Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo) Zastosowanie znakowania zbliżeniowego opartego na TurboID u Drosophila melanogaster

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68193

⸱

13 czerwca 2025

 , 
1Soonchunhyang Institute of Medi-bio-Science, Soonchunhyang University, 2Department of Integrated Biomedical Science, Soonchunhyang University

W tym artykule

Podsumowanie

W tym badaniu ustalamy szczegółowy protokół znakowania zbliżeniowego (PL) opartego na TurboID w jajniku D. melanogaster, obejmujący etapy od suplementacji biotyną i rozwarstwienia jajników do walidacji ekspresji transgenu i wzbogacenia biotynylowanych peptydów do spektrometrii mas.

Streszczenie

Etykietowanie zbliżeniowe (PL) to skuteczna metoda mapowania sieci interakcji białko-białko. Postępy w znakowaniu enzymów, zwłaszcza TurboID, poszerzyły jego zastosowanie w systemach biologicznych. TurboID jest szczególnie korzystny do zastosowań in vivo ze względu na swoją wytrzymałość, nietoksyczność i łatwość użycia. Enzym ten rozwiązłe biotynyluje pobliskie biomolekuły, w tym białka i kwasy nukleinowe, w zakresie około 10 nm w obecności biotyny. Zastosowaliśmy tę metodę do zbadania interakcji cukinii (Zuc), kluczowego czynnika w biogenezie RNA oddziałującego z piwi (piRNA) na zewnętrznej błonie mitochondrialnej (OMM) w komórkach linii rozrodczej jajnika Drosophila melanogaster. Poprzez ekspresję Zuc-TurboID w komórkach rozrodczych i suplementację biotyną, indukowaliśmy biotynylację białek proksymalnych Zuc. Analiza spektrometrii mas po wzbogaceniu biotynylowanych peptydów pozwoliła zidentyfikować białka znajdujące się w bliskim sąsiedztwie Zuc, w tym dobrze znane interakcje w biogenezie piRNA. Co ciekawe, odkryliśmy nowe interakcje Zuc zaangażowane w fałdowanie białek, organizację błony i transport pęcherzyków.

Wprowadzenie

Konwencjonalne metody mapowania interakcji białko-białko (PPI), takie jak oczyszczanie powinowactwa i spektrometria mas (AP-MS) oraz systemy hybrydowe drożdży-2 (Y2H), często nie są w stanie uchwycić białek o niskiej obfitości, przejściowo eksprymowanych lub związanych z błoną. To ograniczenie wynika z ich niezdolności do odtworzenia natywnych warunków fizjologicznych żywej komórki1,2,3. Aby sprostać tym wyzwaniom, PL stała się potężną techniką mapowania proteomu w wysokiej rozdzielczości na poziomie suborganelli in vivo. PL wykorzystuje fuzję promiskuitycznego enzymu z białkiem przynęty, umożliwiając enzymowi katalizowanie powstawania krótkożyciowych reaktywnych cząsteczek1. Te reaktywne cząsteczki, takie jak biotyna, kowalencyjnie znakują białka w promieniu kilku nanometrów od białka fuzyjnego4. Następnie biotynylowane białka są izolowane i analizowane za pomocą spektrometrii mas, aby ułatwić identyfikację białek na dużą skalę5,6.

W ciągu ostatnich lat rozwinięto różne enzymy rozwiązłe, które rozwijają techniki PL. Dwa szeroko stosowane enzymy to zmutowana ligaza biotyny R118G pochodząca z Escherichia coli (BioID) i enzym peroksydazy askorbinianowej 2 pochodzący z grochu (APEX2). BioID przekształca biotynę i ATP w biotynylo-5'-adenylan (bioAMP)1. Ta reaktywna cząsteczka kowalencyjnie wiąże się z resztami lizyny pobliskich białek w promieniu ± 10 nm. Kluczową zaletą PL opartej na BioID jest zastosowanie biotyny. Jest to naturalnie występująca i nietoksyczna biomolekuła w organizmach żywych, co pozwala na bezpieczne etykietowanie in vivo6. BioID ma jednak ograniczenia, w tym powolną kinetykę znakowania (18-24 h) i wymóg wysokiej temperatury (37 °C) dla optymalnej aktywności katalitycznej4. Cechy te mogą utrudniać jego zastosowanie w badaniu dynamicznych procesów biologicznych. Tymczasem APEX2 katalizuje powstawanie rodników biotynowo-fenoksylowych w obecności biotyny-fenolu i nadtlenku wodoru (H2O2)<sup class="xref">7. Rodniki te reagują głównie z łańcuchem bocznym aminokwasów bogatych w elektrony, takich jak tyrozyna, a także mogą wiązać cysteinę, histydynę i tryptofan8. Zdolność enzymu peroksydazy do szybkiego znakowania (< 1 min) jest odpowiednia do wychwytywania dynamicznych i przejściowych IPP9. Ponadto ma szerszy zakres wykrywania (do 20 nm) niż ligaza biotyny. Jednak PL na bazie APEX2 ma swoje wady, w tym wymóg toksycznego środka utleniającego,H2O2, oraz niską przepuszczalność biotyny-fenolu, co ogranicza możliwość zastosowania in vivo10.

W 2018 roku Branon i in. opracowali nową ligazę biotyny o nazwie TurboID, zmutowaną wersję BirA (ligazy biotyny występującej w E. coli) o sile 35 kD)4. Enzym ten zawiera mutację w pozycji R118 (R118S) wraz z 15 innymi mutacjami w stosunku do BirA. Wykazuje dwukrotnie wyższą aktywność katalityczną niż BioID. Biotynylacja indukowana przez TurboID w ciągu 10 minut generuje dane proteomiczne o wielkości i swoistości porównywalnej z 18 godzinami znakowania przez BioID. Ponadto wykazuje doskonałą aktywność etykietowania w temperaturze 30 °C4. Dlatego TurboID jest bardziej odpowiedni do stosowania w organizmach takich jak Drosophila lub Caenorhabditis elegans, które są zwykle hodowane w temperaturze odpowiednio 25 °C i 20 °C.

