Do monitorowania gęstości zasiewów mikrotubul należy stosować przerywaną ekspozycję na krótkie światło (100 ms), ponieważ w roztworze nie ma jeszcze środka zapobiegającego blaknięciu.
  10. Po osiągnięciu odpowiedniej gęstości związanych nasion należy przymocować nowy kawałek rurki wlotowej do strzykawki.
  11. Wlej ciepły 1x roztwór zapobiegający blaknięciu do rurki i powtórz kroki 7.3-7.6.
    UWAGA: Dzięki rozwiązaniu zapobiegającemu blaknięciu w urządzeniu, fotostabilność jest znacznie poprawiona, a urządzenie jest stabilne. Jednak nadal zaleca się zminimalizowanie ekspozycji na światło lasera.

8. Uprawa przedłużeń mikrotubul z nasion (15 - 30 min)

  1. Połącz znakowaną fluorescencyjnie tubulinę, nieznakowaną tubulinę, 2x roztwór zapobiegający blaknięciu, trifosforan guanozyno-5'-trifosforan (GTP) i BRB80, aby uzyskać końcowy roztwór zawierający 14 μM tubuliny przy 7% współczynniku znakowania fluorescencyjnego, antifade przy 1x stężeniu roboczym i 1 mM GTP.
    UWAGA: W przypadku stosowania różnych stężeń lub różnych procentów znakowania tubuliny, objętość każdego odczynnika będzie musiała zostać dostosowana, aby osiągnąć pożądane końcowe stężenie i stosunek znakowania. Trzymaj roztwór tubuliny na lodzie do ~30 s przed wprowadzeniem, w którym to momencie zdejmij roztwór z lodu i podgrzej go w dłoni do RT. Pomoże to w polimeryzacji przedłużeń mikrotubul, która jest procesem zależnym od temperatury. Rzeczywiście, polimeryzację mikrotubul należy przeprowadzić w temperaturze 35 °C, podczas gdy wszystkie inne etapy eksperymentalne można przeprowadzić w temperaturze pokojowej.
  2. Podłącz 10-15 cm nowej rurki do strzykawki i wciągnij roztwór tubuliny do rurki.
  3. Delikatnie docisnąć tłok strzykawki, aż na końcu rurki znajdzie się mała kropla płynu. Zapobiegnie to przedostawaniu się powietrza do urządzenia mikroprzepływowego, gdy rurka jest podłączona.
  4. Podłącz rurkę do wlotu urządzenia mikroprzepływowego.
  5. Powoli naciskać tłok strzykawki, aż większość, ale nie całość, roztworu przeleci przez rurkę. Pozostawienie niewielkiej ilości płynu w wężyku zapewni, że powietrze nie zostanie przypadkowo przepchnięte przez rurkę. Odłącz rurkę doprowadzającą od urządzenia mikroprzepływowego.
  6. Obraz z żądaną częstotliwością przez 10-15 minut lub do momentu, gdy przedłużenia będą wystarczająco długie, aby się zgiąć. Zazwyczaj obrazowanie wykonuje się przy długości fali 488 nm co 5 s i długości fali 561 nm co 60 s, aż wydłużenia osiągną długość co najmniej 5-10 μm (~15 min).
    UWAGA: Przy tym stężeniu tubuliny mikrotubule mogą stochastycznie przełączać się między okresami polimeryzacji i depolimeryzacji; Można się tego spodziewać, ale ogólnie rzecz biorąc, rozszerzenia mikrotubul będą się wydłużać49.

9. Stabilizacja przedłużeń mikrotubul (10-15 min)

  1. Połącz Taxol, 2x roztwór zapobiegający blaknięciu i BRB80, aby uzyskać końcowy roztwór zawierający 10 μM taksolu i środka zapobiegającego blaknięciu o stężeniu roboczym 1x.
    UWAGA: Roztwór taksolu należy przechowywać na lodzie do ~30 s przed wprowadzeniem, po czym należy zdjąć roztwór z lodu i podgrzać go w dłoni do RT. Zapobiegnie to depolimeryzacji przedłużeń mikrotubul, która jest procesem zależnym od temperatury.
  2. Podłącz 10-15 cm nowej rurki do strzykawki i wciągnij roztwór taksolu do rurki.
  3. Delikatnie docisnąć tłok strzykawki, aż na końcu rurki znajdzie się mała kropla płynu. Zapobiegnie to przedostawaniu się powietrza do urządzenia mikroprzepływowego, gdy rurka jest podłączona.
  4. Podłącz rurkę do wlotu urządzenia mikroprzepływowego.
  5. Naciskać tłok strzykawki, aż większość, ale nie całość, roztworu przeleci przez rurkę. Pozostawienie niewielkiej ilości płynu w wężyku zapewni, że powietrze nie zostanie przypadkowo przepchnięte przez rurkę.
  6. Powtórz kroki 9.2-9.5 dwa razy w krótkich odstępach czasu. W tym przypadku można użyć tego samego odcinka rurki.
    UWAGA: Taxol wspomaga zarodkowanie mikrotubul de novo z tubuliny w roztworze, a te mikrotubule mogą wylądować na powierzchni kanału mikroprzepływowego i zakłócać późniejsze obrazowanie/zginanie. Z tego powodu roztwór taksolu powinien przepływać przez urządzenie szybko i w wielu iteracjach, aby jak najszybciej usunąć jak najwięcej wolnej tubuliny z urządzenia.
  7. Sprawdź, czy mikrotubule wyhodowane z nasion są nadal obecne i ustabilizowane w urządzeniu.

10. Przedłużanie mikrotubul stabilizowanych przy gięciu (10 - 15 min)

UWAGA: Stabilizowane przedłużenia mikrotubul mogą być teraz gięte za pomocą regulatora przepływu. W tym przypadku zastosowano regulowany, nadciśnieniowy system wyporowy (Elveflow OB1 MK3+) do przepływu roztworu z hermetycznej fiolki źródłowej przez przepływomierz do mikroprzepływu. W zależności od specyfiki dostępnej konfiguracji regulatora przepływu, można wprowadzić modyfikacje w następujących krokach.

