Artykuł metodologiczny

Opracowanie opartego na mikrofluidyce podejścia do badania mechaniki polimerów mikrotubul

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68185

⸱

30 maja 2025

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Department of Biochemistry, Vanderbilt University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje projekt i wykonanie urządzenia mikroprzepływowego odpowiedniego do badania mechaniki polimerów mikrotubul. Synteza technik mikrowytwarzania, zautomatyzowanej kontroli przepływu i modelowania obliczeniowego umożliwia stworzenie elastycznego systemu idealnie nadającego się do sondowania cytoszkieletu komórkowego in vitro.

Streszczenie

W tym protokole opisujemy projekt i wykonanie urządzenia mikroprzepływowego opracowanego do badania mechaniki polimerów mikrotubul. Projekt wykorzystuje nieodłączne zalety urządzeń mikroprzepływowych opartych na polidimetylosiloksanach (PDMS) i wprowadza kilka funkcji, które umożliwiają solidne i konfigurowalne podejście eksperymentalne o wysokiej przepustowości. Opracowane urządzenie zawiera redundantne funkcje wychwytywania pęcherzyków powietrza, aby zapobiec występowaniu szkodliwych pęcherzyków powietrza. Ponadto urządzenie łączy się ze zautomatyzowanym systemem sterowania przepływem, aby ograniczyć ręczną interwencję i umożliwić analizy o wysokiej przepustowości. Komercyjne oprogramowanie symulacyjne jest wykorzystywane do lepszego rozwoju i zrozumienia transportu płynów za pomocą tego systemu. Na koniec demonstrujemy zdolność do przeprowadzania wielu eksperymentów jednocześnie w jednym urządzeniu poprzez hodowanie przedłużeń mikrotubul z odrębnymi znacznikami fluorescencyjnymi w różnych sekcjach urządzenia. Ogólnie rzecz biorąc, ten mikroprzepływowy system przepływu może być używany do badania mechaniki polimerów mikrotubul i zapewnia ulepszenia w projektowaniu eksperymentalnym dla szerszych badań mikrotubul in vitro. Synteza metod mikrowytwarzania, zautomatyzowanej kontroli przepływu i modelowania komputerowego umożliwia stworzenie elastycznego systemu idealnie nadającego się do sondowania cytoszkieletu komórkowego in vitro.

Wprowadzenie

Mikrofluidyka umożliwia precyzyjną kontrolę minimalnych objętości cieczy, często mniejszych niż jeden mikrolitr, dzięki skomplikowanej konstrukcji i wykonaniu kanałów przepływu płynów1,2. Mała skala urządzeń mikrofluidycznych prowadzi do wystąpienia unikalnych zjawisk inżynieryjnych. Mianowicie liczba Reynoldsa – bezwymiarowa miara stosunku sił bezwładności do sił lepkości w przepływie płynu – jest mała, zazwyczaj rzędu O(10) lub niższa w mikrofluidyce, co podkreśla znaczenie sił lepkości w tych urządzeniach. Dodatkowo liczba Pécleta, która porównuje transport konwekcyjny do dyfuzyjnego, wykazuje, że transport konwekcyjny w mikrofluidyce jest zazwyczaj pomijalny3,4,5. Taki reżim przepływu laminarnego, sterowany dyfuzją, jest w mikrofluidyce korzystny, ponieważ umożliwia prowadzenie równoległych eksperymentów na jednym urządzeniu poprzez utrzymanie precyzyjnych gradientów płynów.

Fotolitografia pozostaje główną metodą wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych6,7,8. W skrócie proces ten polega na stworzeniu wytrawionego szablonu „matrycy” projektu mikroprzepływowego (Rysunek 1). Przygotowywany jest podłoże światłoczułe, a fotomaska projektu mikroprzepływowego selektywnie naświetla obszary fotorezystu promieniowaniem ultrafioletowym. Następnie stosuje się metody trawienia w celu wywołania podłoża, co pozwala uzyskać relief projektu. Polidimetylosiloksan (PDMS) jest często odlewany i utwardzany na matrycy. Utwardzony PDMS, który przyjmuje negatywowe cechy projektu, jest następnie oddzielany od matrycy i przywiązany do szkiełka nakrywki. Cały ten proces wytwarzania trwa zazwyczaj 1-2 dni, co umożliwia szybkie iteracje projektowe i produkcję wielu urządzeń. Szczegółowe przeglądy procesów soft litografii i mikrofabrykacji znajdują się w innych referencjach1,2,3,10,11,12,13.

Schemat procesu fotolitografii: naświetlanie UV, wywoływanie fotorezystu, etapy wytwarzania formy z PDMS.
Rycina 1: Przegląd tradycyjnego procesu fotolitografii oraz procesu mikrowytwarzania. (A) Tradycyjny proces fotolitografii oraz (B) proces mikrowytwarzania. W zależności od zastosowania i pożądanych właściwości fotorezystu można użyć fotorezystu negatywowego lub pozytywowego, mimo że oba pozwolą na uzyskanie tego samego wzorca projektowego. O wyborze odpowiedniego typu fotorezystu decydują takie parametry jak pożądana wysokość struktur lub temperatura topnienia fotorezystu. Rycina została zmodyfikowana za zgodą Rogersa (2022)14. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Zastosowanie mikroprzepływów rozszerzyło możliwości w wielu dziedzinach badawczych, a ich najnowszy wpływ odnotowano w naukach biologicznych. Ze względu na niewielką skalę, mikroprzepływy umożliwiają precyzyjne zarządzanie ograniczonymi, cennymi zasobami, takimi jak komórki lub białka. Jeszcze większy wpływ ma możliwość dostosowania systemów mikroprzepływowych do naśladowania warunków fizjologicznych, takich jak modyfikacje sztywności podłoża, wywieranie siły na próbkę, a nawet integracja prądu elektrycznego. Ponadto zastosowanie mikroprzepływów oferuje możliwość równoległego manipulowania wieloma odczynnikami oraz szybkiego tworzenia prototypów i iteracyjnego udoskonalania konstrukcji systemów. Cechy te umożliwiają miniaturyzację całych laboratoriów na jednym urządzeniu, powszechnie nazywanym „laboratorium na chipie” (lab-on-a-chip)1,6,9,15,16,17,18,19.

Jednym z zastosowań mikrofluidyki w biologii komórki jest badanie polimerów mikrotubul. Mikrotubule stanowią istotny element cytoszkieletu komórkowego, odgrywając kluczową rolę w procesach takich jak podział komórki i wewnątrzkomórkowy transport ładunków20,21. Jako najsztywniejszy element cytoszkieletu, mikrotubule wykazują moduł sprężystości porównywalny z modułem Plexiglassu22,23. Ich silne właściwości mechaniczne są niezbędne dla różnych funkcji komórkowych, na przykład dla skurczu kardiomiocytów, w którym mikrotubule cyklicznie wyginają się i rozluźniają podczas fazy skurczowej i rozkurczowej serca24. Urządzenia mikrofluidyczne były wcześniej wykorzystywane do badania właściwości mikrotubul i ich struktur wyższego rzędu in vitro. Rzeczywiście, mikrofluidyka była stosowana do analizy dynamiki polimeryzacji mikrotubul, oddziaływań między mikrotubulami oraz wpływu białek związanych z mikrotubulami na ich właściwości mechaniczne25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41.

Choć wprowadzenie mikrofluidyki do dziedziny badań nad mikrotubulami przyniosło wiele ekscytujących odkryć, wciąż istnieje przestrzeń do ulepszeń w zakresie adaptacji tych urządzeń do badań nad mikrotubulami. W niniejszej pracy odnosimy się do dwóch konkretnych ograniczeń, które nadal występują podczas badania mikrotubul w urządzeniach mikrofluidycznych: ryzyka powstania pęcherzyków powietrza wewnątrz urządzenia, zazwyczaj wprowadzanych podczas ręcznej manipulacji urządzeniami mikrofluidycznymi, oraz niedostatecznego wykorzystania analiz wysokoprzepustowych. Po pierwsze, manipulacje ręczne, takie jak podłączanie i odłączanie rurek, mogą prowadzić do powstania pęcherzyków w kanałach. Powstanie pęcherzyków powietrza w komorze przepływowej jest katastrofalne, ponieważ pęcherzyki powietrza mogą denaturować białka, ścinać polimery mikrotubularne i negatywnie wpływać na hodowle komórkowe42,43. Ponadto ostre narożniki i skośne kąty w urządzeniu powodują nierównomierne zwilżanie powierzchni, co zwiększa możliwość wciągania powietrza. Opracowano liczne techniki mające na celu ograniczenie powstawania, trwałości i wpływu pęcherzyków powietrza; jednak stosowanie metod łagodzenia skutków powstawania pęcherzyków nie jest powszechne42,43,44,45,46. Co więcej, mimo że jedną z głównych zalet stosowania mikrofluidyki jest możliwość prowadzenia eksperymentów wysokoprzepustowych, mikrofluidyka nie została jeszcze wykorzystana do skalowania badań nad mikrotubulami. Urządzenia mikrofluidyczne mogą być projektowane w taki sposób, aby testować wiele warunków eksperymentalnych równolegle w tym samym urządzeniu. Na przykład gradienty płynów mogą być wykorzystywane do kierowania przepływu różnych białek związanych z mikrotubulami lub leków, umożliwiając ich celowaną dostawę do określonych obszarów podzielonych mikrotubul w obrębie jednego urządzenia.

W niniejszej pracy opracowaliśmy w sposób iteracyjny urządzenie mikroprzepływowe, które eliminuje te ograniczenia. Przedstawiamy szczegółowy protokół wykonania urządzenia, umożliwiając tym samym szerszemu gronu badaczy wykorzystanie technologii mikroprzepływowej w badaniach nad mikrotubulami. Projekt tego urządzenia zawiera elementy służące do wychwytywania pęcherzyków powietrza i wykorzystuje zautomatyzowany system kontroli przepływu w celu zredukowania manualnej interwencji, umożliwiając jednocześnie tworzenie gradientów roztworów w urządzeniu do analiz wysokoprzepustowych. Podsumowując, opracowanie tej konstrukcji mikroprzepływowej może ułatwić szersze badania i zrozumienie mechaniki mikrotubul, oferując jednocześnie cenne usprawnienia w projektowaniu eksperymentów w całej dziedzinie badań nad mikrotubulami.