W tym badaniu zamierzamy wykorzystać PL oparte na TurboID do badania interaktomu w jajniku Drosophila. Opisane tutaj protokoły są stosowane do mapowania interaktomu Zuc w komórkach linii rozrodczej. Zuc to endonukleaza zlokalizowana na zewnętrznej błonie mitochondrialnej (OMM), która pośredniczy w biogenezie piRNA, małych niekodujących RNA krytycznych dla utrzymania integralności genomu11,12,13. Porównując biotynylowane białka zidentyfikowane na podstawie analizy Zuc-TurboID z białkami z dwóch dodatkowych kontroli, NES-TurboID i Tom20-TurboID, zdefiniowaliśmy odrębnych kandydatów na oddziałujące z Zuc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. PL w dorosłej muchy

  1. Przygotowanie pokarmu biotynowego
    1. Przygotować 1 M roztwór NaOH, rozcieńczając 10 M NaOH w wodzie potrójnie destylowanej (TDW). Przechowuj go w temperaturze pokojowej (RT). Przygotować 1 M roztwór podstawowy biotyny, rozpuszczając 0,0049 g biotyny w proszku w 20 ml TDW. Dodać 150-200 μL 1 M NaOH w celu zwiększenia rozpuszczalności biotyny. Wirować, aby homogenizować roztwór. Przechowywać roztwór podstawowy biotyny w temperaturze 4 °C.
    2. Wyjmij pokarm na muchy z fiolki i podgrzewaj go w kuchence mikrofalowej przez 2 minuty, aż się rozpuści.
      UWAGA: Standardowy pokarm dla much zawiera 5% mąki kukurydzianej, 3% drożdży, 10% sacharozy, 1% agaru, 0,3% kwasu propionowego i 0,3% 4-hydroksybenzoesanu metylu13.
    3. Do stopionej żywności dodać bulion biotyny o końcowym stężeniu 100 μM, a następnie wymieszać przez wirowanie. Natychmiast dozować 4,5 ml pokarmu uzupełnionego biotyną do każdej pustej fiolki za pomocą pipety serologicznej. Pozostaw pokarm do ostygnięcia przez 30 minut, umieść bawełniany wieczko na fiolce, a następnie przechowuj pokarm z biotyną w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Biotynę należy dodać, zanim żywność ostygnie i stwardnieje.
  2. Karmienie biotyną
    1. Skrzyżowanie transgenicznych muszek, które wykazują nadekspresję białka fuzyjnego TurboID, z muchami GAL4 specyficznymi dla tkanek lub komórek14,15,16. Jako kontrola negatywna, muchy krzyżowe typu dzikiego z muchami kierującymi GAL4, aby zapewnić brak indukcji biotynylacji.
    2. Około 10 dni po skrzyżowaniu zaczną wykluwać się potomstwo. Rozpuść suche drożdże w proszku w TDW i wymieszaj na gładką pastę. Nałóż łyżkę laboratoryjną pasty drożdżowej na ściankę nowej fiolki. Delikatnie postukaj w starą fiolkę zawierającą nowo wyklute muchy, aby zebrać muchy na dnie. Odwrócić starą fiolkę na nową fiolkę zawierającą pastę drożdżową, upewniając się, że brzegi obu fiolek są wyrównane, aby zapobiec ucieczce much.
    3. Postukaj tymi fiolkami razem, aby przenieść muchy ze starej fiolki do dolnej części nowej fiolki. Po przeniesieniu much, bezpiecznie umieść bawełniane nakrętki z powrotem zarówno na nowej, jak i starej fiolce. Poczekaj 3 dni. Pasta drożdżowa może być przechowywana w temperaturze pokojowej przez kilka dni.
      UWAGA: Przenoszenie much musi być wykonane tak szybko, jak to możliwe, ponieważ muchy zostaną ogłuszone tylko tymczasowo.
    4. Przygotować 0,5% roztwór kwasu propionowego, rozcieńczając 250 μl kwasu propionowego w 50 ml TDW. Przechowuj go w RT.
    5. Trzeciego dnia przygotować 100 μM roztwór roboczy biotyny, rozcieńczając 1 M zapas biotyny w TDW, a następnie dodać 500 μL 0,5% kwasu propionowego. Wymieszaj roztwór roboczy biotyny z suchymi drożdżami w proszku i mieszaj, aż utworzy się pasta. Dodaj łyżkę laboratoryjną pasty biotynowo-drożdżowej do ścianki fiolki z biotyną. Pasta biotynowo-drożdżowa może być przechowywana w RT przez kilka dni.
    6. Podziel muchy na dwie grupy. Trzymaj jedną grupę w normalnej fiolce z żywnością jako kontrolę, a drugą grupę przenieś do fiolki z biotyną (dodano pastę z biotyny i drożdży), aby rozpocząć biotynylację. Po 16 godzinach biotynylacji przenieść muchy do nowej normalnej fiolki z pokarmem.
      UWAGA: Wcześniej przeprowadziliśmy test karmienia biotyną przez 4 godziny, 8 godzin i 16 godzin. Sygnał biotynylacji był najsilniejszy po 16 godzinach karmienia, dlatego wybraliśmy ten punkt czasowy do kolejnych eksperymentów.
  3. Kolekcja jajników Drosophila
    1. Włóż muchy do podkładki na muchy CO2, zatrzymaj samice i odrzuć samce. Po tym, jak muchy zostaną odpowiednio znieczulone (już się nie poruszają), odpipetuj 1 ml zimnego podłoża owadziego Grace na naczynie separacyjne.
    2. Weź muchę do naczynia preparacyjnego za pomocą kleszczy z cienką końcówką i pozwól jej zanurzyć się w podłożu. Trzymaj klatkę piersiową muchy kleszczami, uważając, aby nie zmiażdżyć ciała. Następnie użyj kolejnych kleszczy, aby delikatnie usunąć czubek tylnej części brzucha (gdzie znajduje się część genitaliów).
    3. Użyj kleszczy, aby powoli wycisnąć jajniki (zaczynając od górnej części brzucha w dół do dołu).
    4. Po ich wyjęciu usuń siatki mięśniowe i inne tkanki otaczające jajniki. Uważaj, aby nie uszkodzić jajników.
    5. Ostrożnie przenieś czyste jajniki do probówki o pojemności 1,7 ml za pomocą kleszczy; trzymaj probówkę na lodzie. Powtórz kroki 1.3.2 - 1.3.4 dla następnych much.
    6. Wirować probówkę przy 3 500 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C, a następnie użyć końcówek do mikropipet, aby usunąć pozostałe medium. Uważaj, aby nie dotykać jajników.
    7. Zatrzaskowo zamrozić probówkę ciekłym azotem, a następnie przechowywać jajniki w temperaturze -80 °C. Próbki jajników są stabilne przez 1 rok.

2. Ekspresja transgenu i wykrywanie biotynylowanych białek za pomocą testu Western blot

UWAGA: Do testu western blot zbierz około pięciu par jajników na próbkę.

