Izolacja komórek płuc zawierających retinoidy przez sortowanie komórek

Seth Calindas; Olga Ilnytska; Igor Shmarakov

doi:10.3791/68205

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja komórek płuc zawierających retinoidy przez sortowanie komórek

849 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68205

⸱

11 kwietnia 2025

Seth Calindas¹^,² , Olga Ilnytska¹^,³^,⁴ , Igor Shmarakov¹^,³^,⁴

¹Department of Animal Sciences, School of Environmental and Biological Sciences, Rutgers, The State University of New Jersey, ²Undergraduate Program in Biochemistry, School of Environmental and Biological Sciences, Rutgers, The State University of New Jersey, ³Rutgers Center for Lipid Research, ⁴Rutgers Center for Environmental Exposures & Disease

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół opisany poniżej jest prostym i skutecznym sposobem na izolację komórek zawierających retinoidy z wysoce heterogenicznych populacji komórek płuc poprzez wykorzystanie specyficznej autofluorescencji retinoidów i zastosowanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

Streszczenie

Retinoidy (witamina A i jej metabolity) są niezbędnym składnikiem lipidowym mikrośrodowiska pęcherzyków płucnych, a specyficzny dla typu komórki metabolizm retinoidów jest niezbędny do utrzymania funkcjonalnego zdrowia rozwijających się i dorosłych płuc. Komórki płuc wykorzystują specyficzne szlaki, co pozwala na efektywne pobieranie krążących retinoidów z krwi w postaci retinolu (ROH), a następnie wewnątrzkomórkową stopniową konwersję ROH do transkrypcyjnie aktywnego rodzaju retinoidu, kwasu all-trans-retinowego (ATRA). Sygnalizacja za pośrednictwem ATRA (lub za pośrednictwem retinoidów) ma kluczowe znaczenie dla regulacji pęcherzyków płucnych, produkcji środków powierzchniowo czynnych, angiogenezy, przepuszczalności i odporności. Co ważne, określone komórki płuc, w tym fibroblasty, mogą gromadzić retinoidy w postaci estrów retinylu (RE), które mogą być magazynowane lub dalej mobilizowane jako ROH w celu przeniesienia do sąsiednich komórek w razie potrzeby. Komórki płuc zawierające retinoidy można wyizolować i pobrać z jednokomórkowej zawiesiny strawionych płuc za pomocą autofluorescencji retinoidów (emisja przy 455 nm po wzbudzeniu przy 350 nm) i stosując sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Dodatkowe specyficzne dla komórki znakowanie in vivo komórek płuc białkiem czerwonej fluorescencji umożliwia izolację i zbieranie określonych populacji komórek płuc zawierających retinoidy. Pobrane komórki mogą być bezpośrednio analizowane lub hodowane w celu dalszych analiz morfologii komórek, ekspresji genów i reakcji na manipulacje farmakologiczne. Ta technika izolacji i zastosowania jest ważna dla badań na modelach zwierzęcych nad zdrowiem płuc i uszkodzeniem płuc w celu uzyskania głębszego wglądu w komórkowe aspekty metabolizmu retinoidów w płucach i komunikacji komórkowej za pośrednictwem lipidów.

Wprowadzenie

Retinoidy (witamina A i jej metabolity) są niezbędnym składnikiem lipidowym mikrośrodowiska pęcherzyków płucnych, a specyficzny dla typu komórki metabolizm i sygnalizacja retinoidów są niezbędne do utrzymania funkcjonalnego zdrowia rozwijającego się i dorosłego płuca1^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴. Komórki płuc wykorzystują specyficzne szlaki, co pozwala na efektywne pobieranie krążących retinoidów pochodzących z diety z krwi w postaci retinolu (ROH)¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹, po czym następuje wewnątrzkomórkowa stopniowa konwersja ROH do transkrypcyjnie aktywnego rodzaju retinoidu, kwasu all-trans-retinowego (ATRA)²⁰. Sygnalizacja za pośrednictwem ATRA (lub za pośrednictwem retinoidów) jest osiągana poprzez interakcję ATRA z trzema pokrewnymi receptorami hormonów jądrowych, receptorami kwasu retinowego (RARα, RARβ i RARγ²¹^,²²), i jest kluczowa dla regulacji pęcherzyków płucnych²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹, produkcja środków powierzchniowo czynnych³⁰^,³¹^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵, angiogeneza³⁶, przepuszczalność³⁷ i odporność³⁸^,³⁹^,⁴⁰. Co ważne, specyficzne komórki płuc, zwłaszcza fibroblasty płuc, mogą gromadzić retinoidy w postaci estrów retinylu (RE), które mogą być przechowywane lub dalej mobilizowane jako ROH w celu przeniesienia do sąsiednich komórek w razie potrzeby¹.