Protokół

UWAGA: Prace opisane w tej części protokołu były prowadzone w czystym pomieszczeniu klasy 100 w Vanderbilt Institute of Nanoscale Science and Engineering (VINSE). Zaleca się stosowanie kontrolowanego czystego pomieszczenia z odpowiednią odzieżą ochronną i oświetleniem z filtrem UV, aby zapobiec uszkodzeniom urządzeń spowodowanym wilgotnością lub warunkami oświetlenia otoczenia oraz aby uniknąć zanieczyszczeń cząsteczkowych. Wszystkie operacje na waflowach krzemowych należy wykonywać tak, aby polerowana strona wafla była skierowana do góry. Podczas manipulowania waflami należy używać pęsety i ograniczyć dotykanie ich powierzchni, aby zapobiec zarysowaniom. Wafle należy przechowywać w szalkach Petriego z przykrywkami podczas transportu oraz na koniec każdego dnia, chyba że wskazano inaczej.

1. Fotolitografia (6 - 8 h)

  1. Wyczyścić plazmą 3-calowy wafle krzemowy przez 5 min w próżni (idealnie, ciśnienie próżni < 5 × 10-5 torr), używając plazmy tlenowej (O2) lub czystego suchego powietrza (CDA).
  2. Wycentrować wafle krzemowy na urządzeniu do nanoszenia warstw (spin coater) w celu nałożenia fotorezystu.
  3. Nanieść ~1-2 mL fotorezystu SPR 220 7.0 na środek wafla krzemowego.
    OSTROŻNIE: Fotorezystem należy posługiwać się w rękawiczkach i z ochroną oczu, a utylizację przeprowadzić zgodnie z protokołami producenta lub specyfiką danego laboratorium.
  4. Nanieść fotorezyst na wafle krzemowy metodą spin-coatingu, aby uzyskać pożądaną grubość zgodnie z krzywymi producenta. Warstwy o grubości ~13 µm uzyskuje się przy wirowaniu z prędkością 1000 RPM przez 30 s. Następnie usunąć resztki fotorezystu z urządzenia do nanoszenia warstw za pomocą acetonu i zutylizować zgodnie z protokołami laboratorium.
    UWAGA: Jeśli po nanoszeniu warstwy wafle nie jest pokryty fotorezystem równomiernie, należy powtórzyć kroki 1.2-1.4. Nierównomierna powłoka może wynikać z nieprawidłowego centrowania wafla na urządzeniu, użycia zbyt małej ilości fotorezystu i/lub naniesienia go poza środek wafla.
  5. Przenieść wafle krzemowy na płytkę grzewczą ustawioną na 70 ˚C, starając się jak najmniej dotykać naniesionego fotorezystu.
  6. Inkubować wafle krzemowy na płytce grzewczej, zwiększając temperaturę o 10 ˚C co 3-5 min, aż do osiągnięcia temperatury 115 ˚C.
  7. Wyłączyć płytkę grzewczą i pozwolić waflowi krzemowemu ostygnąć, aż jego temperatura spadnie poniżej 65 ˚C.
    UWAGA: Etapy ogrzewania i chłodzenia przeprowadza się powoli, aby zapobiec pękaniu termicznemu fotorezystu, co często zdarza się przy tej grubości. Jeśli wystąpią pęknięcia termiczne, można je zazwyczaj naprawić poprzez ponowne ogrzanie wafla krzemowego i spowolnienie tempa chłodzenia.
  8. Za pomocą pęsety przenieść schłodzony wafle krzemowy do urządzenia do wyrównywania masek (mask aligner) i załadować zarówno wafle krzemowy, jak i odpowiednią fotomaskę zgodnie z protokołami producenta lub specyfiką laboratorium.
    UWAGA: Fotomaski zostały wykonane przez zewnętrznego dostawcę zgodnie z określonym projektem stworzonym w programie AutoCAD. Render projektu maski znajduje się w Pliku uzupełniającym 1.
  9. Naświetlić wafle krzemowy promieniowaniem ultrafioletowym (UV) przez określony czas (zależny od mocy lampy UV) zgodnie z protokołami producenta lub specyfiką laboratorium. Pożądana energia dla tej aplikacji wynosi ~400 mJ/cm2; czas naświetlania należy obliczyć według wzoru: Równanie czasu naświetlania; schemat zależności między energią a mocą lampy w eksperymentach optycznych..
  10. Po naświetleniu wyjąć wafle krzemowy z urządzenia do wyrównywania masek i pozwolić fotorezystowi na rehydratację przez 4 h przy zachowaniu cyrkulacji powietrza. Należy zostawić pokrywkę płytki Petri otwartą, aby umożliwić przepływ powietrza, ale umieścić płytkę w miejscu, w którym prawdopodobieństwo kontaktu z cząstkami zanieczyszczeń jest niskie.
    UWAGA: Podczas czasu rehydratacji można zrobić 4-godzinną przerwę, jednak zaleca się kontynuowanie procedury tego samego dnia.
  11. Po 4-godzinnej rehydratacji przenieść naświetlony wafle na płytkę grzewczą ustawioną na 70 ˚C.
  12. Inkubować wafle krzemowy na płytce grzewczej, zwiększając temperaturę o 10 ˚C co 3-5 min, aż do osiągnięcia temperatury 115 ˚C.
  13. Inkubować wafle w temperaturze 115 ˚C przez 10 min.
  14. Stworzyć izolującą „osłonę” dla naświetlonego wafla, formując arkusz folii aluminiowej w kształcie pokrywki płytki Petri.
  15. Wyłączyć płytkę grzewczą i przykryć naświetlony wafle osłoną z folii aluminiowej. Pozostawić wafle do ostygnięcia w temperaturze otoczenia przez noc.
    UWAGA: Pękanie termiczne fotorezystu jest znacznie częstsze podczas etapu inkubacji po naświetleniu, dlatego zaleca się powolne chłodzenie przez noc. Tym kończą się etapy wymagane pierwszego dnia procesu wytwarzania. Zaleca się przejście do następnej sekcji następnego dnia.

2. Wywoływanie (1 - 2 h)

  1. Po przygotowaniu do wywołania naświetlonego wafla, należy przygotować czysty pojemnik i odpowiedni wywoływacz do fotorezystu. W tym przypadku zastosowano wywoływacz MF-319 w dedykowanym pojemniku.
    OSTROŻNIE: Wywoływacz należy obsługiwać w rękawiczkach i z ochroną oczu, przelewać z opakowania zbiorczego do pojemnika wtórnego i utylizować zgodnie z protokołami producenta lub specyficznymi zasadami danej jednostki.
  2. Nalać do pojemnika tyle wywoływacza, aby w pełni zanurzyć naświetlony wafele (faktyczna objętość zależy od rozmiaru pojemnika).
  3. Zanurzyć naświetlony wafele w wywoływaczu i czekać, aż cały niepożądany fotorezyst zostanie rozpuszczony. Delikatne obracanie/wstrząsanie pojemnikiem wspomaga proces wywoływania, aż na waflu nie będzie widoczny niemal żaden pozostały fotorezyst poza obszarem projektu urządzenia.
    UWAGA: W zależności od użytej objętości roztworu wywoływacza, może być konieczna wielokrotna wymiana roztworu w celu całkowitego usunięcia niepożądanego fotorezystu.
  4. Wyjąć wywołany wafele z roztworu wywołującego i delikatnie opłukać obie strony wafla wodą dejonizowaną (DI) przez 30 s.
  5. Osuszyć wywołany wafele za pomocą gazu azotowego (N2).
  6. Przechowywać wywołany wafele w szalce Petriego w suchym i chłodnym środowisku do czasu dalszego użycia. Szalkę Petriego należy owinąć folią aluminiową, aby zapobiec degradacji fotorezystu pod wpływem światła otoczenia.
    UWAGA: Zaleca się, choć nie jest to wymagane, przejście do następnej sekcji tego samego dnia.

3. Silanizacja (1 - 2 h)

  1. Przenieś podłoże krzemowe do eksykatora.
  2. Umieść mały pojemnik aluminiowy (lub kawałek folii aluminiowej złożony w kształt pojemnika) w eksykatorze.
  3. Pipetą nanieś 1 kroplę (~50 µL) trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylo)silanu do pojemnika aluminiowego.
    OSTROGNIĄ: Roztwór silanu należy obsługiwać w rękawiczkach i z ochroną oczu, a jego utylizację przeprowadzać zgodnie z protokołami producenta lub obowiązującymi w danej placówce.
  4. Zamknij eksykator i włącz pompę próżniową.
  5. Pozostaw do wysuszenia/silanizacji na 1-2 h.
  6. Po upływie czasu silanizacji wyłącz próżnię i wyjmij silanizowane podłoże. Przechowuj silanizowane podłoże w szalce Petriego owiniętej folią aluminiową w suchym i chłodnym miejscu do czasu dalszego użycia.
    UWAGA: Silanizację podłoży może być konieczne okresowo powtarzać, a częściej w przypadku urządzeń, w których stosowane są cieńsze warstwy PDMS. Jeśli podczas oddzielania PDMS od podłoża zauważalna jest adhezja PDMS, może być konieczne ponowne poddanie podłoża silanizacji; tę procedurę należy powtórzyć po całkowitym usunięciu PDMS z podłoża. To kończy kroki wymagane do stworzenia matryc urządzeń mikroprzepływowych. Matryce są stabilne i kolejne sekcje można realizować w dowolnym momencie.

4. Nakładanie PDMS (1 - 2 h)

UWAGA: Jeśli na matrycy pozostały resztki PDMS z poprzedniego procesu mikrowytwarzania, należy je usunąć przed nałożeniem nowej warstwy PDMS.

  1. Odważyć na wadze do pojemnika PDMS oraz odpowiadający mu czynnik sieciujący w stosunku wagowym 10:1. Całkowita wymagana masa zależy od pożądanej grubości PDMS i rozmiaru szalki Petriego. Dla szalki Petriego o średnicy 4" użycie ~20 g PDMS i ~2 g czynnika sieciującego pozwoli uzyskać grubość 2-3 mm.
    OSTROŻNIE: Roztwór PDMS należy przygotowywać w rękawiczkach i okularach ochronnych, a jego utylizacja powinna odbywać się zgodnie z protokołami producenta lub konkretnego laboratorium.
  2. Mieszać PDMS z czynnikiem sieciującym w pojemniku przez 5 min za pomocą plastikowej szpatułki lub innego odpowiedniego narzędzia.
  3. Przenieść pojemnik z wymieszanym PDMS do eksykatora w celu odgazowania.
  4. Zamknąć eksykator i włączyć pompę próżniową. W PDMS zaczną pojawiać się pęcherzyki powietrza.
  5. Pozostawić do wysuszenia/odgazowania na 30 min. W zależności od ilości użytego PDMS i kształtu pojemnika rzeczywisty czas może się różnić; ogólnym punktem końcowym jest moment, gdy w PDMS występuje niewiele lub żadne pęcherzyki.
  6. Po odgazowaniu wyłączyć próżnię i wyjąć pojemnik z PDMS.
  7. Wylać wymieszany i odgazowany PDMS na matrycę w szalce Petriego.
  8. Inkubować matrycę w zamkniętej szalce Petriego w temperaturze 65 ˚C przez noc, aby PDMS mógł całkowicie utwardzić.
    UWAGA: To kończy etapy nanoszenia PDMS. Zaleca się utwardzanie PDMS w inkubatorze przez noc. PDMS staje się wówczas stabilny, więc kolejne sekcje można przeprowadzić w dowolnym czasie.

