Izolacja i hodowla pierwotnych cholangiocytów od myszy z wielotorbielowatością wątroby przy użyciu dwuetapowej metody trawienia

Podsumowanie

Ten protokół opisuje zoptymalizowaną dwuetapową metodę trawienia do izolowania pierwotnych cholangiocytów o wysokiej czystości i żywotności od myszy typu dzikiego i myszy z wielotorbielowatą chorobą wątroby.

Streszczenie

W tym protokole zoptymalizowaliśmy dwuetapową metodę trawienia, aby wyizolować pierwotne cholangiocyty o wysokiej czystości i żywotności od myszy typu dzikiego i myszy z wielotorbielowatością wątroby (PLD). Po znieczuleniu myszy, wątroby przeprowadzono przez żyłę główną dolną za pomocą 50 ml roztworu A, a następnie 30 ml roztworu B w temperaturze 37 °C w celu enzymatycznego trawienia tkanki wątroby. Przeprowadzono mechaniczną dysocjację, potrząsanie i mikrodysekcję w celu usunięcia przylegających komórek miąższowych, pozostawiając nienaruszone drzewo żółciowe. Drzewo żółciowe zostało następnie drobno rozdrobnione i strawione przez wytrząsanie przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Otrzymaną zawiesinę jednokomórkową zebrano za pomocą sitka o wielkości 70 μm. Cholangiocyty oczyszczono za pomocą izolacji immunomagnetycznej. Zawiesinę komórkową inkubowano z przeciwciałem anty-EpCAM pod wpływem rotacji przez 45 minut w temperaturze 4 °C, a następnie dodano kulki białka G i kontynuowano rotację przez kolejne 45 minut w temperaturze 4 °C. Po trzech płukaniach PBS cholangiocyty pobrano za pomocą separatora magnetycznego. Oczyszczone pierwotne cholangiocyty zawieszono ponownie w pożywce do hodowli cholangiocytów i wysiano na szalki do hodowli komórkowych pokryte 1 mg / ml kolagenu z ogona szczura typu I. Czystość cholangiocytów potwierdzono za pomocą barwienia immunologicznego dla specyficznego dla cholangiocytów markera cytokeratyny-19 (CK19). Chociaż badanie to koncentrowało się na izolowaniu pierwotnych cholangiocytów od myszy typu dzikiego i myszy PLD, jesteśmy przekonani, że protokół można zastosować również do innych modeli myszy chorobowych. Ta szczegółowa, dwuetapowa metoda trawienia ułatwia badania in vitro cholangiopatii i opracowywanie terapii celowanych.

Wprowadzenie

Cholangiocyty, komórki nabłonkowe wyściełające wewnątrzwątrobowe drzewo żółciowe, tworzą monowarstwę i stanowią około 3-5% całkowitej populacji komórek wątroby¹. Komórki te łączą się ze sobą w wątrobie, tworząc złożoną trójwymiarową sieć przewodową². W normalnych warunkach cholangiocyty pełnią funkcje życiowe, w tym wydzielanie, wchłanianie, naprawę uszkodzeń i służą jako bariera immunologiczna, odgrywając w ten sposób kluczową rolę w fizjologii i patologii wątroby. Jednak dysfunkcja cholangiocytów może prowadzić do różnych chorób, w tym PLD, pierwotnego stwardniającego zapalenia dróg żółciowych, raka dróg żółciowych i cholestatycznego uszkodzenia wątroby^3,4,5.

Wśród chorób związanych z cholangiopatią, PLD wyróżnia się jako zaburzenie dziedziczne charakteryzujące się powstawaniem licznych torbieli wypełnionych płynem pochodzących z cholangiocytów. Postępujące powiększanie się tych torbieli znacznie obniża jakość życia pacjentów⁶. Obecne możliwości leczenia PLD są nadal niewystarczające, oferując ograniczoną skuteczność, a jednocześnie często wiążąc się z wysokimi wskaźnikami nawrotów i powikłań⁷. Podkreśla to pilną potrzebę opracowania bezpiecznych i skutecznych strategii terapeutycznych, aby sprostać niezaspokojonym wymaganiom klinicznym w leczeniu PLD.

Badania nad mechanizmami cholangiopatii, w tym PLD, zostały znacznie utrudnione przez brak odpowiednich linii komórkowych. Aby rozwiązać ten problem, wykorzystanie mysich modeli choroby i izolacja pierwotnych cholangiocytów z tych modeli do eksperymentów in vitro okazało się nieocenione w odkrywaniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw cholangiopatii i identyfikowaniu potencjalnych strategii terapeutycznych.

