Minimalnie inwazyjny model iniekcji Cisterna Magna do badań przerzutów opon mózgowo-rdzeniowych u myszy

Największym wyzwaniem dla pacjentów z zaawansowanymi nowotworami pozostaje choroba przerzutowa. Przerzuty opon mózgowo-rdzeniowych (LM) odnoszą się do rozprzestrzeniania się komórek rakowych do błony pia mater, pajęczynówki i przestrzeni podpajęczynówkowej. LM z guzów litych staje się coraz bardziej powszechne w raku płuc (9%-25%), raku piersi (5%-20%) i czerniaku (6%-18%)^1,2, głównie ze względu na dłuższe przeżycie i ulepszone techniki diagnostyczne. Komórki rakowe mogą atakować przestrzeń oponowo-rdzeniową na wiele sposobów, w tym 1) bezpośrednią inwazję przez struktury obwodowe, takie jak opona twarda, kości i nerwy; 2) krwiotwórcze rozprzestrzenianie się przez układ żylny; oraz 3) wejście przez krążenie tętnicze, gdzie komórki rakowe prześlizgują się przez naczynia z okienkami do splotu naczyniówkowego, a następnie do komór wypełnionych płynem mózgowo-rdzeniowym ^3,4,5. Komórki nowotworowe wchodzące do przestrzeni oponowo-rdzeniowej napotykają wiele wyzwań, w tym pozbawienie czynników wzrostu, ograniczone produkty pośrednie metabolizmu i stany^{niedotlenienia 6}. Jednak ze względu na brak odpowiednich narzędzi i technik, sposób, w jaki komórki nowotworowe poruszają się po tych szlakach i pokonują niegościnne warunki, aby skolonizować przestrzeń opon mózgowo-rdzeniowych, jest słabo poznany. Pomimo postępów w terapiach multimodalnych, w tym radioterapii, leczeniu ogólnoustrojowym i terapii iniekcyjnej dooponowej, rokowanie dla pacjentów z LM pozostaje złe, a przeżycie zwykle wynosi od 2 do 4 miesięcy 3,7,8,9. W związku z tym istnieje pilna potrzeba głębszego zrozumienia biologii przerzutów opon mózgowo-rdzeniowych w celu ulepszenia obecnych metod leczenia i opracowania nowatorskich, celowanych terapii. Osiągnięcie tego celu wymaga opracowania modeli in vivo, które podsumowują złożone cechy LM.

W przeciwieństwie do przerzutów w narządach takich jak wątroba, kości i mózg, LM zwykle rozwija się wiele lat po rozpoznaniu guza pierwotnego 10,11,12. Podobnie w modelach mysich ze spontanicznymi przerzutami LM jest rzadki ze względu na niską częstość występowania i fakt, że myszy zazwyczaj ulegają przerzutom w innych miejscach. Eksperymentalne mysie modele LM można tworzyć różnymi metodami, w tym śródsercową, tętnicą szyjną lub, alternatywnie, bezpośrednim wstrzyknięciem do cisterna magna lub komór mózgowych. Chociaż dosercowe wstrzykiwanie komórek rakowych jest szeroko stosowane⁹, często powoduje znaczne obciążenie guzem zewnątrzczaszkowym, powodując śmiertelność niezwiązaną z LM. Alternatywne podejścia, takie jak wstrzykiwanie komórek nowotworowych przez tętnicę szyjną^13,14, wymagają rozległych specjalistycznych zasobów i skutkują dużymi nacięciami chirurgicznymi, które są traumatyczne. Co więcej, metoda ta prowadzi przede wszystkim do przerzutów w obrębie samych tkanek mózgowych, a nie opon mózgowo-rdzeniowych, i jest czasochłonna i nieefektywna w tworzeniu modeli LM¹⁵. Iniekcja do cisterna magna umożliwia bezpośrednie dostarczenie komórek nowotworowych do przestrzeni oponowo-rdzeniowej. W kilku badaniach zastosowano to podejście do zbadania mechanizmów LM i oceny nowych metod leczenia ^6,16,17.