5. Montaż urządzenia PDMS (1 - 2 h)

  1. Przygotuj matrycę urządzenia z utwardzonym PDMS, pęsetę, standardowy wycinak do biopsji o średnicy 1,5 mm z ręcznym tłokiem oraz skalpel lub żyletkę.
    OSTRZEŻENIE: Ostrożnie obchodzić się z ostrzem i nigdy nie ciąć w kierunku własnym ani w stronę innych osób. Zaleca się stosowanie ostrzy z mechanizmem samoczynnego chowania lub ostrzy zabezpieczonych.
  2. Wokół elementów urządzenia wyciąć z matrycy warstwy prostokątne kawałki PDMS. Należy upewnić się, że każdy kawałek PDMS ma odpowiedni zapas miejsca po każdej stronie elementów urządzenia, aby zapewnić dobry kontakt podczas bonducia, jednocześnie dbając o to, aby każdy fragment mieścił się na osobnej szkiełku nakrywkowym o wymiarach 22 mm × 22 mm.
    UWAGA: Ważne jest, aby nie dotykać dolnej powierzchni PDMS (strony z wytłoczonymi elementami), dlatego PDMS należy zawsze trzymać za krawędzie za pomocą pęsety. Ponadto nigdy nie należy kłaść PDMS stroną z elementami do dołu na żadnej powierzchni. W przypadku nieużywania, PDMS należy przechowywać w zamkniętym pojemniku stroną z elementami skierowaną do góry do momentu użycia.
  3. Wykonać otwory wlotowe i wylotowe w kawałkach PDMS za pomocą czystego wycinaka o średnicy 1,5 mm. Wycinanie należy przeprowadzać przez PDMS urządzenia do zapasowej warstwy poświęcalnego PDMS, a nie do twardej powierzchni, która mogłaby uszkodzić wycinak.
  4. Przygotować i oczyścić szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm × 22 mm za pomocą chusteczki nasączonej alkoholem izopropylowym (IPA).
  5. Oczyścić szkiełko nakrywkowe 22 mm × 22 mm w plazmie przez 5 min w próżni (ciśnienie < 0,5 Torr) przy użyciu plazmy CDA. Pozwoli to usunąć wszelkie zanieczyszczenia lub powłoki organiczne ze szkiełka.
  6. Przetrzeć szkiełko nakrywkowe 22 mm × 22 mm oraz stronę z elementami PDMS chusteczką nasączoną IPA.
  7. Umieścić zarówno PDMS (stroną z elementami do góry), jak i szkiełko nakrywkowe (tą samą stroną do góry, która była wcześniej czyszczona) w urządzeniu do czyszczenia plazmowego i poddać jednoczesnemu oczyszczaniu przez 30 s w próżni (ciśnienie < 0,5 Torr) przy użyciu plazmy CDA.
  8. Wyjąć szkiełko nakrywkowe i urządzenie z PDMS z urządzenia do czyszczenia plazmowego. Odwrócić PDMS tak, aby strona z elementami była skierowana w dół, i położyć go na szkle nakrywkowym. Obserwować proces bonducia i w razie potrzeby lekko docisnąć PDMS, aby ułatwić dobry kontakt.
  9. Inkubować zbondowane szkiełko w zamkniętej szalce Petriego w temperaturze 65 ˚C przez 3 min w celu ułatwienia wiązania.
    UWAGA: Bonducie plazmowe zmienia hydrofobowość szkiełka nakrywkowego, tworząc powierzchnię hydrofilową. Z doniesień wynika, że pierwotny stan hydrofobowy szkiełka powraca po około 2 dniach inkubacji w temperaturze pokojowej. Zaleca się używanie wykonanych urządzeń nie wcześniej niż 2 dni po bonduciu plazmowym. To kończy etapy mikrowytwarzania. Urządzenia nie mają określonego terminu przydatności, ale gdy nie są używane, powinny być przechowywane w chłodnym i suchym miejscu.

6. Przygotowanie mikrofluidycznego kanału przepływowego (1 h)

  1. Zamocuj złożone urządzenie mikrofluidyczne w czystym, specjalnie dopasowanym adapterze stolika47.
  2. Przygotuj strzykawkę, adapter typu Luer-lock wraz z opaską zaciskową oraz odcinek przezroczystej rurki o średnicy zewnętrznej 1,5 mm (o długości około 15-20 cm). Połącz rurkę ze strzykawką za pomocą adaptera.
  3. Podłącz trzy kolejne odcinki rurek do wylotów urządzenia mikrofluidycznego (te rurki nie muszą mieć określonej długości) i skieruj ich drugie końce do fiolki na odpady znajdującej się poniżej.
  4. Za pomocą strzykawki przygotuj urządzenie mikrofluidyczne, wprowadzając roztwory zgodnie z poniższymi krokami. Kolejność i objętość roztworów są następujące: 50 µL buforu BRB80, 25 µL roztworu przeciwciał anty-rodaminowych, odczekaj 5 min, 50 µL BRB80, 25 µL poloksameru 407 (F127), odczekaj 15 min i 50 µL BRB80. Przykład znajduje się w Tabeli 1.
    1. Naciągnij roztwór ze źródła do rurki.
      UWAGA: Nie wciągaj roztworu całkowicie do wnętrza strzykawki. Roztwór powinien pozostać wyłącznie w rurce.
    2. Delikatnie naciśnij tłok strzykawki, aż na końcu rurki pojawi się mała kropla cieczy. Zapobiegnie to przedostaniu się powietrza do urządzenia mikrofluidycznego podczas podłączenia rurki.
    3. Podłącz rurkę do wlotu urządzenia mikrofluidycznego.
    4. Powoli naciskaj tłok strzykawki, aż większość, ale nie całość roztworu, przepłynie przez rurkę. Pozostawienie niewielkiej ilości cieczy w rurce zapobiegnie przypadkowemu wtłoczeniu powietrza. Obserwuj rurkę i kanały mikrofluidyczne podczas tych transferów, zwracając uwagę na ewentualne pęcherzyki powietrza.
      UWAGA: Jeśli w rurce pojawią się pęcherzyki, rozpocznij rozwiązywanie problemu (spróbuj usunąć pęcherzyk, zanim dostanie się do urządzenia mikrofluidycznego, odłączając rurkę tuż przed dotarciem pęcherzyka, a następnie podłączając ją ponownie po jego przejściu itp.).
    5. Powtarzaj kroki 6.4.1-6.4.4 dla każdego kolejnego odczynnika, aż wszystkie zostaną przepuszczone. Dla każdego odczynnika wymagany będzie nowy odcinek rurki wlotowej, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej odczynników źródłowych. Po zakończeniu ostatniego płukania BRB80 urządzenie pozostaje stabilne przez kilka minut. Kropla roztworu BRB80 na wlotach zapobiegnie wysychaniu urządzenia.
  5. Przygotuj „zarodniki” mikrotubul stabilizowane przez guanozyno-5'-[(α,β)-metyleno]trifosforan (GMPCPP) zgodnie ze standardowymi protokołami (z zastosowaniem stosunku znakowania TTR na poziomie ~25%)47,48.
  6. Przygotuj bufor obrazujący („antifade”) o dwukrotnym (2x) stężeniu roboczym, łącząc następujące odczynniki w odpowiednich ilościach (w zależności od stężeń zapasowych), aby uzyskać określone stężenia końcowe: BRB80 uzupełniony o 40 mM glukozy, 40 µg/mL oksydazy glukozowej, 16 µg/mL katalazy, 0,5 mg/mL kazeiny, 50 mM chlorku potasu oraz 10 mM ditiotreitolu (DTT). Bufor obrazujący ten służy do przedłużenia fotostabilności. Przykład znajduje się w Tabeli 2.
  7. Rozcieńcz część 2x roztworu antifade w stosunku 1:1 w BRB80, aby otrzymać 1x roboczy roztwór antifade. Ogrzej ten roztwór do temperatury pokojowej (RT); zapasowy roztwór antifade należy przechowywać w lodzie.
KolejnośćOdczynnikiRozcieńczanie objętościoweObjętość płukaniaCzas inkubacji
1BRB80Ze względu na brak tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o dostarczenie treści, którą należy przełożyć na język polski.50 μLPonieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o wprowadzenie treści, którą należy przełożyć na język polski zgodnie z wytycznymi.
2Przeciwciało antyrodamina1:50 w BRB80, wymieszać dokładnie25 μL5 min
3BRB80N/D50 μLZ powodu braku tekstu źródłowego do przetłumaczenia, proszę o dostarczenie materiału, który ma zostać przełożony na język polski. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy do przygotowania wiernego, precyzyjnego przekładu zgodnie z wytycznymi dotyczącymi rejestru akademickiego i terminologii specjalistycznej.
4Poloksamer 407 (F127)1% w BRB8025 μL15 min
5BRB80Nie dotyczy50 μLN/D

Tabela 1: Kolejność przygotowania kanałów urządzenia mikrofluidycznego.

ObjętośćOdczynnikStężenie roztworu roboczegoStężenie końcowe
16 μLD-glukoza2 M80 mM
16 μLOksydaza glukozowa2 mg/ml80 μg/mL
16 μLKatalaza0,8 mg/ml32 μg/mL
14 μLKazeina28 mg/mL0,16 mg/ml
8 μLDTT1 M20 mM
40 μLChlorek potasu1 M100 mM
290 μLBRB801xPonieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do przetłumaczenia, proszę o przesłanie materiału, który ma zostać przełożony na język polski.
400 μLKOŃCOWA (2x stężenie robocze)

Tabela 2: Przepis na roztwór obrazujący przeciwko zanikaniu sygnału (stężenie 2x).