  1. Skonfiguruj regulator przepływu i powiązane urządzenia zgodnie z protokołami specyficznymi dla producenta/lokalizacji, używając rurki do podłączenia fiolki źródłowej do wlotu przepływomierza i wylotu przepływomierza do wlotu mikroprzepływowego, ale nie należy jeszcze podłączać rurki do urządzenia mikroprzepływowego.
  2. Włóż ~200 μl roztworu taksolu 10 μM do fiolki źródłowej, którą można podłączyć do konfiguracji regulatora przepływu. Ta konfiguracja wykorzystuje połączenia Luer-lock w celu uzyskania hermetycznego uszczelnienia.
  3. Włącz system kontroli przepływu i zalej rurkę, aby usunąć powietrze. Zapobiegnie to przedostawaniu się powietrza do urządzenia mikroprzepływowego, gdy rurka jest podłączona.
  4. Po zalaniu rurki przez przepływomierz, a na końcu rurki znajduje się niewielka kropla płynu, wyłącz układ kontroli przepływu.
  5. Podłącz rurkę do wlotu urządzenia mikroprzepływowego. Użyj wlotu prostopadłego do wlotu używanego do wprowadzania nasion mikrotubul i wyhoduj przedłużenia mikrotubul, aby wygięły się prostopadle.
  6. Przedłużenia gięcia, rozpoczynając i zatrzymując przepływ przy żądanym natężeniu przepływu lub ciśnieniu. Ciśnienie 30 mbar jest standardem dla tego protokołu wykorzystującego 5-sekundowy przepływ oscylacyjny. Wyobraź sobie zginanie w tym czasie, zwykle co 0,1 s przy 488 nm i co 10 s przy 561 nm.
    UWAGA: Na tym kończy się podstawowy test zginania mikrotubul. Wszystkie urządzenia i odczynniki można wyczyścić/zutylizować zgodnie z protokołami specyficznymi dla producenta/lokalizacji.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzasadnienie projektu urządzenia mikroprzepływowego
Przy projektowaniu urządzenia mikroprzepływowego w tym badaniu kierowano się kilkoma kluczowymi cechami (Rysunek 2), które opierają się na tradycyjnej prostej konstrukcji komory przepływowej i ją ulepszają. Warto zauważyć, że urządzenie mikroprzepływowe ma wewnętrzną objętość ~160 nL, znacznie mniejszą niż objętość ~10 μL bardziej tradycyjnych komórek przepływowych47, co pozwala na bardziej kontrolowane użycie potencjalnie cennych odczynników, takich jak oczyszczone składniki białkowe. Ponieważ mikroprzepływowy regulator przepływu zawiera dwa kanały regulacyjne, urządzenie zostało opracowane przy założeniu, że tylko dwa porty wlotowe/wylotowe będą miały kontrolę ciśnienia w danym momencie. W razie potrzeby można zastosować więcej kanałów sterowanych ciśnieniem.

figure-results-1
Rysunek 2: Schemat projektu urządzenia mikroprzepływowego. Prostokątne oznaczenia na obrzeżach służą do wizualnej pomocy w widzeniu obrzeży kanałów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Centralna, prostokątna komora urządzenia służy jako główny obszar obrazowania, gdzie dołączane są nasiona mikrotubul, a przedłużenia mikrotubul są polimeryzowane z tych nasion. Komora jest przecięta kanałem przepływowym z każdej strony, z prostymi kanałami wzdłuż osi x służącymi jako wlot i wylot, aby ułatwić szybką wymianę roztworu reakcyjnego. Kanał wlotowy mikrotubul służy również do wprowadzania nasion mikrotubul do komory, przy czym przepływ laminarny powoduje wiązanie nasion z powierzchnią szkła wzdłuż kierunku przepływu. W kierunku prostopadłym (oś y) kanały przepływu rozgałęziają się na mniejsze kanały w kierunku komory, podobnie jak w niektórych poprzednich konstrukcjach25,28,36,39. Geometria rozgałęzień jest szczególnie przydatna do badania właściwości mechanicznych mikrotubul. Przepływ roztworu do komory centralnej z kierunku prostopadłego do orientacji zarodków mikrotubul pozwala na uzyskanie sił zginających wywołanych przepływem pod kątem zbliżonym do normalnego. Co więcej, włączenie geometrii rozgałęzień z wieloma mniejszymi kanałami przepływu ułatwia bardziej jednorodne przyłożenie siły na dużym obszarze komory centralnej, czego nie osiąga się za pomocą prostej geometrii przepływu jednokanałowego. W ten sposób motyw rozgałęzienia, choć pozornie bardziej skomplikowany, może zmniejszyć ogólną złożoność określania siły wywieranej na mikrotubule (Rysunek 3). Ta konstrukcja charakteryzuje się również wieloma liniami symetrii, co pozwala na łatwość użycia i możliwość oceny gięcia z kilku kierunków (np. od góry do dołu).

figure-results-2
Rysunek 3: Włączenie rozgałęziającego się motywu powoduje powstanie dużego obszaru o podobnym przepływie. Symulacje dwóch konstrukcji urządzeń w stanie ustalonym: jednego bez kanałów rozgałęziających (A) i jednego z kanałami rozgałęzionymi (B). Strzałki wyznaczają lokalny kierunek przepływu i są proporcjonalne do wielkości przepływu. Zabarwienie powierzchni oznacza prędkość linii środkowej. Zdjęcia po prawej stronie pokazują powiększoną sekcję urządzenia, w której mikrotubule (nie pokazane) zorientowane wzdłuż osi x byłyby poddawane siłom zginania od płynu przepływającego do górnego portu i wychodzącego z dolnego portu. Włączenie rozgałęzionych kanałów zwiększa względny obszar podlegający podobnym polom prędkości, nie zwiększając jednocześnie wymaganej objętości odczynnika. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Rogers (2022)14. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Warto zauważyć, że urządzenie implementuje również szereg pułapek bąbelkowych w kanałach przepływu wlotowego i wylotowego, aby zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do centralnej komory obrazowania. W szczególności zdecydowaliśmy się uwzględnić tablice mikrofilarów w ścieżce przepływu, aby zablokować pęcherzyki powietrza przed przemieszczaniem się w przeszłości z powodu napięcia powierzchniowego (Rysunek 2)46. Ponadto, aby zapobiec porywaniu powietrza, zaprojektowaliśmy krawędzie wewnątrz urządzenia jako gładkie krzywizny, zamiast mieć ukośne kąty. Podsumowując, te cechy konstrukcyjne zmniejszają możliwość powstawania pęcherzyków powietrza i zwiększają wytrzymałość urządzenia.

Produkcja urządzeń mikroprzepływowych
Określenie odpowiednich parametrów do stworzenia mastera urządzenia wymagało pewnej optymalizacji. Jak wcześniej zauważono, ten fotorezystor jest bardzo wrażliwy na kluczowe parametry operacyjne, takie jak oświetlenie otoczenia oraz szybkość nagrzewania i chłodzenia podczas etapów fotolitografii50. Na przykład, jeśli master zostanie schłodzony zbyt szybko po podgrzaniu, w fotorezyście mogą powstać pęknięcia termiczne. Jest to niepożądane, ponieważ pęknięcia mogą zagrozić integralności kanału. Podczas gdy pęknięcia można rozwiązać poprzez ponowne podgrzanie rezystu do temperatury zbliżonej do temperatury przejścia (~115 °C), stwierdziliśmy, że umożliwienie mistrzowi schłodzenia w otoczeniu na płycie grzejnej było najsolidniejszym sposobem zapobiegania pękaniu. Co więcej, nadmiar światła otoczenia może spowodować niezamierzone naświetlenie fotorezystu, osłabienie rezystu i spowodowanie, że same cechy urządzenia (które powinny pozostać na płytce po wywołaniu) zostaną częściowo usunięte na etapie wywoływania. Z tego powodu zachęcamy do wykonania etapu wywoływania następnego dnia po etapie pieczenia po ekspozycji i chłodzenia w temperaturze otoczenia przez noc. Ponadto, gdy urządzenie główne nie jest używane, zalecamy przechowywanie go w ciemnym miejscu lub zawinięcie w folię aluminiową, aby zapobiec degradacji w miarę upływu czasu. Po ustaleniu tych parametrów proces fotolitografii był wysoce powtarzalny (Rysunek 4).