  1. Liza tkanek
    1. Rozmrozić zamrożoną tkankę jajnika. Dodać 50 μl buforu do lizy RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 0,5% deoksycholanu sodu, 1% Triton X-100), uzupełniony koktajlem 1x inhibitora proteazy (PI) i 1 mM fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF). Przechowywać bufor do lizy RIPA (bez 1x koktajlu PI i 1 mM PMSF) w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Koktajl PI i PMSF należy dodawać tylko tuż przed eksperymentem.
    2. Rozbić jajniki za pomocą ręcznego homogenizatora połączonego z plastikowym tłuczkiem (1 min na probówkę). Aby zapewnić całkowitą lizę, a następnie homogenizację, konieczny jest proces lizy tkanek na lodzie przez 10 minut.
    3. Wirować przy 13 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu oddzielenia lizatu białkowego od zanieczyszczeń.
    4. Odpipetować czysty lizat białkowy do nowej probówki o pojemności 1,7 ml (unikać pobierania warstwy lipidowej na wierzchu), a następnie przechowywać lizat w temperaturze -20 °C do dalszego użycia.
  2. Pomiar stężenia białka za pomocą testu kwasu bicunchoninowego (BCA)
    1. Przygotować odczynnik roboczy (WR) kwasu bicunchoninowego (BCA), mieszając odczynnik A i odczynnik B w stosunku 50:1. Zmieszać 1 μl lizatu lub rozcieńczonego wzorca BSA z 200 μl WR na 96-dołkowej płytce (w dwóch częściach), a następnie inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
      1. Oblicz, ile WR jest potrzebne, korzystając z tego wzoru:
        (# wzorce + # próbki) × (# powtórzenia) × (objętość WR na próbkę)
        Aby sporządzić zestaw wzorców białkowych, należy przygotować kilka rozcieńczeń albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 2 mg/ml w buforze do lizy RIPA (bez koktajlu PI i PMSF) o końcowych stężeniach 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500 i 2000 μg/ml.
    2. Zmierzyć absorbancję za pomocą czytnika mikropłytek o długości fali 495 nm. Wygeneruj krzywą wzorcową na podstawie wartości absorbancji BSA, a następnie określ stężenie białka.
  3. Test Western blot
    1. Elektroforeza żelowa
      1. Dodaj 30-50 μg lizatu białkowego do bufora ładującego 2x SDS. Dodać TDW (jeśli to konieczne), aby uzyskać końcowe stężenie białka 2 μg/μl i 1x końcowe stężenie SDS, a następnie gotować próbkę w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
      2. Przygotować bufor do biegania, mieszając 25 ml buforu 20x MOPS z 500 ml TDW, aby uzyskać 1x stężenie buforu bieżącego. Przechowuj go w RT.
      3. Przepłukać studzienki żelu Bis-Tris 1 ml buforu do biegania (3x), a następnie umieścić żel Bis-Tris w komorze elektroforetycznej. Napełnij przednią stronę komory nowym buforem do pracy, aż wszystkie studzienki zostaną zanurzone (± 250 ml). Napełnij tylną stronę komory zużytym buforem roboczym (wystarczy połowa objętości nowego bufora roboczego).
      4. Załaduj próbkę do żelu Bis-Tris i użyj 4 μl wstępnie wybarwionej drabinki białkowej jako markera. Wykonaj elektroforezę (200 V, 30 min). Wyjmij żel z kasety i spłucz TDW.
    2. Blotting membranowy
      1. Utworzyć bufor transferowy, dodając 20 ml buforu transferowego (25x zapas) i 50 ml metanolu do 430 ml TDW.
      2. Ułóż kanapkę składającą się z bibuły, bibuły filtracyjnej, żelu i membrany nitrocelulozowej w module blot. Przed ułożeniem nowej warstwy użyj wałka, aby usunąć bąbelki.
      3. Zainstaluj moduł blot w komorze transferowej, a następnie napełnij komorę 500 ml buforu transferowego. Przenoszenie białek przez 1 godzinę w stężeniu 175 mA.
        UWAGA: Bufor transferowy powinien być świeżo przygotowany przed eksperymentem.
    3. Blokowanie
      1. Dodaj 5 ml bulionu Tween20 do 45 ml TDW, aby uzyskać 10% roztwór podstawowy Tween20. Rozpuścić dwie tabletki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w 400 ml TDW. Usuń 4 ml roztworu, a następnie dodaj 4 ml 10% Tween20 (końcowe stężenie 0,1%), aby uzyskać 1x roztwór PBST. Przechowuj go w RT.
      2. Usunąć osuszoną membranę z komory transferowej, a następnie spłukać 1x PBST.
        UWAGA: Jeśli membrana musi być inkubowana z różnymi przeciwciałami, przed wykonaniem etapu blokowania należy ją przeciąć czystym ostrzem ze stali nierdzewnej zgodnie z oczekiwanymi rozmiarami białka.
      3. Aby sprawdzić ekspresję genów, użyj 2% BSA w 1x PBST dla etapu blokowania (1 godzina, RT). Przygotować 2% roztwór BSA, dodając 1 g BSA do 50 ml 1x PBST. W celu wykrycia biotynylowanych białek należy przeprowadzić blokowanie za pomocą 3% BSA w 1x PBST (przez noc, 4 °C). Rozpuść 1,5 g proszku BSA w 50 ml 1x PBST, aby uzyskać 3% roztwór BSA. Przechowywać roztwory blokujące w temperaturze 4 °C.
        UWAGA: Zastosowany BSA różni się od tego użytego w teście BCA. BSA do testu BCA jest częścią zestawu BCA.
    4. Inkubacja przeciwciał pierwotnych
      1. Rozcieńczyć 1 μl α-V5 w 10 ml 2% BSA (1: 10 000) i 10 μl genu porządkowego α-HSP90 w 2% BSA (1: 1 000). Dodać 2,7 μl koniugatu streptawidyny i peroksydazy chrzanowej (SA-HRP) do 9 ml 1x roztworu PBST, aby uzyskać 0,3 μg/ml roztworu Sa-HRP.
      2. Aby sprawdzić ekspresję genów, należy inkubować błonę z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C. W celu wykrycia biotynylowanego białka należy inkubować błonę przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Przechowywać przeciwciało pierwszorzędowe z powrotem w temperaturze 4 °C. Może być używany wielokrotnie.
      3. Umyj membranę 1x PBST przez 3x w RT przez 15 min każdy.
    5. Inkubacja przeciwciał wtórnych
      1. Przygotować roztwór przeciwciał drugorzędowych, dodając 2 μl koziej anty-króliczej lub anty-mysiej IgG (sprzężonej z peroksydazą chrzanową (HRP)) do 10 ml 2% BSA (1: 5,000).
        UWAGA: W przypadku SA-HRP przeciwciało drugorzędowe nie jest potrzebne. Przejdź bezpośrednio do kroku wizualizacji. Przeciwciała drugorzędowe powinny być świeżo rozcieńczone przed eksperymentem.
      2. Inkubować błonę w roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć błonę 1x PBST przez 3x w RT przez 15 minut każdy.
    6. Wykrywanie białek metodą wzmocnionej chemiluminescencji (ECL)
      1. Zmieszać 750 μl luminolu i 750 μl roztworu HRP (stosunek 1:1). Utrzymuj membranę wilgotną w buforze myjącym podczas przygotowywania mieszaniny.
        UWAGA: Ta mieszanina powinna być świeżo przygotowana przed eksperymentem. Ponieważ chemikalia są wrażliwe na światło, trzymaj je z dala od światła słonecznego lub innych intensywnych źródeł światła (krótkotrwała ekspozycja na oświetlenie laboratoryjne jest w porządku).
      2. Zanurz membranę w roztworze na 30 s, a następnie umieść ją między przezroczystymi arkuszami tworzywa sztucznego. Obserwuj osuszone prążki białkowe za pomocą narzędzia Chemidoc.