7. Wprowadzanie zarodków mikrotubul do układu mikroprzepływowego (10 - 15 min)

  1. Podłącz urządzenie mikroprzepływowe do mikroskopu.
    UWAGA: Ponieważ stabilność mikrotubul zależy od temperatury, zaleca się przeprowadzanie eksperymentów obrazowania w temperaturze 35 °C.
  2. Do strzykawki przyczep 10-15 cm nowej rurki i nabierz do niej pożądane rozcieńczenie nasion mikrotubul stabilizowanych GMPCPP.
    UWAGA: W przypadku tego urządzenia optymalnym stężeniem były nasiona mikrotubul GMPCPP o stężeniu ~10 nM.
  3. Delikatnie naciśnij tłok strzykawki, aż na końcu rurki pojawi się mała kropla cieczy. Zapobiegnie to przedostaniu się powietrza do urządzenia mikroprzepływowego podczas podłączenia rurki.
  4. Podłącz rurkę do wlotu urządzenia mikroprzepływowego.
  5. Powoli naciśnij tłok strzykawki, aż większość, ale nie cały roztwór, przepłynie przez rurkę. Pozostawienie niewielkiej ilości cieczy w rurce zapewni, że do rurki nie zostanie przypadkowo wtłoczone powietrze.
  6. Odłącz rurkę wlotową od urządzenia mikroprzepływowego i strzykawki, a następnie podłącz do strzykawki nowy fragment rurki.
  7. Nabierz do rurki bufor BRB80.
  8. Powtórz kroki 7.3-7.6, aby wypłukać z urządzenia niezwiązane nasiona mikrotubul.
  9. Obserwuj przyłączanie nasion do powierzchni mikroprzepływowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF). Idealna liczba nasion w jednym polu widzenia będzie różnić się w zależności od zastosowania i rozmiaru pola widzenia, ale zazwyczaj optymalne jest ~10-20 nasion na pole widzenia 80 µm × 80 µm. Powtarzaj kroki 7.2-7.9 w razie potrzeby, aż do osiągnięcia pożądanej gęstości nasion.
    UWAGA: Do monitorowania gęstości nasion mikrotubul należy stosować przerywaną krótką ekspozycję na światło (100 ms), ponieważ w roztworze nie ma jeszcze środka zapobiegającego blaknięciu (antifade).
  10. Po osiągnięciu odpowiedniej gęstości związanych nasion podłącz do strzykawki nowy fragment rurki wlotowej.
  11. Nabierz do rurki ciepły, 1x roztwór antifade i powtórz kroki 7.3-7.6.
    UWAGA: Dzięki obecności roztworu antifade w urządzeniu fotostabilność uległa znacznemu poprawieniu, a urządzenie jest stabilne. Mimo to nadal zaleca się minimalizowanie ekspozycji na światło laserowe.

8. Hodowla wydłużeń mikrotubul z zarodków (15 - 30 min)

  1. Połączyć tubulinę znakowaną fluorescencyjnie, tubulinę nieznakowaną, 2x roztwór antifade, guanozyno-5'-trifosforan (GTP) oraz bufor BRB80 w celu przygotowania końcowego roztworu zawierającego 14 µM tubuliny przy 7% stopniu znakowania fluorescencyjnego, antifade w 1x stężeniu roboczym oraz 1 mM GTP.
    UWAGA: W przypadku zastosowania innych stężeń lub innych procentowych stopni znakowania tubuliny, objętość każdego z odczynników musi zostać dostosowana, aby uzyskać pożądane stężenie końcowe i stosunek znakowania. Roztwór tubuliny należy trzymać na lodzie do około 30 s przed wprowadzeniem, po czym należy wyjąć roztwór z lodu i ogrzać go w dłoni do temperatury RT. Ułatwi to polimeryzację wypustek mikrotubul, która jest procesem zależnym od temperatury. W rzeczywistości polimeryzację mikrotubul należy przeprowadzać w 35 °C, natomiast wszystkie pozostałe kroki eksperymentalne można realizować w RT.
  2. Do strzykawki przyłączyć 10-15 cm nowego przewodu i zassać do niego roztwór tubuliny.
  3. Delikatnie nacisnąć tłok strzykawki, aż na końcu przewodu pojawi się mała kropla cieczy. Zapobiegnie to przedostawaniu się powietrza do urządzenia mikroprzepływowego po podłączeniu przewodu.
  4. Podłączyć przewód do wlotu urządzenia mikroprzepływowego.
  5. Powoli naciskać tłok strzykawki, aż większość, ale nie całość, roztworu przepłynie przez przewód. Pozostawienie niewielkiej ilości cieczy w przewodzie zapewni, że do wnętrza nie zostanie przypadkowo wtłoczone powietrze. Odłączyć przewód wlotowy od urządzenia mikroprzepływowego.
  6. Obrazować z pożądaną częstotliwością przez 10-15 min lub do momentu, gdy wypustki będą wystarczająco długie, aby ulec wygięciu. Zazwyczaj obrazowanie wykonuje się przy 488 nm co 5 s i 561 nm co 60 s, aż wypustki osiągną długość co najmniej 5-10 µm (~15 min).
    UWAGA: Przy tym stężeniu tubuliny mikrotubule mogą stochastycznie przełączać się między okresami polimeryzacji i depolimeryzacji; jest to zjawisko spodziewane, jednak ogólnie wypustki mikrotubul będą się wydłużać49.

9. Stabilizacja przedłużeń mikrotubul (10-15 min)

  1. Połączyć Taxol, 2x roztwór antifade oraz BRB80, aby uzyskać końcowy roztwór zawierający 10 µM Taxolu oraz antifade w stężeniu roboczym 1x.
    UWAGA: Roztwór Taxolu należy przechowywać w lodzie do momentu ok. 30 s przed wprowadzeniem, po czym należy wyjąć go z lodu i ogrzać w dłoni do RT. Zapobiegnie to depolimeryzacji wydłużonych mikrotubul, która jest procesem zależnym od temperatury.
  2. Przymocować 10-15 cm nowej rurki do strzykawki i naciągnąć roztwór Taxolu do rurki.
  3. Delikatnie nacisnąć tłok strzykawki, aż na końcu rurki pojawi się mała kropla cieczy. Zapobiegnie to przedostaniu się powietrza do urządzenia mikroprzepływowego podczas podłączania rurki.
  4. Przymocować rurkę do wlotu urządzenia mikroprzepływowego.
  5. Naciskać tłok strzykawki, aż większość, ale nie cały roztwór przepłynie przez rurkę. Pozostawienie niewielkiej ilości cieczy w rurce zapewni, że do urządzenia nie zostanie przypadkowo wtłoczone powietrze.
  6. Powtórzyć kroki 9.2-9.5 dwukrotnie w szybkim odstępie czasu. W tym przypadku można użyć tej samej rurki.
    UWAGA: Taxol sprzyja nukleacji mikrotubul de novo z tubuliny w roztworze; mikrotubule te mogą osadzać się na powierzchni kanału mikroprzepływowego i zakłócać późniejszy obrazowanie lub wyginanie. Z tego powodu roztwór Taxolu powinien przepływać przez urządzenie szybko i wielokrotnie, aby jak najszybciej usunąć z urządzenia jak największą ilość wolnej tubuliny.
  7. Potwierdzić, że mikrotubule wyrosłe z zarodków są nadal obecne i ustabilizowane w urządzeniu.

10. Zginanie stabilizowanych przedłużeń mikrotubularnych (10 - 15 min)

UWAGA: Zstabilizowane wydłużenia mikrotubulek można obecnie zginać za pomocą kontrolera przepływu. W tym przypadku zastosowano regulowany system wypierania z nadciśnieniem (Elveflow OB1 MK3+), aby przeprowadzić roztwór ze szczelnej fiolki źródłowej przez przepływomierz do układu mikroprzepływowego. W zależności od specyfiki dostępnego ustawienia kontrolera przepływu, w poniższych krokach można wprowadzić modyfikacje.

  1. Przygotować kontroler przepływu oraz powiązany sprzęt zgodnie z protokołami producenta lub specyfikacjami ośrodka, używając rurek do połączenia fiolki z materiałem z wlotem przepływomierza oraz wylotu przepływomierza z wlotem mikroprzepływowym, jednak nie należy jeszcze przytwierdzać rurek do urządzenia mikroprzepływowego.
  2. Wprowadzić ~200 µL roztworu taxolu o stężeniu 10 µM do fiolki z materiałem, którą można podłączyć do zestawu kontrolera przepływu. Zestaw ten wykorzystuje połączenia typu Luer-lock w celu zapewnienia szczelności powietrznej.
  3. Włączyć system kontroli przepływu i przepłukać rurki, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Zapobiegnie to przedostaniu się powietrza do urządzenia mikroprzepływowego po podłączeniu rurek.
  4. Po przepłukaniu rurek przez przepływomierz i pojawieniu się małej kropli cieczy na końcu rurki, wyłączyć system kontroli przepływu.
  5. Podłączyć rurkę do wlotu urządzenia mikroprzepływowego. Należy użyć wlotu prostopadłego do wlotu służącego do wprowadzania zarodków mikrotubul, aby rozrastające się wydłużenia mikrotubul wyginały się ortogonalnie.
  6. Wywołać wyginanie wydłużeń poprzez uruchamianie i zatrzymywanie przepływu z żądaną prędkością lub pod żądanym ciśnieniem. Standardem dla tego protokołu jest ciśnienie 30 mbar przy zastosowaniu przepływu oscylacyjnego o okresie 5 s. W tym czasie należy obrazować wyginanie, zazwyczaj co 0,1 s przy 488 nm oraz co 10 s przy 561 nm.
    UWAGA: To kończy podstawowy test wyginania mikrotubul. Cały sprzęt i odczynniki można oczyścić lub zutylizować zgodnie z protokołami producenta lub specyfikacjami ośrodka.

Wyniki

Uzasadnienie konstrukcji urządzenia mikroprzepływowego
Konstrukcja urządzenia mikroprzepływowego w niniejszym badaniu opierała się na kilku kluczowych cechach (Rysunek 2), które rozwijają i ulepszają tradycyjną, prostą konstrukcję komór przepływowych. Warto zaznaczyć, że urządzenie mikroprzepływowe posiada objętość wewnętrzną ok. 160 nL, co jest znacznie mniejszą wartością niż objętość ok. 10 µL typowych komór przepływowych47, co pozwala na bardziej kontrolowane wykorzystanie potencjalnie cennych odczynników, takich jak oczyszczone komponenty białkowe. Ponieważ mikroprzepływowy kontroler przepływu zawiera dwa kanały regulacyjne, urządzenie opracowano z założeniem, że w danej chwili kontrola ciśnienia będzie dostępna tylko dla dwóch portów wlotowych/wylotowych. W razie potrzeby można zaimplementować większą liczbę kanałów z kontrolą ciśnienia.