W tym manuskrypcie przedstawiamy wygodny protokół wstrzyknięcia przezskórnego polegający na bezpośrednim przezskórnym nakłuciu w celu szybkiego i stabilnego wygenerowania większej liczby myszy z LM. Metoda ta omija barierę mózg-krew, a tym samym umożliwia skuteczny ksenoprzeszczep komórek nowotworowych w przestrzeni opon mózgowo-rdzeniowych. Znacznie skraca również czas urazu chirurgicznego i zabiegu, jednocześnie niezawodnie indukując LM u myszy. Potwierdziliśmy występowanie LM przy minimalnym naciekaniu do miąższu mózgu, co zostało zweryfikowane za pomocą mikroskopii dwufotonowej i analizy histologicznej. W związku z tym uzyskany model wiernie odwzorowuje złożone mikrośrodowisko LM, dostarczając cennego narzędzia do badania mechanizmów komórkowych i patologicznych związanych z chorobą oraz oceny potencjalnych terapii.

Wszystkie procedury na zwierzętach w tym manuskrypcie zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komisję ds. Oceny Dobrostanu i Etyki Zwierząt Laboratoryjnych ZJU (ZJU20230155). Myszy C57BL/6J i NSG uzyskano i trzymano w warunkach wolnych od specyficznych patogenów w Centrum Zwierząt Laboratoryjnych ZJU. Protokół ten wykorzystuje mysią linię komórkową raka płuc, raka płuc Lewisa (LLC1) i linię komórkową ludzkiego raka płuc, A549, obie oznaczone GFP i lucyferazą świetlika. Obie linie komórkowe zostały dzięki uprzejmości dr Xiang H. F. Zhang (Baylor College of Medicine, USA)¹⁸. Tutaj jako przykładu używamy ogniw LLC1. Procedura wstrzykiwania komórek A549 jest prawie identyczna, z wyjątkiem tego, że myszom NSG wstrzyknięto 6 x 10⁴ komórki A549.

1. Przygotowanie komórek rakowych do wstrzyknięcia

1. Hodowla 1,0 x 10⁶ komórek LLC1 w DMEM uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 0,1 mg / ml penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO₂ . Gdy komórki osiągną zbieżność 70%-90%, trypsynizuj je przez 1 minutę, używając 2 ml 0,25% roztworu trypsyny/EDTA. Odwirować komórki przy 300 x g przez 3 minuty, umyć je 2x lodowatym PBS i ponownie zawiesić w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
2. Oceń stężenie żywotnych komórek za pomocą roztworu błękitu trypanowego i hemocytometru¹⁹. Upewnij się, że żywotność komórek jest większa niż 90%, przy czym większość komórek jest pojedyncza. Dostosuj stężenie komórek do 2 x 10⁶ komórek/ml w lodowatym PBS.
3. Porcjować 50 μl zawiesiny komórek do oddzielnych probówek do mikrowirówek, aby uniknąć wielokrotnego pipetowania.
4. Zawiesiny komórkowe należy przechowywać na lodzie do czasu, aż będą gotowe do wstrzyknięcia. Wstrzyknij 10 μl komórek LLC1 znakowanych GFP-lucyferazą na mysz w tym protokole, co odpowiada 2 x 10⁴ komórkom na mysz.
   UWAGA: Dostosuj liczbę komórek w razie potrzeby w oparciu o kinetykę przerzutów wstrzykniętych linii komórkowych.

2. Przygotowanie myszy

UWAGA: W tym badaniu wykorzystano samce myszy C57BL / 6J w wieku 6-8 tygodni.

1. Autoklaw wszystkie narzędzia chirurgiczne i rękawice wypełnione obłożeniami chirurgicznymi. Zdezynfekuj blat stołu i sprzęt niechirurgiczny za pomocą 75% etanolu, a następnie przykryj miejsce pracy wodoodpornymi zasłonami.
2. Przygotuj czystą klatkę w pomieszczeniach dla zwierząt i podkładkę rozgrzewającą do rekonwalescencji po zabiegu.
3. Znieczulić mysz poprzez podskórne wstrzyknięcie ketaminy (80-100 mg/kg) i ksylazyny (8-10 mg/kg). Przed kontynuowaniem sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą testu szczypania. Nałóż sterylną maść okulistyczną, aby chronić oczy przed uszkodzeniem rogówki po znieczuleniu myszy.
4. Ogol sierść z tylnej części potylicznej za pomocą maszynki do strzyżenia, a następnie nałóż kremy do depilacji, aby całkowicie usunąć sierść w tym samym obszarze.
5. Ustaw mysz na brzuchu z szyją umieszczoną nad probówką wirówkową o pojemności 15 ml. Zabezpiecz głowę i dolną część pleców taśmą i palcem wskazującym zbadaj palcem wskazującym przestrzeń między potylicą a kręgiem C1 (ryc. 1).
6. Zdezynfekuj tylną część potyliczną przez trzy rundy przecierania sterylnymi wacikami nasączonymi etanolem 75%, a następnie peelingiem chirurgicznym betadyny. Przykryj niesterylne części zwierzęcia sterylnym obłożeniem.