3. Walidacja ekspresji i lokalizacji transgenu za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego

UWAGA:Aby sprawdzić ekspresję i lokalizację genów, przeprowadź sekcję około pięciu par jajników na próbkę od 2-dniowych samic karmionych pastą drożdżową. Młode jajniki zawierają głównie wczesne stadia komór jajowych, które są idealne do barwienia immunofluorescencyjnego ze względu na obfitość komórek pielęgniarskich (komórek linii rozrodczej) i ich stosunkowo przepuszczalnych błon17. Późne stadia komór jajowych są sztywniejsze i trudniejsze do penetracji ze względu na tworzenie się kompleksu skorupki jaja, który rozpoczyna się na etapie 918. W teście biotynylacji białek należy wyciąć około pięciu par jajników na próbkę od 4-dniowych samic karmionych biotyną, jak opisano w kroku 1.2.

  1. Przygotowanie próbki
    1. Przytrzymaj tylną część wypreparowanego jajnika na miejscu za pomocą kleszczy. Użyj kolejnych kleszczy, aby delikatnie rozdzielić jajnik na poszczególne komory jajowe. Pracuj ostrożnie, aby uniknąć pęknięcia komór na jajka. Protokół izolacji komory jajowej został szczegółowo opisany w19. Ostrożnie pipetować komory na jajka do probówki o pojemności 1,7 ml, a następnie przemyć 1 ml 1x PBS (RT). Przed pipetowaniem należy przyciąć krawędź końcówek pipet, aby zapobiec utknięciu komór na jajka w końcówkach.
      UWAGA: Komór na jajka należy używać tylko na etapie ≤ 9 (przezroczyste). Wyrzuć dojrzałe oocyty i komory jajowe w późnym stadium ≥ 10. Pipetowanie spowoduje, że komory jaj będą unosić się w roztworze. Dlatego pozwól komorom na jajka osiąść na dnie (przez 5 minut) przed przejściem do kolejnych kroków.
  2. Utrwalenie
    1. Rozcieńczyć 3,125 ml 16% bulionu formaldehydu (FA) w 6,875 ml 1x PBS, aby uzyskać 5% roztwór FA. Przechowuj go w RT.
      UWAGA: FA jest wrażliwy na światło, więc trzymaj go z dala od światła.
    2. Odpipetować 1 ml 5% formaldehydu (FA) do probówki zawierającej oocyty. Umieść rurkę na multirotatorze, a następnie utrwal oocyty na 30 min.
      UWAGA: Od fazy fiksacji do etapu barwienia jądrowego, eksperymenty są przeprowadzane na wielorotatorze z delikatnym obrotem.
    3. Przygotuj 0,5% Triton X-100 w 1x PBS (1x PBT) jako roztwór myjący, dodając 10 ml 10% bulionu Triton X-100 do 190 ml 1x PBS. Przechowuj go w RT.
    4. Opłucz stałe komory na jajka 1x, a następnie umyj 3x w temperaturze pokojowej przez 10 min. Użyj 1 ml 1x PBT zarówno do etapu płukania, jak i mycia.
  3. Blokowanie
    1. Przygotuj 5% płodową surowicę bydlęcą (FBS), dodając 250 μl bulionu FBS do 4,75 ml 1x PBT.
      UWAGA: Ten roztwór powinien być świeżo przygotowany przed eksperymentem.
    2. Dodać 1 ml 5% FBS do probówki i wykonywać etap blokowania przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przepłukać oocyty 1x.
  4. Inkubacja przeciwciał pierwotnych
    1. Aby sprawdzić ekspresję i lokalizację transgenu, rozcieńczyć 2 μl α-V5 i 2 μl α-ATP5A lub α-Tom20 (jako marker mitochondrialny) w 400 μl 1x PBT (stosunek 1:200).
      UWAGA: Chociaż dwa przeciwciała mogą być używane razem do barwienia jednej próbki, ich gospodarze muszą być różni. Ma to na celu uniknięcie nakładania się kolejnych przeciwciał drugorzędowych.
    2. Inkubować komory jajowe z 400 μl rozcieńczonego roztworu przeciwciał pierwszorzędowych (przez noc, 4 °C).
      UWAGA: Podobnie jak w teście Western blot, przeciwciała pierwotne mogą być wielokrotnie używane do barwienia immunologicznego. Przed ponownym przechowywaniem roztworu przeciwciał upewnij się, że nie zawiera on żadnych komór na jajka.
    3. Opłucz komory na jajka 1x, a następnie umyj 3x w temperaturze RT przez 10 min.
  5. Inkubacja przeciwciał wtórnych
    1. Rozcieńczyć 2 μl koziego α-Rb IgG Alexa Fluor 488 i 2 μl koziego α-M IgG Alexa Fluor 594 w 400 μl 1x PBT (stosunek 1:200). Inkubować komory jajowe z 400 μl rozcieńczonego roztworu przeciwciał drugorzędowych przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. W celu wykrycia biotynylacji dodać 2 μl Alexa Fluor 594 sprzężonego ze streptawidyną do 1x PBT (stosunek 1:200) i inkubować razem z przeciwciałem drugorzędowym.
      UWAGA: Na tym etapie należy chronić próbkę przed światłem. Przeciwciała drugorzędowe powinny być świeżo rozcieńczone przed eksperymentem. Wiele przeciwciał drugorzędowych może być używanych razem, ale każde przeciwciało pierwszorzędowe powinno być przypisane do różnych fluoroforów, które również pochodzą od różnych gospodarzy, aby uniknąć nakładania się sygnałów. Na przykład 488 Goat α-Rb zwiąże się z królikiem α-V5. Jeśli chodzi o mysie α-ATP5A, 594 Goat α-M jest stosowany jako komplementarne przeciwciało drugorzędowe. W przypadku detekcji biotynylacji należy pominąć stosowanie innych barwników o tej samej długości fali co koniugat streptawidyny.
    2. Opłucz komory na jajka 1x, a następnie umyj 3x w temperaturze RT przez 10 min.
  6. Barwienie jądrowe
    1. Rozcieńczyć 1 μl DAPI w 1 ml 1x PBS (stosunek 1:1,000). Inkubować komory jajowe z 1 ml rozcieńczonego roztworu DAPI przez 5 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: DAPI powinno być świeżo rozcieńczone przed eksperymentem.
    2. Opłucz komory na jajka 1x, a następnie umyj 3x w temperaturze pokojowej przez 10 min.
      UWAGA: Komory na jajka można przechowywać w 1x roztworze PBS w temperaturze 4 °C przez kilka godzin przed montażem, ale zaleca się jak najszybsze przystąpienie do pracy.
  7. Montaż na suwaku
    1. Wyczyść szkiełko niestrzępiącą się chusteczką, a następnie zapisz na nim przykładowe informacje. Usuń 1x PBS z tuby, ale pozostaw niewielką ilość, aby zapobiec wysuszeniu.
    2. Odetnij krawędź końcówek mikropipet, a następnie ostrożnie pipetuj komory na jajka na szklane szkiełko. Użyj kleszczy, aby ostrożnie rozprowadzić komory na jajka na szkiełku i uniknąć zbrylania. Obserwuj szkiełka pod mikroskopem (wystarczy 2-krotne powiększenie), aby upewnić się, że komory na jajka są równomiernie rozłożone.
    3. Usunąć pozostały PBS ze szkiełka za pomocą mikropipety. Odpipetuj 15-30 μl roztworu zapobiegającego blaknięciu (wrażliwego na światło) na szklane szkiełko i upewnij się, że styka się ze wszystkimi komorami na jajka.
    4. Użyj kleszczyków, aby przytrzymać krawędź pokrywy prowadnicy, a następnie umieść ją na szklanym szkiełku (zaczynając od jednej krawędzi do drugiej), tak aby zakryła komory na jajka. Rób to powoli, aby uniknąć pęcherzyków. Nadmiar roztworu osusz niestrzępiącą się chusteczką, a następnie uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci. Pozostaw lakier do paznokci do wyschnięcia (± 5 min).
    5. Zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopu konfokalnego. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