Złożoność metabolizmu i sygnalizacji retinoidów, jak również złożoność komórkowa płuc, sprawiają, że badania mające na celu zbadanie metabolizmu retinoidów w płucach in vivo są wyzwaniem. Przedstawiliśmy prosty i solidny protokół izolowania komórek zawierających retinoidy (Rysunek 1) z wysoce heterogenicznych populacji komórek płuc poprzez wykorzystanie specyficznej autofluorescencji retinoidów (emisja przy 455 nm po wzbudzeniu przy 350 nm) i poprzez zastosowanie sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Protokół nie wymaga dodatkowego znakowania komórek, z wyjątkiem barwienia żywotności, jeśli celem badania jest wyizolowanie i scharakteryzowanie pierwotnych żywych komórek płuc na podstawie ich zdolności do przechowywania retinoidów. To znacznie skraca czas przygotowania do sortowania komórek, eliminuje potrzebę dodatkowego barwienia i pozwala na izolowanie wysokich plonów żywotnych komórek pierwotnych. Jeśli jednak celem badania jest wyizolowanie i scharakteryzowanie określonych populacji komórek płuc (fibroblastów, komórek śródbłonka, nabłonka lub komórek odpornościowych), dodatkowe sortowanie komórek można przeprowadzić po znakowaniu posortowanych komórek zawierających retinoidy przeciwciałami specyficznymi dla komórki.

Autofluorescencja retinoidów została wykorzystana w opublikowanych badaniach w celu ustalenia tożsamości komórek zawierających retinoidy i/lub ilościowego określenia obfitości tych komórek w wątrobie41^,^42,⁴³^,⁴⁴, trzustka⁴⁵^,⁴⁶, nerki⁴¹^,⁴⁷, oraz lung⁴¹. Co więcej, kilka grup badawczych zgłosiło zastosowanie fluorescencji retinoidów do izolacji za pomocą FACS i badania pierwotnych komórek zawierających retinoidy z żywych tkanek, w tym wątroby⁴⁴^,⁴⁸^,⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹^,⁵²^,⁵³ i lung¹. W obecnym protokole pokazujemy, w jaki sposób określone populacje komórek mogą być znakowane in vivo przed wyizolowaniem komórek zawierających retinoidy za pomocą tdTomato (czerwone białko fluorescencyjne). Charakterystyka spektralna tdTomato (emisja przy 581 nm po wzbudzeniu przy 554 nm⁵⁴) i jasność nie zakłócają autofluorescencji retinoidów, a zatem ułatwiają osiągnięcie specyficzności komórek podczas sortowania. Biorąc pod uwagę krytyczną rolę niezakłóconego metabolizmu retinoidów i sygnalizacji w normalnym mikrośrodowisku pęcherzyków płucnych¹, opisana technika izolacji komórek płuc jest użytecznym narzędziem w badaniach na modelach zwierzęcych nad zdrowiem i chorobami płuc w celu uzyskania głębszego wglądu w komórkowe aspekty metabolizmu retinoidów w płucach i komunikację komórkową za pośrednictwem lipidów in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane procedury i eksperymenty z udziałem myszy zostały przeprowadzone za zgodą Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Rutgers (IACUC ID: PROTO202200111) zgodnie z kryteriami określonymi w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych przygotowanym przez Narodową Akademię Nauk⁵⁵.