Schemat urządzenia mikrofluidycznego z pułapkami pęcherzykowymi do izolacji płynów w systemach lab-on-a-chip.
Rycina 2: Schemat konstrukcji urządzenia mikrofluidycznego. Prostokątne oznaczenia na obwodzie służą jako pomoc wizualna do wyznaczenia krawędzi kanałów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Centralna, prostokątna komora urządzenia służy jako główny obszar obrazowania, w którym przytwierdzone są zarodniki mikrotubul, a następnie od tych zarodków polimeryzują się wydłużenia mikrotubul. Komora jest przecięta z obu stron kanałami przepływowymi, przy czym proste kanały wzdłuż osi x służą jako wlot i wylot, co ułatwia szybką wymianę roztworu reakcyjnego. Kanał wlotowy mikrotubul jest również wykorzystywany do wprowadzania zarodników mikrotubul do komory, a przepływ laminarny powoduje wiązanie się zarodników z powierzchnią szkła wzdłuż kierunku przepływu. W kierunku prostopadłym (oś y) kanały przepływowe rozgałęziają się na mniejsze kanały prowadzące w stronę komory, podobnie jak w niektórych wcześniejszych konstrukcjach25,28,36,39. Geometria rozgałęzień jest szczególnie odpowiednia do badania właściwości mechanicznych mikrotubul. Wprowadzanie roztworu do centralnej komory z kierunku prostopadłego do orientacji zarodników mikrotubul pozwala na wywołanie sił zginających pod kątami bliskimi kątom prostym. Co więcej, zastosowanie rozgałęziającej się geometrii z wieloma mniejszymi kanałami przepływowymi ułatwia bardziej jednorodne przyłożenie siły na dużym obszarze centralnej komory, czego nie udaje się osiągnąć przy zastosowaniu prostej geometrii z jednym kanałem przepływowym. W ten sposób motyw rozgałęzień, choć wydaje się bardziej skomplikowany, może zmniejszyć ogólną złożoność określania siły przekazywanej mikrotubulom (Rysunek 3). Konstrukcja ta posiada również wiele linii symetrii, co zapewnia łatwość użytkowania i możliwość oceny zginania z kilku kierunków (np. z góry vs. z dołu).

Schemat symulacji dynamiki płynów; gradient kolorów i wektory prędkości ilustrują wzorce przepływu.
Rysunek 3: Wprowadzenie motywu rozgałęzień skutkuje powstaniem dużego obszaru o podobnym przepływie. Symulacje dwóch konstrukcji urządzenia przy przepływie stanu stacjonarnego: jednej bez kanałów rozgałęzionych (A) oraz jednej z kanałami rozgałęzionymi (B). Strzałki oznaczają lokalny kierunek przepływu i są proporcjonalne do jego wartości. Kolorystyka powierzchni oznacza prędkość w linii środkowej. Obrazy po prawej stronie pokazują powiększony fragment urządzenia, w którym mikrotubule (niewidoczne), zorientowane wzdłuż osi x, byłyby poddane siłom zginania wywołanym przez płyn wpływający górnym otworem i wypływający dolnym otworem. Wprowadzenie kanałów rozgałęzionych zwiększa względną powierzchnię poddaną podobnym polom prędkości, nie zwiększając przy tym objętości wymaganego odczynnika. Rysunek został zmodyfikowany za zgodą Rogersa (2022)14. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Warto zaznaczyć, że urządzenie posiada również szereg pułapek na pęcherzyki powietrza w kanałach dopływowych i odpływowych, aby zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do centralnej komory obrazowania. W szczególności zdecydowano się na umieszczenie macierzy mikrofilarów na drodze przepływu, aby zablokować przemieszczanie się pęcherzyków powietrza ze względu na napięcie powierzchniowe (Rycina 2)46. Ponadto, aby zapobiec zasysaniu powietrza, krawędzie wewnątrz urządzenia zaprojektowano jako gładkie krzywe, zamiast stosować kąty skośne. Wspólnie te cechy konstrukcyjne zmniejszają prawdopodobieństwo wystąpienia pęcherzyków powietrza i zwiększają niezawodność urządzenia.

Wytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego
Wyznaczenie odpowiednich parametrów do stworzenia matrycy urządzenia wymagało optymalizacji. Jak zaobserwowano wcześniej, ten fotorezyst jest bardzo wrażliwy na kluczowe parametry operacyjne, takie jak oświetlenie otoczenia oraz szybkość nagrzewania i chłodzenia podczas etapów fotolitografii50. Na przykład, jeśli matryca była chłodzona zbyt szybko po nagrzaniu, w fotorezyście mogły powstać pęknięcia termiczne. Jest to niepożądane, ponieważ pęknięcia mogą naruszyć integralność kanałów. Chociaż pęknięcia można było usunąć poprzez ponowne nagrzanie rezystu do temperatury zbliżonej do temperatury przejścia (~115 ˚C), stwierdzono, że umożliwienie matrycy schłodzenia się w temperaturze otoczenia na płycie grzewczej było najskuteczniejszym sposobem zapobiegania pękaniu. Co więcej, nadmiar światła otoczenia może prowadzić do niezamierzonej ekspozycji fotorezystu, co osłabia rezyst i powoduje, że elementy urządzenia (które powinny pozostać na waflu po wywoływaniu) ulegają częściowemu usunięciu podczas etapu wywoływania. Z tego powodu zaleca się, aby etap wywoływania przeprowadzić dzień po wygrzewaniu po naświetlaniu oraz nocnym chłodzeniu w temperaturze otoczenia. Ponadto, gdy matryca urządzenia nie jest używana, zaleca się przechowywanie jej w ciemnym miejscu lub zawiniętą w folię aluminiową, aby zapobiec degradacji w czasie. Po ustaleniu tych parametrów proces fotolitografii okazał się wysoce powtarzalny (Rysunek 4).

Po przygotowaniu matrycy, na jej powierzchni odlewano ciekły PDMS, pozwalając mu utwardzić się i utworzyć negatywny odcisk struktur matrycy. Stwierdzono, że odlewanie PDMS o grubości 2-3 mm umożliwia łatwą manipulację urządzeniami; w przeciwieństwie do tego, w przypadku nanoszenia metodą spin-coatingu w celu uzyskania grubości rzędu µm, PDMS był podatny na rozdarcia lub samozlepianie, co utrudniało manipulację. Ponadto grubsza warstwa PDMS ułatwia podłączanie rurek, ponieważ pozostają one w portach wlotowych/wylotowych bez konieczności stosowania uszczelniacza lub zacisku.

Wreszcie, podczas gdy tradycyjne analizy w komorach przepływowych w tych zastosowaniach biologicznych często wykorzystują szklane deklasyzatory, które zostały uprzednio oczyszczone za pomocą roztworu Piranha (nadtlenek wodoru i kwas siarkowy), a następnie silanizowane, ustaliliśmy, że deklasyzatory poddane przedłużonemu czyszczeniu plazmowemu i płukaniu IPA były odpowiednie do naszych celów47. Inne zastosowania, takie jak obrazowanie pojedynczych cząsteczek, mogą wymagać bardziej rozległej obróbki szkła okrywego.

Urządzenie mikroprzepływowe w systemie OB1, konfiguracja mikroskopowa, sterowanie przepływem reagentów do analizy eksperymentalnej.
Rycina 4: Proces fotolitografii. (A) Maska z pożądanym wzorem (maska wykonana z chromu wytrawionego na szkle). (B) Nieznaczne pęknięcia fotorezystu na waflu krzemowym spowodowane naprężeniem termicznym (strzałki wskazują kilka pęknięć). Pęknięcia te często rozciągają się przez cały wafele. (C) Wywołany wzorzec (master). (D) Układ mikroprzepływowy na mikroskopie. Poszczególne komponenty są oznaczone na zielono. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wzrost, stabilizacja i wyginanie mikrotubul
Zarodki mikrotubul wyhodowane w GMPCPP służą jako miejsca nukleacji dla polimeryzacji wydłużenia mikrotubul i same pozostają stabilne przeciwko depolimeryzacji przez kilka godzin w temperaturze pokojowej. Zarodki zostały przywiązane do szkiełka podstawowego w kanale mikrofluidycznym przy użyciu przeciwciała anty-rodamina47. Następnie dynamiczne wydłużenia mikrotubul hodowano w obecności rozpuszczalnej tubuliny (znakowanej fluorescencyjnie, ale nie sprzężonej z rodamina) oraz GTP. W ten sposób miejsca nukleacji zarodków zostały przymocowane do szkiełka podstawowego, natomiast wydłużenia nie. Podczas 15-minutowego okresu wzrostu wydłużenia mikrotubul polimeryzowały i depolimeryzowały stochastycznie, co było spodziewane ze względu na ich wewnętrzną niestabilność dynamiczną49. Po tym okresie wzrostu przeprowadzono płukanie 10 µM Taxolu, aby usunąć pozostałą tubulinę z roztworu i ustabilizować utworzone wydłużenia mikrotubul. Stabilizacja jest kluczowa, ponieważ w przeciwnym razie wydłużenia mikrotubul uległyby depolimeryzacji po wyczerpaniu tubuliny. Wykazano, że Taxol, oprócz wiązania i stabilizowania polimeru mikrotubul, wpływa również na mechanikę polimeru mikrotubul i może indukować zakrzywienie w przeciwnym razie liniowych wydłużeń mikrotubul51,52,53,54. Przedstawione tutaj wyniki odzwierciedlały te obserwacje; jednak zwijanie się wydłużeń mikrotubul jest niepożądane, ponieważ prowadzi to do nierównomiernego rozkładu sił przykładanych wzdłuż sieci podczas wyginania. Dlatego do analizy wyginania wykorzystano tylko mikrotubule, które pozostały względnie proste po stabilizacji. Alternatywnie, po wstępnym okresie wzrostu, można zastosować wtórny okres wzrostu z roztworem tubuliny i GMPCPP (zamiast początkowego GTP), aby utworzyć stabilne „czapeczki” na rosnących końcach sieci mikrotubul i zapobiec depolimeryzacji55.