W naszym ostatnim badaniu⁸, udało nam się stworzyć model myszy PLD przy użyciu myszy z warunkowym nokautem Pkd1 (KO). Torbiele wątroby obserwowano już 1 miesiąc po delecji Pkd1 i stopniowo zwiększały się w czasie. Podczas gdy protokoły izolacji cholangiocytów od szczurów i ludzi są dobrze udokumentowane^9,10, izolowanie pierwotnych cholangiocytów od myszy pozostaje szczególnie trudne ze względu na ich mały rozmiar i skomplikowaną architekturę żyły wrotnej i układu żółciowego. Istniejące metody napotykają na poważne ograniczenia, w tym niską czystość komórek, niską żywotność, skomplikowane procedury i wysokie koszty^11,12.

Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół izolowania pierwotnych cholangiocytów o wysokiej czystości od myszy za pomocą dwuetapowej metody trawienia. To zoptymalizowane podejście ma na celu wsparcie badań in vitro, ułatwiając badanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw cholangiopatii i przyspieszając rozwój nowych strategii terapeutycznych.

Protokół

Wszystkie protokoły eksperymentalne dotyczące opieki nad myszami zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny Uniwersytetu Medycznego w Tianjin (Nr dokumentu: TMUa-MEC 2022016).

1. Przygotowanie sprzętu i rozwiązań

1. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne (nożyczki, kleszcze i rękojeści skalpela) przez autoklawowanie co najmniej 1 dzień przed izolacją komórek.
2. Co najmniej 1 dzień przed izolacją komórek należy przygotować pożywkę do hodowli cholangiocytów, używając odczynników wymienionych w tabeli 1. Wysterylizuj pożywkę do hodowli cholangiocytów, filtrując ją przez filtr 0,22 μm.
3. Co najmniej 1 dzień przed izolacją komórek należy przygotować roztwór A i roztwór B, używając odczynników wymienionych w Tabeli 2 do perfuzji wątroby myszy. Wysterylizuj roztwór A i roztwór B przez autoklawowanie lub filtrowanie przez filtr 0,22 μm i dostosuj ich pH do 7,35 za pomocą sterylnego NaOH pod delikatnym mieszaniem.
   UWAGA: Pożywka do hodowli cholangiocytów, roztwór A i roztwór B mogą być przechowywane w temperaturze 4°C przez co najmniej jeden miesiąc.
4. Przed rozpoczęciem eksperymentu dodaj proszek kolagenazy II do roztworu B i delikatnie wymieszaj, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 mg/ml. Przed użyciem podgrzej roztwór A i roztwór B w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
5. Bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować 6 cm szalki wypełnione sterylnym PBS i umieścić je na lodzie, aby były zimne podczas zabiegu.

2. Perfuzja trawienia tkanek wątroby

1. Znieczulić mysz za pomocą przedawkowania izofluranu wziewnego. Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na plecach i zabezpiecz ją taśmą klejącą, aby ułatwić zabieg.
2. Otwórz jamę brzuszną myszy po wysterylizowaniu jamy brzusznej 75% etanolem, a następnie zawiąż węzeł wokół żyły głównej dolnej za pomocą igły. Przepłukać cewnik dożylny 24 G roztworem A za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml.
3. Wprowadzić cewnik dożylny do żyły głównej dolnej poniżej węzła, zabezpieczyć węzeł ślizgowy i przymocować cewnik taśmą klejącą.
4. Wykonać perfuzję wątroby z 50 ml roztworu A przez żyłę główną dolną za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml i naciąć żyłę wrotną wątroby w celu odprowadzenia roztworu perfuzyjnego. Utrzymać szybkość perfuzji na poziomie 10 ml/min.
5. Kontynuować perfuzję z 30 ml roztworu B zawierającego kolagenazę II przy szybkości przepływu 3,5 ml/min za pomocą pompy perystaltycznej.
   UWAGA: Ten etap jest przeznaczony do trawienia tkanki wątroby.
6. Usunąć pomyślnie perfundowaną tkankę wątroby i umieścić ją w 6 cm naczyniu wypełnionym zimnym, sterylnym PBS.

3. Izolacja cholangiocytów

UWAGA: Ponieważ liczba cholangiocytów u normalnych myszy jest stosunkowo niska, zaleca się użycie grupy 2-6 myszy do zabiegu. Jednak w przypadku mysich modeli chorób z nieprawidłową proliferacją cholangiocytów, takich jak PLD, cholangiocyty z jednej myszy są wystarczające. O ile nie określono inaczej, próbki i odczynniki muszą być zawsze przechowywane na lodzie, a wszystkie procedury powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