1. Rozważania i przygotowania do eksperymentu

Hodowla i manipulacje zwierzętami
UWAGA: W badaniach można wykorzystać trzymiesięczne (10-12 tygodniowe) samce i samice myszy. Lecytyna: myszy z niedoborem acylotransferazy retinolu (Lrat-bicient, Lrat^-/- mice⁵⁶) na tle genetycznym C57BL / 6J i w opisanych eksperymentach wykorzystano rodzeństwo z miotu w tym samym wieku (typ dziki, myszy Lrat^+/+). Myszy z ekspresją genu tdTomato w fibroblastach (myszy F-tdT) zostały wygenerowane przez skrzyżowanie myszy z kasetą reporterową tdTomato (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze}/J, szczep Jackson Lab #007914) z myszami Col1a2-CreER (B6. Cg-Tg(Col1a2-Cre/ERT,-ALPP)7Cpd/2J, szczep Jackson Lab #029567).
1. Zastosuj mysi model z ekspresją Cre, jedną z wielu dostępnych opcji oznaczania docelowej populacji komórek in vivo.
  UWAGA: W zależności od wyboru komórki docelowej, ekspresji Cre, skuteczności rekombinacji za pośrednictwem Cre i specyficzności komórki, badacze mogą wykorzystać dowolny wiarygodny model myszy z ekspresją Cre.
2. Ekspresję transgenu tdTomato (po leczeniu tamoksyfenem, jak opisano poniżej) należy oznaczyć fibroblasty Col1a2 ⁺, a następnie wyizolować je z zawiesin jednokomórkowych strawionego płuca, jak opisano poniżej.
Rekombinacja za pośrednictwem Cre i aktywacja transgenów in vivo
1. Indukować ekspresję Cre u myszy F-tdT poprzez dootrzewnowe (IP) wstrzyknięcie 2 mg tamoksyfenu raz na 24 godziny przez łącznie 5 kolejnych dni.
2. Przed wstrzyknięciem zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia 70% etanolem. Myszy należy stosować do eksperymentów 1 miesiąc po ostatnim wstrzyknięciu tamoksyfenu.
3. Sprawdź skuteczność rekombinacji Cre przed eksperymentami sortowania. Potwierdź skuteczną rekombinację Cre i ekspresję tdTomato, izolując docelową populację komórek fibroblastów płuc od myszy F-tdT leczonych tamoksyfenem przy użyciu kulek magnetycznych anty-Pdgfrα i sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS).
Przygotowanie roztworów do wyrobów z tworzyw sztucznych i szkła
UWAGA: W przypadku procedur opisanych poniżej należy przestrzegać technik aseptycznych. Procedury obejmujące przygotowanie roztworu, trawienie tkanek i izolację komórek powinny być wykonywane pod kapturem laminarnym. Roztwory należy sterylizować przez filtrację przy użyciu filtra 0,2 μm; Narzędzia chirurgiczne, a także sprzęt laboratoryjny powinny być sterylizowane w autoklawie.
1. Pod maską laminarną przygotuj zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS), wolny od wapnia i magnezu (HBSS bez Ca²⁺/Mg²⁺, zawierający 5,3 mM KCl, 0,4 mM KH₂PO₄, 4,2 mM NaHCO₃, 137,9 mM NaCl, 0,3 mM Na₂HPO₄, 5,6 mM D-Glukoza) do perfuzji płuc (5 ml na mysz). Wysterylizować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm i napełnić strzykawkę roztworem.
2. Pod maską laminarną przygotować zbilansowany roztwór soli Hanksa z wapniem i magnezem (HBSS z Ca²⁺/Mg²⁺, zawierający 1,3 mM CaCl₂, 0,5 MgCl_2·6H₂O, 0,4 mM MgSO_4·7H₂O, 5,3 mM KCl, 0,4 mM KH₂PO₄, 4,2 mM NaHCO₃, 137,9 mM NaCl, 0,3 mM Na₂HPO₄, 5,6 mM D-glukozy), zawierające 0,3 mg/ml kolagenazy typu IV i 1 mg/ml dypazy do perfuzji płuc (10 ml na mysz). Wysterylizować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm i napełnić strzykawkę roztworem.
3. Pod kapturem laminarnym przygotować HBSS z Ca²⁺/Mg²⁺, zawierającym 0,3 mg/ml kolagenazy typu IV, 1 mg/ml dyspazy i 5 mg/ml DNazy I do trawienia płuc (10 ml na mysz). Wysterylizować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm i napełnić strzykawkę roztworem.
4. Pod kapturem laminarnym napełnij naczynie do hodowli komórkowych (35 mm 10 mm, jedno naczynie na każde płuco zebrane od jednej myszy) 2 ml sterylnego HBSS z Ca²⁺/Mg²⁺. Umieścić naczynie zawierające HBSS z Ca²⁺/Mg²⁺ na lodzie.