4. Wzbogacanie biotynylowanych peptydów do analizy spektrometrii mas

UWAGA: Do próbki spektrometrii mas potrzebne są około 3 mg białek. Dlatego należy przeciąć około 100 par jajników, aby uzyskać tę ilość.

  1. Liza tkanek
    1. Rozmrozić zamrożoną tkankę jajnika. W międzyczasie przygotuj 1x roztwór soli fizjologicznej buforowany Tris (TBS), rozpuszczając 1 tabletkę TBS w 500 ml TDW. Przechowywać w RT. Przygotować 2% SDS w 1x TBS jako bufor do lizy, rozcieńczając 4 ml 10% bulionu SDS w 16 ml 1x TBS. Przechowywać w RT.
    2. Dodaj 500 μl 2% SDS w 1x TBS (uzupełnionym 1x koktajlem PI) do probówki zawierającej jajniki. Odczekaj kilka minut, aż komórki zostaną poddane lizie, a roztwór stanie się lepki.
    3. Odpipetować lizat do milirurki o wielkości 1 ml zawierającej włókno AFA (Adaptive Focused Acoustics). Przed użyciem odetnij końcówki pipet. Aby zapewnić skuteczną sonikację, należy przenieść maksymalnie 500 μl lizatu na probówkę.
    4. Wykonaj sonikację w następujących warunkach: szczytowa moc padająca 75 W, współczynnik wypełnienia 10%, cykle na impuls 200, czas 180 s, temperatura 6 °C.
      UWAGA: Jeśli próbka musi być wielokrotnie poddawana sonikacji, należy ustawić kilka odstępów między nimi, aby uniknąć generowania nadmiaru ciepła.
  2. Wytrącanie acetonu
    1. Przenieś lizat do probówki o niskiej zawartości wiązania o pojemności 5 ml, a następnie dodaj zimny aceton do probówki w ilości 6-krotności objętości próbki. Na przykład dodaj 3 ml acetonu do 500 μl lizatu.
      UWAGA: Przed użyciem aceton należy wstępnie schłodzić w temperaturze -20 °C.
    2. Rurkę wirową, załadować do wielorotatora i inkubować przez noc (± 16 godzin) w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Jest to punkt zatrzymania, co oznacza, że eksperyment może zostać chwilowo wstrzymany po wykonaniu tego kroku.
    3. Białka wytrącone w osadach w temperaturze 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, a następnie odwirować probówkę w temperaturze 4 °C.
    4. Dodać 2 ml roztworu mieszaniny składającej się z 90% zimnego acetonu i 10% 1x TBS. Pipetować ruchem góra-dół, aby wymieszać osad i roztwór. Przed użyciem odetnij końcówki pipet.
    5. Rurkę wirową, a następnie załadować do wielorotatora i inkubować przez 2 godziny w temperaturze -20 °C.
    6. Białka w granulkach w temperaturze 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić supernatant, a następnie odwirować probówkę w temperaturze 4 °C. Otwórz probówkę i susz granulki na powietrzu przez 10 minut.
      UWAGA: Nie należy nadmiernie suszyć pelletu, ponieważ później trudno będzie go ponownie zawiesić.
    7. Przygotować 500 mM roztworu podstawowego wodorowęglanu amonu (ABC), rozpuszczając 0,7906 g ABC w 20 ml TDW. Przygotować 50 mM roztworu roboczego ABC, rozcieńczając 3 ml 500 mM roztworu podstawowego ABC w 27 ml TDW.
    8. Przygotować 8 M roztwór mocznika, dodając 0,4805 g mocznika w 1 ml 50 mM ABC.
      UWAGA: Roztwór mocznika powinien być świeżo przygotowany przed eksperymentem.
    9. Zawiesić osad białkowy w 500 μl 8 M mocznika. Objętość 8 M mocznika można zmniejszyć w celu zwiększenia stężenia białka.
    10. Przenieść zawieszone białko do milirurki o wielkości 1 ml zawierającej błonnik AFA, a następnie przeprowadzić sonikację w tych samych warunkach, które opisano w kroku 4.1.4.
    11. Wykonaj test BCA, aby określić stężenie białka. Ten krok jest punktem zatrzymania. Przechowywać próbkę białka w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
  3. Trawienie trypsyny
    1. Wymieszać 3 mg białek z TDW (jeśli to konieczne) w probówce o niskim stopniu wiązania o pojemności 5 ml, aby uzyskać w sumie 500 μl roztworu.
    2. Denaturacja białek za pomocą termobloku przy 450 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    3. Dodać 5 μl 1 M DTT (rozpuszczonego w TDW) do probówki, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mM DTT, a następnie redukować białka za pomocą termobloku przy 450 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    4. Przygotować 400 mM jodoacetamidu, rozpuszczając 0,0111 g jodoacetamidu w 150 μl ABC. Dodać 55 μl 400 mM jodoacetamidu do probówki (końcowe stężenie 40 mM), a następnie alkilatować białka za pomocą termobloku przy 450 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Jodoacetamid jest wrażliwy na światło, a wszystkie roztwory jodoacetamidu powinny być świeżo przygotowane przed eksperymentem.
    5. Rozcieńczyć próbkę, dodając 50 mM roztworu ABC, aż całkowita objętość osiągnie 4 ml. Po rozcieńczeniu stężenie mocznika w roztworze wynosi około 1 M.
    6. Przygotować 1 M roztwór podstawowy CaCl2 rozpuszczając 1,1098 g CaCl2 w 10 ml TDW. Dodać 4 μl 1 M CaCl2 bulionu do probówki, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM, a następnie pipetować w górę i w dół, aby homogenizować roztwór.
    7. Przygotować roztwór podstawowy trypsyny o stężeniu 1 mg/ml, dodając 0,001 g trypsyny do 1 ml ABC. Dodać 150 μl trypsyny do probówki (trypsyna: próbka = stosunek 1:20). Białko trawić za pomocą termobloku przy 450 obr./min przez 16 godzin w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Trypsyna powinna być świeżo rozpuszczona przed eksperymentem. Ten krok jest punktem zatrzymania. Strawione peptydy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
  4. Wzbogacenie w biotynylowane peptydy
    UWAGA: do przemywania i elucji powinny być świeżo przygotowane przed eksperymentem.
    1. Przygotować 2 M mocznika w 1x TBS roztworze, dodając 1.2012 g mocznika w 10 ml 1x TBS.
    2. Użyć 150 μl kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną na próbkę 3 mg. Umyj kulki streptawidyny 1 ml 2 M mocznika w 1x TBS. Powtórz ten krok 4 razy. Po każdym praniu umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 1 minutę, a następnie wyrzuć bufor do mycia.
      UWAGA: Zalecane są kulki magnetyczne Pierce Streptawidin, ponieważ minimalizują one sygnały tła podobne do PEG w wynikach spektrometrii mas.