Następnie mikrotubule wygięto poprzez przepływ roztworu buforowego z wykorzystaniem systemu sterowania ciśnieniem w celu utrzymania stałego ciśnienia dopływu (Rysunek 5, Wideo uzupełniające 1). W ten sposób możliwe było przybliżenie lokalnego przepływu oddziałującego na mikrotubule. Poprzez doprowadzanie cieczy przez górny port urządzenia i odprowadzanie jej przez port dolny, zamierzono skierować przepływ prostopadle do orientacji osadzania.

Wizualizacja sekwencyjnego wzrostu mikrotubul w zarodku GMPCPP w przepływie; poklatkowa mikroskopia.
Rycina 5: Układ mikroprzepływowy może być wykorzystany do wyginania stabilizowanych mikrotubul. Mikrotubule w stanie spoczynku po stabilizacji paclitaxelem wyginają się podczas przepływu pulsacyjnego. Stałe ciśnienie powyżej 30 mbar napędza przepływ (strzałka oznacza kierunek przepływu). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyznaczenie profilu przepływu w urządzeniu mikrofluidycznym
Prędkość w linii środkowej w układzie mikrofluidycznym może zostać symulowana obliczeniowo przy użyciu oprogramowania COMSOL (oprogramowanie symulacyjne, Rysunek 6A). Jednak mikrotubule są przytwierdzone do szkiełka podstawowego dla mikroskopii TIRF w odległości ~100 nm od powierzchni. W związku z tym prędkość, której podlegają mikrotubule, nie jest taka sama, jak ta przewidywana w symulacji 2D. Aby przybliżyć lokalny przepływ doświadczany przez mikrotubule, zastosowaliśmy ogólne równanie Naviera-Stokesa dla nieściśliwego przepływu płynu w jednym wymiarze:

Równanie dynamiki płynów \(v_y(z) = v_c(1-(z/h)^2)\) ilustrujące profil prędkości.

Tutaj z oznacza wysokość mikrotubul w urządzeniu, h to całkowita wysokość urządzenia, a vc to prędkość na osi centralnej w urządzeniu. Zgodnie z definicją układu, początek osi z znajduje się w centrum urządzenia (Rysunek 6B). Przy zastosowaniu tej definicji oraz wysokości kanału wynoszącej 13 µm, wysokość mikrotubul szacuje się jako z = -6,4 µm. Rozwiązanie tego równania pozwala uzyskać szacunkową wartość lokalnej prędkości płynu, jakiej poddawane są mikrotubule:

Obliczenie prędkości \(v_y(6.4) = 92 \mu m/s\), równanie do analizy fizycznej.

Schemat dynamiki płynów przedstawiający pole prędkości przepływu w mikrokanale z wektorami kierunkowymi i gradientem kolorystycznym.
Rysunek 6: Definiowanie układu do analizy przepływu płynu wchodzącego do urządzenia przez górny otwór i opuszczającego je przez otwór dolny (otwory nie pokazane). (A) Symulacja przeskalowanego pola prędkości na osi środkowej, analogicznie do Rysunku 3B. Gwiazdka oznacza obszar zainteresowania dla panelu B. (B) Przedstawienie przekroju poprzecznego urządzenia. W pełni rozwinięty profil przepływu płynu znajduje się w kierunku y, z prędkością na osi środkowej vc przy z = 0 oraz warunkiem braku poślizgu na ściankach. Należy zauważyć, że strzałki w tym panelu nie są w skali w odniesieniu do rzeczywistego pola prędkości pokazanego w panelu A. Rysunek został zmodyfikowany za zgodą Rogersa (2022)14. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Poza symulacjami, prędkość płynu można kontrolować za pomocą kontrolera przepływu opartego na objętościowym natężeniu przepływu, zamiast utrzymywać stałe ciśnienie. Ponadto lokalne natężenie przepływu w każdym urządzeniu można bezpośrednio określić poprzez dodanie fluorescencyjnych kulek i monitorowanie ich prędkości, co pozwala wyeliminować zmienność między poszczególnymi próbkami.

Modelowanie obliczeniowe i demonstracje gradientów
Na koniec przeprowadziliśmy symulacje obliczeniowe w połączeniu z eksperymentami, aby wykazać możliwość wykorzystania tego urządzenia do eksperymentów wysokoprzepustowych. Oprócz możliwości zginania mikrotubul w wielu kierunkach dzięki symetrii urządzenia, symulacje wykazały, że urządzenie potrafi utrzymywać precyzyjne gradienty, co umożliwia jednoczesne badanie wielu warunków eksperymentalnych (Rysunek 7A). Wstępne eksperymenty (metody nieopisane szczegółowo w niniejszej publikacji) z użyciem barwnika fluorescencyjnego w roztworze wykazały zgodność z przewidywaniami obliczeniowymi (Rysunek 7B). Ponadto z sukcesem zademonstrowaliśmy rozdzielenie różnych białek w różnych obszarach urządzenia poprzez jednoczesny wzrost wydłużenia mikrotubul z różnymi znacznikami fluorescencyjnymi (Rysunek 8). Z naszej wiedzą jest to pierwsze zastosowanie mikroprzepływów wysokoprzepustowych w badaniach mikrotubul. Ta cecha urządzenia może być wykorzystana do skrócenia czasu i zmniejszenia ilości potrzebnych odczynników, przy jednoczesnej poprawie powtarzalności eksperymentów. Na przykład wpływ różnych białek lub odmiennych stężeń poszczególnych białek na mechanikę i dynamikę mikrotubul może być badany jednocześnie w jednym urządzeniu.

Dyfuzja w urządzeniu mikroprzepływowym, schemat gradientu stężeń i obraz z mikroskopii fluorescencyjnej.
Rycina 7: Tworzenie gradientu. (A) Symulacja gradientu dwóch roztworów wprowadzanych do urządzenia pod tym samym ciśnieniem wlotowym (50 mbar) i stężeniem (15 µM). Porty wlotowe dla każdego roztworu oznaczone są kolorowymi strzałkami (jeden roztwór w porcie górnym i drugi roztwór w porcie prawym), a dwa pozostałe porty służą jako wyloty. Mapa cieplna przedstawia profil stężenia roztworu górnego. Stan stacjonarny osiągnięto w t = 5 s. (B) Eksperymentalne generowanie podobnego gradientu przy użyciu barwnika fluorescencyjnego w roztworze w porcie górnym oraz buforu w porcie prawym. Obraz stanowi warstwę rastrową utworzoną poprzez zestawienie każdego pola widzenia (80 µm × 80 µm) w celu zobrazowania całego obszaru urządzenia. Rycina została zmodyfikowana za zgodą Rogersa (2022)14. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna polimeryzacji tubuliny, znakowanej A647 i A488, pokazująca kierunek przepływu.
Rysunek 8: Wykazanie gradientu białka w urządzeniu mikroprzepływowym. Tubulina znakowana AlexaFluor647 (magenta) została wprowadzona przez wlot 1, a tubulina znakowana AlexaFluor488 (zielona) przez wlot 2 urządzenia, przy równych stężeniach i prędkościach przepływu. Przepływ był oscylowany (włączany/wyłączany) w odstępach 90 s, aby umożliwić polimeryzację tubuliny z ustabilizowanych zarodków GMPCPP (czerwone), jednocześnie hamując mieszanie. (A) Wielkoskalowa warstwa rastrowa utworzona przez zszycie pól widzenia (80x80 µm) w celu zobrazowania całej długości urządzenia. Litery oznaczają względną lokalizację poszczególnych pól widzenia na kolejnych panelach. Pasek skali wynosi 50 µm w osi X i Y. (B) Pole widzenia w pobliżu wlotu 1 urządzenia, gdzie wydłużenia składają się przeważnie z tubuliny znakowanej A647. (C) Pole widzenia w pobliżu środka urządzenia, gdzie wydłużenia składają się z mieszaniny znakowanych tubulin, zgodnie z przewidywaniami. (D) Pole widzenia w pobliżu dolnej części urządzenia, gdzie wydłużenia składają się przeważnie z tubuliny znakowanej A488. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat blokowy (PFD) układu eksperymentalnego mikroprzepływowego na mikroskopie przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 1.

Rycina uzupełniająca 1: Schemat blokowy procesu (PFD) dla mikrofluidycznego układu doświadczalnego na mikroskopie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Wideo uzupełniające 1. Układ mikroprzepływowy może być wykorzystany do wyginania stabilizowanych mikrotubul. Mikrotubule w stanie spoczynku po stabilizacji paklitakselem ulegają wygięciu podczas przepływu pulsacyjnego. Przepływ jest wymuszany przez stałe ciśnienie dopływowe wynoszące 30 mbar. Prędkość odtwarzania wideo 10 fps. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Plik CAD projektu maski mikrofluidycznej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Głównym celem tego protokołu było zaprojektowanie i wyprodukowanie urządzenia mikroprzepływowego odpowiedniego do badania mechaniki mikrotubul in vitro. Projekt został oparty na chęci wykorzystania nieodłącznych zalet urządzeń mikroprzepływowych opartych na PDMS, a jednocześnie obejmuje kombinację funkcji, które umożliwiłyby solidne i konfigurowalne eksperymenty o wysokiej przepustowości.

Cel ten został pomyślnie osiągnięty, co zaowocowało protokołami produkcyjnymi i ogólnymi wytycznymi, które mogą służyć jako podstawa dla przyszłych użytkowników tego systemu. Włączenie do urządzenia nadmiarowych pułapek bąbelkowych zmniejsza prawdopodobieństwo denaturacji białek z powodu obecności pęcherzyków powietrza. Chociaż nadal mamy do czynienia z odłączaniem i ponownym podłączaniem przewodów w urządzeniu, te pułapki bąbelkowe zmniejszają prawdopodobieństwo niepowodzenia eksperymentu. Przyszłe ulepszenia układu mikroprzepływowego mogą jeszcze bardziej zmniejszyć liczbę ręcznych manipulacji rurkami dokonywanych podczas eksperymentu. Co więcej, integracja urządzenia mikroprzepływowego ze zautomatyzowanym oprogramowaniem do sterowania przepływem pozwala na znaczne dostosowanie warunków eksperymentalnych przy jednoczesnym zmniejszeniu możliwości błędu ręcznego. Wykazaliśmy pomyślne działanie urządzenia, wytwarzając urządzenie, a następnie hodując, stabilizując i zginając przedłużenia mikrotubul w urządzeniu przy użyciu automatycznego, regulowanego przez kontroler przepływu. Ponadto, ustalając gradient odrębnych znakowanych fluorescencyjnie roztworów tubuliny w tym samym urządzeniu, wykazaliśmy, że wiele warunków może być uruchamianych jednocześnie w jednym urządzeniu. Wspomagany technikami modelowania i analizy obliczeniowej, nasz system może badać i określać właściwości biomechaniczne mikrotubul, takie jak sztywność zginania 52,56,57,58,59.