2. Perfuzja płuc, trawienie i zbieranie zawiesiny jednokomórkowej

Znieczulić mysz, podając koktajl znieczulający przez wstrzyknięcie IP, dostarczając dawkę 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny.
UWAGA: Poniższa technika wymaga użycia żywych zwierząt pod narkozą, aby zapobiec krzepnięciu krwi w mikrokrążeniu płuc, które mogłoby ograniczyć dostęp enzymów do obszarów pęcherzyków płucnych, a tym samym znacznie pogorszyć dalszą izolację docelowych populacji komórek.
Upewnij się, że mysz jest w głębokim stanie nieprzytomności, oceniając reakcję na uszczypnięcie palca u nogi. Brak odpowiedzi wskazuje, że zwierzę jest wystarczająco znieczulone do kolejnych kroków. Usuń luźne włosy i widoczny brud/zanieczyszczenia z pola operacyjnego i wytrzyj pole operacyjne do czysta przy użyciu 70% alkoholu do dezynfekcji.
Za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych otwórz jamę brzuszną i klatkę piersiową. Przetnij żebra i przeponę, aby odsłonić płuca i serce.
UWAGA: Torakotomia zapewni śmierć, ponieważ spontaniczne oddychanie może już nie wystąpić; Przy prawidłowym wykonaniu ta część zabiegu potrwa do 3 minut od rozpoczęcia zabiegu do torakotomii, po której następuje śmierć zwierzęcia.
Przeciąć żyłę główną dolną i nałożyć wkładkę chłonną, aby wchłonąć uwolnioną krew.
Wykonaj fuzję płuc in situ przez prawą komorę serca za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o wymiarach 25 G X 1" wypełnionej 5 ml sterylnego HBSS bez Ca^{2 +} / Mg^{2 +}. Jeśli perfuzja się powiedzie, tkanka płucna stanie się biała.
Wykonaj perfuzję płuc in situ za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 25 G X 1" wypełnionej 10 ml sterylnego HBSS z Ca^{2 +} / Mg²⁺, zawierającego kolagenazę typu IV (0,3 mg / ml) i dyspazę (1 mg / ml).
Usunąć płuca i przenieść je do naczynia do hodowli komórkowej (35 mm X 10 mm) z 2 ml sterylnego HBSS z Ca²⁺/Mg²⁺.
Pod laminarnym kapturem wypłucz płuca płuca i zmiel je na małe kawałki za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego (#20, pasuje do uchwytu #4). Przenieść zmielone płuco do probówki o pojemności 15 ml, dodając pierwsze 5 ml HBSS z Ca^{2 +} / Mg^{2 +} zawierającym 0,3 mg / ml kolagenazy typu IV, 1 mg / ml dyspazy i 5 mg / ml DNazy I do tkanki mielonej i przenosząc ją za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Zebrać i przenieść pozostałe pozostałości tkanek mielonych, myjąc naczynie do hodowli komórkowych pozostałymi 5 ml HBSS z Ca^{2 +} / Mg^{2 +} zawierającym 0,3 mg / ml kolagenazy typu IV, 1 mg / ml dypazy i 5 mg / ml DNazy I.
Inkubować zmieloną tkankę płucną w HBSS z Ca²⁺/Mg²⁺ zawierającym 0,3 mg/ml kolagenazy typu IV, 1 mg/ml dypazy i 5 mg/ml DNazy I na obrotowej wytrząsarce utrzymywanej w temperaturze 37 °C przez 45 minut. W każdym z trzech 15-minutowych odstępów, pod kapturem laminarnym, przepuść zmieloną tkankę 10 razy przez pipetę serologiczną o pojemności 10 ml, aby lepiej dysocjować komórki.
Przepuść powstałą zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 100 μm, aby zebrać pojedyncze komórki do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml roztworu do obrazowania zimnych żywych komórek (sól fizjologiczna zawierająca 20 mM HEPES, pH 7,4) zawierającej mniej niż 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 500 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek i pozostawić probówkę na 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu wyeliminowania erytrocytów. Dodaj 20 ml zimnego roztworu do obrazowania żywych komórek zawierającego mniej niż 5% FBS. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 500 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 20 ml zimnego roztworu do obrazowania żywych komórek zawierającego mniej niż 5% FBS. Przepuść powstałą zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm, aby zebrać pojedyncze komórki do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml zimnego roztworu do obrazowania żywych komórek zawierającego mniej niż 5% FBS. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 500 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml zimnego roztworu do obrazowania żywych komórek zawierającego mniej niż 5% FBS. Policz komórki i dostosuj stężenie komórek do ~5-10 x 10⁶ komórek / ml.