Po utworzeniu wzorca, płynny PDMS został wylany na wzorzec, co pozwoliło PDMS na utwardzenie i stworzenie negatywnego odcisku cech wzorca. Stwierdziliśmy, że odlewanie PDMS na grubość 2-3 mm pozwalało na łatwą manipulację urządzeniami; w przeciwieństwie do tego, jeśli został pokryty wirowo w celu uzyskania grubości w zakresie μm, PDMS był podatny na rozdarcie lub samoprzywieranie, co utrudniało manipulację. Co więcej, grubsza warstwa PDMS pozwala na łatwiejsze podłączanie przewodów, ponieważ rurki pozostaną w portach wlotowych/wylotowych bez konieczności stosowania uszczelniacza lub zacisku.

Na koniec, podczas gdy tradycyjne testy z wykorzystaniem komórek przepływowych do tych zastosowań biologicznych często wykorzystują szklane szkiełka nakrywkowe, które zostały wstępnie oczyszczone roztworem Piranha (nadtlenek wodoru i kwas siarkowy), a następnie silanizowane, stwierdziliśmy, że szkiełka nakrywkowe poddane działaniu przedłużonego czyszczenia plazmowego i płukania IPA były odpowiednie dla naszych celów47. Inne zastosowania, takie jak obrazowanie pojedynczych cząsteczek, mogą wymagać bardziej rozległej obróbki szkła nakrywkowego.

figure-results-3
Rysunek 4: Proces fotolitografii. (A) Maska z pożądanym wzorem (maska wykonana z chromu wytrawionego na szkle). (B) Niewielkie pęknięcie fotorezystu na płytce krzemowej spowodowane naprężeniami termicznymi (strzałki zaznaczają kilka pęknięć). Pęknięcia te często rozciągają się na całej płytce. (C) Rozwinięty mistrz. (D) Układ mikroprzepływowy w mikroskopie. Poszczególne komponenty są oznaczone kolorem zielonym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wzrost, stabilizacja i zginanie mikrotubul
Nasiona mikrotubul wyhodowane przez GMPCPP służą jako miejsca zarodkowania dla przedłużeń mikrotubul do polimeryzacji i same w sobie są odporne na depolimeryzację przez kilka godzin w temperaturze pokojowej. Nasiona powiązano ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym w kanale mikroprzepływowym za pomocą przeciwciała anty-rodaminowego47. Dynamiczne przedłużenia mikrotubul hodowano następnie w obecności rozpuszczalnej tubuliny (znakowanej fluorescencyjnie, ale nie sprzężonej z rodaminą) i GTP. W ten sposób miejsca zarodkowania nasion zostały przymocowane do szklanego szkiełka nakrywkowego, ale przedłużenia nie. Podczas 15-minutowego okresu wzrostu wydłużenia mikrotubul polimeryzowały i depolimeryzowały stochastycznie, zgodnie z oczekiwaniami ze względu na ich wewnętrzną niestabilność dynamiczną49. Po tym okresie wzrostu przeprowadzono wymywanie 10 μM Taxolu w celu wyeliminowania wszelkich pozostałych tubuliny z roztworu i ustabilizowania utworzonych rozszerzeń mikrotubul. Stabilizacja jest kluczowa, ponieważ w przeciwnym razie przedłużenia mikrotubul uległyby depolimeryzacji po wyczerpaniu tubuliny. Oprócz wiązania i stabilizacji polimeru mikrotubul, wykazano również, że Taxol wpływa na mechanikę polimerów mikrotubul i może indukować krzywiznę w liniowych przedłużeniach mikrotubul51,52,53,54. Przedstawione tutaj wyniki odzwierciedlały te obserwacje; Jednak zwijanie się przedłużeń mikrotubul jest niepożądane, ponieważ powoduje to nierównomierne siły przenoszone wzdłuż siatki podczas zginania. Dlatego do analizy zginania wykorzystano tylko mikrotubule, które pozostały względnie proste po stabilizacji. Alternatywnie, po początkowym okresie wzrostu, wtórny okres wzrostu z roztworem tubuliny i GMPCPP (w przeciwieństwie do początkowego GTP) może być wykorzystany do stworzenia stabilnych "czapek" na rosnących końcach siatki mikrotubul i zapobieżenia depolimeryzacji55.

Mikrotubule były następnie wyginane przez przepływ w roztworze buforowym za pomocą systemu kontroli ciśnienia w celu utrzymania stałego ciśnienia przed (Rysunek 5, Dodatkowe wideo 1). W ten sposób mogliśmy w przybliżeniu określić lokalny przepływ doświadczany przez mikrotubule. Poprzez przepływ płynu od góry i od dołu przez dolny port urządzenia, orientacja przepływu miała być prostopadła do orientacji wysiewu.

figure-results-4
Rysunek 5: Konfiguracja mikroprzepływowa może być używana do gięcia stabilizowanych mikrotubul.Mikrotubule w stanie spoczynku po ustabilizowaniu paklitakselem ulegają zgięciu podczas przepływu pulsacyjnego. Stałe ciśnienie przed przepływem wynoszące 30 mbar napędza przepływ (strzałka oznacza kierunek przepływu). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyznaczanie profilu przepływu w urządzeniu mikroprzepływowym
Prędkość linii środkowej w mikroprzepływie można symulować obliczeniowo za pomocą oprogramowania COMSOL (oprogramowanie symulacyjne, Rysunek 6A). Jednak mikrotubule są przymocowane do szklanego szkiełka nakrywkowego do mikroskopii TIRF w odległości ~100 nm od powierzchni. W związku z tym prędkość doświadczana przez mikrotubulę nie jest taka sama, jak przewidywana w symulacji 2D. Aby przybliżyć lokalny przepływ doświadczany przez mikrotubule, użyliśmy ogólnego równania Naviera-Stokesa dla nieściśliwego przepływu płynu w jednym wymiarze:

figure-results-5

Tutaj z to wysokość mikrotubul w urządzeniu, h to całkowita wysokość urządzenia, a vc to prędkość linii środkowej urządzenia. Zgodnie z definicją systemu, z-origin jest środkiem urządzenia (Rysunek 6B). Korzystając z tej definicji i wysokości kanału 13 μm, wysokość mikrotubul jest w przybliżeniu określana jako z = -6,4 μm. Rozwiązanie tego równania daje oszacowanie lokalnej prędkości płynu doświadczanej przez mikrotubule:

figure-results-6

figure-results-7
Rysunek 6: Definiowanie systemu do analizy przepływu płynów wchodzących do urządzenia w górnym porcie i wychodzących z dolnego portu (porty nie pokazane). (A) Symulacja skalowanego pola prędkości linii środkowej, jak w Rysunek 3B. Gwiazda oznacza obszar zainteresowania panelu B. (B) Reprezentacja przekroju poprzecznego urządzenia. W pełni rozwinięty profil przepływu płynu jest w kierunku y z prędkością osiową vc przy z = 0 i stanem brzegowym braku poślizgu na ścianach. Zauważ, że strzałki w tym panelu nie są skalowane w odniesieniu do rzeczywistego pola prędkości pokazanego w panelu A. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Rogers (2022)14. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Poza symulacjami, prędkość płynu może być kontrolowana za pomocą regulatora przepływu opartego na objętościowym natężeniu przepływu, a nie na utrzymywaniu ciśnienia. Co więcej, lokalne natężenie przepływu w każdym urządzeniu można bezpośrednio określić poprzez włączenie kulek fluorescencyjnych i monitorowanie ich prędkości, zmniejszając w ten sposób wszelkie różnice między próbkami.

Modelowanie obliczeniowe i demonstracje gradientów
Na koniec przeprowadziliśmy symulacje obliczeniowe w połączeniu z eksperymentami, aby zademonstrować możliwość wykorzystania tego urządzenia do eksperymentów o wysokiej przepustowości. Wraz z możliwością zginania mikrotubul w wielu kierunkach dzięki symetrii urządzenia, symulacje wykazały, że urządzenie może utrzymywać precyzyjne gradienty, umożliwiając jednoczesne badanie wielu warunków eksperymentalnych (Rysunek 7A). Wstępne eksperymenty (metody, które nie zostały wyraźnie określone w ramach tej publikacji) z użyciem barwnika fluorescencyjnego w roztworze wykazały zgodność z przewidywaniami obliczeniowymi (Rysunek 7B). Co więcej, udało nam się zademonstrować partycjonowanie różnych białek w różnych obszarach urządzenia poprzez jednoczesne hodowanie rozszerzeń mikrotubul z różnymi znacznikami fluorescencyjnymi (Rysunek 8). Według naszej wiedzy jest to pierwsze zastosowanie wysokoprzepustowej mikrofluidyki do badań mikrotubul. Ta cecha tego urządzenia może być wykorzystana do skrócenia czasu i ilości potrzebnych odczynników, przy jednoczesnej poprawie odporności eksperymentalnej. Na przykład wpływ różnych białek lub różnych stężeń poszczególnych białek na mechanikę i dynamikę mikrotubul może być jednocześnie badany w jednym urządzeniu.

figure-results-8
Rysunek 7: Tworzenie gradientu. (A) Symulacja gradientu dwóch roztworów wchodzących do urządzenia przy tym samym ciśnieniu wlotowym (50 mbar) i stężeniu (15 μM). Porty wlotowe dla każdego roztworu są oznaczone kolorowymi strzałkami (jeden roztwór w górnym porcie, a drugi roztwór w prawym porcie), a dwa pozostałe porty służą jako wyloty. Mapa cieplna pokazuje profil stężenia górnego roztworu. Stan stacjonarny osiągnięto przy t = 5 s. (B) Eksperymentalne generowanie podobnego gradientu przy użyciu barwnika fluorescencyjnego w roztworze w górnym porcie i buforu w prawym porcie. Obraz to warstwa rastrowa utworzona przez zszycie każdego pola widzenia (80 μm × 80 μm) w celu rozdzielczości całego obszaru urządzenia. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Rogers (2022)14. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 8: Demonstracja gradientu białek w urządzeniu mikroprzepływowym. Tubulina oznaczona AlexaFluor647 (magenta) była podawana we wlocie 1, a tubulina oznaczona AlexaFluor488 (zielona) była podawana we wlocie 2 urządzenia w równych stężeniach i natężeniach przepływu. Przepływ był oscylowany włącz / wyłącz w krokach co 90 s, aby umożliwić polimeryzację tubuliny ze stabilizowanych nasion GMPCPP (czerwonych) przy jednoczesnym hamowaniu mieszania. (A) Wielkoskalowa warstwa rastrowa utworzona przez zszywanie pól widzenia (80x80 μm) w celu rozdzielczości na całej długości urządzenia. Litery wyznaczają względne położenie poszczególnych pól widzenia w kolejnych panelach. Podziałka wynosi 50 μm w położeniach X i Y. (B) Pole widzenia w pobliżu wlotu 1 urządzenia, gdzie przedłużenia składają się głównie z tubuliny znakowanej A647. (C) Pole widzenia w pobliżu środka urządzenia, gdzie przedłużenia składają się z mieszaniny oznakowanych tubuliny, zgodnie z przewidywaniami. (D) Pole widzenia w pobliżu dolnej części urządzenia, gdzie przedłużenia składają się głównie z tubuliny znakowanej A488. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Diagram przepływu procesu (PFD) dla eksperymentalnego zestawu mikrofluidyki na mikroskopie jest pokazany na rysunku uzupełniającym 1.

Rysunek uzupełniający 1: Diagram przepływu procesu (PFD) dla eksperymentalnego układu mikrofluidyki na mikroskopie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowe wideo 1. Układ mikroprzepływowy może być używany do zginania stabilizowanych mikrotubul. Mikrotubule w stanie spoczynku po ustabilizowaniu paklitakselem ulegają zgięciu podczas przepływu pulsacyjnego. Stałe ciśnienie przed zaworem wynoszące 30 mbar napędza przepływ. Szybkość odtwarzania wideo 10 kl./s. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Plik CAD projektu maski mikroprzepływowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym celem tego protokołu było zaprojektowanie i wyprodukowanie urządzenia mikroprzepływowego odpowiedniego do badania mechaniki mikrotubul in vitro. Projekt został oparty na chęci wykorzystania nieodłącznych zalet urządzeń mikroprzepływowych opartych na PDMS, a jednocześnie obejmuje kombinację funkcji, które umożliwiłyby solidne i konfigurowalne eksperymenty o wysokiej przepustowości.

Cel ten został pomyślnie osiągnięty, co zaowocowało protokołami produkcyjnymi i ogólnymi wytycznymi, które mogą służyć jako podstawa dla przyszłych użytkowników tego systemu. Włączenie do urządzenia nadmiarowych pułapek bąbelkowych zmniejsza prawdopodobieństwo denaturacji białek z powodu obecności pęcherzyków powietrza. Chociaż nadal mamy do czynienia z odłączaniem i ponownym podłączaniem przewodów w urządzeniu, te pułapki bąbelkowe zmniejszają prawdopodobieństwo niepowodzenia eksperymentu. Przyszłe ulepszenia układu mikroprzepływowego mogą jeszcze bardziej zmniejszyć liczbę ręcznych manipulacji rurkami dokonywanych podczas eksperymentu. Co więcej, integracja urządzenia mikroprzepływowego ze zautomatyzowanym oprogramowaniem do sterowania przepływem pozwala na znaczne dostosowanie warunków eksperymentalnych przy jednoczesnym zmniejszeniu możliwości błędu ręcznego. Wykazaliśmy pomyślne działanie urządzenia, wytwarzając urządzenie, a następnie hodując, stabilizując i zginając przedłużenia mikrotubul w urządzeniu przy użyciu automatycznego, regulowanego przez kontroler przepływu. Ponadto, ustalając gradient odrębnych znakowanych fluorescencyjnie roztworów tubuliny w tym samym urządzeniu, wykazaliśmy, że wiele warunków może być uruchamianych jednocześnie w jednym urządzeniu. Wspomagany technikami modelowania i analizy obliczeniowej, nasz system może badać i określać właściwości biomechaniczne mikrotubul, takie jak sztywność zginania 52,56,57,58,59.