Potencjalne przyszłe ulepszenia ułatwiłyby opracowanie jeszcze bardziej niezawodnego systemu i związanej z nim analizy eksperymentalnej. Po pierwsze, osadzanie fotorezystu, ekspozycja i wypalanie były kluczowymi parametrami, które wykazały pewną zmienność. Stosunkowo duże rozmiary elementów fotorezystu SPR wymagały bardzo stopniowego nagrzewania i chłodzenia, aby zapobiec pękaniu termicznemu, które mogłoby zniszczyć urządzenia. Chociaż próbowano użyć cieńszych urządzeń, znaleźliśmy problemy z manipulowaniem tymi mniejszymi rozmiarami funkcji. Dbałość o szczegóły i cierpliwość są kluczowe przy replikowaniu urządzeń o tej grubości za pomocą fotorezystu SPR. Do rozwiązania tego problemu można użyć różnych fotorezystorów, w zależności od dostępności.

Podsumowując, urządzenie mikroprzepływowe i protokół pozwalają na szereg konfiguracji eksperymentalnych o bardziej solidnych, wysokowydajnych możliwościach testowych niż poprzednie testy z komórkami przepływowymi47. Co więcej, eksperymenty można zautomatyzować za pomocą regulatorów przepływu w celu utrzymania precyzyjnych profili przepływu lub gradientów stężeń w urządzeniu, zmniejszając zmienność nieodłącznie związaną z użytkownikami ręcznymi. Przyszłe potencjalne zastosowania tego układu obejmują badanie wpływu białek związanych z mikrotubulami na sztywność zginania mikrotubul, dynamikę, uszkodzenie i naprawę sieci, a także biomechaniczne interakcje mikrotubul i włókien aktynowych 54,60,61,62,63,64,65,66,67, 68,69,70. Integracja mikrofabrykacji, zautomatyzowanej kontroli przepływu oraz technik modelowania i analizy obliczeniowej tworzy wszechstronny system odpowiedni do badania cytoszkieletu komórkowego in vitro.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów. Autorzy ujawniają wykorzystanie ChatGPT-4o OpenAI do korekty i korekty tekstu.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie i zasoby dostarczone przez Vanderbilt Institute of Nanoscale Science and Engineering (VINSE), gdzie przeprowadzono część tych badań. Praca ta została częściowo sfinansowana z grantu NIH NIGMS dla M. Zanica (R35 GM1192552) i grantu NSF ID 2018661 dla M. Zanicia. M. Rogers otrzymał wsparcie z grantu NIH T32 GM08320 oraz nagrody pilotażowej VINSE. L. Richardson jest wspierany przez grant NSF GRFP nr 1937963. Autorzy chcieliby również podziękować dr Alice Leach, Davidowi Schafferowi, dr Christinie McGahan i całemu laboratorium Zanic za ich pomoc i wsparcie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do mikrowirówek 0,6 ml (przezroczyste)Dowolna markaPreferowany typ o niskiej retencji
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml (przezroczyste)Dowolna markaPreferowany typ niskiej retencji
Standardowy dziurkacz do biopsji 1,5 mmIntegra LifeSciences33-31A-P/25
100x/1,49 apertura numeryczna Obiektyw TIRFNikon
22 x 22 mm szkło Szkiełka nakrywkoweThorLabsCG15CH
3" jednostronnie polerowane wafle silikonoweUniversity Wafer447
4" szalka PetriegoDowolna marka
450 i mikro; L, Otwarta cienkościenna, ultraprzezroczysta rurka BeckmanCoulter, Inc.345843Określany jako "rurka powietrzna" w protokole
Lasery półprzewodnikowe 488, 561 i 640 nmNikon
A-95 Rotor o stałym kącienachylenia Beckman Coulter, Inc.
AcetonDowolna marka
Ultrawirówka pneumatyczna AirfugeBeckman Coulter, Inc.347854Określany jako "airfuge" w protokole
Alexa Fluor 488 Microscale Protein Labeling KitThermo Fisher ScientificA30006
Folia aluminiowaDowolna marka
Andor iXon Ultra EM-CCDNikon
Andor NEO sCMOSNikon
AutoCADAutodeskWersje ogólne może być używany
Mózg bydlęcy nieoznakowana tubulina (oczyszczona)Nie dotyczyWyprodukowany we własnym zakresie, ale można go kupić
KazeinaMiliporeSigmaC7078
KatalazaMiliporeSigmaC9322
Czyste suche powietrze (CDA) (gaz pod ciśnieniem)Dowolna marka
Zasilanie sprężonym powietrzemDowolna markaŁączy się z mikroprzepływowym regulator przepływu
COMSOL Multiphysics oprogramowanieCOMSOL, Inc.
Niestandardowy mosiężny adapter scenicznyN/AWyprodukowany we własnym zakresie, aby pasował do naszych szkiełek nakrywkowych 22 mm x 22 mm na mikroskopie
Woda dejonizowanaDowolna marka
D-glukozaMiliporeSigmaG7528
Dithiothreitol (DTT)MiliporeSigmaD0632
EGTAOprogramowanie MilliporeSigma324626
Elveflow Smart Interface (ESI)Elveflow
Bezkołnierzowe złączki PFA z ETFE i frac14; "od -28 do 1/16" Średnica zewnętrzna okuć Darwin MicrofluidicsCIL-XP-245XSłuży do łączenia rurki z fiolek źródłowych micrewtube do czujnika przepływu za pośrednictwem ciśnieniowego stojaka na zbiornik
Fluiwell 4-kanałowy 2 mL niskociśnieniowyfluigent14002001Służy do podłączenia systemu kontroli przepływu do rur micrew. Określany również jako "ciśnieniowy stojak na zbiornik
Okapdowolnej marki
Oksydaza glukozowaMilliporeSigmaG6125
GMPCPPJena BioscienceNU-405L
Trifosforan guanozyny (GTP)MiliporeSigmaG8877
Płyta grzejnaDowolna marka
HS-625 o dużej prędkości koło filtra emisyjnegoOprzyrządowanie
Oprogramowanie ImageJNie dotyczy
InkubatorDowolna marka
Alkohol izopropylowyDowolna marka
Karl Suss MA-6 nakładka do maskiSUSS MicroTec
Chlorek magnezuMilliporeSigma1.05833
Oprogramowanie MATLABMathWorks
MEGAPOSIT SPR 220 7.0 fotorezystorDow, Inc.
Złączki mikroprzepływowe 6-40 do 1/4"-28 Zestaw adapterówDarwin MicrofluidicsLVF-KFI-08Służy do łączenia rurki z fiolek źródłowych micrewtube do czujnika przepływu za pośrednictwem ciśnieniowego stojaka na zbiornik (stojak Fluiwell)
Złączki mikroprzepływowe żeńskie Zestaw adapterów Luer LockDarwin MicrofluidicsLVF-KFI-04Służy do podłączenia strzykawki do rurki
Mikroprzepływowy regulatorprzepływuElveflowOB1 MK3 +
mikroprzepływowy czujnik przepływuElveflowMFS3Ten zakres czujników przepływu wynosi 0-80 μ L 
Deweloper MICROPOSIT MF-319Dow, Inc.
MikroskopNikonEclipse Ti
Oprogramowanie NIS-ElementsNikon
Azot (gaz pod ciśnieniem)Dowolna marka
Grzejnik obiektywowyTokai Hit
Jednoczęściowa dokręcana na palce 10-32 Złączka stożkowa do rurek o średnicy zewnętrznej 1/16" Darwin MicrofluidicsCIL-F-120XSłuży do podłączenia strzykawki do rurki
Paklitaksol (Taxol)Tocris Bioscience1097
Maski fotolitograficzneN/AWykonane przez podmiot zewnętrzny przy użyciu naszych projektów
RURYThermo Fisher Scientific172615000
Odkurzacz plazmowyHarrick PlasmaPDC-32G
System przepływomierza plazmowegoHarrick PlasmaPDC-FMGIntegruje się z myjką plazmową, aby umożliwić kontrolę przepływu gazu pod ciśnieniem
Pipeta z plastikową bańkąDowolna marka
Pluoronic F-127MilliporeSigmaP2443Określany jako "poloksomer 407" w protokole
Chlorek potasuProducts InternationalP41000
Saint Gobain Performance Plastics  Rurka Tygon .020 IDThermo Fisher Scientific50-206-8921Określane jako "rurka 1,5 mm" i "rurka" w protokole
SkalpelDowolna marka
Powlekarka wirowaCost Effective Equipment, LLC.200xTen model może zostać wycofany
ze sprzedaży Standardowe pipety i zestawy końcówekDowolna marka
Standardowa plastikowa strzykawkaDowolna markaUżyliśmy 10 ml strzykawki Luer-slip
Sylgard 184 zestaw elastomerów silikonowychDow, Inc.Określany jako "PDMS" i "utwardzacz" w protokole
T339 Micrewtube z uszczelką wargową i płaską nakrętkąMedline Industried, LP.T339Określany w protokole jako "fiolka źródłowa". Użyliśmy zarówno rozmiarów 0,5 ml, jak i 1,5 ml
TAMRA, SE; 5-(i-6)-karboksytetrametylorodamina, ester sukcynimidyluInvitrogenC1171Określany jako "TTR" w protokole
Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylo)silanMilliporeSigma448931
Trion Phantom RIE ICP Trion Technology, Inc.Ten odkurzacz plazmowy jest używany tylko w kroku 1.1 protokołu. Zamiast tego można użyć innego środka do czyszczenia plazmowego, takiego jak ten używany do klejenia PDMS; po prostu preferujemy znacznie niższą próżnię, jaką można osiągnąć dzięki temu systemowi do czyszczenia płytki krzemowej
TRITC Przeciwciało poliklonalneThermo Fisher ScientificA6397Określane jako "przeciwciało anty-rodaminowe" w protokole
PęsetaDowolna marka
Pompa próżniowaDowolna marka
347595 Eksykator Dowolna marka " wyciągowy Finger Lakes z otwartym dostępem Research