3. Izolacja komórek płuc zawierających retinoidy za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)

Pobrać porcję zawiesiny komórkowej i odłożyć ją na bok, aby można ją było wykorzystać jako niebarwioną kontrolę bramkowania. Do pozostałej zawiesiny komórek dodać barwnik żywotności SYTOX Green (rozcieńczenie 1:1000, stężenie końcowe 30 nM).
Przepuścić zawiesiny komórek przez filtr przymocowany do probówki zbiorczej z polistyrenu o pojemności 5 ml (12 x 75 mm).
Kontynuuj izolację komórek FACS, sortując żywe, pojedyncze komórki zawierające retinoidy na podstawie ich emisji przy 455 nm. Wykonaj sekwencyjną dyskryminację singletową przy użyciu wykresu dla rozproszenia do przodu (wysokość rozproszenia do przodu/FSC-H w porównaniu z obszarem rozproszenia do przodu/FSC-A). Wyklucz martwe komórki na podstawie charakterystyki rozproszenia (rozproszenie boczne) i barwienia SYTOX Green.
Bramkować, sortować i zbierać pojedyncze, żywe komórki zawierające retinoidy za pomocą emisji przy 455 nm po wzbudzeniu przy 350 nm.
UWAGA: Korzystając z opisanej procedury, z jednego płuca myszy można pobrać około 5·10⁵ komórek płuc zawierających retinoidy.
Wykonaj analizę danych FACS za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Izolacja komórek płuc zawierających retinoidy
Płuca myszy (od myszy Lrat^+/+oraz Lrat^-/-) poddano trawieniu enzymatycznemu, a przygotowane zawiesiny pojedynczych komórek poddano analizie FACS zgodnie z opisaną powyżej procedurą. Sortowanie komórek i akwizycja danych zostały wykonane na systemie Cytek Aurora™ Cell Sorter sterowanym oprogramowaniem SpectroFlo CS w wersji 1.3.0, przy użyciu dyszy 100 µm i ciśnieniu 15 ps...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zdolność wykrywania witaminy A w tkankach ludzkich i zwierzęcych oraz jej histologicznej wizualizacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej została po raz pierwszy opisana już w latach czterdziestych XX wieku^59,60. Zjawisko autofluorescencji retinoidów zostało następnie z powodzeniem zastosowane w badaniach mających na celu zlokalizowanie wysokich stężeń witaminy A w tkankach in vitro⁶¹ oraz scharakteryzowanie morfogenezy zwierzę...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana z grantu z National Institutes of Health/National Heart, Lung, and Blood Institute (NIH/NHLBI) R01 HL171112 (do I.S.), nagrody za rozwój kariery (dla I.S.) od Rutgers Center for Environmental Exposures & Disease ufundowanej przez National Institutes of Health/National Institute of Environmental Health Sciences (NIH/NIEHS) P30 ES005022, oraz fundusze na rozpoczęcie działalności z Rutgers, The State University of New Jersey (do I.S.). Autorzy pragną podziękować personelowi Immune Monitoring and Flow Cytometry Shared Resource w Rutgers Cancer Institute (wspieranym, częściowo, przez finansowanie z NCI-CCSG P30CA072770-5920) za ich wkład w pracę przedstawioną w tym manuskrypcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy
Pipeta serologiczna 10 ml	Avantor/VWR	76452-284
100 µ m sitko	Greiner Bio-One	542000
15 ml tubka sokoła	Corning	352099
40 µ m sitko	Greiner Bio-One	542040
50 ml probówka sokoła	Corning	352070
Naczynie do hodowli komórkowych, 35 mm i ostre; 10 mm	Corning	430165
Podłoże do sortowania komórek	Gibco	A59688DJ
Kolagenaza typ IV	Korporacja Biochemiczna Worthington	LS004188
System sortowania komórek Cytek Aurora	Cytek Biosciences
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DNase I	Sigma-Aldrich	DN25
Falcon 5-ml polipropylenowa probówka z okrągłym dnem, 12 mm i 75 mm	Corning	352063
Falcon 5-ml polistyrenowa probówka okrągłodenna z nasadką sitkową, 12 mm i ostra 75 mm		Corning 352235
Oprogramowanie FlowJo	Oprogramowanie do cytometrii przepływowej	Becton Dickinson
HBSS z Ca²⁺/Mg²⁺	Gibco	14925-092
HBSS bez Ca²⁺/Mg²⁺	Gibco	14175-095
Nalgene Sterylne jednorazowe filtry do butelek Rapid-Flow	ThermoFisher	595-3320
Liza czerwonych krwinek bufor	Sigma-Aldrich	R7757
SpectroFlo CS oprogramowanie	Cytek Biosciences	Wersja 1.3.0
Projekt chirurgiczny Royaltek Ostrza skalpela chirurgicznego ze stali nierdzewnej	Fisher Scientific	22-079-683
SYTOX Zielona plama martwych komórek	Invitrogen	S34860
Tamoksyfen	Sigma-Aldrich	T2859