1. Mechanicznie dysocjuj i potrząśnij tkanką wątroby za pomocą zakrzywionych kleszczy. Następnie wykonaj mikrodysekcję pod mikroskopem preparacyjnym, aby usunąć przylegające komórki miąższowe, pozostawiając nienaruszone drzewo żółciowe. Usuń tkankę pęcherzyka żółciowego przed przejściem do następnego kroku.
   Umyj chusteczkę 2x PBS.
2. Drobno zmielić drzewo żółciowe za pomocą ostrza chirurgicznego i wytrawić je w 3 ml roztworu trawiącego (Tabela 3) na mysz z potrząsaniem (90 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 60 min. Po upływie 30 minut delikatnie odpipetować mieszaninę za pomocą końcówki pipety, aby dokładnie wymieszać.
   UWAGA: Roztwór trawiący powinien być świeżo przygotowany przed użyciem.
3. Przepuścić zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 μm. Za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 5 ml lub 10 ml delikatnie przecisnąć zawiesinę komórkową przez sitko. Umyj sitko za pomocą PBS.
4. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć komórki 3x pożywką RPMI.
5. Ponownie odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 900 μl pożywki RPMI zawierającej 40 U/ml DNazy I. Dodać 2 μg przeciwciała anty-EpCAM i inkubować zawiesinę na rotatorze (20 obr./min) w temperaturze 4 °C przez 45 min.
7. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
8. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki RPMI zawierającej 40 U/ml DNazy I. Wstępnie przemyć kulki białka G 1 ml pożywki RPMI. Dodać 20 μl kulek białka G do zawiesiny komórkowej i inkubować z rotacją (20 obr./min) w temperaturze 4 °C przez kolejne 45 minut
   UWAGA: Przeciwciało anty-EpCAM może być również wstępnie inkubowane z kulkami białka G w celu wytworzenia kompleksu kulka-przeciwciało przed wprowadzeniem zawiesiny komórkowej.
9. Umyj komórki 3x PBS za pomocą separatora magnetycznego.
10. Przeprowadzić zliczanie komórek i ocenę żywotności komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym (0,04%, 3 min) na hemocytometrze.
    UWAGA: Nie ma potrzeby usuwania kulek z cholangiocytów, odczepią się one naturalnie po rozpoczęciu hodowli i nie będą kolidować z hodowlą komórkową.

4. Hodowla cholangiocytów

UWAGA: Przygotuj świeże naczynia do hodowli komórek pokrytych kolagenem z ogona szczura przed hodowlą cholangiocytów. Schłodź wszystkie odczynniki na lodzie.

1. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, wymieszaj sterylny ddH₂O, 10x PBS, 1 N NaOH i kolagen z ogona szczura typu I, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mg / ml kolagenu z ogona szczura typu I w 1x PBS. Równomiernie pokryj szalki z kultur komórkowych mieszanką i umieść szalki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ na 30 minut, aby kolagen mógł się zestalić.
2. Umyj naczynia do hodowli komórkowych pokrytych kolagenem z ogona szczura typu I wstępnie podgrzanym PBS.
3. Ponownie zawiesić cholangiocyty w podgrzanej pożywce do hodowli cholangiocytów. Wysiewać zawiesinę komórkową na 1 mg/ml pokrytych kolagenem z ogona szczura typu I i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ . Wymieniaj podłoże co 2 dni.

5. Pasażowanie i kriokonserwacja cholangiocytów

1. Przemyć cholangiocyty dwukrotnie PBS, a następnie inkubować komórki w 0,25% trypsyny w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut.
2. Dodać równą objętość pożywki do hodowli cholangiocytów, aby zneutralizować trypsynę, a następnie odwirować przy 500 x g przez 5 minut.
3. Przygotować naczynia do hodowli komórkowej pokryte kolagenem z ogona szczura typu I, jak opisano w kroku 4.1.
4. Wykonaj kroki 4.2 i 4.3.
5. Jeśli wymagana jest kriokonserwacja, ponownie zawieś cholangiocyty na podłożu magazynującym (9:1 FBS: DMSO) i przechowuj w zamrażarce o temperaturze -80 °C lub ciekłym azocie. Rozmrozić ogniwa w razie potrzeby do wykorzystania w przyszłości.

6. Walidacja cholangiocytów

UWAGA: Czystość cholangiocytów została oceniona przez barwienie na marker cholangiocytów CK19.

1. Przemyj cholangiocyty 2x PBS, a następnie utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie przez 15 minut.
2. Umyj cholangiocyty PBS, a następnie przepuszczaj komórki 1% Triton X-100 przez 8 minut.
3. Umyj cholangiocyty PBS, a następnie zablokuj komórki w 5% BSA na 1 godzinę.
4. Przemyć cholangiocyty PBS, a następnie inkubować komórki z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko CK19 (rozcieńczenie 1:12 z 2% BSA) przez noc w temperaturze 4 °C.
5. Przemyj cholangiocyty 2x PBS, a następnie inkubuj komórki z przeciwciałem drugorzędowym przeciwko szczurom Alexa Fluor 488 (rozcieńczenie 1:1,000 z PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
6. Umyj cholangiocyty PBS, zabarwić 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem przez 15 minut i obserwować pod mikroskopem.