Potencjalne przyszłe ulepszenia ułatwiłyby opracowanie jeszcze bardziej niezawodnego systemu i związanej z nim analizy eksperymentalnej. Po pierwsze, osadzanie fotorezystu, ekspozycja i wypalanie były kluczowymi parametrami, które wykazały pewną zmienność. Stosunkowo duże rozmiary elementów fotorezystu SPR wymagały bardzo stopniowego nagrzewania i chłodzenia, aby zapobiec pękaniu termicznemu, które mogłoby zniszczyć urządzenia. Chociaż próbowano użyć cieńszych urządzeń, znaleźliśmy problemy z manipulowaniem tymi mniejszymi rozmiarami funkcji. Dbałość o szczegóły i cierpliwość są kluczowe przy replikowaniu urządzeń o tej grubości za pomocą fotorezystu SPR. Do rozwiązania tego problemu można użyć różnych fotorezystorów, w zależności od dostępności.

Podsumowując, urządzenie mikroprzepływowe i protokół pozwalają na szereg konfiguracji eksperymentalnych o bardziej solidnych, wysokowydajnych możliwościach testowych niż poprzednie testy z komórkami przepływowymi47. Co więcej, eksperymenty można zautomatyzować za pomocą regulatorów przepływu w celu utrzymania precyzyjnych profili przepływu lub gradientów stężeń w urządzeniu, zmniejszając zmienność nieodłącznie związaną z użytkownikami ręcznymi. Przyszłe potencjalne zastosowania tego układu obejmują badanie wpływu białek związanych z mikrotubulami na sztywność zginania mikrotubul, dynamikę, uszkodzenie i naprawę sieci, a także biomechaniczne interakcje mikrotubul i włókien aktynowych 54,60,61,62,63,64,65,66,67, 68,69,70. Integracja mikrofabrykacji, zautomatyzowanej kontroli przepływu oraz technik modelowania i analizy obliczeniowej tworzy wszechstronny system odpowiedni do badania cytoszkieletu komórkowego in vitro.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów. Autorzy ujawniają wykorzystanie ChatGPT-4o OpenAI do korekty i korekty tekstu.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie i zasoby dostarczone przez Vanderbilt Institute of Nanoscale Science and Engineering (VINSE), gdzie przeprowadzono część tych badań. Praca ta została częściowo sfinansowana z grantu NIH NIGMS dla M. Zanica (R35 GM1192552) i grantu NSF ID 2018661 dla M. Zanicia. M. Rogers otrzymał wsparcie z grantu NIH T32 GM08320 oraz nagrody pilotażowej VINSE. L. Richardson jest wspierany przez grant NSF GRFP nr 1937963. Autorzy chcieliby również podziękować dr Alice Leach, Davidowi Schafferowi, dr Christinie McGahan i całemu laboratorium Zanic za ich pomoc i wsparcie.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówki do mikrowirówek 0,6 ml (przezroczyste)Dowolna markaPreferowany typ o niskiej retencji
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml (przezroczyste)Dowolna markaPreferowany typ niskiej retencji
Standardowy dziurkacz do biopsji 1,5 mmIntegra LifeSciences33-31A-P/25
100x/1,49 apertura numeryczna Obiektyw TIRFNikon
22 x 22 mm szkło Szkiełka nakrywkoweThorLabsCG15CH
3" jednostronnie polerowane wafle silikonoweUniversity Wafer447
4" szalka PetriegoDowolna marka
450 i mikro; L, Otwarta cienkościenna, ultraprzezroczysta rurka BeckmanCoulter, Inc.345843Określany jako "rurka powietrzna" w protokole
Lasery półprzewodnikowe 488, 561 i 640 nmNikon
A-95 Rotor o stałym kącienachylenia Beckman Coulter, Inc.
AcetonDowolna marka
Ultrawirówka pneumatyczna AirfugeBeckman Coulter, Inc.347854Określany jako "airfuge" w protokole
Alexa Fluor 488 Microscale Protein Labeling KitThermo Fisher ScientificA30006
Folia aluminiowaDowolna marka
Andor iXon Ultra EM-CCDNikon
Andor NEO sCMOSNikon
AutoCADAutodeskWersje ogólne może być używany
Mózg bydlęcy nieoznakowana tubulina (oczyszczona)Nie dotyczyWyprodukowany we własnym zakresie, ale można go kupić
KazeinaMiliporeSigmaC7078
KatalazaMiliporeSigmaC9322
Czyste suche powietrze (CDA) (gaz pod ciśnieniem)Dowolna marka
Zasilanie sprężonym powietrzemDowolna markaŁączy się z mikroprzepływowym regulator przepływu
COMSOL Multiphysics oprogramowanieCOMSOL, Inc.