Bibliografia

Shmarakov, I. O., et al. Retinoids stored locally in the lung are required to attenuate the severity of acute lung injury in male mice. Nat Commun. 14 (1), 851(2023).
Bogue, C. W., Jacobs, H. C., Dynia, D. W., Wilson, C. M., Gross, I. Retinoic acid increases surfactant protein mRNA in fetal rat lung in culture. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 271 (5), L862-L868 (1996).
Ng-Blichfeldt, J. -P., et al. Retinoic acid signaling balances adult distal lung epithelial progenitor cell growth and differentiation. EBioMedicine. 36, 461-474 (2018).
Chen, F., et al. Prenatal retinoid deficiency leads to airway hyperresponsiveness in adult mice. J Clin Invest. 124 (2), 801-811 (2014).
Esteban-Pretel, G., Marin, M. P., Renau-Piqueras, J., Barber, T., Timoneda, J. Vitamin A deficiency alters rat lung alveolar basement membrane: reversibility by retinoic acid. J Nutr Biochem. 21 (3), 227-236 (2010).
Massaro, G. D., Massaro, D. Postnatal treatment with retinoic acid increases the number of pulmonary alveoli in rats. Am J Physiol. 270 (2 Pt 1), L305-L310 (1996).
Hind, M., Maden, M. Retinoic acid induces alveolar regeneration in the adult mouse lung. Eur Respir J. 23 (1), 20-27 (2004).
Belloni, P. N., Garvin, L., Mao, C. P., Bailey-Healy, I., Leaffer, D. Effects of all-trans-retinoic acid in promoting alveolar repair. Chest. 117 (5 Suppl 1), 235S-241S (2000).
Veness-Meehan, K. A., Bottone, F. G. Jr, Stiles, A. D. Effects of retinoic acid on airspace development and lung collagen in hyperoxia-exposed newborn rats. Pediatr Res. 48 (4), 434-444 (2000).
Cho, S. J., George, C. L., Snyder, J. M., Acarregui, M. J. Retinoic acid and erythropoietin maintain alveolar development in mice treated with an angiogenesis inhibitor. Am J Respir Cell Mol Biol. 33 (6), 622-628 (2005).
Massaro, G. D., Massaro, D. Retinoic acid treatment abrogates elastase-induced pulmonary emphysema in rats. Nat Med. 3 (6), 675-677 (1997).
Stinchcombe, S. V., Maden, M. Retinoic acid induced alveolar regeneration: critical differences in strain sensitivity. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (2), 185-191 (2008).
Fraslon, C., Bourbon, J. R. Retinoids control surfactant phospholipid biosynthesis in fetal rat lung. Am J Physiol. 266 (6 Pt 1), L705-L712 (1994).
Zachman, R. D. Role of vitamin A in lung development. J Nutr. 125 (6 Suppl), 1634s-1638s (1995).
van Bennekum, A. M., et al. Lipoprotein lipase expression level influences tissue clearance of chylomicron retinyl ester. J Lipid Res. 40 (3), 565-574 (1999).
Blaner, W. S., et al. Lipoprotein lipase hydrolysis of retinyl ester: possible implications for retinoid uptake by cells. J Biol Chem. 269 (24), 16559-16565 (1994).
Trites, M. J., Febbraio, M., Clugston, R. D. Absence of CD36 alters systemic vitamin A homeostasis. Sci Rep. 10 (1), 20386(2020).
Wassef, L., Quadro, L. Uptake of dietary retinoids at the maternal-fetal barrier: in vivo evidence for the role of lipoprotein lipase and alternative pathways. J Biol Chem. 286 (37), 32198-32207 (2011).
Spiegler, E., Kim, Y. -K., Wassef, L., Shete, V., Quadro, L. Maternal-fetal transfer and metabolism of vitamin A and its precursor β-carotene in the developing tissues. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1821 (1), 88-98 (2012).
Kedishvili, N. Y. Enzymology of retinoic acid biosynthesis and degradation. J Lipid Res. 54 (7), 1744-1760 (2013).
Channabasappa, S., Caldwell, S., Kanthan, R., Singh, B. Retinoid receptors are expressed in mouse and human lungs. Anat Rec. 305 (9), 2281-2289 (2022).
Kimura, Y., et al. Retinoid receptors in the developing human lung. Clin Sci (Lond). 103 (6), 613-621 (2002).
Yang, L., Naltner, A., Yan, C. Overexpression of dominant negative retinoic acid receptor alpha causes alveolar abnormality in transgenic neonatal lungs. Endocrinology. 144 (7), 3004-3011 (2003).