Wyniki

Schemat blokowy dwuetapowego procesu trawienia wykorzystywanego do izolacji cholangiocytów przedstawiono na Ryc. 1. Cała procedura trwa ~5 h. Najpierw wątrobę płucze się Roztworem A poprzez dolną żyłę główną w celu usunięcia krwi, co objawia się zblednięciem narządu. Następnie wątrobę płucze się Roztworem B zawierającym kolagenazę II, aby zainicjować trawienie tkanki. Ten wstępny etap trawienia jest zależny od czasu, a o prawidłowym przebiegu świadczy wyraźne...

Dyskusja

Protokół ten zapewnia szczegółową metodę izolowania pierwotnych cholangiocytów o wysokiej czystości od myszy przy użyciu dwuetapowego procesu trawienia, umożliwiając badanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw cholangiopatii. Aby zapewnić pomyślną izolację cholangiocytów, niezbędnych jest kilka kluczowych etapów.

Pierwszym krytycznym krokiem jest zapewnienie skutecznej perfuzji i trawienia przy użyciu roztworu A i roztworu B. Pomyślna perfuzja z roztworem A została potwierdzona przez ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,22 &m; m filtr	PALL	4612
0,25% Trypsyna	Gibco	25200-056
Strzykawka 10 ml	KONSMED	10 ml 1,2*30TWLB
Strzykawka 20 ml	KONSMED	20 ml 1,2*30TWLB
24 G cewnik dożylny	WEGO	24GX19  mm/Y-G
3,3',5-triiodo-L-tyronina	Sigma	T5516	1,7 mg/ml zapas
4% paraformaldehyd	Solarbio	P1110
5 ml strzykawka	KONSMED	5 ml 0,7*30TWLB
Naczynia 6 cm	Thermo Scientific	150462
70 µ m sitko komórkowe	Corning	352350
przeciwciało anty-CK19	DSHB	TROMA-III
przeciwciało anty-EpCAM	DSHB	G8.8
BSA		Solarbio A8020
CaCl2	Sangon Biotech	A501330	2 M
Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy (100x)	Gibco	11905-031
Kolagenaza II	Worthington	LS004176
Kolagenaza XI	Sigma	C7657	3,2 mg / ml zapas
Deksametazon	Sigma	D1756	10 mg / ml zapas
Mikroskop preparacyjny	Leica	EZ4
DMEM/F12 (1:1)	VivaCell biosciences	C3130-0500
DMSO	Sigma	D2650
DNase I	Sigma	D4513	10 U/μ L zapas
Osioł anty-szczur Alexa Fluor 488 przeciwciało wtórne	Invitrogen	A21208
EGTA	Solarbio	E8050	50 mM (PH = 8) zapas
Naskórkowy czynnik wzrostu (1 mg / ml)	Sigma	SRP3196
Etanoloamina	Sigma	E9508
Płodowa surowica bydlęca	VivaCell biosciences	C04001-500
Forskolin	Sigma	F3917	20 mM zapas
Roztwór gentamycyny/amfoterycyny (500x)	Gibco	R01510
Hemocytometr	QIUJING	XB. K.25.
HEPES	Sigma	H4034
Hialuronidaza	Sigma	H3506	10 mg / ml zapas
Insulina-transferyna-selen (100x)	Gibco	41400045
Isoflurane	RWD	R510-22-10
KCl	Sangon Biotech	A100395
L-Glutamina (200 mM)	Sigma	G7513
Separator magnetyczny	Promega	Z5342
MEM aminokwasy endogenne (100x)	Gibco	11140050
roztwór witamin MEM (100x)	Gibco	11120052
MgCl2	Sangon Biotech	A100288	1,5 M
zapas Na Pyruvate  (100 mM)	Gibco	11360070
Na2HPO4	Sangon Biotech	A600487
NaCl	Sangon Biotech	A610476
NaOH	Sangon Biotech	A620617	1 N stock
PBS	VivaCell biosciences	C3580-0500
PBS	Solarbio	P1010
Penicylina-Streptomycyna (100x)	Gibco	15140-122
Pompa perystaltyczna	BaodingRongbai	YZ1515PPS
Kulki białkowe G	Invitrogen	10004D
Rotator	Kylin-Bell	QB-528
RPMI	VivaCell biosciences	C3010-0500
Inhibitor trypsyny sojowej	Sigma	T6522	10 mg / ml zapas
Igła do pieczenia	Jinhuan Medical	HM601
Triton X-100	Solarbio	T8200
Trypan blue	Sigma	T6146	10 mg / ml stock
Typ I kolagen z ogona szczura	BD	354236