Niestandardowy mosiężny adapter scenicznyN/AWyprodukowany we własnym zakresie, aby pasował do naszych szkiełek nakrywkowych 22 mm x 22 mm na mikroskopie
Woda dejonizowanaDowolna marka
D-glukozaMiliporeSigmaG7528
Dithiothreitol (DTT)MiliporeSigmaD0632
EGTAOprogramowanie MilliporeSigma324626
Elveflow Smart Interface (ESI)Elveflow
Bezkołnierzowe złączki PFA z ETFE i frac14; "od -28 do 1/16" Średnica zewnętrzna okuć Darwin MicrofluidicsCIL-XP-245XSłuży do łączenia rurki z fiolek źródłowych micrewtube do czujnika przepływu za pośrednictwem ciśnieniowego stojaka na zbiornik
Fluiwell 4-kanałowy 2 mL niskociśnieniowyfluigent14002001Służy do podłączenia systemu kontroli przepływu do rur micrew. Określany również jako "ciśnieniowy stojak na zbiornik
Okapdowolnej marki
Oksydaza glukozowaMilliporeSigmaG6125
GMPCPPJena BioscienceNU-405L
Trifosforan guanozyny (GTP)MiliporeSigmaG8877
Płyta grzejnaDowolna marka
HS-625 o dużej prędkości koło filtra emisyjnegoOprzyrządowanie
Oprogramowanie ImageJNie dotyczy
InkubatorDowolna marka
Alkohol izopropylowyDowolna marka
Karl Suss MA-6 nakładka do maskiSUSS MicroTec
Chlorek magnezuMilliporeSigma1.05833
Oprogramowanie MATLABMathWorks
MEGAPOSIT SPR 220 7.0 fotorezystorDow, Inc.
Złączki mikroprzepływowe 6-40 do 1/4"-28 Zestaw adapterówDarwin MicrofluidicsLVF-KFI-08Służy do łączenia rurki z fiolek źródłowych micrewtube do czujnika przepływu za pośrednictwem ciśnieniowego stojaka na zbiornik (stojak Fluiwell)
Złączki mikroprzepływowe żeńskie Zestaw adapterów Luer LockDarwin MicrofluidicsLVF-KFI-04Służy do podłączenia strzykawki do rurki
Mikroprzepływowy regulatorprzepływuElveflowOB1 MK3 +
mikroprzepływowy czujnik przepływuElveflowMFS3Ten zakres czujników przepływu wynosi 0-80 μ L 
Deweloper MICROPOSIT MF-319Dow, Inc.
MikroskopNikonEclipse Ti
Oprogramowanie NIS-ElementsNikon
Azot (gaz pod ciśnieniem)Dowolna marka
Grzejnik obiektywowyTokai Hit
Jednoczęściowa dokręcana na palce 10-32 Złączka stożkowa do rurek o średnicy zewnętrznej 1/16" Darwin MicrofluidicsCIL-F-120XSłuży do podłączenia strzykawki do rurki
Paklitaksol (Taxol)Tocris Bioscience1097
Maski fotolitograficzneN/AWykonane przez podmiot zewnętrzny przy użyciu naszych projektów
RURYThermo Fisher Scientific172615000
Odkurzacz plazmowyHarrick PlasmaPDC-32G
System przepływomierza plazmowegoHarrick PlasmaPDC-FMGIntegruje się z myjką plazmową, aby umożliwić kontrolę przepływu gazu pod ciśnieniem
Pipeta z plastikową bańkąDowolna marka
Pluoronic F-127MilliporeSigmaP2443Określany jako "poloksomer 407" w protokole
Chlorek potasuProducts InternationalP41000
Saint Gobain Performance Plastics  Rurka Tygon .020 IDThermo Fisher Scientific50-206-8921Określane jako "rurka 1,5 mm" i "rurka" w protokole
SkalpelDowolna marka
Powlekarka wirowaCost Effective Equipment, LLC.200xTen model może zostać wycofany
ze sprzedaży Standardowe pipety i zestawy końcówekDowolna marka
Standardowa plastikowa strzykawkaDowolna markaUżyliśmy 10 ml strzykawki Luer-slip
Sylgard 184 zestaw elastomerów silikonowychDow, Inc.Określany jako "PDMS" i "utwardzacz" w protokole
T339 Micrewtube z uszczelką wargową i płaską nakrętkąMedline Industried, LP.T339Określany w protokole jako "fiolka źródłowa". Użyliśmy zarówno rozmiarów 0,5 ml, jak i 1,5 ml
TAMRA, SE; 5-(i-6)-karboksytetrametylorodamina, ester sukcynimidyluInvitrogenC1171Określany jako "TTR" w protokole
Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylo)silanMilliporeSigma448931
Trion Phantom RIE ICP Trion Technology, Inc.Ten odkurzacz plazmowy jest używany tylko w kroku 1.1 protokołu. Zamiast tego można użyć innego środka do czyszczenia plazmowego, takiego jak ten używany do klejenia PDMS; po prostu preferujemy znacznie niższą próżnię, jaką można osiągnąć dzięki temu systemowi do czyszczenia płytki krzemowej
TRITC Przeciwciało poliklonalneThermo Fisher ScientificA6397Określane jako "przeciwciało anty-rodaminowe" w protokole
PęsetaDowolna marka
Pompa próżniowaDowolna marka
347595 Eksykator Dowolna marka " wyciągowy Finger Lakes z otwartym dostępem Research