Snyder, J. M., et al. Alveolarization in retinoic acid receptor-beta-deficient mice. Pediatr Res. 57 (3), 384-391 (2005).
Gao, R. -w, et al. Retinoic acid promotes primary fetal alveolar epithelial type II cell proliferation and differentiation to alveolar epithelial type I cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (5), 479-487 (2015).
Dirami, G., et al. Lung retinol storing cells synthesize and secrete retinoic acid, an inducer of alveolus formation. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (2), L249-L256 (2004).
Massaro, G. D., Massaro, D., Chambon, P. Retinoic acid receptor-alpha regulates pulmonary alveolus formation in mice after, but not during, perinatal period. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 284 (2), L431-L433 (2003).
Massaro, G. D., et al. Retinoic acid receptor-beta: an endogenous inhibitor of the perinatal formation of pulmonary alveoli. Physiol Genomics. 4 (1), 51-57 (2000).
McGowan, S., et al. Mice bearing deletions of retinoic acid receptors demonstrate reduced lung elastin and alveolar numbers. Am J Respir Cell Mol Biol. 23 (2), 162-167 (2000).
Yan, C., et al. Retinoic acid-receptor activation of SP-B gene transcription in respiratory epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 275 (2), L239-L246 (1998).
Ghaffari, M., Whitsett, J. A., Yan, C. Inhibition of hSP-B promoter in respiratory epithelial cells by a dominant negative retinoic acid receptor. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 276 (3), L398-L404 (1999).
Yang, L., et al. Synergy between signal transducer and activator of transcription 3 and retinoic acid receptor-α in regulation of the surfactant protein b gene in the lung. Mol Endocrinol. 18 (6), 1520-1532 (2004).
Metzler, M. D., Snyder, J. M. Retinoic acid differentially regulates expression of surfactant-associated proteins in human fetal lung. Endocrinology. 133 (5), 1990-1998 (1993).
George, T. N., Snyder, J. M. Regulation of surfactant protein gene expression by retinoic acid metabolites. Pediatr Res. 41 (5), 692-701 (1997).
Naltner, A., Ghaffari, M., Whitsett, J. A., Yan, C. Retinoic acid stimulation of the human surfactant protein B promoter is thyroid transcription factor 1 site-dependent. J Biol Chem. 275 (1), 56-62 (2000).
Ng-Blichfeldt, J. P., et al. Deficient retinoid-driven angiogenesis may contribute to failure of adult human lung regeneration in emphysema. Thorax. 72 (6), 510-521 (2017).
Lochbaum, R., et al. Retinoic acid signalling adjusts tight junction permeability in response to air-liquid interface conditions. Cell Signal. 65, 109421(2020).
Mamidi, S., Hofer, T. P., Hoffmann, R., Ziegler-Heitbrock, L., Frankenberger, M. All-trans retinoic acid up-regulates prostaglandin-e synthase expression in human macrophages. Immunobiology. 217 (6), 593-600 (2012).
Hashimoto, S., et al. Retinoic acid differentially regulates interleukin-1beta and interleukin-1 receptor antagonist production by human alveolar macrophages. Leuk Res. 22 (11), 1057-1061 (1998).
Li, S., Lei, Y., Lei, J., Li, H. Alltrans retinoic acid promotes macrophage phagocytosis and decreases inflammation via inhibiting CD14/TLR4 in acute lung injury. Mol Med Rep. 24 (6), (2021).
Nagy, N. E., et al. Storage of vitamin A in extrahepatic stellate cells in normal rats. J Lipid Res. 38 (4), 645-658 (1997).
Thompson, K. C., et al. Primary rat and mouse hepatic stellate cells express the macrophage inhibitor cytokine interleukin-10 during the course of activation in vitro. Hepatology. 28 (6), 1518-1524 (1998).
Zhang, X. Y., Sun, C. K., Wheatley, A. M. A novel approach to the quantification of hepatic stellate cells in intravital fluorescence microscopy of the liver using a computerized image analysis system. Microvasc Res. 60 (3), 232-240 (2000).