3. Iniekcja Cisterna magna

UWAGA: Na kolejnych etapach wymagane są techniki aseptyki, w tym stosowanie środków ochrony osobistej i sterylnych rękawic.

1. Delikatnie odpipetować zawiesinę komórkową i odessać 10 μl do wstrzykiwań za pomocą strzykawki insulinowej 31 g o średnicy 8 mm.
2. Zbadaj palpacyjnie obszar między potylicą a C1 myszy palcem wskazującym, aby zlokalizować dokładne miejsce nakłucia na dolnym środkowym brzegu tylnej części czaszki potylicznej. W razie potrzeby oznacz tę stronę.
3. Wbić igłę pod kątem 45°-50° do cisterna magna przez zidentyfikowane miejsce nakłucia, przesuwając się na głębokość 4 mm. Wyraźne odczucie przełomu wskazuje, że igła pomyślnie weszła w cisterna magna.
   1. Jeśli miejsce nakłucia jest trudne do zlokalizowania, wykonaj małe nacięcie 3-5 mm na poziomie ucha, aby odsłonić tylną linię środkową. Jeśli wymagane jest nacięcie chirurgiczne, meloksykam (5 mg/kg mc./dobę) i buprenorfinę (0,1 mg/kg mc.) należy podać podskórnie na 1 godzinę przed zabiegiem.
4. Powoli wstrzykiwać zawiesinę komórek, przesuwając tłok strzykawki, trzymając strzykawkę nieruchomo z ręką umieszczoną na stole.
5. Po zaszczepieniu należy przytrzymać strzykawkę na miejscu przez dodatkowe 10 sekund, aby umożliwić wyrównanie ciśnienia wewnątrzczaszkowego. Następnie należy wyjąć igłę i dociskać miejsce nakłucia sterylnym wacikiem przez 1-2 minuty.

4. Opieka po iniekcji

1. Przenieś zwierzęta do czystych klatek na poduszce grzewczej i uważnie je monitoruj, aż w pełni wyzdrowieją.
   1. W przypadku wykonania nacięcia należy zamknąć ranę za pomocą kleju tkankowego i klipsów. Podawaj dodatkowe leki przeciwbólowe przez 2-3 dni po operacji, aby kontrolować ból i wspomóc powrót do zdrowia.
2. Należy ściśle obserwować myszy przez 7 dni po zabiegu i codziennie sprawdzać aktywność fizyczną zwierząt oraz wygląd wokół miejsca wstrzyknięcia.