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).">Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
  2. Flexible methods for microfluidics. Phys Today. 54 (6), 42(2001).">Whitesides, G. M., Stroock, A. D. Flexible methods for microfluidics. Phys Today. 54 (6), 42(2001).
  3. Microfluidics: Fluid physics at the nanoliter scale. Rev Mod Phys. 77, 977(2005).">Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: Fluid physics at the nanoliter scale. Rev Mod Phys. 77, 977(2005).
  4. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu Rev Biomed Eng. 4, 261-286 (2002).">Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu Rev Biomed Eng. 4, 261-286 (2002).
  5. Components for integrated poly(dimethylsiloxane) microfluidic systems. Electrophoresis. 23 (20), 3461-3473 (2010).">Ng, J. M. K., Stroock, A. D., Whitesides, G. M. Components for integrated poly(dimethylsiloxane) microfluidic systems. Electrophoresis. 23 (20), 3461-3473 (2010).
  6. Five Short Stories on The History of Microfluidics. , https://www.elveflow.com/microfluidic-reviews/general-microfluidics/history-of-microfluidics/ (2025).">Dellaquila, A. Five Short Stories on The History of Microfluidics. , https://www.elveflow.com/microfluidic-reviews/general-microfluidics/history-of-microfluidics/ (2025).
  7. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).">Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
  8. Lab-on-a-chip: Microfluidics in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 5 (3), 210-218 (2006).">Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: Microfluidics in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 5 (3), 210-218 (2006).
  9. Revisiting lab-on-a-chip technology for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (8), 620-632 (2012).">Neužil, P., Giselbrecht, S., Länge, K., Huang, T. J., Manz, A. Revisiting lab-on-a-chip technology for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (8), 620-632 (2012).
  10. Miniaturized total chemical analysis systems: a novel concept for chemical sensing. Sens Actuators B: Chem. 1 (1-6), 244-248 (1990).">Manz, A., Graber, N., Widmer, H. M. Miniaturized total chemical analysis systems: a novel concept for chemical sensing. Sens Actuators B: Chem. 1 (1-6), 244-248 (1990).
  11. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).">Harrison, D. J., et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).
  12. Microfluidics: Honey, I shrunk the lab. Nature. 418 (6897), 474-475 (2002).">Knight, J. Microfluidics: Honey, I shrunk the lab. Nature. 418 (6897), 474-475 (2002).
  13. Photolithographic fabrication techniques for transistors which are an integral part of a printed circuit. Nall, J. R., Lathrop, J. W. 1957 International Electron Devices Meeting, Washington, DC, USA, , (1957).
  14. The design and fabrication of a two-layer microfluidic device for studying microtubules in vitro [Master's Thesis]. , Vanderbilt University. Nashville, TN. (2022).">Rogers, M. The design and fabrication of a two-layer microfluidic device for studying microtubules in vitro [Master's Thesis]. , Vanderbilt University. Nashville, TN. (2022).
  15. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2015).">Lee, J. B., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2015).
  16. Soft lithography for microfluidics: A Review. Biochip J. 2 (1), 1-11 (2008).">Kim, P., et al. Soft lithography for microfluidics: A Review. Biochip J. 2 (1), 1-11 (2008).
  17. Recent Advances in Mechanical Engineering. , Springer. Singapore. 235-245 (2020).">Venkatesan, S. u, Jerald, J., Asokan, P., Prabakaran, R. A Comprehensive Review on Microfluidics Technology and its Applications. Recent Advances in Mechanical Engineering. , Springer. Singapore. 235-245 (2020).
  18. Microfluidic Techniques: Reviews and Protocols. , Humana Press. New Jersey. (2006).">Minteer, S. Microfluidic Techniques: Reviews and Protocols. , Humana Press. New Jersey. (2006).
  19. Microfluidics and Nanofluidics Handbook: Fabrication, Implementation, and Applications. , Taylor and Francis Group. Florida. (2016).">Mitra, S. K., Chakraborty, S. Microfluidics and Nanofluidics Handbook: Fabrication, Implementation, and Applications. , Taylor and Francis Group. Florida. (2016).
  20. Molecular Biology of the Cell. , Garland Science. New York. (2014).">Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , Garland Science. New York. (2014).
  21. Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , Springer. Heidelberg. (2001).">Howard, J. Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , Springer. Heidelberg. (2001).
  22. Mechanics of microtubules. J Biomech. 43 (1), 23-30 (2010).">Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. Mechanics of microtubules. J Biomech. 43 (1), 23-30 (2010).
  23. Chapter 19: Mechanical Response of Cytoskeletal Networks. Methods Cell Biol. 89, 487-519 (2008).">Gardel, M. L., Kasza, K. E., Brangwynne, C. P., Liu, J., Weitz, D. A. Chapter 19: Mechanical Response of Cytoskeletal Networks. Methods Cell Biol. 89, 487-519 (2008).
  24. The microtubule cytoskeleton in cardiac mechanics and heart failure. Nat Rev Cardiol. 19 (6), 364-378 (2022).">Caporizzo, M. A., Prosser, B. L. The microtubule cytoskeleton in cardiac mechanics and heart failure. Nat Rev Cardiol. 19 (6), 364-378 (2022).
  25. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nat Mater. 14 (11), 1156-1163 (2015).">Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nat Mater. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  26. A microfluidic device for in situ fixation and super-resolved mechanosensation studies of primary cilia. Biomicrofluidics. 13 (1), 014105(2019).">Chu, S. H., et al. A microfluidic device for in situ fixation and super-resolved mechanosensation studies of primary cilia. Biomicrofluidics. 13 (1), 014105(2019).
  27. Microtubule growth rates are sensitive to global and local changes in microtubule plus-end density. Curr Biol. 30 (15), 3016-3023 (2020).">Geisterfer, Z. M., Zhu, D. Y., Mitchison, T. J., Oakey, J., Gatlin, J. C. Microtubule growth rates are sensitive to global and local changes in microtubule plus-end density. Curr Biol. 30 (15), 3016-3023 (2020).
  28. Lattice defects induce microtubule self-renewal. Nat Phys. 15 (8), 830-838 (2019).">Schaedel, L., et al. Lattice defects induce microtubule self-renewal. Nat Phys. 15 (8), 830-838 (2019).
  29. CLASP mediates microtubule repair by restricting lattice damage and regulating tubulin incorporation. Curr Biol. 30 (11), 2175-2183 (2020).">Aher, A., et al. CLASP mediates microtubule repair by restricting lattice damage and regulating tubulin incorporation. Curr Biol. 30 (11), 2175-2183 (2020).
  30. The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability. ELife. 5, e13470(2016).">Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability. ELife. 5, e13470(2016).
  31. Micropattern-guided assembly of overlapping pairs of dynamic microtubules. Methods Enzymol. 540, 339-360 (2014).">Fourniol, F. J., et al. Micropattern-guided assembly of overlapping pairs of dynamic microtubules. Methods Enzymol. 540, 339-360 (2014).
  32. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. J Vis Exp. (114), e54278(2016).">Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. J Vis Exp. (114), e54278(2016).
  33. Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout. Mol Biol Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).">Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout. Mol Biol Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).
  34. Mechanisms underlying the active self-assembly of microtubule rings and spools. Biomacromolecules. 17 (3), 1048-1056 (2016).">VanDelinder, V., Brener, S., Bachand, G. D. Mechanisms underlying the active self-assembly of microtubule rings and spools. Biomacromolecules. 17 (3), 1048-1056 (2016).
  35. bioRxiv. , (2019).">Roth, S., Gârlea, I. C., Vleugel, M., Mulder, B. M., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in cell-like confinement. bioRxiv. , (2019).
  36. Microtubules acquire resistance from mechanical breakage through intralumenal acetylation. Science. 356 (6335), 328-332 (2017).">Xu, Z., et al. Microtubules acquire resistance from mechanical breakage through intralumenal acetylation. Science. 356 (6335), 328-332 (2017).
  37. Shape and size control of artificial cells for bottom-up biology. ACS Nano. 13 (5), 5439-5450 (2019).">Fanalista, F., et al. Shape and size control of artificial cells for bottom-up biology. ACS Nano. 13 (5), 5439-5450 (2019).