    3. Pobrać pipetą 1 ml strawionych peptydów do probówki zawierającej kulki, delikatnie wymieszać, a następnie połączyć mieszaninę z pozostałą próbką w probówce o niskiej zawartości wiązania o pojemności 5 ml. Umieścić probówkę na wielorotatorze i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    4. Przenieś 1 ml mieszaniny do probówki o pojemności 1,5 ml i umieść ją na stojaku magnetycznym na 1 minutę. Wyrzuć supernatant. Powtarzaj ten krok, aż wszystkie koraliki zostaną zebrane.
    5. Przygotować 2 M mocznika w 50 mM ABC, rozpuszczając 0,7207 g mocznika w 6 ml 50 mM ABC. Umyj kulki 1 ml 2 M mocznika w 50 mM 2x i jednorazowo 1 ml TDW. Po każdym praniu umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 1 minutę, a następnie wyrzuć bufor do mycia.
    6. Przygotować 10% roztwór podstawowy kwasu mrówkowego, rozpuszczając 1 ml kwasu mrówkowego w 9 ml TDW. Przygotować bufor elucyjny składający się z 80% acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego w TDW. Na przykład zmieszaj 1,2 ml acetonitrylu, 15 μl 10% bulionu kwasu mrówkowego i 285 μl TDW, aby uzyskać 1,5 ml buforu elucyjnego.
      UWAGA: Acetonitryl i kwas mrówkowy są szkodliwe ze względu na swoje właściwości lotne, dlatego należy nosić maskę i zachować ostrożność podczas obchodzenia się z nimi.
    7. Odpipetować 100 μl buforu elucyjnego do probówki, delikatnie homogenizować, a następnie eluować peptydy za pomocą termobloku przy 300 obr./min przez 5 minut w temperaturze 60 °C. Po elucji umieścić probówkę na stojaku magnetycznym i przenieść eluat do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Unikaj przyjmowania kulek podczas przenoszenia eluatu. Powtórz ten krok 5 razy.
    8. Umieść probówkę zawierającą 500 μl eluatu na stojaku magnetycznym na 5 minut, a następnie przenieś ją do nowej probówki o pojemności 1,5 ml, aby zapewnić całkowite usunięcie kulek. Wymyte próbki można następnie wysuszyć i wykorzystać do analizy spektrometrii mas.
    9. Aby uzyskać dodatkowe informacje na temat analizy LC-MS/MS wzbogaconych próbek peptydów i przetwarzania danych MS, sprawdź Nguyen et al.20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przykładowe wyniki przedstawiono na Rysunku 1, Rysunku 2, Rysunku 3 oraz Rysunku 4, które zostały wcześniej opublikowane przez zespół Nguyen i wsp.20. Rysunek 1 ilustruje procedurę eksperymentalną PL opartej na TurboID w jajniku Drosophila. Najpierw wygenerowano konstrukt łączący Zuc i TurboID (Zuc-V5-TurboID...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy kompleksową procedurę znakowania zbliżeniowego (PL) w jajniku Drosophila opartą na TurboID, opracowaną w wyniku szeroko zakrojonego rozwiązywania problemów w celu pokonania różnych wyzwań. Jedna z kluczowych kwestii dotyczyła konstruktów genetycznych, ponieważ różne układy fuzji znacząco wpływały na ekspresję białek i wydajność biotynylacji. Na przykład NES-V5-TurboID wykazywał słabszą ekspresję i biotynylację w porównaniu z innymi transgenami, co czasami komplikowało interpretację da...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy członkom laboratorium za ich dyskusje i pomoc. Praca ta była wspierana przez Narodową Fundację Badawczą (NRF) finansowaną przez rząd koreański (MSIT) (RS-2024-00345327 do ML; RS-2023-00219563 do ML).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciała
alexa fluor plus 488InvitrogenA32731Klasa analityczna, światłoczułe, światłoczułe
kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L), HRPInvitrogen31460Klasa analityczna, światłoczułe
przeciwciało HSP90 (królik)Technologia sygnalizacji komórkowej4874Przeciwciało poliklonalne
Pierce Streptawidyna, HRPThermo Fisher Scientific21126Klasa analityczna
Streptawidyna, Alexa Fluor 594 koniugatInvitrogenS11227Światłoczuły, klasa
analitycznaPrzeciwciało V5-tag (mysz)InvitrogenR960-25Przeciwciało monoklonalne
V5-tag przeciwciało (królik) (D3H8Q)Technologia sygnalizacji komórkowej13202Przeciwciało monoklonalne
Fly LinesCompanyNumer katalogowyKomentarze/Opis
pUASp Tom20 V5-TurboID/ TM3Korea Drosophila Stock Center2373-2Fly stock
pUASp Zucchini V5-TurboID/CyoKorea Drosophila Stock Center2188Fly stock
pUASP_attB_V5-TurboID-NES/CyoKorea Drosophila Stock Center2635-4Fly stock
stock w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2HBloomington Drosophila Stock Center7062Fly stock
Equipments and ConsumablesCompanyNumer katalogowyKomentarze/Opis
Analytical BalanceMettler ToledoME204Odczyt
0,1 mgMembrany Western Blot Amersham Protran 0,45 NC nitrocelulozowe (300 mm i razy 4 m)Cytiva
10600002-Axygen 1,7 mL MaxyClear Snaplock Probówka mikrowirówkowaCorningMCT-175-C
Kopolimer MARKA  Szkło pokrywowe (22 mm x 22 mm)Sigma-AldrichBR470055szkło borokrzemianowe
Końcówki do pipet luzem (10 &mikro; L)Vertex4110N00Końcówki
do pipet luzem propylenowym (1000 &mikro; L)Vertex4330N00Końcówki
do pipet propylenowych (200 &mikro; L)Vertex4230N00Płytka do hodowli komórek propylenowych
(96-dołkowa)SPL300096Polistyren, płaska
wirówka denna (z rotorem o pojemności 1,5-2 ml)Eppendorf5424 RWirówka z chłodzeniem o stałym kącie
nachylenia (z wirnikiem o pojemności 5 ml)Eppendorf5425 Rstałym kącie, z chłodzeniem
-- System
obrazowania ChemiDocobrazowania Western blotBiorad12003153
Podkładka muchowa CO2< / sub>Tablica anestezjologiczna
CO2< / sub> zbiornik i regulatorUwaga przed gazem pod wysokim ciśnieniem i zawrotami głowy
Kompaktowy inkubatorJSRJSGI-10TUwaga na wysoką jakość temperatura
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyZeissLSM 710Uwaga przed intensywną wiązką laserową
Rurka stożkowa (15 mL)SPL50015Polipropylen / polietylen o wysokiej gęstości 
Rurka stożkowa (50 mL)SPL50050Polipropylen / Polietylen o wysokiej gęstości 
Równowaga cyfrowa---
Zegar cyfrowy---
Miska preparacyjna--Silikonowe
kleszcze Dumont #5SF Fine Science Tools11252-00Super cienkie końcówki, uwaga na ostre przedmioty
Magnes DynaMag-2Invitrogen12321DDo probówek mikrowirówek o wielkości 1,5-2 ml