5. Ocena wzrostu guza opon mózgowo-rdzeniowych

1. Obrazowanie bioluminescencyjne
   1. Znieczulić mysz i podać D-lucyferynę (150 μg/g) w żyle zaoczodołowej. Umieść myszy w komorze obrazowania, umieszczając je w wyznaczonym stożku nosowym na kolektorze anestezjologicznym. Użyj przegród świetlnych między zwierzętami, aby zminimalizować zakłócenia sygnału.
   2. Zobrazuj zwierzęta natychmiast za pomocą systemu IVIS z czasem naświetlania od 0,5 s do 2 min⁶. Potwierdź udaną inokulację komórek nowotworowych w przestrzeni oponowo-rdzeniowej za pomocą dyspersyjnego sygnału bioluminescencyjnego przez głowę i rdzeń kręgowy (ryc. 2A).
   3. Monitoruj postęp LM za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego co 4 dni. Dostosuj interwały obrazowania w oparciu o kinetykę wzrostu guza.
2. Analiza histologiczna
   1. Znieczulenie myszy, gdy były znacznie mniej aktywne lub straciły 20% masy ciała i przecięło skórę i żebra, aby odsłonić klatkę piersiową. Ostrożnie włóż kaniulę z końcówką do lewej komory i wsuń kaniulę do aorty wstępującej. Powoli przeprowadź perfuzję zwierzęcia z 20 ml PBS przez kaniulę.
   2. Użyj nożyczek, aby usunąć głowę i wykonaj nacięcie skóry głowy w linii środkowej, aby odsłonić czaszkę. Wyciąć otaczające tkanki miękkie. Przetnij wzdłuż grzbietu oczodołu, a następnie włóż nożyczki do otworu wielkiego i ostrożnie przesuwaj się wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki z naciskiem w górę, aby uniknąć uszkodzenia tkanki.
   3. Usuń kości czaszki, a następnie delikatnie usuń mózg. Utrwalić mózg w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C przez 24 godziny, a następnie zrównoważyć go z 15% roztworem sacharozy PBS przez 24 godziny, a następnie 30% roztworem sacharozy PBS przez kolejne 24 godziny w temperaturze 4 °C.
   4. Umieść chusteczkę w kriofordzie wypełnionym związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), a następnie przechowuj ją na suchym lodzie przez 30 minut²⁰.
   5. Pokrój mózg osadzony w OCT na sekcje o grubości 10 μm za pomocą kriostatu. Przechowuj sekcje w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu dalszej aplikacji.
   6. Wykonaj barwienie hematoksyliny/eozyny (H&E) na szkiełkach mózgowych²¹. Obecność komórek nowotworowych na brzegu mózgu wskazuje, że przerzuty występują wyłącznie w przestrzeni oponowo-rdzeniowej (ryc. 3 i tabela 1).
3. Mikroskopia dwufotonowa
   1. Znieczulij myszy LM. Usuń skórę głowy pokrywającą grzbietową powierzchnię czaszki za pomocą kleszczy i nożyczek. Użyj ostrza skalpela, aby usunąć cienką okostną z powierzchni czaszki.
   2. Rozcieńczyć czaszkę wiertłem ściernym, aż naczynia krwionośne będą widoczne przez przerzedzoną czaszkę. Ustabilizuj obszar obserwacji głowy myszy za pomocą trójkątnej głowicy zabezpieczonej klejem tkankowym^22,23.
   3. Podaj 0,025 ml 5% (w/v) dekstranu TRITC do żyły podoczodołowej, aby oznaczyć naczynia krwionośne²².
   4. Wykonaj mikroskopię dwufotonową przez okienka obrazowania i zrekonstruuj przestrzeń opon mózgowo-rdzeniowych (ryc. 4). Wykryj kość za pomocą fluorescencji drugiej harmonicznej przy emisji 450 nm i wzbudzeniu 900 nm²⁴. Wizualizacja komórek nowotworowych i naczyń znakowanych dekstranem GFP poprzez zbieranie sygnałów fluorescencyjnych przy emisji 507 nm i 572 nm ze wzbudzeniem odpowiednio 900 nm i 1000 nm.
4. Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny
   1. Usuń mózg myszy i umieść go pod mikroskopem stereoskopowym. Wizualizacja komórek oznaczonych GFP przy użyciu zestawu filtrów specyficznych dla GFP (Rysunek 5).

Rysunek 1 ilustruje umiejscowienie myszy do wstrzyknięcia i miejsce nakłucia z perspektywy bocznej i czołowej. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne obrazy bioluminescencyjne in vivo zwierząt badanych pod kątem generowania LM za pomocą różnych podejść. Komórki LLC1 znakowane lucyferazą GFP wstrzyknięto zwierzętom różnymi drogami, a następnie poddano obrazowaniu bioluminescencyjnemu. Jak pokazano na rycinie 2A, 10 dni po wstrzyknięciu magna do cysterny, sygnał bioluminescencyjny był obecny w mózgu myszy i rozprowadzany wzdłuż rdzenia kręgowego, co wskazuje na pomyślne wszczepienie komórek nowotworowych w przestrzeni oponowo-rdzeniowej. W przeciwieństwie do tego, wstrzyknięcia komórek nowotworowych do tętnicy szyjnej głównie generowały przerzuty miąższu do mózgu bez znaczącego udziału w oponach mózgowych 21 dni po wstrzyknięciu (Figura 2B). W przypadku metody iniekcji dosercowej obrazowanie bioluminescencyjne z pozycji leżącej pokazuje, że większość przerzutów rośnie w narządach pozaczaszkowych (po lewej), a obrazy z pozycji leżącej potwierdziły, że u żadnej z trzech myszy nie rozwinął się LM (po prawej; Rysunek 2C). Ten sam rozkład komórek nowotworowych zaobserwowano 10 dni po wstrzyknięciu cysterny magna 6 x 104 (10 μL) komórek A549 znakowanych GFP-lucyferazy u myszy NSG (Figura 2D), co sugeruje, że takie podejście silnie generuje LM w różnych szczepach myszy o różnych liniach komórkowych.