  38. A fast microfluidic temperature control device for studying microtubule dynamics in fission yeast. Methods Cell Biol. 97, 185-201 (2010).">Velve-Casquillas, G., Costa, J., Carlier-Grynkorn, F., Mayeux, A., Tran, P. T. A fast microfluidic temperature control device for studying microtubule dynamics in fission yeast. Methods Cell Biol. 97, 185-201 (2010).
  39. Tubulin acetylation protects long-lived microtubules against mechanical ageing. Nat Cell Biol. 19 (4), 391-398 (2017).">Portran, D., Schaedel, L., Xu, Z., Théry, M., Nachury, M. V. Tubulin acetylation protects long-lived microtubules against mechanical ageing. Nat Cell Biol. 19 (4), 391-398 (2017).
  40. Microtubule transport, concentration and alignment in enclosed microfluidic channels. Biomed Microdevices. 9 (2), 175-184 (2007).">Huang, Y. M., Uppalapati, M., Hancock, W. O., Jackson, T. N. Microtubule transport, concentration and alignment in enclosed microfluidic channels. Biomed Microdevices. 9 (2), 175-184 (2007).
  41. Methods in Bioengineering: Microfabrication and Microfluidics. , Artech House Publishers. Boston, MA. (2009).">Uppalapati, M., Huang, Y., Shastry, S., Jackson, T. N., Hancock, W. O. Microtubule Motors in Microfluidics. Methods in Bioengineering: Microfabrication and Microfluidics. , Artech House Publishers. Boston, MA. (2009).
  42. Prevention of air bubble formation in a microfluidic perfusion cell culture system using a microscale bubble trap. Biomed Microdevices. 11 (4), 731-738 (2009).">Sung, J. H., Shuler, M. L. Prevention of air bubble formation in a microfluidic perfusion cell culture system using a microscale bubble trap. Biomed Microdevices. 11 (4), 731-738 (2009).
  43. A low-cost, rapidly integrated debubbler (RID) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360(2019).">Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (RID) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360(2019).
  44. Circumventing air bubbles in microfluidic systems and quantitative continuous-flow PCR applications. Anal Bioanal Chem. 386 (5), 1327-1333 (2006).">Nakayama, T., et al. Circumventing air bubbles in microfluidic systems and quantitative continuous-flow PCR applications. Anal Bioanal Chem. 386 (5), 1327-1333 (2006).
  45. Lateral degassing method for disposable film-chip microfluidic devices. Membranes. 11 (5), 316(2021).">Park, S., Cho, H., Kim, J., Han, K. -H. Lateral degassing method for disposable film-chip microfluidic devices. Membranes. 11 (5), 316(2021).
  46. Nip the bubble in the bud: A guide to avoid gas nucleation in microfluidics. Lab Chip. 19 (14), 2296-2314 (2019).">Pereiro, I., Fomitcheva Khartchenko, A., Petrini, L., Kaigala, G. V. Nip the bubble in the bud: A guide to avoid gas nucleation in microfluidics. Lab Chip. 19 (14), 2296-2314 (2019).
  47. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods in Cell Biol. 95, 221-245 (2010).">Gell, C., et al. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods in Cell Biol. 95, 221-245 (2010).
  48. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: Information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Mol Biol Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).">Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: Information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Mol Biol Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
  49. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).">Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  50. Comparative analysis of fabrication methods for achieving rounded microchannels in PDMS. J Micromech Microeng. 26 (11), 115013(2016).">Bartlett, N. W., Wood, R. J. Comparative analysis of fabrication methods for achieving rounded microchannels in PDMS. J Micromech Microeng. 26 (11), 115013(2016).
  51. Taxol®: The first microtubule stabilizing agent. Int J Mol Sci. 18 (8), 1733(2017).">Yang, C. P. H., Horwitz, S. B. Taxol®: The first microtubule stabilizing agent. Int J Mol Sci. 18 (8), 1733(2017).
  52. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. J Cell Biol. 120 (4), 923-934 (1993).">Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. J Cell Biol. 120 (4), 923-934 (1993).
  53. Mechanochemical model of microtubule structure and self-assembly kinetics. Biophys J. 89 (5), 2911-2926 (2005).">VanBuren, V., Cassimeris, L., Odde, D. J. Mechanochemical model of microtubule structure and self-assembly kinetics. Biophys J. 89 (5), 2911-2926 (2005).
  54. Taxol-induced flexibility of microtubules and its reversal by MAP-2 and Tau. J Biol Chem. 268 (10), 6847-6850 (1993).">Dye, R. B., Fink, S. P., Williams, R. C. Taxol-induced flexibility of microtubules and its reversal by MAP-2 and Tau. J Biol Chem. 268 (10), 6847-6850 (1993).
  55. The minimum GTP cap required to stabilize microtubules. Curr Biol. 4 (12), 1053-1061 (1994).">Drechsel, D. N., Kirschnert, M. W. The minimum GTP cap required to stabilize microtubules. Curr Biol. 4 (12), 1053-1061 (1994).
  56. Measurement of the persistence length of cytoskeletal filaments using curvature distributions. Biophys J. 121 (10), 1813-1822 (2022).">Wisanpitayakorn, P., Mickolajczyk, K. J., Hancock, W. O., Vidali, L., Tüzel, E. Measurement of the persistence length of cytoskeletal filaments using curvature distributions. Biophys J. 121 (10), 1813-1822 (2022).
  57. Rigidity of microtubules is increased by stabilizing agents. J Cell Biol. 130 (4), 909-917 (1995).">Mickey, B., Howard, J. Rigidity of microtubules is increased by stabilizing agents. J Cell Biol. 130 (4), 909-917 (1995).
  58. Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking. Biophys J. 93 (1), 346-359 (2007).">Brangwynne, C. P., et al. Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking. Biophys J. 93 (1), 346-359 (2007).
  59. Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations. J Biol Chem. 269 (18), 13353-13360 (1994).">Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations. J Biol Chem. 269 (18), 13353-13360 (1994).
  60. Flexural rigidity of microtubules measured with the use of optical tweezers. J Cell Sci. 109 (Pt 2), 509-516 (1996).">Felgner, H., Frank, R., Schliwa, M. Flexural rigidity of microtubules measured with the use of optical tweezers. J Cell Sci. 109 (Pt 2), 509-516 (1996).
  61. Domains of neuronal microtubule-associated proteins and flexural rigidity of microtubules. J Cell Biol. 138 (5), 1067-1075 (1997).">Felgner, H., et al. Domains of neuronal microtubule-associated proteins and flexural rigidity of microtubules. J Cell Biol. 138 (5), 1067-1075 (1997).
  62. Effects of three microtubule-associated proteins (MAP2, MAP4, and Tau) on microtubules' physical properties and neurite morphology. Sci Rep. 13, 8870(2023).">Nishida, K., et al. Effects of three microtubule-associated proteins (MAP2, MAP4, and Tau) on microtubules' physical properties and neurite morphology. Sci Rep. 13, 8870(2023).
  63. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).">Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).
  64. Microtubule dynamics: An interplay of biochemistry and mechanics. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (7), 451-463 (2018).">Brouhard, G. J., Rice, L. M. Microtubule dynamics: An interplay of biochemistry and mechanics. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (7), 451-463 (2018).
  65. More is different: Reconstituting complexity in microtubule regulation. J Biol Chem. 299 (12), 105398(2023).">Lawrence, E. J., Chatterjee, S., Zanic, M. More is different: Reconstituting complexity in microtubule regulation. J Biol Chem. 299 (12), 105398(2023).
  66. Dynamics and mechanics of the microtubule plus end. Nature. 422 (6933), 753-758 (2003).">Howard, J., Hyman, A. A. Dynamics and mechanics of the microtubule plus end. Nature. 422 (6933), 753-758 (2003).
  67. Regulation of the microtubule network; the shaft matters. Curr Opin Syst Biol. 34, 100457(2023).">Mehidi, A., Aumeier, C. Regulation of the microtubule network; the shaft matters. Curr Opin Syst Biol. 34, 100457(2023).
  68. Causes, costs and consequences of kinesin motors communicating through the microtubule lattice. J Cell Sci. 136 (5), jcs260735(2023).">Verhey, K. J., Ohi, R. Causes, costs and consequences of kinesin motors communicating through the microtubule lattice. J Cell Sci. 136 (5), jcs260735(2023).
  69. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (1), 38-54 (2019).">Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (1), 38-54 (2019).
  70. Microtubule self-repair. Curr Opin Cell Biol. 68, 144-154 (2021).">Théry, M., Blanchoin, L. Microtubule self-repair. Curr Opin Cell Biol. 68, 144-154 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic DeviceMicrotubule MechanicsPDMS MicrofluidicsMicrotubule PolymerHigh Throughput AssayPlasma CleaningPhotoresist DepositionComputational ModelingFlow Control SystemFluorescent Labeling

Related Articles