Fisherbrand  Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus (25 mm x 75 mm)Fisher Scientific12-550-15Uwaga na ostre przedmioty
Butelki na żywność na muchy (z papierową zatyczką)Hansol TechFFB-21010-Fiolki
pokarmem dla much (z bawełnianą nakrętką)Hansol TechFFV-11010-Skoncentrowany-ultradźwiękowiec
CovarisM220Ostrzeżenie przed falą ultradźwiękową
Nóż żelowyInvitrogenEI9010Stal nierdzewna z plastikowym uchwytem
Klasa 3MM Bibuła Chr (46 cm i czasy; 57 cm)Cytiva3030-917Papier Whatmann
Ręczny homogenizator i plastikowy tłuczekKimble749540-0000Silnik akumulatorowy
Blok grzewczyDrobny ALB6400 PCRUwaga przed wysoką temperaturą
Niestrzępiąca się chusteczkaYuhan-Kimberly41112-
Ciekły azot-Uwaga przed odmrożeniami i oparzeniami
Spektrofotometr mikropłytkowyAgilent TechnologiesEpokaOptyka oparta na monochromatorze
Mikrofale-Uwaga przed wysoką
temperaturą milliTUBE 1 mL włókno AFACovarisPN 520135Szkło
Mini zbiornik żelowyThermo Fisher ScientificA25977Uwaga przed wysokotemperaturowymi
mini żelami białkowymi NuPAGE Bis-tris, 4– 12%, 1.0– 1,5 mm, 10-dołkowyInvitrogenNP0323BOXZawierają poliakrylamid, ostrzeżenie o toksyczności
NuPAGE Bis-tris mini żele białkowe, 4– 12%, 1.0– 1,5 mm, 15-dołkowyInvitrogenNP0321BOXZawierają poliakrylamid, ostrzeżenie o toksyczności
Pędzel malarski (Ø 1,8 mm)Hwa hong791240-Pipetman
L (P1000L)GilsonFA10006MMikropipeta jednokanałowa z metalowym wyrzutnikiem
Pipetman L (P200L)GilsonFA10005MMikropipeta jednokanałowa z metalowym wyrzutnikiem
Pipetman L ( P20L)GilsonFA10003MMikropipeta jednokanałowa z metalowym wyrzutnikiem
Pipetman L (P2L)GilsonFA10001MMikropipeta jednokanałowa z metalowym eżektorem
Zasilanie NaukaMajorMP-310Uwaga przed elektrycznością wysokonapięciową
Programowalny rotatorBiosanRS-24-Protein
LoBind  rurki Eppendorf
30108302-ŻyletkaDorco304020Stal nierdzewna, uwaga na ostre przedmioty
Wałek---
Pipeta serologiczna (10 ml)SPL91010Polistyren
Pipeta serologiczna (25 ml)SPL91025Polistyren
Pipeta serologiczna (5 ml)SPL91005Polistyrenowa
pipeta serologiczna (50 ml)SPL91050Polistyrenowe
probówki mikrowirówkowe o niskiej retencji z zatrzaskiem (1,5 ml)Thermo Scientific3451PKPolipropylenowa
podkładka z gąbkiInvitrogenEI9052-Mikroskop
stereoskopowyZeissStemi 508-Stereoskop
nbsp;Termomikser Leica
  CEppendorf5382000015Z blokami o wielkości 1,5 i 5 ml
PęsetaAven Tools18526Plastikowa, płaska końcówka
Mieszalnik VortexScientific IndustriesSI-0236-XCell
II Moduł BlotInvitrogenEI9051Ostrzeżenie przed wysoką temperaturą
XCell  Mini-komórka SureLockInvitrogenEI0001Ostrzeżenie przed wysoką temperaturą
Chemikalia<silny>FirmaNumer katalogowyKomentarze/Opis
AcetonSigma-Aldrich650501Klasa analityczna
AcetonitrylSupelco1.00029.1000Stopień LC-MS, ostrożność przed toksycznością inhalacyjną i łatwopalnymi
ampułkami wzorcowymi albuminy (zawierające albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 2 mg/ml w 0,9% soli fizjologicznej i 0,05% azydku sodu)Thermo Scientific23209Część zestawów do oznaczania białek Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)
Albumina, surowica bydlęcaBioshopALB001
Wodorowęglan amonuSigma-Aldrich09830Biotyna klasy analitycznej
 Sigma-AldrichB4639Klasa do hodowli komórkowych i tkankowych
Chlorek wapnia (CaCl2)Sigma-AldrichC5670Klasa hodowli komórkowych
Klarowność zachodniego substratu ECLBiorad1705060Klasa analityczna
DAPISigma-AldrichMBD0015Światłoczuły, analityczny
Ditiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861Klasa analityczna
Płodowa surowica bydlęcaCorning35-015-CVKlasa hodowli komórkowej
Kwas mrówkowySigma-AldrichF0507Klasa odczynnika, uwaga na toksyczność inhalacyjną
Pożywka dla owadów GraceGibco11595030Klasa hodowli komórkowej
Błyskawiczne suche drożdżeBrak markiN1019-
JodoacetamidSigma-AldrichI1149Światłoczuły, analityczny
metanolCarlo Erba41484Klasa analityczna
Lakier do paznokci-bezbarwny
bufor do próbek Novex Tris-glycine SDS (2X)InvitrogenLC2676Klasa analityczna
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)InvitrogenNP0001Klasa analityczna
PageRuler Prestained protein ladderThermo Fisher Scientific26616Klasa analityczna
Fluorek fenylometanosulfonylu Thermo Fisher Scientific36978Klasa analityczna
Bufor fosforanowy sól fizjologicznaSigma-AldrichP4417Klasa analityczna
Pierce 16% Formaldehyd (w/v)Thermo Fisher Scientific28908Klasy analitycznej, światłoczułe
zestawy do oznaczania białek Pierce BCAThermo Scientific23225Klasa
analitycznaOdczynnik A Pierce BCA (zawierający węglan sodu, wodorowęglan sodu, kwas bicynchoninowy i winian sodu w 0,1 M wodorotlenku sodu)Thermo Scientific23228Część zestawów do oznaczania białek Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)
Odczynnik Pierce BCA B (zawierający 4% siarczanu miedzi)Thermo Scientific1859078Część zestawów do oznaczania białek Pierce BCA (Thermo Scientific, 23225)
Kwas propionowySigma-Aldrich402907
Zestaw koktajli inhibitorów proteazyACS Klasa 539134 CalbiochemKlasa kultur komórkowych i tkankowych
SlowFade Gold Antifade MountantInvitrogenS36936Światłoczuły
chlorek sodu (NaCl)BioneerC-9025Klasa analityczna
Deoksycholan soduSigma-AldrichD6750Klasa analityczna
Dodecylosiarczan soduSigma-Aldrich71736Klasa cząsteczkowa
Wodorotlenek sodu (NaOH)BiosesangSR2018-100-00Klasa analityczna
Potrójnie destylowana wodaultraczysta (typ 1)
sól fizjologiczna buforowana trisemSigma-Aldrich94158Klasa analityczna
Bufor transferowy Tris-glicynyKoma BiotechK0341001Klasa analityczna
Tris-HCl, pH 8BioneerC-9006Klasa analityczna
Triton x-100Sigma-Aldrich93443Klasa molekularna
TrypsynaThermo Fisher Scientific20233Klasa hodowli komórkowej
Tween 20Sigma-AldrichP9416
MocznikSigma-AldrichU5378Molekularne i Klasa hodowli komórkowej
Goat anty-mysie przeciwciało drugorzędowe IgG (H+L), HRP Invitrogen 31430 Klasa analityczna, światłoczułe kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) wysoce adsorbowane krzyżowo, Center Łyżka chemiczna o ze stali nierdzewnej System - - z & klasy analitycznej klasy - klasy cząsteczkowej