Bibliografia

  1. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
  2. Whitesides, G. M., Stroock, A. D. Flexible methods for microfluidics. Phys Today. 54 (6), 42(2001).
  3. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: Fluid physics at the nanoliter scale. Rev Mod Phys. 77, 977(2005).
  4. Beebe, D. J., Mensing, G. A., Walker, G. M. Physics and applications of microfluidics in biology. Annu Rev Biomed Eng. 4, 261-286 (2002).
  5. Ng, J. M. K., Stroock, A. D., Whitesides, G. M. Components for integrated poly(dimethylsiloxane) microfluidic systems. Electrophoresis. 23 (20), 3461-3473 (2010).
  6. Dellaquila, A. Five Short Stories on The History of Microfluidics. , https://www.elveflow.com/microfluidic-reviews/general-microfluidics/history-of-microfluidics/ (2025).
  7. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
  8. Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: Microfluidics in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 5 (3), 210-218 (2006).
  9. Neužil, P., Giselbrecht, S., Länge, K., Huang, T. J., Manz, A. Revisiting lab-on-a-chip technology for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (8), 620-632 (2012).
  10. Manz, A., Graber, N., Widmer, H. M. Miniaturized total chemical analysis systems: a novel concept for chemical sensing. Sens Actuators B: Chem. 1 (1-6), 244-248 (1990).
  11. Harrison, D. J., et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).
  12. Knight, J. Microfluidics: Honey, I shrunk the lab. Nature. 418 (6897), 474-475 (2002).
  13. Photolithographic fabrication techniques for transistors which are an integral part of a printed circuit. Nall, J. R., Lathrop, J. W. 1957 International Electron Devices Meeting, Washington, DC, USA, , (1957).
  14. Rogers, M. The design and fabrication of a two-layer microfluidic device for studying microtubules in vitro [Master's Thesis]. , Vanderbilt University. Nashville, TN. (2022).
  15. Lee, J. B., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2015).
  16. Kim, P., et al. Soft lithography for microfluidics: A Review. Biochip J. 2 (1), 1-11 (2008).
  17. Venkatesan, S. u, Jerald, J., Asokan, P., Prabakaran, R. A Comprehensive Review on Microfluidics Technology and its Applications. Recent Advances in Mechanical Engineering. , Springer. Singapore. 235-245 (2020).
  18. Minteer, S. Microfluidic Techniques: Reviews and Protocols. , Humana Press. New Jersey. (2006).
  19. Mitra, S. K., Chakraborty, S. Microfluidics and Nanofluidics Handbook: Fabrication, Implementation, and Applications. , Taylor and Francis Group. Florida. (2016).
  20. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , Garland Science. New York. (2014).
  21. Howard, J. Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , Springer. Heidelberg. (2001).
  22. Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. Mechanics of microtubules. J Biomech. 43 (1), 23-30 (2010).
  23. Gardel, M. L., Kasza, K. E., Brangwynne, C. P., Liu, J., Weitz, D. A. Chapter 19: Mechanical Response of Cytoskeletal Networks. Methods Cell Biol. 89, 487-519 (2008).
  24. Caporizzo, M. A., Prosser, B. L. The microtubule cytoskeleton in cardiac mechanics and heart failure. Nat Rev Cardiol. 19 (6), 364-378 (2022).
  25. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nat Mater. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  26. Chu, S. H., et al. A microfluidic device for in situ fixation and super-resolved mechanosensation studies of primary cilia. Biomicrofluidics. 13 (1), 014105(2019).
  27. Geisterfer, Z. M., Zhu, D. Y., Mitchison, T. J., Oakey, J., Gatlin, J. C. Microtubule growth rates are sensitive to global and local changes in microtubule plus-end density. Curr Biol. 30 (15), 3016-3023 (2020).
  28. Schaedel, L., et al. Lattice defects induce microtubule self-renewal. Nat Phys. 15 (8), 830-838 (2019).
  29. Aher, A., et al. CLASP mediates microtubule repair by restricting lattice damage and regulating tubulin incorporation. Curr Biol. 30 (11), 2175-2183 (2020).
  30. Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability. ELife. 5, e13470(2016).
  31. Fourniol, F. J., et al. Micropattern-guided assembly of overlapping pairs of dynamic microtubules. Methods Enzymol. 540, 339-360 (2014).
  32. Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. J Vis Exp. (114), e54278(2016).
  33. Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout. Mol Biol Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).
  34. VanDelinder, V., Brener, S., Bachand, G. D. Mechanisms underlying the active self-assembly of microtubule rings and spools. Biomacromolecules. 17 (3), 1048-1056 (2016).
  35. Roth, S., Gârlea, I. C., Vleugel, M., Mulder, B. M., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in cell-like confinement. bioRxiv. , (2019).
  36. Xu, Z., et al. Microtubules acquire resistance from mechanical breakage through intralumenal acetylation. Science. 356 (6335), 328-332 (2017).
  37. Fanalista, F., et al. Shape and size control of artificial cells for bottom-up biology. ACS Nano. 13 (5), 5439-5450 (2019).
  38. Velve-Casquillas, G., Costa, J., Carlier-Grynkorn, F., Mayeux, A., Tran, P. T. A fast microfluidic temperature control device for studying microtubule dynamics in fission yeast. Methods Cell Biol. 97, 185-201 (2010).
  39. Portran, D., Schaedel, L., Xu, Z., Théry, M., Nachury, M. V. Tubulin acetylation protects long-lived microtubules against mechanical ageing. Nat Cell Biol. 19 (4), 391-398 (2017).
  40. Huang, Y. M., Uppalapati, M., Hancock, W. O., Jackson, T. N. Microtubule transport, concentration and alignment in enclosed microfluidic channels. Biomed Microdevices. 9 (2), 175-184 (2007).
  41. Uppalapati, M., Huang, Y., Shastry, S., Jackson, T. N., Hancock, W. O. Microtubule Motors in Microfluidics. Methods in Bioengineering: Microfabrication and Microfluidics. , Artech House Publishers. Boston, MA. (2009).
  42. Sung, J. H., Shuler, M. L. Prevention of air bubble formation in a microfluidic perfusion cell culture system using a microscale bubble trap. Biomed Microdevices. 11 (4), 731-738 (2009).
  43. Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (RID) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360(2019).
  44. Nakayama, T., et al. Circumventing air bubbles in microfluidic systems and quantitative continuous-flow PCR applications. Anal Bioanal Chem. 386 (5), 1327-1333 (2006).
  45. Park, S., Cho, H., Kim, J., Han, K. -H. Lateral degassing method for disposable film-chip microfluidic devices. Membranes. 11 (5), 316(2021).
  46. Pereiro, I., Fomitcheva Khartchenko, A., Petrini, L., Kaigala, G. V. Nip the bubble in the bud: A guide to avoid gas nucleation in microfluidics. Lab Chip. 19 (14), 2296-2314 (2019).
  47. Gell, C., et al. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods in Cell Biol. 95, 221-245 (2010).
  48. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: Information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Mol Biol Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
  49. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  50. Bartlett, N. W., Wood, R. J. Comparative analysis of fabrication methods for achieving rounded microchannels in PDMS. J Micromech Microeng. 26 (11), 115013(2016).
  51. Yang, C. P. H., Horwitz, S. B. Taxol®: The first microtubule stabilizing agent. Int J Mol Sci. 18 (8), 1733(2017).
  52. Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. J Cell Biol. 120 (4), 923-934 (1993).
  53. VanBuren, V., Cassimeris, L., Odde, D. J. Mechanochemical model of microtubule structure and self-assembly kinetics. Biophys J. 89 (5), 2911-2926 (2005).
  54. Dye, R. B., Fink, S. P., Williams, R. C. Taxol-induced flexibility of microtubules and its reversal by MAP-2 and Tau. J Biol Chem. 268 (10), 6847-6850 (1993).
  55. Drechsel, D. N., Kirschnert, M. W. The minimum GTP cap required to stabilize microtubules. Curr Biol. 4 (12), 1053-1061 (1994).
  56. Wisanpitayakorn, P., Mickolajczyk, K. J., Hancock, W. O., Vidali, L., Tüzel, E. Measurement of the persistence length of cytoskeletal filaments using curvature distributions. Biophys J. 121 (10), 1813-1822 (2022).
  57. Mickey, B., Howard, J. Rigidity of microtubules is increased by stabilizing agents. J Cell Biol. 130 (4), 909-917 (1995).
  58. Brangwynne, C. P., et al. Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking. Biophys J. 93 (1), 346-359 (2007).
  59. Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations. J Biol Chem. 269 (18), 13353-13360 (1994).
  60. Felgner, H., Frank, R., Schliwa, M. Flexural rigidity of microtubules measured with the use of optical tweezers. J Cell Sci. 109 (Pt 2), 509-516 (1996).
  61. Felgner, H., et al. Domains of neuronal microtubule-associated proteins and flexural rigidity of microtubules. J Cell Biol. 138 (5), 1067-1075 (1997).
  62. Nishida, K., et al. Effects of three microtubule-associated proteins (MAP2, MAP4, and Tau) on microtubules' physical properties and neurite morphology. Sci Rep. 13, 8870(2023).
  63. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).
  64. Brouhard, G. J., Rice, L. M. Microtubule dynamics: An interplay of biochemistry and mechanics. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (7), 451-463 (2018).
  65. Lawrence, E. J., Chatterjee, S., Zanic, M. More is different: Reconstituting complexity in microtubule regulation. J Biol Chem. 299 (12), 105398(2023).
  66. Howard, J., Hyman, A. A. Dynamics and mechanics of the microtubule plus end. Nature. 422 (6933), 753-758 (2003).
  67. Mehidi, A., Aumeier, C. Regulation of the microtubule network; the shaft matters. Curr Opin Syst Biol. 34, 100457(2023).
  68. Verhey, K. J., Ohi, R. Causes, costs and consequences of kinesin motors communicating through the microtubule lattice. J Cell Sci. 136 (5), jcs260735(2023).
  69. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (1), 38-54 (2019).
  70. Théry, M., Blanchoin, L. Microtubule self-repair. Curr Opin Cell Biol. 68, 144-154 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Urz dzenie mikrofluidycznemechanika mikrotubulmikrofluidyka PDMStest wysokoprzepustowyczyszczenie plazmowenanoszenie fotorezystumodelowanie obliczeniowesystem kontroli przep ywuznakowanie fluorescencyjne
Opracowanie opartego na mikrofluidyce podejścia do badania mechaniki polimerów mikrotubul
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.