Rycina 3 przedstawia reprezentatywne obrazy histologicznego i immunofluorescencyjnego barwienia tkanek mózgu po 14 dniach od wstrzyknięcia komórek nowotworowych przez cisterna magna. Barwienie hematoksyliną-eozyną (H&E) pokazuje większość obszarów nowotworowych zlokalizowanych w przestrzeni opon mózgowo-rdzeniowych (ryc. 3A). Rycina 3B pokazuje, że większość komórek nowotworowych znakowanych GFP była skupiona w oponach mózgowych i komorach, podczas gdy komórki nowotworowe w okolicy miąższu to głównie pojedyncze komórki. Rysunek 4 przedstawia reprezentatywne dwufotonowe obrazy przestrzeni oponowo-rdzeniowej myszy z LM. Kość czaszki (niebieska) została wykryta poprzez zebranie fluorescencji drugiej harmonicznej przy emisji 450 nm ze wzbudzeniem 900 nm24. Układ naczyniowy (czerwony) był oznaczony TRITC-dekstranem (70 kDa). Komórki nowotworowe znakowane GFP (kolor zielony) znaleziono między kością czaszki (kolor niebieski) a miąższem mózgu, szczególnie w obszarze opon mózgowo-rdzeniowych. Rycina 5 przedstawia obecność komórek nowotworowych znakowanych GFP na powierzchni mózgu, uwidocznionych za pomocą stereomikroskopowego mikroskopu fluorescencyjnego. W tabeli 1 przedstawiono porównanie między tymi trzema metodami.

Rycina 1: Przygotowanie zwierzęcia i miejsce wkłucia do wstrzyknięcia dożylnego cisterna magna. (A) Mysz umieszcza się w pozycji leżącej, z szyją owiniętą na probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Głowa i dolna część pleców są zabezpieczone taśmą. Igłę wprowadza się pod kątem 45°-50° do cisterna magna na środkowym dolnym brzegu. (B) Igła jest wprowadzana na środkowym dolnym brzegu tylnej części czaszki potylicznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Reprezentatywne obrazy bioluminescencyjne in vivo myszy otrzymujących różne metody iniekcji. orazSygnał bioluminescencji in vivo całego zwierzęcia po wstrzyknięciu komórek LLC1 do cisterna magna. (B) Obraz bioluminescencji in vivo myszy po wstrzyknięciu komórek LLC1 do tętnicy szyjnej. (C) Sygnał bioluminescencyjny in vivo myszy po wstrzyknięciu dosercowym komórek LLC1. Lewa strona pokazuje widok na leżąco, a prawa strona pokazuje widok na brzuchu. (D) Obraz bioluminescencji myszy NSG po wstrzyknięciu komórek A549 przez cisterna magna.a Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Reprezentatywne obrazy barwienia histologicznego i immunofluorescencyjnego. (A) Reprezentatywne barwienie H&E pokazuje komórki LLC1 osadzone głównie na powierzchni opon mózgowych i komór. Pasek skali = 25 μm. (B) Immunofluorescencyjne obrazy barwienia mózgu z guzem LLC1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne dwufotonowe obrazy myszy z LM. Komórki nowotworowe oznaczone GFP (kolor zielony) znajdują się wyłącznie między czaszką (kolor niebieski) a miąższem mózgu (kolor czerwony). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Reprezentatywne obrazy stereomikroskopu fluorescencyjnego. (A) Globalne pole widzenia mózgu myszy pod mikroskopem. (B) Na powierzchni mózgu przedstawiono komórki nowotworowe znakowane GFP, które emitują zieloną fluorescencję. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Porównanie trzech różnych metod iniekcji pod względem czasu trwania operacji, częstości występowania przerzutów do opon mózgowo-rdzeniowych, guzów pozaczaszkowych oraz częstości występowania dużych guzów miąższowych mózgu.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.