Bibliografia

  1. Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: Proximity-based labeling of proteins in living cells. Trend Cell Biol. 26 (11), 804-817 (2016).
  2. Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by turboid. eLife. 8, e47864(2019).
  3. Qi, Y., Katagiri, F. Purification of low-abundance Arabidopsis plasma-membrane protein complexes and identification of candidate components. Plant J. 57 (5), 932-944 (2009).
  4. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with turboid. Nat Biotechnol. 36 (9), 880-887 (2018).
  5. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  6. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).
  7. Quantitative Proteomics. , https://case.edu/medicine/nutrition/centers-and-collaborations/case-center-proteomics-and-bioinformatics/proteomics-and-small-molecule-mass-spectrometry-core/quantitative-proteomics (2025).
  8. Udeshi, N. D., et al. Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins. Nat Meth. 14 (12), 1167-1170 (2017).
  9. Ummethum, H., Hamperl, S. Proximity labeling techniques to study chromatin. Front Genet. 11, 450(2020).
  10. Han, S., Li, J., Ting, A. Y. Proximity labeling: Spatially resolved proteomic mapping for neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 50, 17-23 (2018).
  11. Nishimasu, H., et al. Structure and function of zucchini endoribonuclease in pirna biogenesis. Nature. 491 (7423), 284-287 (2012).
  12. Zamudio, N., et al. DNA methylation restrains transposons from adopting a chromatin signature permissive for meiotic recombination. Genes Dev. 29 (12), 1256-1270 (2015).
  13. Cha, S. J., et al. Therapeutic modulation of gsto activity rescues fus-associated neurotoxicity via deglutathionylation in als disease models. Dev Cell. 57 (6), 783-798.e8 (2022).
  14. Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing Drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. J Undergrad Neurosci Educ. 11 (1), A139-A148 (2012).
  15. Feizy, N., et al. In vivo identification of Drosophila rhodopsin interaction partners by biotin proximity labeling. Sci Rep. 14 (1), 1986(1986).
  16. Zhang, B., Zhang, Y., Liu, J. L. Highly effective proximate labeling in Drosophila. G3. 11 (5), jkab077(2021).
  17. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
  18. Waring, G. L. Morphogenesis of the eggshells in Drosophila. Int Rev Cytol. 198, 67-108 (2000).
  19. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual drosophila egg chambers for live imaging. J Vis Exp. (60), e3679(2012).
  20. Nguyen, T. T. M., et al. In vivo profiling of the zucchini proximal proteome in the Drosophila ovary. Development. 150 (4), dev201220(2023).
  21. Ahmadi, S., Winter, D. Identification of poly(ethylene glycol) and poly(ethylene glycol)-based detergents using peptide search engines. Anal Chem. 90 (11), 6594-6600 (2018).
  22. Zada, A., Khan, I., Zhang, M., Cheng, Y., Hu, X. Airid-based proximity labeling for protein-protein interaction in plants. J Vis Exp. (187), e64428(2022).
  23. Fang, B., et al. Lowering sample requirements to study tyrosine kinase signaling using phosphoproteomics with the tmt calibrator approach. Proteomics. 20 (24), 2000116(2020).
  24. Park, N., et al. One-stage tip method for tmt-based proteomic analysis of a minimal amount of cells. ACS Omega. 8 (22), 19741-19751 (2023).
  25. Zhang, Y., et al. Turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. J Vis Exp. (159), e60728(2020).
  26. Trinkle-Mulcahy, L. Recent advances in proximity-based labeling methods for interactome mapping. F1000Res. 8, Faculty Rev-135 F1000(2019).
  27. Wei, X. F., Li, S., Hu, J. L. A turboid-based proximity labelling approach for identifying the DNA-binding proteins. STAR Protoc. 4 (1), 102139(2023).
  28. Bosch, J. A., Chen, C. L., Perrimon, N. Proximity-dependent labeling methods for proteomic profiling in living cells: An update. WIREs Dev Biol. 10 (1), e392(2021).
  29. Rayaprolu, S., et al. Cell type-specific biotin labeling in vivo resolves regional neuronal and astrocyte proteomic differences in mouse brain. Nat Commun. 13, 2927(2022).
  30. Uckun, E., et al. In vivo profiling of the alk proximitome in the developing Drosophila brain. J Mol Biol. 433 (23), 167282(2021).
  31. Xiong, Z., et al. In vivo proteomic mapping through gfp-directed proximity-dependent biotin labelling in zebrafish. Elife. 10, e64631(2021).
  32. Holzer, E., Rumpf-Kienzl, C., Falk, S., Dammermann, A. A modified turboid approach identifies tissue-specific centriolar components in C. elegans. PLoS Genet. 18 (4), e1010150(2022).
  33. Artan, M., et al. Interactome analysis of Caenorhabditis elegans synapses by turboid-based proximity labeling. J Biol Chem. 297 (3), 101094(2021).
  34. Zhang, Y., et al. Turboid-based proximity labeling reveals that ubr7 is a regulator of n nlr immune receptor-mediated immunity. Nat Comm. 10 (1), 3252(2019).
  35. Baumgartner, L., et al. The Drosophila zad zinc finger protein kipferl guides rhino to pirna clusters. eLife. 11, e80067(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

znakowanie blisko ciowe TurboIDmapowanie oddzia ywa bia kowychpeptydy biotynilowanespektrometria maskom rki linii zarodkowejfa dowanie bia ekorganizacja b ontransport p cherzykowyobrazowanie konfokalne
In vivo (in vivo) Zastosowanie znakowania zbliżeniowego opartego na TurboID u Drosophila melanogaster
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.