D'Ambrosio, D. N., et al. Distinct populations of hepatic stellate cells in the mouse liver have different capacities for retinoid and lipid storage. PLoS One. 6 (9), e24993(2011).
Apte, M. V., et al. Periacinar stellate shaped cells in rat pancreas: identification, isolation, and culture. Gut. 43 (1), 128-133 (1998).
Kim, N., et al. Formation of vitamin A lipid droplets in pancreatic stellate cells requires albumin. Gut. 58 (10), 1382-1390 (2009).
Kida, Y., et al. Characterization of vitamin A-storing cells in mouse fibrous kidneys using Cygb/STAP as a marker of activated stellate cells. Arch Histol Cytol. 70 (2), 95-106 (2007).
Ogawa, T., et al. Identification of vitamin A-free cells in a stellate cell-enriched fraction of normal rat liver as myofibroblasts. Histochem Cell Biol. 127 (2), 161-174 (2007).
Tacke, F., Weiskirchen, R. Update on hepatic stellate cells: pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 67-80 (2012).
Bartneck, M., et al. Isolation and time lapse microscopy of highly pure hepatic stellate cells. Anal Cell Pathol (Amst). , (2015).
Balaphas, A., et al. Optimized isolation and characterization of C57BL/6 mouse hepatic stellate cells. Cells. 11 (9), (2022).
Kubota, H., Yao, H. L., Reid, L. M. Identification and characterization of vitamin A-storing cells in fetal liver: implications for functional importance of hepatic stellate cells in liver development and hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2339-2349 (2007).
Larsen, A. K., et al. Autofluorescence in freshly isolated adult human liver sinusoidal cells. Eur J Histochem. 65 (4), (2021).
Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci. 120 (24), 4247-4260 (2007).
National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , The National Academies Press. Washington DC. (2011).
O'Byrne, S. M., et al. Retinoid absorption and storage is impaired in mice lacking lecithin: retinol acyltransferase (LRAT). J Biol Chem. 280 (42), 35647-35657 (2005).
McGowan, S. E., Torday, J. S. The pulmonary lipofibroblast (lipid interstitial cell) and its contributions to alveolar development. Annu Rev Physiol. 59, 43-62 (1997).
McGowan, S. E. The lipofibroblast: more than a lipid-storage depot. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 316 (5), L869-L871 (2019).
Meyer, K. A., Popper, H., Ragins, A. B. Histologic distribution of vitamin A in biopsy specimens of the liver. Arch Surg. 43 (3), 376-385 (1941).
Popper, H. L. Histological demonstration of vitamin A in rats by means of fluorescence microscopy. Proc Soc Exp Biol Med. 43, 133-136 (1940).
Van Exan, R. J., Hardy, M. H. Localization of vitamin A by autofluorescence during induced metaplastic changes in cultures of skin. In Vitro. 15 (8), 631-640 (1979).
Schweigert, F. J., Siegling, C., Tzimas, G., Seeger, J., Nau, H. Distribution of endogenous retinoids, retinoid binding proteins (RBP, CRABPI) and nuclear retinoid X receptor beta (RXRbeta) in the porcine embryo. Reprod Nutr Dev. 42 (4), 285-294 (2002).
Wake, K. Perisinusoidal stellate cells (fat-storing cells, interstitial cells, lipocytes), their related structure in and around the liver sinusoids, and vitamin A-storing cells in extrahepatic organs. Int Rev Cytol. 66, 303-353 (1980).
Senoo, H., Kojima, N., Sato, M. Vitamin A-storing cells (stellate cells). Vitam Horm. 75, 131-159 (2007).
Senoo, H., et al. Hepatic stellate cell (vitamin A-storing cell) and its relative--past, present and future. Cell Biol Int. 34 (12), 1247-1272 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

kom rki p ucne zawieraj ce retinoidy autofluorescencja retinoid w sortowanie kom rek aktywowane fluorescencj izolacja kom rek p ucnych metabolizm retinoid w cytometria przep ywowa estry retinolu fibroblasty p ucne zawiesina pojedynczych kom rek

Izolacja komórek płuc zawierających retinoidy przez sortowanie komórek